一种氟雷拉纳中间体肟酸的反相高效液相色谱分析方法与流程

1.本发明属于药物分析检测技术领域，具体涉及一种氟雷拉纳中间体肟酸的反相高效液相色谱分析方法。


背景技术：

2.氟雷拉纳化学名为4-[5-(3，5-二氯苯基)]-4，5-二氢-5-三氟甲基-3-异噁唑基]-2-甲基-n-[2-氧代-2-[2.2.2-三氟乙基)氨基]]苯甲酰胺，是一种新型广谱性杀虫剂，是神经元中配体门控氯离子通道的有效抑制剂，对哺乳动物神经元和节肢动物神经元具有显著的选择性。氟雷拉纳的成功研发开创了一类全新的gaba门控氯离子通道干扰剂研究方向，与环戊二烯、类苯基吡唑类和大环内酯类等杀虫剂的作用靶标类似，对蜱目、蚤目、虱目、半翅目和双翅目等害虫具有良好的杀虫活性，其毒力高于或与常用杀虫剂相当，与其他同类杀虫剂相比，该药在分子结构、作用位点、选择性以及交互抗性等方面均有显著的差异，近年来，该药已被应用于犬、猫体外寄生虫病临床治疗。
[0003]
氟雷拉纳中间体肟酸的化学名为(4-(羟基亚氨基)甲基)-2-甲基苯甲酸，cas号：1437051-93-8分子式为c9h9no3，分子量为179.17。
[0004]
目前，未见该化合物及其杂质检测方法的相关专利文献报道，随着国内对该产品的研究深入，其生产过程中产生的杂质也逐渐被发现，为了加强该氟雷拉纳中间体肟酸及其中间体、杂质的质量控制，有必要提供一种灵敏、稳定、可靠的检测方法。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种氟雷拉纳中间体肟酸的反相高效液相色谱分析方法。
[0006]
本发明所采取的技术方案是：
[0007]
一种氟雷拉纳中间体肟酸的反相高效液相色谱分析方法，所述氟雷拉纳中间体肟酸为(4-(羟基亚氨基)甲基)-2-甲基苯甲酸，包括如下步骤：
[0008]
配制标准品溶液：使用乙腈水溶液溶解所述氟雷拉纳中间体肟酸标准品；
[0009]
配制待测样品溶液：使用乙腈水溶液溶解氟雷拉纳中间体肟酸待测样品；
[0010]
使用反向高效液相色谱测定标准品溶液和待测样品的色谱图，所述反向高效液相色谱的条件为：流动相由流动相a和流动相b组成，其中乙腈为流动相a、磷酸溶液为流动相b，磷酸的质量浓度为0.05％～0.15％，流动相a：流动相b进行梯度洗脱；
[0011]
根据标准品和待测样品的色谱图计算出待测样品的含量。
[0012]
在一些实例中，所述乙腈水溶液体积浓度为40％～80％。
[0013]
在一些实例中，所述反向高效液相色谱中流动相的流速为0.6～1ml/min。
[0014]
在一些实例中，所述反向高效液相色谱的色谱柱温为20℃～35℃。
[0015]
在一些实例中，所述反相高效液相色谱的色谱柱为c18色谱柱：4.6
×
250mm，5μm。
[0016]
在一些实例中，所述磷酸溶液中，磷酸的质量浓度为0.1％。
[0017]
在一些实例中，所述反相高效液相色谱的检测波长为200nm～210nm。
[0018]
在一些实例中，所述反向高效液相色谱的进样量为10μl～20μl。
[0019]
在一些实例中，所述氟雷拉纳中间体肟酸的浓度为0.3～1mg/ml。
[0020]
在一些实例中，梯度洗脱时间及流动相中乙腈的体积比顺序为：
[0021]
0～30min，10～20v/v％运行；优选20v/v％；
[0022]
30～31min，90～95v/v％运行；优选95v/v％；
[0023]
31～40min，10～20v/v％运行；优选20v/v％。
[0024]
在一些实例中，高效液相色谱分析方法包括如下步骤：
[0025]
配制标准品溶液：使用60v/v％的乙腈水溶液溶解所述氟雷拉纳中间体肟酸标准品；
[0026]
配制待测样品溶液：使用60v/v％的乙腈水溶液溶解氟雷拉纳中间体肟酸待测样品，待测样品的浓度为0.4mg/ml；
[0027]
使用反向高效液相色谱测定标准品溶液和待测样品的色谱图，所述反向高效液相色谱的条件为：色谱柱为c18色谱柱：4.6
×
250mm，5μm，柱温：25℃，进样量：15μl，检测波长205nm，流动相由流动相a和流动相b组成，其中流动相a为乙腈、流动相b为0.1wt％的磷酸溶液，流动相a：流动相b进行梯度洗脱，流速：0.8ml/min，梯度洗脱时间及流动相中乙腈的体积比顺序为：
[0028]
0～30min，20v/v％运行；
[0029]
30～31min，95v/v％运行；
[0030]
31～40min，20v/v％运行；
[0031]
根据标准品和待测样品的色谱图计算出待测样品的含量。
[0032]
本发明的有益效果是：
[0033]
本发明提供的氟雷拉纳中间体肟酸的高效液相分析方法，检测灵敏度高，稳定性高，可靠性高，理论塔板数高，同时操作相对简单优点，能够有效测出氟雷拉纳中间体肟酸料肟酸含量，有利于保证氟雷拉纳中间体肟酸原料药及制剂的质量。
附图说明
[0034]
图1为实施例1中氟雷拉纳中间体肟酸标准品溶液的色谱图；
[0035]
图2为实施例2中氟雷拉纳中间体肟酸标准品溶液的色谱图；
[0036]
图3为实施例4的线性关系图；
[0037]
图4为对比例1中氟雷拉纳中间体肟酸标准品溶液的色谱图；
[0038]
图5为对比例2中氟雷拉纳中间体肟酸标准品溶液的色谱图；
[0039]
图6为对比例3中氟雷拉纳中间体肟酸标准品溶液的色谱图；
[0040]
图7为对比例4中氟雷拉纳中间体肟酸标准品溶液的色谱图。
具体实施方式
[0041]
一种氟雷拉纳中间体肟酸的反相高效液相色谱分析方法，所述氟雷拉纳中间体肟酸为(4-(羟基亚氨基)甲基)-2-甲基苯甲酸，包括如下步骤：
[0042]
配制标准品溶液：使用乙腈水溶液溶解所述氟雷拉纳中间体肟酸标准品；
[0043]
配制待测样品溶液：使用乙腈水溶液溶解氟雷拉纳中间体肟酸待测样品；
[0044]
使用反向高效液相色谱测定标准品溶液和待测样品的色谱图，所述反向高效液相色谱的条件为：流动相由流动相a和流动相b组成，其中乙腈为流动相a、磷酸溶液为流动相b，磷酸的质量浓度为0.05％～0.15％，流动相a：流动相b进行梯度洗脱；
[0045]
根据标准品和待测样品的色谱图计算出待测样品的含量。
[0046]
在一些实例中，所述乙腈水溶液体积浓度为40％～80％。数据表明这一浓度的乙腈水溶液对样品有很好的溶解能力，也不会对后续的液相色谱产生不利影响。
[0047]
在一些实例中，所述反向高效液相色谱中流动相的流速为0.6～1ml/min。这种流速下可以更好地进行洗脱，得到更为准确的结果。
[0048]
在一些实例中，所述反向高效液相色谱中流动相的流速为0.8ml/min。数据表明这一流速下具有更佳的效果。
[0049]
在一些实例中，所述反向高效液相色谱的色谱柱温为20℃～35℃。在这一范围内都可以得到比较准确的检测结果。特别的，柱温控制在25℃更有利于得到准确的结果。
[0050]
在一些实例中，所述反相高效液相色谱的色谱柱为c18色谱柱：4.6
×
250mm，5μm。
[0051]
在一些实例中，所述磷酸溶液中，磷酸的质量浓度为0.1％。
[0052]
在一些实例中，所述反相高效液相色谱的检测波长为200nm～210nm。
[0053]
在一些实例中，所述反向高效液相色谱的进样量为10μl～20μl。
[0054]
在一些实例中，所述氟雷拉纳中间体肟酸的浓度为0.3～1mg/ml。
[0055]
在一些实例中，梯度洗脱时间及流动相中乙腈的体积比顺序为：
[0056]
0～30min，10～20v/v％运行；优选20v/v％；
[0057]
30～31min，90～95v/v％运行；优选95v/v％；
[0058]
31～40min，10～20v/v％运行；优选20v/v％。
[0059]
在一些实例中，高效液相色谱分析方法包括如下步骤：
[0060]
配制标准品溶液：使用60v/v％的乙腈水溶液溶解所述氟雷拉纳中间体肟酸标准品；
[0061]
配制待测样品溶液：使用60v/v％的乙腈水溶液溶解氟雷拉纳中间体肟酸待测样品，待测样品的浓度为0.4mg/ml；
[0062]
使用反向高效液相色谱测定标准品溶液和待测样品的色谱图，所述反向高效液相色谱的条件为：色谱柱为c18色谱柱：4.6
×
250mm，5μm，柱温：25℃，进样量：15μl，检测波长200nm～210nm，流动相由流动相a和流动相b组成，其中流动相a为乙腈、流动相b为0.1wt％的磷酸溶液，流动相a：流动相b进行梯度洗脱，流速：0.8ml/min，梯度洗脱时间及流动相中乙腈的体积比顺序为：
[0063]
0～30min，20v/v％运行；
[0064]
30～31min，95v/v％运行；
[0065]
31～40min，20v/v％运行；
[0066]
根据标准品和待测样品的色谱图计算出待测样品的含量。
[0067]
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工
艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
[0068]
以下各实施例、对比例和各试验中采用的试剂中，乙腈为国外进口hplc级别，品牌为fisher，水为纯化水，以减少基线噪音，采用的高效液相色谱仪为agilent1260
‑ⅱ
。
[0069]
实施例1：氟雷拉纳中间体肟酸的反相高效液相色谱分析方法：
[0070]
标准品溶液的制备：称取氟雷拉纳中间体肟酸约10mg，精密称定于25ml容量瓶中，加适量体积浓度为60％乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，混匀，得氟雷拉纳中间体肟酸浓度为0.4mg/ml。
[0071]
色谱测定条件：
[0072]
色谱柱：c18，规格4.6
×
250mm，5μm；
[0073]
流动相：a：乙腈，b：0.1％磷酸溶液；
[0074]
流速：0.8ml/min；
[0075]
柱温：25℃；
[0076]
进样量：15μl；
[0077]
检测波长：205nm；
[0078]
梯度洗脱程序：
[0079]
当时间为0.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0080]
当时间为30.0min时，流动相中a的体积分数为95％，b的体积分数为5％；
[0081]
当时间为31.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0082]
当时间为40.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0083]
在实施例1色谱条件下，标准品溶液的检测色谱图如图1所示。
[0084]
从图1可以看出，氟雷拉纳中间体肟酸料肟酸保留时间为12.56min，峰形良好，峰纯度高(≥98.0％)。
[0085]
实施例2：氟雷拉纳中间体肟酸含量测定的系统适应性试验
[0086]
标准品溶液的制备：称取氟雷拉纳中间体肟酸10.2mg，精密称定与25ml容量瓶中，加适量体积浓度为60％乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，混匀，得氟雷拉纳中间体肟酸浓度为0.408mg/ml。
[0087]
色谱测定条件：
[0088]
色谱柱：c18，规格4.6
×
250mm，5μm；
[0089]
流动相：a：乙腈，b：0.1％磷酸溶液；
[0090]
流速：0.8ml/min；
[0091]
柱温：25℃；
[0092]
进样量：15μl；
[0093]
检测波长：205nm；
[0094]
梯度洗脱程序：
[0095]
当时间为0.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0096]
当时间为30.0min时，流动相中a的体积分数为95％，b的体积分数为5％；
[0097]
当时间为31.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0098]
当时间为40.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0099]
取标准品溶液，重复进样6次，试验结果如表1所示：
[0100]
表1、系统适应性试验结果
[0101][0102]
从表1可以看出，重复进同一氟雷拉纳中间体肟酸样品溶液6次，氟雷拉纳中间体肟酸峰面积rsd为0.12％，符合rsd≤2.0％的规定，说明本发明的方法系统适应性良好，试验可信度高。
[0103]
实施例3
[0104]
氟雷拉纳中间体肟酸的重复性考察
[0105]
(1)标准对照品的配制：称取氟雷拉纳中间体肟酸10mg，精密称定与25ml容量瓶中，加入稀释剂溶解并稀释至刻度，混匀，作为标准对照品溶液。
[0106]
(2)供试品的配制：分别称取氟雷拉纳中间体肟酸原料药样品6份：(10.2mg，10.3mg，10.1mg，10.33mg，10.21mg，10.36mg)，各精密称定于25ml容量瓶中，用体积浓度为60％乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，混匀，获得不同质量浓度的氟雷拉纳中间体肟酸溶液，分别依次对应编号1～6号标准品溶液：0.408mg/ml，0.412mg/ml，0.404mg/ml，0.413mg/ml，0.408mg/ml，0.414mg/ml。
[0107]
色谱测定条件：
[0108]
色谱柱：c18，规格4.6
×
250mm，5μm；
[0109]
流动相：a：乙腈，b：0.1％磷酸溶液；
[0110]
流速：0.8ml/min；
[0111]
柱温：25℃；
[0112]
进样量：15μl；
[0113]
检测波长：205nm；
[0114]
梯度洗脱程序：
[0115]
当时间为0.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0116]
当时间为30.0min时，流动相中a的体积分数为95％，b的体积分数为5％；
[0117]
当时间为31.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0118]
当时间为40.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0119]
取1～6号不同质量浓度的标准品溶液分别进样，测得各标准品溶液的含量如表2所示：
[0120]
表2、重复性试验结果
[0121][0122]
从表2可以看出，样品中氟雷拉纳中间体肟酸平均含量为98.39％，氟雷拉纳中间体肟酸含量rsd％为0.26％，符合含量在98.0％～102.0％之间，rsd％不大于2.0％的规定，说明本发明的方法重现性良好。
[0123]
实施例4
[0124]
氟雷拉纳中间体肟酸的线性关系考察
[0125]
标准品溶液的制备：分别按照样品体积浓度20％，50％，80％，100％，120％，五个浓度，称取氟雷拉纳中间体肟酸样品5份：21.48mg，54.39mg，86.68mg，108.72mg，130.25mg，精密称定于100ml容量瓶中，加入适量体积浓度为60％乙腈水溶液并稀释至刻度，混匀，获得不同质量浓度的氟雷拉纳中间体肟酸溶液，分别依次对应编号7～11号标准品溶液：0.2148mg/ml，0.5439mg/ml，0.8668mg/ml，1.0872mg/ml，1.3025mg/ml。
[0126]
色谱测定条件：
[0127]
色谱柱：c18，规格4.6
×
250mm，5μm；
[0128]
流动相：a：乙腈，b：0.1％磷酸水；
[0129]
流速：0.8ml/min；
[0130]
柱温：25℃；
[0131]
进样量：15μl；
[0132]
检测波长：205nm；
[0133]
梯度洗脱程序：
[0134]
当时间为0.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0135]
当时间为30.0min时，流动相中a的体积分数为95％，b的体积分数为5％；
[0136]
当时间为31.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0137]
当时间为40.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0138]
取7～11号不同质量浓度的标准品溶液分别进样，测得各标准品的溶液峰面积与标准浓度如表3所示：
[0139]
表3、线性试验结果
[0140]
编号峰面积标准浓度(mg/ml)74292.4340.0804810564.0550.2010916569.2690.32161020499.7890.4020
1124217.0880.4824
[0141]
从表3可以看出，以氟雷拉纳中间体肟酸的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归。氟雷拉纳中间体肟酸在0.0804～0.4824mg/ml进样浓度范围内，线性回归方程为y＝49641x 426.86，线性回归系数r2为0.9996，符合规定r2≥0.998，说明本发明的方法线性良好，其线性关系图如图3所示。
[0142]
对比例1～5中，标准品溶液均与实施例1中标准品溶液一致。
[0143]
对比例1
[0144]
对比例1的检测步骤同实施例1，不同之处在于其色谱测定条件为：
[0145]
色谱柱：c18，规格4.6
×
250mm，5μm；
[0146]
流动相：a：乙腈，b：0.1％磷酸溶液；
[0147]
流速：1.2ml/min；
[0148]
柱温：25℃；
[0149]
进样量：15μl
[0150]
检测波长：205nm；
[0151]
梯度洗脱程序：
[0152]
当时间为0.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0153]
当时间为30.0min时，流动相中a的体积分数为95％，b的体积分数为5％；
[0154]
当时间为31.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0155]
当时间为40.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0156]
对比例1的检测结果为：如图4所示，相邻峰的分离度小于1.5，导致氟雷拉纳中间体肟酸与杂质不能进行有效分离，无法对氟雷拉纳中间体肟酸的含量进行准确检测。
[0157]
对比例2
[0158]
对比例2的检测步骤同实施例1，不同之处在于其色谱测定条件为：
[0159]
色谱柱：c18，规格4.6
×
250mm，5μm；
[0160]
流动相：a：乙腈，b：水；
[0161]
流速：0.8ml/min；
[0162]
柱温：25℃；
[0163]
进样量：15μl；
[0164]
检测波长：205nm；
[0165]
梯度洗脱程序：
[0166]
当时间为0.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0167]
当时间为30.0min时，流动相中a的体积分数为95％，b的体积分数为5％；
[0168]
当时间为31.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0169]
当时间为40.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0170]
对比例2的检测结果为：如图5所示，主峰及部分杂质峰峰形较差，基线漂移明显，无法对氟雷拉纳中间体肟酸的含量进行准确检测。
[0171]
对比例3
[0172]
对比例3的检测步骤同实施例1，不同之处在于其色谱测定条件为：
[0173]
色谱柱：c18，规格4.6
×
250mm，5μm；
[0174]
流动相：a：乙腈，b：0.1％甲酸；
[0175]
流速：0.8ml/min；
[0176]
柱温：25℃；
[0177]
进样量：15μl；
[0178]
检测波长：205nm；
[0179]
梯度洗脱程序：
[0180]
当时间为0.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0181]
当时间为30.0min时，流动相中a的体积分数为95％，b的体积分数为5％；
[0182]
当时间为31.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0183]
当时间为40.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0184]
对比例3的检测结果为：如图6所示，主峰及部分杂质峰峰形较差，基线漂移明显，主峰分裂，无法对氟雷拉纳中间体肟酸的含量进行准确检测。
[0185]
对比例4
[0186]
对比例4的检测步骤同实施例1，不同之处在于其色谱测定条件为：
[0187]
色谱柱：c18，规格4.6
×
250mm，5μm；
[0188]
流动相：a：乙腈，b：0.1％三乙胺；
[0189]
流速：0.8ml/min；
[0190]
柱温：25℃；
[0191]
进样量：15μl；
[0192]
检测波长：205nm；
[0193]
梯度洗脱程序：
[0194]
当时间为0.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0195]
当时间为30.0min时，流动相中a的体积分数为95％，b的体积分数为5％；
[0196]
当时间为31.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0197]
当时间为40.0min时，流动相中a的体积分数为20％，b的体积分数为80％；
[0198]
对比例4的检测结果为：如图7所示，基线漂移明显，且未检测出氟雷拉纳中间体肟酸主峰及杂质峰，无法对氟雷拉纳中间体肟酸的含量进行准确检测。
[0199]
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。