一种光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及新型纳米材料技术领域，特别涉及一种光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.细菌在我们生活中无处不在，致病菌侵入人体后引起的感染已成为重要的死亡原因。细菌感染严重威胁着人类健康，20世纪20年代青霉素问世以来，抗生素一直是对抗细菌感染的常用方法。然而，随着抗生素等抗菌剂的过度滥用，许多效果显著的抗生素对细菌的杀伤效果已大打折扣，细菌耐药性问题的出现和快速发展已严重威胁到人类健康。2015年11月，《柳叶刀
·
传染病》杂志报道，22％的大肠杆菌携带多粘菌素耐药基因。这一事件引起全球关注，因为粘菌素被认为是对抗细菌感染的最后一道防线。此外，联合国粮农组织的报告指出，如果耐药“超级细菌”在全球扩散，到2050年，全球因为耐抗生素细菌而造成的死亡人数将达到每年一千万人以上。届时，全球将步入“后抗生素时代”。因此，迫切需要合成更为有效的抗菌材料，以应对细菌耐药性的威胁。
3.作为一种新兴治疗策略，光动力疗法(pdt)在治疗生物膜感染中具有非侵袭性及低耐药性等优势，在抗菌、细菌生物膜清除应用中受到广泛关注。通过引入光敏剂，如亚甲基蓝(mb)、二氢卟吩e6(ce6)等，pdt在特定波长的照射后与周围的氧反应生成活性氧(ros)，包括过氧化氢(h2o2)、羟基自由基(
·
oh)、超氧自由基(
·o2-)或单线态氧(1o2)等，具有破坏细菌的dna和生物膜以及诱导细菌凋亡作用。然而，由于光敏剂材料固有的生物毒性，以及光敏剂对生物膜穿透深度有限等不足，极大限制了其在临床治疗上的转化应用潜力。如何赋予光敏剂高生物膜渗透能力和低毒性是提高pdt治疗生物膜感染的巨大挑战。
4.外源性一氧化氮被发现具有良好的生物膜清除作用，且不易导致耐药性，逐渐发展为21世纪最优秀的抗菌候选物之一。因此，为了解决日益严峻的抗生物耐药性问题，基于no的抗菌材料研究已成为当下的研究热点。据报道，no能够与氧气或者活性氧的中间体(如超氧化物或过氧化氢)反应形成大量的氧化/亚硝化物质(包括过氧化氢亚硝酸盐、rsno、二氧化氮和三氧化二氮)，这些活性物质能够与微生物蛋白、dna和代谢酶相互作用，最终破坏细菌生物膜，阻止细菌正常的代谢功能，从而实现高效的抗菌效果。尽管如此，no在实际抗菌应用过程中仍然存在一些不足，例如还未实现可控的长效释放，其释放过程需要光、热、特定的酶的辅助条件才能释放no，且no的治疗效果与其浓度具有极大的依赖性，从而造成no抗菌效果不太理想。因此，制备具有可控释放的no载体材料，对于增强no的生物学效应、解决no治疗浓度依赖性显得至关重要。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的制备方法。
6.本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料。
7.本发明的再一目的在于提供上述光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的应用。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.一种光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的制备方法，包括将黑磷纳米片与一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯混合的步骤。
10.所述的黑磷纳米片优选通过超声液相剥离黑磷晶体粉末得到。
11.所述的黑磷晶体粉末的粒径优选为1～5μm。
12.所述的黑磷纳米片优选通过如下制备方法制备得到：
13.将黑磷晶体粉碎后分散到含有饱和氢氧化钠的n-甲基吡咯烷酮溶液中，超声、离心，取上清离心收集沉淀，即得黑磷纳米片(bpns)。
14.所述的黑磷晶体与含有饱和氢氧化钠的n-甲基吡咯烷酮溶液优选按质量体积比1:1～2计算；更优选按质量体积比(mg:ml)1:2计算。
15.所述的黑磷纳米片的粒径优选为200～450nm；更优选为400nm。
16.所述的超声的功率为450～550w，时间为10～14h；更优选功率为500w，时间为12h。
17.所述的离心的转速为3500～4500rpm，时间10～30min；更优选转速为4000rpm，时间20min。
18.所述的取上清离心的条件为：10000～14000rpm离心10～30min；更优选为12000rpm离心20min。
19.所述的一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯优选通过可逆加成-断裂链转移聚合法制备得到。
20.所述的一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯优选通过如下制备方法制备得到：
21.将甲基丙烯酸缩水甘油酯与6-乙酰硫代乙基酯分散于有机溶剂中，进行氮气吹扫-脱气处理，得到反应混合物；将反应混合物油浴加热后，冷却，在空气中静置使反应混合物充分氧化；将氧化后的反应混合物于乙醚中沉淀，收集沉淀溶于二氯甲烷后在戊烷中沉淀，收集沉淀并溶于n,n-二甲基甲酰胺，与亚硝酸叔丁酯溶液在氮气吹扫下反应，产物在乙腈中沉淀，收集沉淀干燥后即得一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(patsno)。
22.所述的甲基丙烯酸缩水甘油酯在反应混合物中的终浓度优选为2～3mg/ml；更优选为2.625mg/ml。
23.所述的6-乙酰硫代乙基酯在反应混合物中的终浓度优选为0.5～1.5mg/ml；更优选为1mg/ml。
24.所述的有机溶剂包括但不限于乙腈、戊烷、乙醚和n,n-二甲基甲酰胺中的至少一种。
25.所述的氮气吹扫-脱气处理的次数优选为2～5个循环；更优选为3个循环。
26.所述的油浴加热的温度为70～80℃，时间为4～8h；更优选温度为75℃，时间为6h。
27.所述的冷却优选为在冰水浴中冷却。
28.所述的静置优选在空气中静置；所述的静置的时间优选为4～8h；更优选为6h。
29.所述的在氮气吹扫下反应的时间优选为10～14h；更优选为12h。
30.所述的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的制备方法，具体包括如下步骤：
31.(1)将黑磷纳米片分散于水中，得到黑磷纳米片水溶液；
32.(2)将一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯溶于水中，得到一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液；
33.(3)将步骤(1)的黑磷纳米片水溶液与步骤(2)的一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液混合，搅拌，离心，即得光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料(bpns@patsno)。
34.步骤(1)中，所述的黑磷纳米片水溶液中黑磷纳米片的浓度优选为500～1000μg/ml；更优选为500μg/ml。
35.步骤(1)中，所述的水优选包括去离子水。
36.步骤(2)中，所述的一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液中一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的浓度优选为1～5mg/ml；更优选为1mg/ml。
37.步骤(2)中，所述的水优选包括去离子水。
38.步骤(3)中，所述的黑磷纳米片水溶液与一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液优选按体积比1:1～8计算；更优选按体积比1:6计算。
39.步骤(3)中，所述的搅拌的条件优选为：400～800rpm搅拌8～12分钟；更优选为600rpm搅拌10分钟。
40.步骤(3)中，所述的静置的时间优选为4～8h；更优选为6h。
41.步骤(3)中，所述的离心的条件优选为10000～14000rpm离心15～25min；更优选为12000rpm离心20min。
42.一种光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料，通过上述制备方法制备得到。
43.所述的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料在生物医学领域，尤其在制备抗菌药物中的应用。
44.一种抗菌药物，包括光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料。
45.所述的菌优选为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的至少一种。
46.所述的抗菌药物的使用方法，包括用激光照射抗菌药物的步骤。
47.所述的激光优选为：波长为660nm、功率为50～600mw的激光；更优选为：波长为660nm、功率为200mw的连续激光。
48.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
49.(1)本发明中，黑磷作为一种非金属层状半导体，具有褶皱状表面结构及随厚度变化的带隙，这种独特的电子结构赋予黑磷独特的物理性质，如黑磷可作为一种高效的光敏剂，用于产生单线态氧。此外，黑磷纳米片在人体中适度使用时可降解为对人体无害的磷酸根离子，避免了传统光敏材料的生物毒性。本发明利用黑磷纳米片制备得到的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料，在水中的分散性好，在生理环境中可生物降解，在特定波长(660nm)的近红外光照射线下能被诱导产生单线态氧，用于对抗细菌感染。
50.(2)本发明制备的方法是将甲基丙烯酸缩水甘油酯、6-乙酰硫代乙基酯分散于乙腈等有机溶剂中，得到一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，再将一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液与黑磷纳米片水溶液按照一定比例混合，搅拌后静置一段时间离心即得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的黑磷纳米片，即一种光动力触发一氧化氮释放黑
磷纳米材料(bpns@patsno)。该方法利用黑磷纳米片表面的负电荷与带正电的一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯通过简单的正负电相互作用在黑磷纳米片表面修饰一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，可以提高黑磷在水中的稳定性，同时bpns@patsno经660nm激光照射处理后产生的单线态氧可实现一氧化氮的可控释放。该方法在工艺上操作简单，耗时短，可重复性好，可以实现纳米级别黑磷纳米片的大规模生产，所需的有机溶剂量少，对环境的损害低。
51.(3)本发明通过黑磷纳米片产生的单线态氧实现聚甲基丙烯酸缩水甘油酯负载的一氧化氮的控制释放，即光动力触发一氧化氮释放。与原始一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯相比，光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的一氧化氮的可控性释放性能显著提高，在生理环境中通过特定波长的近红外光刺激可按需释放一氧化氮。与传统的一氧化氮载体相比，本发明所述方法制备得到的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料可响应单线态氧，实现一氧化氮的可控按需释放；而且在给药后无需照射高能射线，无辐射。
52.(4)本发明所述方法制备得到的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料在黑磷纳米片表面修饰一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，保留了黑磷的光敏剂特性，同时增加了黑磷在生理环境中的稳定性。由于单线态氧可破坏一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯侧链上的基团，实现光动力触发一氧化氮释放，而且一氧化氮进一步与单线态氧反应后可生成抗菌活性更高的过氧亚硝酸盐等活性氮，从而实现一氧化氮与光动力协同效果。
53.(5)本发明所述制备光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的方法可以实现光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的大规模制备，为其在生物医学等领域的应用奠定基础。经过660nm激光照射处理后bpns@patsno产生的单线态氧可实现一氧化氮的可控释放，同时一氧化氮与活性氧进一步反应生成的过氧亚硝酸盐具有更显著的抑制细菌性能，在生物医学领域具有广阔的应用前景。
附图说明
54.图1为实施例2中黑磷晶体和黑磷纳米片的性能检测结果图；其中，图1a为黑磷纳米片的透射电镜结果图；图1b为黑磷晶体和黑磷纳米片的拉曼光谱图；图1c为bpns、patsno、bpns@patno的电位检测结果图。
55.图2为实施例2中光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料在ph＝7.4的磷酸盐缓冲液中不同时间下的紫外吸收光谱图。
56.图3为实施例3光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料与1,3-二苯基异苯并呋喃的混合液经660nm激光照射不同时间后的紫外吸收光谱图。
57.图4为光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料在室温下和660nm激光照射后一氧化氮的释放曲线图。
58.图5为不同功率的660nm激光照射bpns@patsno水溶液5min后的荧光强度变化结果图。
59.图6为660nm激光照射对不同bpns@patsno的体外抗菌效果图。
60.图7为实施例4中bpns@patsno 660nm激光组、bpns@patsno组对应的荧光强度变化结果图。
61.图8为实施例5中bpns@patsno 660nm激光组、bpns@patsno组大鼠伤口面积变化结
果图。
62.图9为200w、300w、400w的超声功率对黑磷纳米片厚度的影响结果图；其中，图9a为200w超声功率对黑磷纳米片厚度的影响结果图；图9b为300w超声功率对黑磷纳米片厚度的影响结果图；图9c为400w超声功率对黑磷纳米片厚度的影响结果图。
63.图10为黑磷纳米片水溶液与一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液的混合比例对所得bpns@patsno的一氧化氮释放量的影响结果图。
具体实施方式
64.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
65.实施例1：光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料
66.黑磷纳米片是通过超声液相剥离黑磷晶体粉末得到的。其具体步骤为：将黑磷晶体(购于上海科拉曼试剂有限公司)通过研磨机研磨成粒径大小为1～5μm的粉末状样品，然后以1:2的质量体积(mg:ml)比分散到40ml含有饱和氢氧化钠的n-甲基吡咯烷酮溶液中，通过超声波细胞破碎仪在冰水浴中超声12小时，功率为500w，然后在4000转离心20分钟收集上清液，再取上清液于12000转离心20分钟收集沉淀即得到所需的黑磷纳米片(bpns)。
67.一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯是通过可逆加成-断裂链转移聚合法制备得到的。其具体步骤为：将甲基丙烯酸缩水甘油酯(购于上海阿拉丁试剂公司，分析级)、6-乙酰硫代乙基酯(购于上海阿拉丁试剂公司，分析级)分散在20ml乙腈中，得到混合液；其中，混合液中甲基丙烯酸缩水甘油酯、6-乙酰硫代乙基酯的终浓度分别为2.625mg/ml、1mg/ml，将混合液转移到反应茄瓶中进行三个循环的氮气吹扫-脱气处理，得到反应混合物；将反应混合物在75℃油浴中搅拌6小时，然后在冰水浴中冷却，在空气中放置6h，使反应混合物充分氧化；将氧化后的反应混合物在50ml乙醚中沉淀，收集沉淀溶于10ml二氯甲烷后在50ml戊烷中沉淀。收集沉淀并溶于10ml n,n-二甲基甲酰胺，与50μl亚硝酸叔丁酯(购于sigma公司，分析级)在氮气吹扫下反应12小时，产物在30ml乙腈中沉淀，收集沉淀干燥后即得到一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(patsno)。
68.一种光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
69.(1)将黑磷纳米片分散在去离子水中，配置浓度为500μg/ml的黑磷纳米片水溶液；
70.(2)将一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯溶于去离子水，配制成浓度为1mg/ml的一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液(新鲜配置，配置后尽快用完)；
71.(3)取5ml步骤(1)得到的黑磷纳米片水溶液加入30ml步骤(2)得到的一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液，在600rpm下搅拌10分钟，然后静置6小时，将混合溶液转移到离心管中以12000转离心20min，获得的沉淀为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的黑磷纳米片，即光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料(bpns@patsno)。
72.实施例2：性能检测
73.(1)黑磷晶体和黑磷纳米片的性能检测结果
74.对实施例1制得的黑磷纳米片进行透射电镜检测。
75.结果如图1a所示。从图1a可以观察到薄片状的二维黑磷纳米片，透射电镜观察到的粒径约400nm。
76.对实施例1的黑磷晶体和黑磷纳米片进行拉曼光谱检测。
77.结果如图1b所示，图1b的拉曼光谱显示黑磷剥离前后吸收峰位置没有改变，表明液相剥离对黑磷的物理性质没有影响，所制备的黑磷纳米片与黑磷晶体性质相近，这说明黑磷纳米片材料的成功制备。
78.对实施例1制得的黑磷纳米片(bpns)、一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(patsno)和光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料(bpns@patsno)进行电位检测。
79.结果如图1c所示。从图1c可以看到所制备的黑磷纳米片和一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的电位分别为-21mv和25mv，光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料(bpns@patsno)的电位为10mv，所制备的bpns@patsno整体带正电荷，有利于结合到细菌表面，具有良好的生物膜渗透性。
80.(2)光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的稳定性检测
81.对实施例1制得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的稳定性进行检测，包括如下步骤：
82.取500μg的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料分散在5ml pbs缓冲液(ph＝7.4，0.01m)中，在不同时间点(第0天、第1天、第3天、第5天、第7天)通过紫外分光光度计检测200～900nm下的吸收光谱。
83.结果如图2所示，发现光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料在磷酸盐缓冲液中的吸光度值随时间的增加而下降，说明本发明的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料在ph值为7.4的环境中可缓慢降解，且由于光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料带正电荷，与带负电荷的细菌具有较强的亲和力，从而本发明所述方法制得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料具有高生物膜渗透能力。
84.实施例3：光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料光动力控释一氧化氮的性能研究
85.(1)对实施例1制得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的光动力效果进行检测，具体步骤如下：
86.取实施例1制得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料配置成浓度为20μg/ml的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料水溶液，然后将上述溶液放置在两端透光的石英皿中，使用1,3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)(购于上海阿拉丁试剂公司)作为检测活性氧(ros)的探针测试bpns@patsno的光动力活性。bpns@patsno产生的单线态氧可与dpbf反应，进一步生成无色邻苯二甲酰苯，并伴随着410nm处吸收的衰减。使用波长为660nm，功率为15mw/cm2的近红外激光器照射溶液，在不同照射时间内(0、1min、2min、3min、4min、5min、10min、20min)，通过紫外分光光度计检测350-500nm处吸光度的变化，评估光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的光动力活性。
87.结果如图3所示。经激光照射20分钟后，本发明的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料与dpbf混合照射660nm激光后在410nm处的吸光度显著降低，这表明实施例1制备得到的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料是一种具有良好光动力性能的光敏材料，在半导体光电元件、太阳能电池和生物医学领域具有广阔的应用前景。
88.(2)对实施例1制备得到的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的一氧化氮释放过程进行检测，其具体步骤如下：
89.取实施例1制得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料配置成浓度为1mg/ml的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料水溶液，使用griess法(griess试剂盒，购于碧云天试剂公司)在室温条件下检测bpns@patsno释放的一氧化氮含量。同样的，在相同室温下用波长为660nm，功率为150mw/cm2的连续激光照射等量浓度为1mg/ml的bpns@patsno水溶液，每间隔5min使用griess法检测bpns@patsno释放的一氧化氮含量，并记录一氧化氮的释放曲线。对660nm激光照射bpns@patsno水溶液前后一氧化氮的释放量差异进行研究。
90.结果如图4所示，在室温条件下，bpns@patsno在30分钟内的一氧化氮释放量为4.6μmol/mg，经660nm激光辐照30min后，bpns@patsno的一氧化氮释放量为9.4μmol/mg，显著高于室温条件下不经激光照射的bpns@patsno的一氧化氮的释放量，这表明实施例1制得的bpns@patsno具有优秀的光动力控释一氧化氮能力，可实现一氧化氮的按需可控释放，在生物医学领域具有广阔的应用前景。
91.(3)对实施例1制得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料与660nm激光协同产生过氧亚硝酸盐的效果进行检测，具体步骤如下：
92.取实施例1制得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料配置成浓度为1mg/ml的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料水溶液，使用不同的功率(50mw、200mw、600mw)的波长为660nm的连续激光照射上述bpns@patsno水溶液5min后使用二氢罗丹明123(购于上海阿拉丁试剂公司，纯度95％)评估过氧亚硝酸盐的产生，二氢罗丹明123可以被过氧亚硝酸盐特异性氧化，生成的罗丹明123具有特殊的荧光(激发/发射＝500/536nm)。在660nm激光照射bpns@patsno水溶液后，使用荧光分光光度计检536nm处的测荧光强度变化，检验过氧亚硝酸盐的生成。同样的，作为对照组，使用超纯水替换bpns@patsno水溶液在功率为600mw的660nm激光照射下进行试验。
93.结果如图5所示，660nm激光照射bpns@patsno水溶液5min后，荧光强度显著增强，且荧光强度随激光功率上升而上升，600mw 660nm激光照射bpns@patsno水溶液5min后，荧光强度最高。对照组的荧光强度在照射前后无明显变化，表明经660nm激光处理后bpns@patsno生成了过氧亚硝酸盐，说明光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料与660nm激光处理具有协同效果。
94.实施例4：光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料一氧化氮协同光动力增强体外抗菌活性研究
95.(1)对实施例1制备得到的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料进行体外光动力/一氧化氮协同抗菌性能检测，其具体步骤如下：
96.取1ml、密度为1
×
109cfu的呈对数期生长的金黄色葡萄球菌(atcc 25923；下同)在4000转下离心10分钟以分离细菌培养液，收集细菌沉淀并重悬于等体积的ph值为7.4的磷酸盐缓冲液(购于biosharp试剂公司，0.01m)中，得到金黄色葡萄球菌菌悬液，然后用ph＝7.4的磷酸盐缓冲液将上述金黄色葡萄球菌菌悬液稀释100倍，得到金黄色葡萄球菌菌液。取实施例1制得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料与上述金黄色葡萄球菌菌液混合(v/v＝1:1，总体积为200μl)，使光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的最终浓度分别为0.1mg/ml、0.3mg/ml、0.6mg/ml和1.2mg/ml，用功率为200mw的660nm激光照射5min，然后在温度为37℃，转速为220转的恒温培养箱中培养6小时，得到培养液。用ph＝7.4 0.01m的磷酸盐缓冲液将上述培养液稀释10倍后，取100μl接种在lb固体琼脂(购于北京环凯生物
公司，配置好经高温灭菌后使用)中，放入37℃培养箱中培养12h。为了设置对照组，取实施例1制得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料与上述金黄色葡萄球菌菌液混合(v/v＝1:1，总体积200μl)，使光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料的最终浓度为0.3mg/ml，不经激光照射，于温度为37℃、转速为220转的恒温培养箱中培养6小时得到的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料与金黄色葡萄球菌菌液的混合液(记为bpns@patsno组)；取实施例1制得的黑磷纳米片水溶液与上述金黄色葡萄球菌菌液混合(v/v＝1:1，总体积200μl)，调整黑磷纳米片的最终浓度为0.3mg/ml，得到黑磷纳米片与金黄色葡萄球菌菌液的混合液，用功率为200mw的660nm激光照射混合液5min(记为bpns laser组)，于温度为37℃、转速为220转的恒温培养箱中培养6小时；同时，为了设置空白对照组，取上述金黄色葡萄球菌菌液与ph＝7.4 0.01m的磷酸盐缓冲液混合(v/v＝1:1，总体积200μl)，不经过激光照射，按上述相同的方法进行培养和接种(记为空白对照组)。利用数码相机对lb固体琼脂进行拍照并使用菌落计数器统计菌落数量，评价bpns@patsno的光动力/一氧化氮(pdt/no)联合抗菌效果。
97.结果如图6所示，与空白对照组相比，经过660nm激光照射处理后，bpns@patsno laser(1.2mg/ml)组显示出最少的菌落数，而没有经过660nm激光处理的bpns@patsno组仍有大量的菌落留存。这是由于单纯的一氧化氮抗菌效果有限，不能完全抑制细菌的生长。黑磷纳米片经过660nm激光照射后，细菌数量有所降低，但仍有较多的菌落存在，说明单纯的单线态氧抗菌效果有限，难以完全抑制细菌生长。而终浓度分别为0.1mg/ml、0.3mg/ml、0.6mg/ml和1.2mg/ml的bpns@patsno经过660nm激光照射后，细菌数量显著降低。我们推测其抗菌效果增强的原因是光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料产生的单线态氧与一氧化氮进一步反应生成了过氧亚硝酸盐，从而产生更强的抗菌效果，能杀死绝大部分的细菌，说明本发明的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料具有显著的抗菌效果。
98.(2)对实施例1制备得到的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料通过活死细菌染色法评价体外光动力/一氧化氮协同消散生物膜的作用，其具体步骤如下：
99.为了阐明光动力/一氧化氮协同消散生物膜的机理，使用活/死菌荧光染色法(live/dead
tm baclight
tm
细菌活力检测试剂盒，购于thermo fisher scientific)对bpns@patsno纳米材料作用后的金黄色葡萄球菌菌液进行标记，并通过激光共聚焦显微镜进行观察。syto
tm 9green fluorescent核酸染色试剂能够穿透样品中所有细菌细胞膜和胞内的核酸相结合后在激发波的激发下可以产生绿色荧光，pi(碘化丙啶)染料进入细胞结构被破坏或者细胞膜结构不完整的细胞液中，与胞内核酸相结合后在激发波长下可以产生红色荧光。同时使用两种颜色时，结构完整、细胞膜无损伤的细菌将被染色呈绿色荧光，而结构发生损伤、细胞膜不完整的细菌将被染色呈红色荧光。
100.取实施例1制得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料配置成浓度为100μg/ml的bpns@patsno水溶液。然后取1ml呈对数期生长的、密度为1
×
109cfu的金黄色葡萄球菌(atcc 25923；下同)，用ph＝7.4 0.01m的磷酸盐缓冲液稀释到密度为1
×
107cfu，得到金黄色葡萄球菌菌液。分别取100μl的bpns@patsno水溶液和金黄色葡萄球菌菌液接种在96孔板中，得到混合溶液；使用功率为200mw的660nm激光器照射混合溶液5分钟，然后置于温度为37℃、转速为150转的恒温培养箱中培养4小时，得到样品(记为bpns@patsno 660nm激光组)。按照上述处理方法，以不经激光照射处理的混合溶液为对照组(记为bpns@patsno组)，
以不加入光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料、不经激光处理的金黄色葡萄球菌菌液为空白对照组。各取2μl的syto
tm 9green fluorescent核酸染色试剂和pi染料，与样品(bpns@patsno 660nm激光组、bpns@patsno组、空白对照组)相互作用染色30分钟，然后用4℃的ph＝7.4 0.01m的磷酸盐缓冲液洗涤三次，以去除游离的染料。然后置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照照片。
101.结果如图7所示，经过200mw 660nm激光器照射后，bpns@patsno 660nm激光组呈现大面积的红色荧光，表明经过光动力/一氧化氮联合治疗后，导致大部分的细菌死亡。这表明经过660nm激光照射处理的bpns@patsno具有显著的抑制细菌性能，在生物医学领域具有广阔的应用前景。
102.实施例5：光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料通过光动力/一氧化氮联合抑制大鼠伤口细菌感染的体内抗菌活性研究
103.对实施例1得到的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米体系进行体内抗菌性能检测，其具体步骤如下所示：
104.(1)大鼠全层皮肤缺损感染模型建立：
105.sd大鼠30只，雌性，5周龄，体重120-150克左右(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)。对购入的大鼠进行为期10天的隔离检疫，期间每日检查大鼠一次，观察大鼠的健康状况，即使转移不健康的大鼠，隔离结束后选取健康的动物进行实验。收集体外培养的呈对数期生长的金黄色葡萄球菌(atcc 25923)，调整细菌密度为1
×
108cfu，得到金黄色葡萄球菌菌悬液。使用戊巴比妥将大鼠麻醉后将其固定，使用75％(v/v)酒精对大腿皮肤进行消毒，待酒精挥发后，使用手术刀制造直径为1cm的伤口，使用1ml注射器将500μl金黄色葡萄球菌菌悬液缓慢滴在伤口部位，滴加注意避免金黄色葡萄球菌菌悬液流出伤口部位。用游标卡尺每天测量一次伤口的长径和短径，并用数码相机拍照记录。接种金黄色葡萄球菌菌悬液2天后，伤口部位可见黄色的脓液，伤口边缘开始结痂。将动物随机分组，一共分为3组，每组4只，分别为：空白对照组、bpns@patsno组以及bpns@patsno 660nm激光组。
106.(2)治疗方式：各组伤口金黄色葡萄球菌感染的大鼠通过注射器在伤口表面滴加药物，隔天给药，其中，空白对照组滴加生理盐水，bpns@patsno组及bpns@patsno 660nm激光组滴加生理盐水配置的bpns@patsno，bpns@patsno终浓度为0.3mg/ml；另外，bpns@patsno 660nm激光组在给药后使用功率为200mw的660nm激光器照射给药部位5分钟。每只大鼠给药的体积为200μl，一共给药7次，第15天对各组大鼠注射过量的戊巴比妥安乐死。
107.结果如图8所示，体内实验结果显示，随着时间增加，对照组的伤口愈合速度缓慢，在第15天，空白对照组的伤口面积平均值为0.38cm2，bpns@patsno处理组的大鼠伤口面积在第15天的时候也达到0.22cm2，说明单独的一氧化氮抑制大鼠伤口感染部位细菌的生长效果不佳。当联合光动力治疗后，bpns@patsno 660nm激光组大鼠伤口面积在第15天时缩小到0.05cm2，基本实现完整的愈合，伤口面积明显小于空白对照组和bpns@patsno组。这说明光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料是一种优良的抗菌材料。
108.实施例6：超声功率对黑磷纳米片厚度的影响
109.黑磷纳米片通过660nm激光照射产生单线态氧的效果与其二维结构的厚度有关，厚度越小单线态氧的产率越高。黑磷纳米片是通过超声波细胞破碎仪在有机溶剂中剥离黑磷晶体得到的，超声功率对黑磷纳米片的厚度可能存在一定影响。为了得到厚度较薄的黑
磷纳米片，有必要探究不同功率超声条件下得到的黑磷纳米片厚度变化情况，具体步骤如下：将黑磷晶体(购于上海科拉曼试剂有限公司)通过研磨机研磨成粒径大小为1～5μm的粉末状样品，然后以1:2的质量体积(mg:ml)比分散到40ml含有饱和氢氧化钠的n-甲基吡咯烷酮溶液中，通过超声波细胞破碎仪在冰水浴中分别以200w、300w、400w、500w的功率连续超声12h，然后在4000转离心20分钟收集上清液，再取上清液于12000转离心20分钟收集沉淀。将沉淀以0.5mg/ml的浓度分散在5ml去离子水中，然后通过透射电镜观察黑磷纳米片的结构形貌。
110.结果如图9及图1a所示。从图9a可以观察到以200w功率超声制备得到的黑磷纳米片厚度较大，表明200w超声功率剥离效果不佳，图9b和图9c也观察到的相似的结果，说明以300w和400w的功率进行超声剥离难以得到厚度较薄的黑磷纳米片。当超声功率提高到500w时，从图1a可以观察到薄片状的二维黑磷纳米片，其粒径约400nm，因此选择500w功率超声制备黑磷纳米片进行后续的检测。
111.实施例7：黑磷纳米片水溶液与一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液的混合比例
112.对实施例1光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料制备方法中黑磷纳米片水溶液与一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液的混合比例进行优化，具体步骤如下：取5ml 500μg/ml的黑磷纳米片水溶液，与1mg/ml一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液分别以1:2，1:4，1:6，1:8的体积比(ml:ml)混合，按实施例1所述的方法进行搅拌混合、静置、离心，得到光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料(bpns@patsno)。分别取1mg所获得的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料(bpns@patsno)溶于5ml超纯水中，配置成0.2mg/ml的bpns@patsno水溶液，使用griess法(griess试剂盒，购于碧云天试剂公司)在室温条件下检测bpns@patsno释放的一氧化氮含量。
113.结果如图10所示，当黑磷纳米片水溶液与一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液以1:2的体积比混合制备的光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料所释放一氧化氮的量较低，仅为4.8μmol/mg，一氧化氮负载量较低。当二者混合的体积比分别提高到1:4和1:6时，一氧化氮的释放量分别提高到7.1μmol/mg和8.98μmol/mg。当黑磷纳米片水溶液与一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液混合的体积比提高到1:8时，所释放的一氧化氮的量与1:6时无明显差别，表明黑磷纳米片水溶液与一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液混合的体积比提高到1:8时，所得bpns@patsno的一氧化氮的负载量已经接近最大值，基于节约材料的目的，选择黑磷纳米片水溶液与一氧化氮载体聚甲基丙烯酸缩水甘油酯水溶液以1:6的体积比混合制备光动力触发一氧化氮释放黑磷纳米材料。
114.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。