一种快速选育全生育期耐盐水稻的方法与流程

1.本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种快速选育全生育期耐盐水稻的育种方法。


背景技术：

2.水稻是世界上最重要的粮食作物之一，对盐害敏感，当土壤中可溶性盐浓度达到0.3％时即表现出受害症状，最终导致显著减产。全世界盐碱地面积约占陆地面积1/3，占世界总耕地面积的20％。中国盐碱地面积约2000万hm2。由于人类活动等诸多因素的影响，土壤盐碱化正不断的吞噬着人类赖以生存的土地，可供耕种的土地面积正日趋减少。从我国水资源、气候以及生态等方面看，除现有的稻区外，我国还有一些地区很适宜于水稻生产，但由于土壤的盐渍化而未能种植。因此培育耐盐水稻品种是提高盐碱土地的利用率和经济效益，缓解世界粮食危机的最佳方案之一。
3.水稻种质资源间耐盐性存在较大差异，而且耐盐机制又不完全相同，因而选育耐盐水稻品种进展较为缓慢。我国从上世纪70年代开始耐盐水稻育种研究工作。最早由赵守仁等人与国际水稻研究所协作，在500多份耐盐水稻材料中筛选、鉴定所得到的优良耐盐水稻品种80-85，该品种高抗盐碱，分蘖性强，耐肥抗倒，丰产性能较好。方先文等用0.8％naci溶液和国际水稻所水稻耐盐性9级评价方法筛选获得苗期极端耐盐水稻品种6份。以上筛选耐盐水稻品种的研究工作大多数是对已经育成的定型水稻品种进行耐盐性筛选，同时积累了较多的耐盐性筛选方法和标准，如种子萌发期鉴定、苗期鉴定，田间生长中后期筛选鉴定等，取得了一定的研究进展，如筛选的耐盐性较好的水稻品种有80-85、盐籼156、盐丰47等等，这些耐盐水稻品种推广应用面积都不大，目前都还作为耐盐资源在水稻育种等研究中应用，无法满足不同农业生态气候以及土壤条件对耐盐(籼、粳型)水稻品种的需求。
4.目前，耐盐水稻鉴定与评价体系主要集中在水稻幼苗期，而水稻全生育期的耐盐性鉴定的研究相对较少。由于水稻耐盐性是由多基因控制的数量性状，遗传机制较复杂，在不同生长发育阶段其耐盐能力也有巨大差异，相互之间关联性也不强。研究人员已经利用分子标记辅助选择和基因工程等手段将单个或者几个耐盐基因(qtl)导入当前水稻主栽品种中，迄今为止，已有多个影响水稻耐盐性的主效qtl被鉴定出来，其中saltol等基因已被精细定位，skc1已被克隆。实践证明，通过对核心种质的鉴定和遗传改良是获得农作物主栽品种有利变异的有效途径，但进展较缓慢，目前还没有培育出生产上大面积推广利用的水稻耐盐品种。
5.本发明拟利用这些已经定位或者克隆的耐盐基因(qtl)，通过传统杂交的方式结合分子标记辅助选择，选择合适的双亲，进行优势互补，将耐盐基因(qtl)导入，通过大田自然筛选和实验室分子标记检测，同时结合系统选育的方法来快速获得全生育期耐盐的水稻品种。现有技术中利用天然的盐场进行自然筛选，同时利用实验室分子标记辅助选择含有耐盐qtl-saltol的供体亲本fl478，从杂交配组的低世代f1就开始连续不断进行耐盐性筛选而选育耐盐水稻品种报道几乎没有。


技术实现要素：

6.技术问题
7.本发明提供一种耐盐水稻品种快速选育方法，利用已经定位或者克隆的耐盐基因(qtl)，通过传统杂交的方式结合分子标记辅助选择，通过摸索选择合适的双亲，进行优势互补，将耐盐基因(qtl)导入优良品种，通过大田自然筛选和实验室分子标记检测，同时结合系统选育的方法来快速获得全生育期耐盐的水稻品种。
8.技术方案
9.一种快速选育全生育期耐盐水稻的方法，指的是，选择用优质常规中熟晚籼玉针香为母本，用耐盐常规中籼稻品系fl478为父本，人工配置杂交组合获得f1种子，将获得f1种子加代繁殖，成熟时混收种子；f2至f3代每代混收直播种植于0.3％-0.4％沿海滩涂进行自然选择，不考虑农艺性状，f4代在实验室中利用高浓度霍格兰nacl营养溶液继续进行苗期筛选，f5至f7代加大筛选压力在0.5％-0.6％沿海滩涂自然条件下进行全生育期耐盐选择，设置全生育期盐害指数n为评价水稻品种全生育期耐盐性强弱的指标，n＝(g2-g1)/g2
×
100，其中：n为盐害指数(％)，g1为盐浓度5
‰
的盐土条件下种植收获的稻谷重量，g2为盐浓度为0的淡水灌溉条件下种植收获的稻谷重量，盐害指数n对应的耐盐级别设置见表1；
10.表1：全生育期耐盐分级评价标准
[0011][0012]
选择盐害指数n对应的耐盐级别为1-3级，并利用耐盐性分子标记rm3412进行辅助选择，选择能扩增出特异性分子标记rm3412条带，农艺性状同常规育种、抗病性与fl478相近、品质与玉针香相近的单株或小区，育成的f7代小区品系，即为所选育的全生育期耐盐水稻品种。
[0013]
具体包括以下步骤：
[0014]
(1)选择用优质常规中熟晚籼玉针香为母本，用耐盐常规中籼稻品系fl478为父本，人工配置杂交组合获得f1种子，将获得f1种子加代繁殖，成熟时混收种子；
[0015]
(2)将收获的f1代种子在盐分浓度为0.3％-0.4％的沿海滩涂盐土条件下直播，进行全生育期耐盐性鉴定，能够完成全生育期正常结实的单株，成熟时混收种子；
[0016]
(3)将筛选混收的f2群体的种子，继续在0.3％-0.4％的沿海滩涂盐土条件下直播，继续进行全生育期耐盐性鉴定，能够完成全生育期正常结实的单株，成熟时混收种子；
[0017]
(4)将筛选混收的f3群体的种子，在实验室中用96孔pcr板，120m/mol的nacl霍格
兰营养液进行苗期筛选，能够正常萌发，待到三叶一心时期，移栽到盐分为0.5-0.6％沿海滩涂自然条件下种植，能够完成生育期的植株，分单株收获f4种子保存；
[0018]
(5)将上代收获的f4单株种子种成株行，在盐分浓度为0.5-0.6％沿海滩涂自然条件下种植，进行水稻全生育期耐盐性鉴定，以选择盐害指数n对应的耐盐级别为1-3级的株行，测量株行中成活植株的农艺性状，选择农艺性状同常规育种的单株留存收获f5代种子；
[0019]
(6)将上代收获的f5代单株继续种植成株行，在盐分浓度为0.5-0.6％沿海滩涂自然条件下种植，重复上述步骤，同时选取留存的耐盐单株种子的叶片进行耐盐分子标记特异性扩增；结合实验室pcr扩增结果，选取能扩增出特异性分子标记rm3412条带的f6代单株种子，保留。
[0020]
(7)在盐分浓度为0.5-0.6％沿海滩涂自然条件下种植f6代单株种子成小区，根据全生育期盐害指数选择耐盐级别为1-3级的小区，进行抗病性鉴定、米质测定，选择抗病性与fl478相近、品质与玉针香相近，垩白度小于10％，直链淀粉含量在13-18％之间，粒型长宽比在3.0以上，成熟期时以小区收获的稻谷产量为400kg/亩以上的小区的f7代品系，即为所选育的全生育期耐盐水稻品种。
[0021]
所述的农艺性状同常规育种，指的是，选择株型与玉针香相当，生育期140天，株高110-115cm，亩穗18万-20万，结实率85％-90％，千粒重25-27g；
[0022]
所述的抗病性与fl478相近，指的是，中抗-中感白叶枯病，病级3-5级；中抗-中感稻瘟病，病级3-5级；
[0023]
所述的品质与玉针香相近，指的是，稻米品质达国标三级优质米标准。
[0024]
育成的全生育期耐盐水稻品系，命名为盐稻3931：
[0025]
(1)产量特性：沿海滩涂种植盐稻3931的生育期140.2天，株高110.7cm，亩有效穗数18.5万，每穗总粒数151.7粒，结实率85.8％，千粒重26.9g，产量水平450kg/亩以上；
[0026]
(2)稻米品质特性：整精米率60.2％，长宽比3.1，垩白粒率29％，垩白度3.3％，直链淀粉17.3％，胶稠度72.0mm，碱消值级6.5，达国标3级米标准；
[0027]
(3)抗性：盐稻3931苗期对稻瘟病6个生理小种zb
27
、zc
15
、zd7、ze3、zf1、zg1均为免疫，穗茎瘟综合抗性指数为4.75，表现为中感；对白叶枯4个生理小种浙173、px079、ks-6-6、js-49-6均表现为3级抗性；
[0028]
(4)耐盐性：苗期耐盐性1级，全生育期耐盐性鉴定为3级，耐盐性强。
[0029]
有益效果
[0030]
本发明目的在于提供一种耐盐水稻品种快速选育方法，利用实验室分子标记辅助选择含有耐盐qtl-saltol的供体亲本fl478，从杂交配组的低世代f1就开始连续不断进行耐盐性筛选而选育耐盐水稻品种。
[0031]
本发明提供一种耐盐水稻品种快速选育方法，即是以玉针香为母本、以耐盐水稻品系fl478为父本进行杂交配置组合，从f2代就开始连续不断在沿海滩涂盐土(盐分浓度为0.3～0.6％)条件下进行种子全生育期的耐盐性鉴定，同时结合实验室高盐浓度的盐溶液进行试验室筛选，根据后期水稻品系的耐盐性、产量、品质和抗病性等性状鉴定，育成耐盐常规中籼稻新品系盐稻3931，具有较高较快的选育效率。
[0032]
利用本发明育成的耐盐常规中籼稻品种盐稻3931，具有以下有益效果：
[0033]
(1)育成品种耐盐性较好
[0034]
通过将供体亲本fl478中含有的耐盐qtl导入到优质籼稻玉针香中，育成耐盐水稻品种盐稻3931，实现在江苏顺泰农场沿海滩涂盐土(盐分浓度为0.3％)条件下，能够正常完成生育期，且全生育期耐盐性达到3级，产量水平较高，实际测产2019年平均亩产467.3kg，2020年平均亩产458.3kg。
[0035]
(2)育成品种稻米品质优良
[0036]
亲本玉针香为国标一级米，而供体亲本fl478因来源于野生稻的后代，米质较差，尤其垩白率和垩白粒率都较高，稻米适口性较差，通过杂交选育，实现了耐盐水稻品种米质的改良，盐稻3931谷粒呈黄色，细长而饱满，长宽比达到3.1，达国标3级米。
[0037]
(3)优势互补，强强联合
[0038]
双亲玉针香与fl478两个品种在盐城地区种植，熟期都较早，有利于后代选育出早熟类型的水稻品种，尤其适宜在江苏沿海滩涂地区种植推广，可以有效的缓解生产上稻麦茬口的问题；其次玉针香株高较高119cm左右，不抗倒伏，而fl478茎秆粗壮，抗倒性强，后代选育的品种盐稻3931株高110.7cm下降了8cm，在沿海滩涂种植能够有效抵挡台风以及极端气候对水稻生产带来的影响。再者，玉针香叶色淡，后期熟相好，而fl478属于耐盐性品种，叶色偏深，后代选育品种转色好。
附图说明
[0039]
图1高盐田块种子萌发期田间表型
[0040]
图2高盐田块苗期表型
[0041]
图3高盐田块分蘖期田间表型
[0042]
图4高盐田块成熟期表型
[0043]
图5实验室种子萌发期耐盐鉴定表型
[0044]
图6实验室种子耐盐苗期鉴定表型
[0045]
图7沿海滩涂全生育期耐盐性鉴定
[0046]
图8 pcr产物电泳检测显示有231bp一条谱带的为供体亲本fl478基因纯合体的水稻品种，据此确认含有saltol基因的单株。
具体实施方式
[0047]
目前，国内从事耐盐水稻育种选育的单位多数集中在沿海地区或者内陆具有大面积的盐碱地的区域，常规方法是将已经育成的品种或稳定的品系种植在当地，通过耐盐筛选获得耐盐的水稻种质资源，而且已经报道的材料农艺性状较差，无法直接应用于杂交配组，本课题组通过国内外引进的3000多份种质资源进行耐盐性鉴定，也获得了相当一部分耐盐种质资源材料，同时也配置了大量杂交组合，例如利用pokkali与9311，盐稻4号、盐恢559、盐恢269、明恢63等恢复系以及优质常规籼稻粤丰丝苗、五山丝苗、鄂丰丝苗等进行杂交，但后代出现生育期偏迟，株高变高，结实率下降等缺点，无法选育适合生产的水稻品种。在经过大量尝试杂交配组以后选用了中间材料fl478与玉针香两个亲本，优势互补，选育出盐稻3931。
[0048]
以所述的玉针香(湖南省水稻研究所选育，湘审稻2009038)为母本，该品种属常规中熟晚籼，在江苏盐城种植全生育期140天左右。株高119cm左右，株型适中。叶色淡分蘖力
强，后期熟相好，不早衰。每亩有效穗24.1万穗，每穗总粒数115.8粒，结实率81.1％，千粒重28.0g。抗性：稻瘟病抗性综合指数8.2，白叶枯病抗性7级，感白叶枯病，抗寒能力较强。米质指标：糙米率80.0％，精米率65.7％，整精米率55.8％，粒长8.8mm，长宽比4.9，垩白粒率3％，垩白度0.4％，透明度1级，直链淀粉含量16.0％，国标1级米。
[0049]
以耐盐供体亲本fl478，来源于耐盐品种pokkali和盐敏感品种ir29构建的近等基因系，(thomson mj,md ocampo,egdane j,et al.characterizing the saltol quantitative trait locus for salinity tolerance in rice[j].rice,2010,3(2):148-160.)，其中pokkali来源于斯里兰卡，于1939年培育出世界上第1个抗盐水稻品种，ir29为国际水稻研究所选育的籼型常规水稻。该品系具有较强的苗期耐盐性和早熟的特性，在第1条染色体上具有一个耐盐qtl-saltol为父本，该品种株型较散，叶色偏深，长势较旺，分蘖力较强，叶姿披，抗倒性较强。全生育期140.5天，在沿海滩涂种植平均亩产450.8kg，每亩有效穗20.5万，穗实粒数140.8粒，结实率90.1％，千粒重26.8g，株高95.5cm，稻瘟病综合指数3.0，中抗穗颈瘟，中抗白叶枯病，国标等外米，苗期耐盐性1级，全生育期耐盐级别3级，进行人工杂交配组。
[0050]
利用与耐盐qtl-saltol紧密连锁的分子标记rm3412耐盐性分子标记辅助选择(thomson m j,md ocampo,egdane j,et al.characterizing the saltol quantitative trait locus for salinity tolerance in rice[j].rice,2010,3(2):148-160.)，扩增出特异性条带的单株，即含有供体亲本fl478的saltol基因。
[0051]
本发明设置盐害指数(salt tolerance index)作为评价水稻品种全生育期耐盐性强弱的指标，盐害指数的大小反映水稻全生育期对盐胁迫忍耐能力的强弱。
[0052]
以盐害指数n作为水稻全生育期耐盐性评价指标。全生育期盐害指数：n＝(g2-g1)/g2
×
100，式中：n为盐害指数(％)，g1为盐浓度5
‰
的滩涂盐土条件下种植收获的稻谷重量(三个重复的平均重量)，g2为盐浓度为0淡水灌溉条件下种植收获的稻谷重量(三个重复的平均重量)。以盐害指数n作为水稻全生育期耐盐性强弱的评价指标，分1-7级评价，见表1。选育过程介绍：
[0053]
(1)选择用优质常规中熟晚籼玉针香为母本，用耐盐常规中籼稻品系fl478为父本，人工配置杂交组合获得f1种子，在江苏沿海地区农业科学研究所南洋试验农场进行人工杂交配组，杂交收获30粒种子，单独播种种植，成熟时混收种子成为f2群体；
[0054]
(2)将上代收获的f1代种子1000粒在盐分浓度为0.3％-0.4％的沿海滩涂盐土条件下直播，进行全生育期耐盐性鉴定，能够完成全生育期，正常结实的单株，不做任何选择，成熟时每一个单株上选取一个单穗，混收成为群体种子；
[0055]
(3)将上代筛选混收的f2代种子，继续在0.3％-0.4％的沿海滩涂盐土条件下直播，继续进行全生育期耐盐性鉴定，能够完成全生育期，正常结实的单株，成熟时继续在每一个单株上选取一个单穗，混收种子；
[0056]
(4)将上代筛选混收的群体f3代种子，在实验室中用96孔pcr板，120m/mol的霍格兰nacl营养液进行筛选，能够正常萌发，待到三叶一心时间，移栽到盐分为0.5-0.6％沿海滩涂自然条件下种植，重点对水稻生长的中后期耐盐性筛选鉴定，成熟时分单株收获保存，共选育86个单株；
[0057]
(5)将上代收获的86个单株f4代种子种成株行，继续在盐分浓度为0.5-0.6％沿海
滩涂自然条件下种植，进行水稻全生育期耐盐性鉴定，成熟时选择盐害指数n对应的耐盐级别为1-3级的株行，选择株型与玉针香相当，生育期140天，株高110-115cm，亩穗18万-20万，结实率85％-90％，千粒重25-27g的优良单株留存，分单株收获，共收获58个单株；
[0058]
(6)将上代收获的f5代58个单株继续种植成株行，在盐分浓度为0.5-0.6％沿海滩涂自然条件下种植，重复上述步骤，共选择35个单株；同时选取这35个优良耐盐单株植株的叶片进行耐盐分子标记特异性扩增；采用sds法提取dna，用ssr标记rm3412序列进行pcr扩增：
[0059]
正向序列为aaagcaggttttcctcctcc，
[0060]
反向序列为cccatgtgcaatgtgtcttc；
[0061]
pcr反应体系：模板dna 10ng/μl 1μl；引物4pmol/μl 0.8μl；10
×
缓冲液1μl；mgcl225mm 0.6μl；dntp2.5mm 0.2μl；taq酶5u/μl 0.1μl；ddh2o 6.3μl；反应总量10μl；
[0062]
pcr反应在mj research ptc-200热循环仪上进行，反应程序包括：94℃预变性5min，每个循环94℃变性30sec，52.2℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸7min，12℃保存；
[0063]
pcr产物电泳检测显示有231bp一条谱带的为供体亲本fl478基因纯合体的水稻品种，据此确认含有saltol基因的单株(图8)；
[0064]
(7)结合实验室pcr扩增结果，选取能扩增出特异性分子标记rm3412条带的f6代单株种子，共13个单株保留，在盐分浓度为0.5-0.6％沿海滩涂自然条件下f6代继续种植成小区，根据全生育期盐害指数选择耐盐级别为1-3级的小区，进行抗病性鉴定、米质测定，选择抗病性与fl478相近、品质与玉针香相近，中抗-中感白叶枯病，病级3-5级；中抗-中感稻瘟病，病级3-5级；稻米品质达国标三级优质米标准，垩白度小于10％，直链淀粉含量在13-18％之间，粒型长宽比在3.0以上，成熟期时以小区收获的稻谷产量为400kg/亩以上的小区的f7代品系，即为所选育的全生育期耐盐水稻品种，并命名为盐稻3931(见表2)。
[0065]
表2盐稻3931选育系谱图
[0066][0067]
育成耐盐水稻品种盐稻3931，在江苏顺泰农场沿海滩涂盐土(盐分浓度为0.3％)条件下，能够正常完成生育期，且全生育期耐盐性达到3级，产量水平较高，实际测产2019年平均亩产467.3kg，2020年平均亩产458.3kg。盐稻3931：
[0068]
(1)产量特性：沿海滩涂种植盐稻3931的生育期140.2天，株高110.7cm，亩有效穗数18.5万，每穗总粒数151.7粒，结实率85.8％，千粒重26.9g，产量水平450kg/亩以上；
[0069]
(2)稻米品质特性：整精米率60.2％，长宽比3.1，垩白粒率29％，垩白度3.3％，直链淀粉17.3％，胶稠度72.0mm，碱消值级6.5，达国标3级米标准；
[0070]
(3)抗性：盐稻3931苗期对稻瘟病6个生理小种zb27、zc15、zd7、ze3、zf1、zg1均为免疫，穗茎瘟综合抗性指数为4.75，表现为中感；对白叶枯4个生理小种浙173、px079、ks-6-6、js-49-6均表现为3级抗性；
[0071]
(4)耐盐性：苗期耐盐性鉴定为1级，全生育期鉴定为3级，耐盐性强。
[0072]
附：水稻萌芽至成苗期耐盐性评价方法。
[0073]
(1)以苗期盐害指数作为水稻萌芽期至苗期耐盐性的评价指标，具体过程如下：
[0074]
(a)每个水稻品种选取健壮饱满成熟的种子100粒，置于网袋中，在37℃恒温箱中黑暗浸种2～3天；
[0075]
(b)待种子露白后，每个品种挑选均匀一致的种子各48粒，播种于去掉底部的96空pcr板中；
[0076]
(c)将装有种子的96空pcr板置于特制的黑色培养盒中，在人工气候室中进行幼苗培养，培养条件为：光照/黑暗为14h/10h，光照强度为800μmol m
–2s
–170％，日温/夜温为28/24℃，相对湿度为70％；
[0077]
(d)在清水中培养7天后，将清水更换为yoshida水稻营养液。
[0078]
(e)待水稻幼苗生长至两叶一心时(约播种后2周)，将幼苗置于140mmnacl盐溶液中进行处理；
[0079]
(f)待80％的幼苗叶片萎蔫时，停止盐处理，将幼苗置于清水中恢复生长7天；
[0080]
(g)对每个水稻材料进行耐盐性鉴定，统计幼苗成活率(ssp)；每个品种重复3次，求取平均值。
[0081]
(2)苗期盐害指标调查
[0082]
盐胁迫20d后取样。每份鉴定材料的盐胁迫和对照两个处理的3个重复所有秧苗，包括受盐胁迫影响、没有长成秧苗的种子(稻谷)。收取的每份鉴定材料及时高温杀青，烘干后的干物重(根、茎、叶)作为考查性状。
[0083]
(3)苗期鉴定标准
[0084]
以苗期盐害指数作为水稻发芽期至苗期耐盐性的评价指标，具体计算如下：
[0085]
苗期盐害指数(％)＝(对照处理干物重－盐胁迫处理干物重)/对照处理干物重
×
100
[0086]
公式中：盐胁迫处理干物重—为5
‰
nacl盐水处理的秧苗干物质重量(3个重复的平均重量)；对照处理干物重—为淡水处理的秧苗干物质重量(3个重复的平均重量)。
[0087]
(4)评价方法
[0088]
以不同苗期盐害指数范围作为水稻发芽期至苗期耐盐性强弱的评价指标，具体分5个级别，对应的耐盐级别数字为1、3、5、7、9，相应的耐盐性等级依次为极强、强、中、弱、极弱。(表3)
[0089]
表3水稻品种芽期至苗期耐盐性评价标准
[0090]