CD127在制备检测再生障碍性贫血免疫异常标志物试剂盒中的应用的制作方法

cd127在制备检测再生障碍性贫血免疫异常标志物试剂盒中的应用
技术领域
1.技术领域本发明属于生物医学领域，特别涉及cd127在制备检测再生障碍性贫血免疫异常标志物试剂盒中的应用。


背景技术：

2.再生障碍性贫血(aplasticanemia,aa)是异常t细胞免疫介导的一种血液系统自身免疫性疾病，我国aa发病率远远高于欧美国家。尽管目前aa治疗取得明显进步，但难治、复发aa患者的治疗和免疫抑制治疗远期不良反应等问题，迫切需要研发新的免疫抑制治疗药物或者开展新的治疗措施以减缓aa病情进展、减轻临床症状和不良反应。
3.aa患者外周血t细胞绝对计数显著低于健康人，但是不同t细胞在aa的发病机制中发挥不同的作用，比如克隆性增殖cd8

t细胞对骨髓造血干/祖细胞的直接杀伤作用。同时，cd8

t细胞所分泌细胞因子如干扰素-γ(ifn-γ)，肿瘤坏死因子-α(tnf-α)等也可以影响骨髓造血功能。
4.随着研究手段的进步，对生理和病理情况下，高度异质性微小t细胞亚群功能特点认识的不断深入，分析和鉴别与aa发病、治疗和预后相关微小t细胞亚群的研究也逐渐展开。比如aa患者cd8

干细胞样记忆t细胞与ist疗效和预后都有一定关系。本课题组前期研究也发现aa患者中与病情程度相关的cd8

cd27

t细胞伴穿孔素升高的细胞毒杀伤表型。更有意思的是，我们前期研究还发现cd8

gitr

t细胞可能对aa患者异常活化t细胞功能发挥负性调控作用，这一结果说明并不是所有的cd8

t细胞都处于效应功能亢进状态而直接参与aa患者t细胞免疫发病机制。因此，筛选和鉴定与aa患者中不同t细胞微小亚群在疾病中的作用，并尝试靶向调控aa中致病t细胞微小亚群功能，将在今后aa潜在治疗靶点临床应用方面有很好的前景和价值。
5.终末效应t细胞(表型：cd45ro-cd27-)是一群处于t细胞活化阶段终末期的t细胞微小亚群，由于其所在t细胞活化进程中的特殊时间节点，该群细胞中发挥效应功能的t细胞比例远远较其他活化阶段t细胞高，因而拥有强大的效应功能。终末效应t细胞与一些自身免疫性疾病发病相关，我们前期研究发现aa患者终末效应t细胞比例和绝对数均显著低于健康人，且在重型再生障碍性贫血(severaplasticanemia，saa)和极重型再生障碍性贫血(veryseveraplasticanemia，vsaa)患者中更为明显。同时，aa患者cd4

终末效应t细胞中分泌ifn-γ水平显著升高，而cd8

终末效应t细胞中ifn-γ和tnf-α水平均显著升高，这说明aa患者cd8

终末效应t细胞处于过度活化状态较cd4

终末效应t细胞更为明显。因此，拥有强大效应功能的终末效应t细胞，尤其cd8

终末效应t细胞是一群在aa发病中起主导性致病作用的t细胞微小亚群。
6.目前，针对性调控与疾病发病相关细胞亚群的临床治疗治疗措施在许多疾病，尤其是自身免疫性疾病的患者中取得不错的效果，这也提示我们通过对与aa发病密切相关t细胞中微小细胞亚群作用和机制的深入解析，将为今后研发靶向调控致病相关微小t细胞
亚群特征性异常改变的药物、遏制致病相关微小t细胞亚群过度活化治疗措施的开展提供新的理论基础和思路，以期解决目前aa临床诊治中所需要解决的问题，突破ist治疗“无差别免疫抑制”的瓶颈。


技术实现要素：

7.本发明的首要目的克服现有技术的缺点与不足，提供cd127在制备检测再生障碍性贫血免疫异常标志物试剂盒中的应用。
8.本发明的另一目的在于提供一种检测再生障碍性贫血免疫异常标志物的试剂盒。
9.本发明的再一目的在于提供上述试剂盒的应用。
10.本发明的目的通过下列技术方案实现：cd127在制备检测再生障碍性贫血免疫异常标志物试剂盒中的应用，所述的cd127主要是cd8

cd45ro-cd27-t细胞中cd127

t细胞所占比例和cd127表达水平。本发明是基于本发明人首次发现aa患者外周血不同活化阶段的t细胞中仅cd8

cd45ro-cd27-t细胞中cd127

比例和cd127表达显著降低，而在其他不同活化阶段的cd8

t细胞亚群并不存在上述改变。鉴于cd127在cd8

cd45ro-cd27-t细胞特征性改变的特点和其在t细胞中的作用机制，及cd127在一些自身免疫性疾病中作为治疗靶点的研究，所做出的发明创造。
11.当所述的cd8

cd45ro-cd27-t细胞中所占比例的中位数低于14.30％，且cd127的表达水平(平均荧光强度)的中位数低于18.94，时候，提示aa患者cd8

cd45ro-cd27-t细胞免疫异常，且可通过靶向性调控cd8

cd45ro-cd27-t细胞中cd127

的比例和cd127表达水平，从而控制cd8

cd45ro-cd27-t细胞过度活化状态，具备潜在治疗靶点的应用前景和价值。
12.一种检测再生障碍性贫血cd8

终末效应t细胞免疫异常标志物的试剂盒，包括如下检测cd8

cd45ro-cd27-t细胞亚群的不同的荧光标记的单克隆抗体：抗cd8抗体、抗cd45ro抗体、抗cd27抗体和抗cd127抗体。
13.所述的抗cd8抗体的荧光标记优选为percp-cy5.5。
14.所述的抗cd45ro抗体的荧光标记优选为bv510。
15.所述的抗cd27抗体的荧光标记优选为pe-cy7。
16.所述的抗cd127抗体的荧光标记优选为pe。
17.所述的试剂盒还包括用于裂解外周血红细胞的红细胞裂解液、细胞染色缓冲液和磷酸盐缓冲溶液(pbs)。
18.上述试剂盒在非疾病诊断或治疗目的的检测cd8

cd45ro-cd27-t细胞亚群中cd127

t细胞比例和cd127表达水平中的应用，包括如下步骤：
19.(1)处理待检测外周血样本，形成单细胞悬液；
20.(2)在步骤(1)得到的单细胞悬液中加入标记不同荧光的单克隆抗体：抗cd8抗体、抗cd45ro抗体、抗cd27抗体和抗cd127抗体，轻轻混匀后避光孵育；
21.(3)洗涤细胞后加入细胞染色缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测，获得荧光标记后的cd8

cd45ro-cd27-t细胞亚群中cd127

t细胞比例和cd127表达水平的相关数据。
22.步骤(1)中所述的处理待检测外周血样本的步骤如下：将待测外周血样本依据常规方法进行全血红细胞裂解处理，离心去上清，洗涤，并用细胞染色缓冲液重悬得到单细胞悬液。
23.所述的待检测外周血样本的体积优选为200μl。
24.所述的全血红细胞裂解处理优选为采用红细胞裂解液处理；裂解期间吹打混匀一次。
25.所述的红细胞裂解液的用量优选为按其与所述的待检测外周血样本＝0.5～1.5:10(体积比)配比计算；更优选为与所述的待检测外周血样本＝1:10配比计算。
26.所述的离心的相对离心力优选为100～300g；更优选为200g。
27.所述的离心的时间优选为3～6min；更优选为5min。
28.所述的洗涤为使用磷酸盐缓冲溶液进行洗涤。
29.所述的磷酸盐缓冲溶液优选为ph值为7.2～7.4、浓度为0.01～0.1m的磷酸盐缓冲溶液；更优选为ph值为7.4、浓度为0.01m的磷酸盐缓冲溶液。
30.所述的细胞染色缓冲液的用量优选为按其与所述的待检测外周血样本＝体积比1：1.5～2.5配比计算；更优选为与所述的待检测外周血样本＝1:2配比计算。
31.步骤(2)中所述的抗cd8抗体的加入量优选按每100μl的单细胞悬液配比3～6μl抗cd8抗体计算；进一步优选为按每100μl单细胞悬液配比5μl抗cd8抗体计算。
32.所述的抗cd8抗体的荧光标记优选为percp-cy5.5；其浓度优选为200μg/ml。
33.步骤(2)中所述的抗cd45ro抗体的加入量优选按每100μl的单细胞悬液配比3～6μl抗cd45ro抗体计算；进一步优选为按每100μl单细胞悬液配比5μl抗cd45ro抗体计算。
34.所述的抗cd45ro抗体的荧光标记优选为bv510；其浓度优选为200μg/ml。
35.步骤(2)中所述的抗cd27抗体的加入量优选按每100μl的单细胞悬液配比3-6μl抗cd27抗体计算；进一步优选为按每100μl单细胞悬液配比5μl抗cd27抗体计算。
36.所述的抗cd27抗体的荧光标记优选为pe-cy7；其浓度优选为200μg/ml。
37.步骤(2)中所述的抗cd127抗体的加入量优选按每100μl的单细胞悬液配比3～6μl抗cd127抗体计算；进一步优选为按每100μl单细胞悬液配比5μl抗cd127抗体计算。
38.所述的抗cd127抗体的荧光标记优选为pe；其浓度优选为200μg/ml。
39.步骤(2)中所述的避光孵育的具体操作为室温避光孵育15～30分钟；优选为室温避光孵育20分钟。
40.所述的室温为5～35℃；优选为20～30℃；更优选为24～26℃。
41.步骤(3)中所述的洗涤是使用细胞染色缓冲液进行洗涤。
42.步骤(3)中所述的洗涤的条件优选为：200～400g的条件离心4～6min；更优选为300g的的条件离心5min。
43.步骤(3)中所述的pbs优选为ph值为7.2～7.4、浓度为0.01～0.1m的pbs；更优选为ph值为7.4、浓度为0.01m的pbs。
44.上述试剂盒在研究aa患者cd8

cd45ro-cd27-t细胞免疫异常的机理中的应用。
45.所述的应用具体包括如下步骤：对所述的cd127

t细胞在cd8

cd45ro-cd27-t细胞中的所占比例和表达水平进行统计学分析，当检测到cd127

t细胞在cd8

cd45ro-cd27-t细胞中的所占比例中位数低于14.30％时，且cd127表达水平低于18.94，表明再生障碍贫血患者cd8

cd45ro-cd27-t细胞免疫功能异常可能性较大，也可以作为今后临床靶向性调控与aa发病密切相关的cd8

cd45ro-cd27-t细胞免疫功能异常的潜在治疗靶点。
46.所述的统计学分析优选秩和检验分析。
47.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
48.1、目前有关aa中t细胞免疫发病机制研究表明cd8

t细胞不但可以直接攻击造血干/祖细胞，且cd8

t细胞所分泌的细胞因子也可以影响骨髓造血功能。近期，国外报道和我们有关t细胞在aa免疫发病机制的研究都说明不同t细胞微小亚群在aa中作用不同。同时，部分难治、复发aa患者以及免疫抑制剂治疗后所引起的副作用等问题都提示我们需要更为精准的辨析与aa发病密切相关t细胞微小亚群作用特点，并筛选和鉴定可以针对性的调控aa致病性t细胞微小亚群的免疫异常的潜在治疗靶点，这不仅为今后临床开展治疗aa新策略提供研究资料，也有很好的应用前景和价值。
49.2、本发明的发明人首次对aa患者中不同活化阶段t细胞亚群中所占比例情况这一研究空白进行了分析，并在此基础之上以cd8

终末效应t细胞为切入点，分析该群细胞免疫效应功能等变化特征以期提供更为准确的aa患者t细胞免疫异常的特点以及潜在治疗靶点。本研究结合aa患者临床资料，创新性的利用流式细胞术更为详尽的研究cd127

t细胞在aa患者外周血cd8

终末效应t细胞中所占比例和表达水平特点，不仅在国际上首次提供aa患者外周血cd8

cd45ro-cd27-t细胞中cd127特征性表达下降科学研究资料，也为临床上应用上述指标评判aa患者cd8

终末效应t细胞免疫异常的标志物和潜在治疗靶点提供了理论支撑。
50.3、本发明人首次发现aa患者外周血中cd127

t细胞在cd8

cd45ro-cd27-t细胞中的比例和表达水平显著降低。可以作为评估aa患者cd8

终末效应t细胞免疫异常的实验室相关检测指标之一。
51.4、本发明提供了cd127

t细胞在cd8

终末效应t细胞亚群中的检测方法，通过该检测方法可将cd127

t细胞比例和cd127表达水平在cd8

终末效应t细胞亚群进行定量统计。另外，也可以将cd127作为潜在治疗靶点对aa患者中功能亢进cd8

终末效应t细胞进行精准的靶向调控。因此，本发明在aa患者免疫异常的判定和潜在治疗靶点方面都具有非常广阔的应用前景。
附图说明
52.图1是健康对照组与aa患者的外周血cd127

t细胞cd8

cd45ro-cd27-t细胞中所占比例的流式细胞术结果分析图。
53.图2是健康对照组与aa患者外周血cd127

在cd8

t细胞不同活化阶段特点示意图；其中，a-d依次为健康对照组和aa患者cd127

在cd8

t细胞尚未活化阶段、早期活化阶段，晚期活化阶段和终末期活化阶段所占比例分析图，e-h：依次为健康对照组和aa患者cd127

在cd8

t细胞尚未活化阶段、早期活化阶段，晚期活化阶段和终末期活化阶段表达水平(平均荧光强度)分析图，右框中d和h分别是健康人和aa患者外周血cd127

在cd8

cd45ro-cd27-t细胞所占比例和表达水平均显著下降独特变化特点(*表示p《0.05)。
具体实施方式
54.下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
55.实例中所用试剂信息具体如下：
56.percp-cy5.5标记小鼠抗人cd8(克隆号：sk1，购自biolegend)；
57.bv510标记小鼠抗人cd45ro(克隆号：uchl1，购自bd pharmingen)
58.pe-cy7标记小鼠抗人cd27(克隆号：mt-271，购自bd pharmingen)；
59.pe标记小鼠抗人cd127(克隆号：a019d5，购自biolegend)；
60.细胞染色缓冲液(cell staining buffer，购自biolegend)；
61.红细胞裂解液(red cell lysing buffer，购自bd pharmingen)。
62.实施例1
63.(1)在与aa患者签署知情同意书的前提下采血，所有标本取自于清晨空腹静脉edta抗凝。收集19例aa患者的外周血样本，其中10例saa和9例vsaa。同时收集健康人样本19例，该部分研究方案已经获得本单位伦理委员会通过。同时收集aa患者的血红蛋白(hb)、血小板(plt)以及中性粒细胞绝对值(anc)等临床资料(如表1所示)。
64.表1 aa患者临床资料
[0065][0066]
(2)将收集的健康人和aa患者外周血，经红细胞裂解液进行裂红。每200μl外周血配比2ml红细胞裂解液，在室温裂解10min，裂解期间用吸管轻轻吹打混匀一次，然后以200g的转速离心5min，弃上清，加入1
×
pbs至2ml，以300g的转速离心洗涤，弃上清，加入100μl细胞染色缓冲液重悬形成单细胞悬液。
[0067]
(3)流式细胞术检测cd127

t细胞在cd8

cd45ro-cd27-t细胞亚群中的情况。
[0068]
3.1每例样本需准备1个流式管，每管均为步骤(2)方法中制得的单细胞悬液。
[0069]
3.2在待测管加入相应的表面分析荧光抗体各5μl，其中包括小鼠抗人percp-cy5.5-cd8、bv510-cd45ro、pe-cd127和pe-cy7-cd27抗体，轻轻混匀后，室温避光孵育20min。
[0070]
3.3加入细胞染色缓冲液以300g的转速洗涤细胞5min。
[0071]
3.4离心后去掉上清，用500μl细胞染色缓冲液重悬细胞后使用流式分析仪(bd verse，usa)分析获取数据，所得原始数据用flowjo software分析，将分析数据汇总后利用spss13.0计算各组数据中位数，并进行统计学分析。
[0072]
(4)分析结果显示，aa患者外周血中cd127

t细胞仅在cd8

cd45ro-cd27-t细胞中的比例(中位数为14.3％)显著低于健康对照组(中位数为20.7％，图1和图2)；之后利用软件进一步分析各组cd8

cd45ro-cd27-t细胞中cd127表达水平，结果提示aa患者外周血中只有cd8

cd45ro-cd27-t细胞中cd127表达水平(中位数为26.1)显著低于健康对照组(中位数为68.9)。因此，上述实验结果表明通过检测cd127

t细胞在cd8

cd45ro-cd27-t细胞中所占比例在辅助诊断和免疫异常标志物检测中有重要意义。
[0073]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。