一种基于统计学的连翘优劣药分类方法与流程

1.本发明涉及中药检测方法，具体涉及一种基于统计学的连翘优劣药分类方法。


背景技术：

2.连翘(forsythiae fructus)，又称落翘、黄花条、黄链条花。连翘果实从开花到成熟有几个阶段：花苞孕育期、开花授粉期、胚胎形成期、果实膨大期、种仁生成期、果实成熟期、种子成熟期、果实开裂期、种子传播期、果壳脱落期。秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘”。果实熟透时采收，晒干除去杂质，习称“老翘”。含木脂素类、黄酮类、挥发性成分、苯乙烷类、乙基环己醇类、三萜类及香豆素类等化合物。还有桦木酸、连翘苷、牛蒡子苷、罗汉松脂苷、松脂素、连翘醇苷c、连翘醇苷d等。
3.历史上连翘在中医配方中只使用老翘(又称黄翘)，青翘则被用于中药提取和中成药投料。抢青的连翘性状与药典不符，不仅不利于药品安全有效，而且造成了巨大的资源浪费。
4.《中国医药报》报道了在2015年连翘产新季采集了主产区12个产地抢青采收(6月中旬到7月中旬)和正常采收(7月下旬至9月上旬)二个时段的青翘样品各12份，并于9月初邮寄到中国医学科学院药用植物研究所进行含量检测，结果如下：
[0005][0006]
结果显示：对于连翘苷，抢青果实的平均含量为1.017％，正常期采摘的果实为0.72％，前者是后者的1.41倍；对于连翘酯苷a，抢青果实的平均含量为11.065％，正常期采摘的为8.41％，前者是后者的1.32倍。由此得出结论：连翘的果实越嫩，其中连翘苷和连翘酯苷a这两个指标的含量就越高。这说明，仅用连翘苷和连翘酯苷a这两个指标来作为连翘的含量测定的指标是不够、也是不合理的。
[0007]
连翘的挥发油则是后期生成的，成熟的果实才有，嫩果是没有的。挥发油是聚集在连翘种子种仁部位，只有待连翘果实膨大之后、果实表皮有多数突起的小斑点生长出来，连翘果实内部的种子生成以后，才开始逐渐生成与积累，并随着果实的成熟不断增加与聚集。果实越接近成熟，鲜果的挥发油含量越高，所以采摘连翘鲜果要坚决杜绝抢青，必须待连翘鲜果由绿转黄即将成熟时采摘为佳，抢青的连翘鲜果是不含挥发油的。2020年版《中国药典》增加挥发油检测项后，连翘抢青将得到有效扼制。
[0008]
而在此过程中，发展简单、快捷而有效的连翘抢青和正常采摘(优劣药)鉴别方法就显得极为重要。


技术实现要素：

[0009]
本发明以抢青连翘果实样本和正常采摘连翘果实样本作为研究对象，重点关注了二者之间可作为潜在鉴别指标的差异物质，并借用统计学方法对二者进行直接分类研究。
[0010]
本发明旨在解决目前新版药典对连翘抢青和正常采摘(正常采收)的有效控制难题。
[0011]
传统方法对连翘的研究中，主要关注连翘苷和连翘酯苷a两种有效成分，而在抢青连翘中这两种物质的含量均高于正常采摘的连翘，且目前尚无限量标准确认抢青与正常采摘，所以只依靠这两者的绝对含量判别无法快捷有效的确认连翘是否是抢青而来。
[0012]
本发明通过使用固相微萃取(spme)进样方式进行gcms数据采集，同时结合主成分分析(pca)统计学分类方法，既可极大简化前处理过程，同时也简化了对数据的后处理，发展出简单、快捷而有效的连翘抢青和正常采摘(优劣药)鉴别方法。
[0013]
本发明通过分别对抢青样品和正常采摘样品进行谱图对比，发现二者共有成分2-甲基-1-苯基丙烯(rt＝12.070min，以下简称a)和乙酸(rt＝12.195min，以下简称b)的相对含量发生倒置(如图2所示)，且这种规律在32例抢青连翘(6，7月采摘)和56例正常采摘连翘(8，9，10月采摘)样本中普遍存在，即a和b两种物质对可作为连翘优劣药鉴别的差异物质。
[0014]
将a与b的保留时间位于11.5-12.5min的区间作为pca模型建立的范围，直接对谱图中的该时间范围内所有的物质及其碎片进行pca分析，所得结果如图3所示。通过pca分析，可直接将32例抢青连翘和56例正常采摘连翘分为两类。此方法简单快捷，未来可发展成统计学分类数据库直接对连翘的优劣进行筛查和判别。
[0015]
本发明提供了一种连翘优劣药分类的检测系统，其包括：固相微萃取(spme)系统、gc-ms分析系统和数据处理分析系统；将连翘样品装入固相微萃取(spme)系统制备得到提取物；将制备得到的提取物装入gc-ms分析系统得到分析谱图和数据；通过数据处理分析系统判断连翘是抢青或正常采摘；任选的，所述检测系统还包含连翘样品。
[0016]
如上所述的一种连翘优劣药分类的检测系统，其特征在于：数据处理分析系统是基于2-甲基-1-苯基丙烯和乙酸的含量进行判断，其中连翘抢青的2-甲基-1-苯基丙烯含量小于乙酸的含量；连翘正常采摘的2-甲基-1-苯基丙烯含量大于乙酸的含量。
[0017]
如上所述的一种连翘优劣药分类的检测系统，其特征在于：数据处理分析系统基于主成分分析(pca)统计学分类方法，使用signpost软件对保留时间位于11.5-12.5min的区间作为pca模型建立的范围，直接对谱图中的该时间范围内所有的物质及其碎片进行pca分析。
[0018]
如上所述的一种连翘优劣药分类的检测系统，其特征在于：所述固相微萃取(spme)系统为aoc-6000plus；所述gc-ms分析系统为gcms-tq8040。
[0019]
如上所述的一种连翘优劣药分类的检测系统，其特征在于：所述固相微萃取(spme)系统的条件为：
[0020]
spme探头shimadzu smart spme arrow 1.10mm：dvb/c-wr/pdms老化温度240℃老化时间(萃取前)0平衡温度40℃平衡时间5min萃取时间8min进样口温度250℃解吸时间1min老化时间(萃取后)10mino
[0021]
如上任一项所述的一种连翘优劣药分类的检测系统，其特征在于：所述gc-ms条件为：
[0022][0023][0024]
本发明还提供了一种用于连翘优劣药分类的组合物，其由2-甲基-1-苯基丙烯和乙酸组成；或者由2-甲基-1-苯基丙烯、乙酸、和任选的辅料或载体组成。
[0025]
本发明还提供了一种组合物作为连翘优劣药分类的检测标志物的用途，其特征在于：所述组合物由2-甲基-1-苯基丙烯和乙酸组成；或者由2-甲基-1-苯基丙烯、乙酸、和任选的辅料或载体组成。
[0026]
本发明还提供了一种用于连翘优劣药分类的组合物，其特征在于：该组合物是由连翘原料经由固相微萃取(spme)系统制备得到，该组合物对应于gc-ms分析系统中保留时间为11.5-12.5min区间内的所有物质；
[0027]
所述固相微萃取(spme)系统的条件为：
[0028]
spme探头shimadzu smart spme arrow 1.10mm：dvb/c-wr/pdms老化温度240℃
老化时间(萃取前)0平衡温度40℃平衡时间5min萃取时间8min进样口温度250℃解吸时间1min老化时间(萃取后)10min
[0029]
所述gc-ms条件为：
[0030]
色谱柱inertcap pure-wax，30m
×
0.25mm
×
0.25μm柱温程序50℃(5min)_10℃/min_250℃(10min)流量控制方式压力载气压力83.5kpa进样方式分流进样分流比40∶1离子源温度200℃接口温度250℃检测器电压相对调谐结果 0kv采集方式scan。
[0031]
如上所述的一种用于连翘优劣药分类的组合物在连翘优劣药分类的用途，其特征在于：基于主成分分析(pca)统计学分类方法，使用signpost软件对保留时间位于11.5-12.5min的区间作为pca模型建立的范围，直接对谱图中的该时间范围内所有的物质及其碎片进行pca分析。
[0032]
本发明还提供了一种连翘优劣药分类的方法或者鉴别连翘优劣的方法，其特征在于：连翘打粉后装入固相微萃取(spme)系统制备得到提取物；将制备得到的提取物装入gc-ms分析系统得到分析谱图和数据；通过数据处理分析系统判断连翘是抢青或正常采摘。
[0033]
如上所述的数据处理分析系统是基于2-甲基-1-苯基丙烯和乙酸的含量进行判断，其中连翘抢青的2-甲基-1-苯基丙烯含量小于乙酸的含量；连翘正常采摘的2-甲基-1-苯基丙烯含量大于乙酸的含量。
[0034]
如上所述数据处理分析系统基于主成分分析(pca)统计学分类方法，使用signpost软件对保留时间位于11.5-12.5min的区间作为pca模型建立的范围，直接对谱图中的该时间范围内所有的物质及其碎片进行pca分析。
[0035]
如上所述的固相微萃取(spme)系统为aoc-6000plus；所述gc-ms分析系统为gcms-tq8040。萃取和gc-ms条件如本发明所描述。
[0036]
如上所述的用于连翘优劣药分类，可用于鉴别连翘优劣，具体的可以鉴别出抢青或正常采摘。
[0037]
连翘果实最佳的采收时间是在7月底到9月底之间。它的果实在7月底的时候重量会达到顶峰，此时连翘苷的含量可以达到药典的标准，最适合采收，若是想要采摘老翘，也要注意时间。不能太晚，应在青翘开始成熟后就进行采收，否则连翘苷的含量会下降。
[0038]
如上所述的，抢青主要是指连翘果实成熟之前提前采收的连翘果实，具体的可以为7月中旬之前采收；更具体的是6月份-7月份采收；更具体的是6月中旬到7月中旬采收；正常采摘或采收，是指连翘果实成熟之后采收的连翘果实，具体的可以为7月份之后采收的连翘，更具体的可以为7月下旬之后采收，也可以为7月下旬至9月上旬采收，也可以是8-10月采收。
[0039]
如上所述的固相微萃取(spme)系统和gc-ms分析系统是带有spme模块的气相色谱质谱联用仪。优选的，其型号为aoc-6000plus gcms-tq8040。
[0040]
如上所述，连翘的处理方法为：将连翘样品，除杂，晾干，并粉碎打粉。任选的，进行过筛操作，优选的可以为100目、200目或300目等。
[0041]
本发明通过使用带有spme模块的气相色谱质谱联用仪对不同采摘期的优劣连翘样品进行实验研究。根据实验结果，发现了与连翘优劣具有极强相关性的两种差异物质，且此两种差异物质的相对含量可作为鉴别依据对连翘优劣药进行有效判别。在此基础上，通过引入pca分析，可将优劣连翘直接进行统计学分类，此方法简单快捷，未来可发展成统计学分类数据库直接对连翘的优劣进行筛查和判别。
附图说明
[0042]
图1：连翘样品的分析系统示意图；
[0043]
图2：抢青连翘与正常采摘连翘差异物质对比；
[0044]
图3：基于pca的抢青连翘与正常采摘连翘统计学分类。
具体实施方式
[0045]
以下结合实施例，对本发明作进一步说明。
[0046]
实施例1抢青和正常采摘的连翘样品的物质分析
[0047]
样品制备
[0048]
将连翘打粉后称量装入顶空瓶内，每瓶重量为2.15g左右。放入带有spme模块的aoc-6000plus gcms-tq8040中进行分析，如图1所示。
[0049]
分析条件
[0050]
spme条件
[0051]
spme探头shimadzu smart spmearrow 1.10mm：dvb/c-wr/pdms老化温度240℃老化时间(萃取前)0平衡温度40℃平衡时间5min萃取时间8min进样口温度250℃解吸时间1min老化时间(萃取后)10min
[0052]
gcms条件
[0053]
色谱柱inertcap pure-wax，30m
×
0.25mm
×
0.25μm
柱温程序50℃(5min)_10℃/min_250℃(10min)流量控制方式压力载气压力835kpa进样方式分流进样分流比40∶1离子源温度200℃接口温度250℃检测器电压相对调谐结果 0kv采集方式scan
[0054]
通过分别对抢青样品和正常采摘样品进行谱图对比，发现二者共有成分2-甲基-1-苯基丙烯(rt＝12.070min，以下简称a)和乙酸(rt＝12.195min，以下简称b)的相对含量发生倒置(如图2所示)，且这种规律在32例抢青连翘(6，7月采摘)和56例正常采摘连翘(8，9，10月采摘)样本中普遍存在，即a和b两种物质对可作为连翘优劣药鉴别的差异物质。
[0055]
实施例2抢青和正常采摘的连翘样品的pca分析处理
[0056]
使用signpost软件对32例抢青连翘样本(6月采摘12例，7月采摘20例)和56例正常连翘样本(8月采摘20例，9月采摘20例，10月采摘16例)进行主成分分析(pca)处理。具体分析处理条件按照以下表格中所示进行处理。
[0057]
pca分析处理条件
[0058][0059][0060]
将a与b的保留时间位于11.5-12.5min的区间作为pca模型建立的范围，直接对谱图中的该时间范围内所有的物质及其碎片进行pca分析，所得结果如图3所示。通过pca分析，可直接将32例抢青连翘和56例正常采摘连翘分为两类。此方法简单快捷，未来可发展成统计学分类数据库直接对连翘的优劣进行筛查和判别。
[0061]
以上描述是本发明的一般性描述。根据情况或实际需要，可进行形式的变化和等值的替代，虽然本文采用特定的术语，但这些术语意在描述，而不是为了限制的目的。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围之内。