一种水溶性超薄氮化碳二维纳米片、其制备方法及其应用与流程

nm；所述纳米片具有水溶性且具有细胞内吞作用；所述纳米片可有效负载dna与其形成纳米颗粒。
9.本发明的实施例提供一种水溶性超薄氮化碳二维纳米片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在氮气保护气氛下对含氮前驱体进行煅烧，得到初始块状氮化碳；（2）将步骤（1）所得到的块状氮化碳置于 98% 浓硫酸和 68% 浓硝酸的混酸溶液中反应，得到多孔氮化碳；（3）将步骤（2）的多孔氮化碳在水中超声剥离，离心后取上层清液，得到水溶性超薄氮化碳二维纳米片。
10.进一步的，所述步骤（1）中制备初始块状氮化碳具体包括：在氮气或氩气条件下，将含氮前驱体为三聚氰胺，在管式炉中，煅烧的温度为500℃～550℃；煅烧1～3 h；升温速度为2～8℃/min，得到初始块状氮化碳。
11.进一步的，所述步骤（2）中制备多孔氮化碳具体包括：将得到的初始块状氮化碳在40 ml的 98% 浓硫酸和 68% 浓硝酸的混酸溶液中搅拌反应2 h，其中浓硫酸和浓硝酸的比例为1:1。反应结束后收集过滤白色絮状物，得到多孔氮化碳。
12.进一步的，所述步骤（3）中制备水溶性超薄氮化碳二维纳米片具体包括：将步骤（2）所得到的多孔氮化碳分散在100 ml的超纯水中，超声6～14 h，优选12 h。
13.进一步的，所述步骤（3）中，离心转速为3000～7000 rpm，离心时长为30 min。
14.本发明上述方法制得的水溶性超薄氮化碳二维纳米片也在保护范围之内。本发明的所述步骤（3）所得的氮化碳为水溶性超薄二维纳米片状结构为纳米片状，纳米片尺寸为100-170 nm，厚度为20-50 nm。
15.本发明的实施例还提供一种水溶性超薄氮化碳二维纳米片作为非病毒基因载体在基因治疗中的应用。
16.本发明的实施例还提供一种水溶性超薄氮化碳二维纳米片作为光敏剂在光动力治疗中的应用。
17.本发明的实施例还提供一种水溶性超薄氮化碳二维纳米片在肿瘤基因及光动力联合治疗中的应用。
18.本发明的实施例还提供一种水溶性超薄氮化碳二维纳米片作为dna标记物的应用。
19.本发明至少包括以下有益效果：1、本发明构建了一种水溶性超薄氮化碳二维纳米片，其自身的毒性小，易于在生物医学领域的应用，可以对光进行刺激响应，在光照条件下，能够产生活性氧，促使该复合物溶酶体逃逸，并实现光动力治疗。
20.2、本发明的纳米片可以有效地负载dna，与其形成纳米颗粒。
21.3、本发明的纳米片与dna自组装后的二元复合物能够进入细胞核，实现基因转染，并且在负载p53基因后，能够实现基因治疗。
22.4、本发明的纳米片可以实现肿瘤的基因及光动力联合治疗，具有实际应用的潜力。
23.5、本发明的纳米片可以对基因转染的过程荧光成像并实时示踪，有利于研究转染
机理，为新型基因载体的研发奠定基础。
24.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
25.附图说明
26.图1为本发明纳米片的x射线衍射（xrd）图谱。
27.图2本发明纳米片的透射电镜（tem）图片。
28.图3为本发明纳米片的原子力显微镜（afm）图谱。
29.图4 为本发明纳米片在400 nm波长光照不同时间条件下的细胞存活率。
30.图5 为本发明纳米片对puc 18 dna的琼脂糖凝胶阻滞实验图。
31.图6 为本发明纳米片对egfp基因的绿色荧光蛋白转染表达共聚焦图。
32.图7 为本发明纳米片负载p53基因在非光照和光照条件下的细胞存活率。
33.图8 为本发明纳米片在非光照和光照条件下与溶酶体探针的共定位图片。
34.图9 为在不同时间段，细胞摄取本发明阳纳米片与fam-dna复合物的共聚焦图。
35.具体实施方式
36.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
37.应当理解，本发明所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
38.《实施例1》一种水溶性超薄氮化碳二维纳米片，以氮化碳为载体，进一步将氮化碳构建成为水溶超薄二维纳米片。
39.上述本实施例的水溶性超薄氮化碳二维纳米片的制备方法，包括以下步骤：（1）将5 g三聚氰胺置于坩埚中，盖好坩埚盖，在氮气保护下放入管式炉中煅烧，控制管式炉的升温速率为5℃/min，在550℃下保持2 h，煅烧产物经冷却研磨后，得到块状氮化碳。
40.（2）将1 g块状氮化碳加入到40 ml的98%浓硫酸和68%浓硝酸的混酸溶液中搅拌反应2 h，其中浓硫酸和浓硝酸的比例为1:1。反应结束后收集过滤白色絮状物，得到多孔氮化碳。
41.（3）将100 mg多孔氮化碳分散在100 ml的超纯水中，超声12 h，离心后取上层清液，得到水溶性超薄氮化碳二维纳米片。
42.如图1所示，所有样品均包含氮化碳的特征峰（002），说明所有样品的主体均为氮化碳，没有多余的杂质。
43.从图2和图3可以看出，本发明所制备的氮化碳纳米片具有典型的热聚合物的形貌，呈现片状结构。本发明所制备的氮化碳纳米片同时具备超薄的片状结构，说明成功制备了水溶性超薄氮化碳二维纳米片。
44.《实施例2》配制50 μg/ml的超薄氮化碳纳米片的溶液，将其与hela细胞共孵育培养12 h后分别用400 nm 波长的led光源（450 mw/cm2）照射不同的时长，没有光照的作为对照。然后更换培养基，再孵育12 h，将 20 μl mtt 溶液 (5 mg/ml) 添加到细胞中。孵育 4 小时后，将培养基更换为 200 μl dmso。 在bio tech synergy h4中以570 nm的波长测量所得溶液，得到细胞活性。
45.图4是本发明氮化碳纳米片在光照条件下，hela细胞的存活率；由图4可见，氮化碳纳米片在光照条件下，随着时间的增加，hela细胞的存活率越来越低。本发明所制备的氮化碳纳米片在光照条件下，可以促进癌细胞凋亡。由实施例2可以得出，本发明制备的水溶性超薄氮化碳纳米片具有光动力治疗的效果。
46.《实施例3》将不同浓度的氮化碳纳米片和puc18质粒dna（9 μg/ml）置于37
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c水浴中，孵育1 h，然后进行dna琼脂糖凝胶阻滞实验得到不同浓度化合物对puc18 dna的凝胶阻滞结果。
47.图5是本发明氮化碳纳米片对puc18 dna的琼脂糖凝胶阻滞实验结果；图5中上标注的数值为测试浓度（μg/ml）；由图5可见，本发明所制备的氮化碳纳米片可在较低浓度下完全阻滞dna在琼脂糖中迁移。由实施例3可以得出，本发明制备的水溶性超薄氮化碳纳米片可以有效凝聚dna形成纳米颗粒，可以作为非病毒基因载体。
48.《实施例4》将50 μg/ml的氮化碳纳米片与egfp-dna孵育30 min后，将其加入到hela细胞中进一步培养，然后对复合用400 nm波长的led光照5 min，以未被光照的及商业转染试剂lipofectamine 2000为对照组。最后，将培养基吸出，加入含有fbs的完全培养基孵育24 h，通过激光共聚焦显微镜进行拍照。
49.图6为氮化碳纳米片 光照情况、氮化碳纳米片 未光照情况及商业转染试剂lipofectamine 2000对egfp的表达影响情况；由图6可见，本发明制备的水溶性超薄氮化碳纳米片可以有效的进行基因转染，并且适当时长的光照有利于促进基因转染。
50.《实施例5》将氮化碳纳米片与p53基因孵育0.5 h后，加入hela细胞中培养4 h，用400 nm波长的led光照20 min后培养24 h，按照实施例2的方法，通过mtt实验测试细胞的存活率，未光照组为对照。
51.图7是氮化碳纳米片负载p53基因在光照条件下对hela细胞的凋亡效果图。由图7及该实施例5可以得出，氮化碳纳米片能够对癌细胞进行基因及光动力联合治疗。
52.《实施例6》将氮化碳纳米片与未荧光标记的dna孵育30 min后，将其和溶酶体染料lysotracker加入hela细胞中培养30 min，用400 nm波长的led光照5 min，未光照组为对照。然后吸出培养基，用pbs洗3-5次，通过激光共聚焦显微镜进行成像，观察溶酶体逃逸情况。
53.图8是将氮化碳纳米片凝聚未荧光标记的dna加入到hela细胞中，进行溶酶体逃逸实验。由图8可以得出，在光照后加速了载体的溶酶体逃逸。
54.《实施例7》
将氮化碳纳米片与fam-dna孵育30 min后，加入hela细胞培养不同时间，吸出培养基，用pbs洗3-5次，通过激光共聚焦显微镜进行拍照，对基因转染过程进行示踪。
55.图9是将氮化碳纳米片凝聚fam-dna与hela细胞孵育，获取不同时长的细胞成像图。由实施例7可以得出，本发明可以实时追踪基因递送的过程，并且1 h可以将dna递送至细胞核。
56.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。