一种部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数数据库的构建及应用的制作方法

1.本发明涉及单糖衍生物保留指数分析数据库的构建及其应用，尤其涉及单糖部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数数据库及其构建方法和在中药糖苷类化合物甲基化分析等方面的应用，属于中药糖苷类化合物甲基化分析领域。


背景技术：

2.气相色谱-质谱法(gc-ms)是气相色谱领域应用最广泛的方法，是将gc的高分离能力与ei-ms的高鉴别能力应用于复杂体系未知化合物的鉴定，在中药糖苷类化合物糖残基连接位置和顺序的分析中具有重要的作用。目前，对于中药糖苷类化合物糖苷键连接位点的研究主要依赖于甲基化阿尔迪醇乙酰化衍生化方法，但对称性衍生物的裂解规律不明显，难以对标准物质缺失的化合物进行定性分析。


技术实现要素：

3.本发明的目的之一是提供一种部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数分析数据库及其构建方法：
4.本发明的目的之二是将构建的部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数数据库应用于同种单糖或异构单糖的同分异构体鉴别、苷类化合物甲基化分析以及中药多糖甲基化分析等方面。
5.为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：
6.本发明一方面提供了单糖部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数分析数据库，其构建方法包括：
7.(1)将各种不同中性单糖制备成部分甲基化糖腈乙酸酯(pman)衍生物；
8.(2)采用气质联用仪和毛细管柱梯度分离不同苷键连接的部分甲基化糖腈乙酸酯衍生物；
9.(3)依据部分甲基化糖腈乙酸酯衍生物的裂解规律并完善ei-ms数据库，对分离的化合物进行了结构确证；
10.(4)根据程序升温保留指数的计算公式计算保留指数，建立包含不同苷键连接类型的部分甲基化糖腈乙酸酯衍生物的分析数据库。
11.作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(1)中所述的部分甲基化糖腈乙酸酯(pman)衍生物的制备方法包括：将各种中性单糖依次进行盐酸甲醇解、部分甲基化、水解、还原和乙酰化处理得到中性单糖的部分甲基化糖腈乙酸酯(pman)衍生物。
12.作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的单糖包括但不限于葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖或岩藻糖中的任何一种。
13.作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述的采用气质联用仪梯度分离不同单糖的方法包括：采用agilent 7890a-5975c气质联用仪，采用毛细管柱，氦气作载气，进样口温度250℃，柱流速1.2ml/min；ei70 ev，接口温度250℃，离子源温度230℃，扫描
范围:m/z50-550，扫描率：2.5scan/s；洗脱梯度的参数可以采用以下2种方式的任何一种：(1)柱温130℃，平衡1min，以5℃/min至230℃平衡2min，以10℃/min至280℃平衡2min；(2)柱温100℃，平衡2min，以8℃/min至150℃平衡2min，以3℃/min至240℃平衡2min。
14.作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的毛细管柱包括但不限于下述毛细管柱中的任何一种：db-5ms，其规格为60m
×
0.25mm
×
0.25μm；db-1701，其规格为60m
×
0.25mm
×
0.25μm；db-225ms，其规格为60m
×
0.25mm
×
0.25μm；db-210，其规格为30m
×
0.25mm
×
0.25μm。
15.步骤(3)中所述完善ei-ms数据库的方法包括：，步骤(2)中所述的采用气质联用仪梯度分离不同单糖部分甲基化糖腈乙酸酯衍生物，通过总结其裂解规律，阐释不同单糖部分甲基化糖腈乙酸酯衍生物的化学结构，明确其ei-ms质谱信息用作各种商品化气相色谱质谱数据库的补充。
16.作为本发明一种优选的具体实施方案，步骤(4)中所述程序升温保留指数的计算公式如下：
17.ri＝100z 100[t
r(x)-t
r(z)
]/[t
r(z 1)-t
r(z)
]；式中，tr代表保留时间，x表示待分析的化合物，z和z 1分别表示正构烷烃的碳原子数，且t
r(z)
《t
r(x)
《t
r(z 1)
。
[0018]
应用本发明构建的部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数数据库能够解决的主要问题包括：
[0019]
①
同一种类单糖不同的连接方式，仅依据质谱数据库不能定性析的问题；
②
异构的单糖之间具有相同的连接方式不能鉴别的问题；
③
现阶段研究关于多糖甲基化分析糖残基连接归属，存在诸多错误的问题；
④
该方法已经应用于木耳多糖、猴头多糖、川芎多糖、桔梗多糖、香菇多糖以及其它小分子糖苷类化合物的甲基化分析。
[0020]
因此，本发明的另一方面是将构建的部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数数据库应用于同种单糖或异构单糖的同分异构体鉴别、苷类化合物甲基化分析以及中药多糖甲基化分析等方面，具体包括；：
[0021]
(ⅰ)应用本发明构建的部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数数据库鉴别同种单糖同分异构体，包括：(1)获得同种类糖不同甲基化位点得到衍生物质谱图，完善单糖不同苷键连接类型的pman衍生物的ei-ms数据库信息；(2)根据线性程序升温条件下的保留指数计算公式，计算出保留指数；(3)根据保留指数辅助质谱信息对同种单糖的同分异构体进行鉴别。
[0022]
(ⅱ)应用本发明构建的部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数数据库鉴别异构单糖的同分异构体，包括：根据线性程序升温条件下的保留指数计算公式计算出保留指数；根据保留指数的差异对于异构单糖的同分异构体进行鉴别。
[0023]
(ⅲ)应用本发明构建的部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数数据库对多种苷类化合物中单糖的连接方式进行分析鉴别，包括：(1)实际测定皂苷化合物的保留指数；(2)将实际测定皂苷化合物的保留指数和本发明构建的部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数进行比较，对苷类化合物中单糖的苷连接方式进行鉴别；作为一种优选的实施方案，所述的苷类化合物包括但不限于桔梗皂苷、松果菊苷、金石蚕甘、巴豆苷、桔梗皂苷d、人参皂苷rc或金丝桃苷中的任何一种。
[0024]
(ⅳ)应用本发明构建的部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数数据库应用于中药多糖甲基化的分析，包括：(1)对中药多糖色谱峰对应的质谱图进行分析，通过对比nist数据库
检索质谱图初步确定可能的结构，并进一步完善单糖不同苷键连接类型的pman衍生物的ei-ms数据库信息；(2)通过比较各个异构体实测的保留指数和本发明构建的部分甲基化糖腈乙酸酯保留指数数据库中保留指数，对多糖甲基化的结构进行准确鉴别。
[0025]
本发明采用气质的分离技术对不同苷键连接类型pman衍生物进行分离，结合衍生物的裂解规律和ei-ms数据库检索，对化合物进行了结构的确证，计算其保留指数，完善单糖不同苷键连接类型的pman衍生物的ei-ms数据库信息，建立包含不同苷键连接类型的pman衍生物保留指数的分析数据库，能够提高定性分析的准确性，可以解决标准标准物质缺失的问题。
[0026]
中药多糖分析中，首先通过谱库搜索方法确定一组备选答案，在与本发明提供的标准保留指数进行对比，对备选结构进行筛选或排除，在一定程度上降低了甲基化分析中质谱信息较为相似的化合物分析的难度，同时，被鉴定的峰不仅与定性化合物物有高度相似的质谱信息，同时也有高度相似的保留指数。
[0027]
据文献报道，糖腈衍生化作为传统的衍生化方法，其衍生物结构具有非对称性，裂解规律明显，本发明以部分甲基化糖腈衍生化为基础，通过衍生物的ei-ms裂解规律和ei-ms数据库检索对衍生物定性分析，引进保留指数鉴别参数，对中药糖苷类化合物中糖苷键连接位置和顺序进行综合定性鉴定。本发明所构建的糖苷键连接分析的保留指数数据库在中药糖苷类化合物连接位置和顺序分析方面具有广阔的应用前景，能够应用于木耳多糖、猴头多糖、川芎多糖、桔梗多糖、香菇多糖、人参皂苷rc的甲基化分析，在同种单糖、异构体单糖和对称性单糖的鉴别上相比现有的鉴别方法具有显著的优势。
[0028]
本发明涉及的术语定义
[0029]
保留指数(retention index,ri)，又称科瓦茨指数(kovats index,ki)，它表示物质在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际上公认的定性分析法，为色谱定性分析的一个重要参数。在化合物的定性过程中主要采用程序升温保留指数，尤其对于沸点范围较宽的复杂组分混合物的分析，一般采用该方法。
附图说明
[0030]
图1各种单糖衍生物ei-ms总离子流图以及正构烷烃同色谱条件ei-ms总离子流图；(a)自制葡萄糖衍生物ei-ms总离子流图；(b)自制阿拉伯糖衍生物ei-ms总离子流图；(c)自制岩藻糖衍生物ei-ms总离子流图；(d)正构烷烃同色谱条件ei-ms总离子流图。
[0031]
图2单糖衍生物的质谱图；(a)：2,4-di-o-methyl-3,5,6-tri-o-acetyl-1-cyano-glucitol质谱图；(b)：2,3-di-o-methyl-4,5,6-tri-o-acetyl-1-cyano-glucitol质谱图。
[0032]
图3不同种类单糖相同苷键连接类型立体异构体质谱图；(a)：4-o-methyl-2,3,5,6-tetra-o-acetyl-1-cyano-glucitol质谱图；(b)：4-o-methyl-2,3,5,6-tetra-o-acetyl-1-cyano-galactitol质谱图；(c)：4-o-methyl-2,3,5,6-tetra-o-acetyl-1-cyano-mannitol质谱图。
[0033]
图4人参皂苷rc的ei-ms总离子流图。
[0034]
图5人参皂苷rc中峰1(a)、峰2(b)、峰3(c)和峰4(d)的质谱图。
[0035]
图6木耳多糖的ei-ms总离子流图。
[0036]
图7木耳多糖中峰1(a)和峰2(b)的质谱图。
[0037]
图8
→
3)-glcp(1
→
(a)、
→
3)-galp(1
→
(b)和
→
3)-manp(1
→
(c)的质谱图。
具体实施方式
[0038]
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0039]
实施例1单糖部分甲基化糖腈乙酰化保留指数数据库的构建
[0040]
1.仪器与试剂
[0041]
ei-ms 5975c(agilent公司，美国)；连接一个db-1701色谱柱(60m,0.25
×
0.25μm)。ml104/02型电子分析天平(梅特勒托利多仪器上海有限公司)；vortex 3000型涡旋震荡仪(wiggens公司，德国)；mikro 200r型离心机(scilogex公司，美国)，kq-500db型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。碘甲烷(郑州阿尔法化工有限公司)；氧化钡(盖德有限公司)；n，n-二甲基甲酰胺(天津市富宇精细化工有限公司)；氢氧化钡(天津市天力化学试剂有限公司)；盐酸羟胺(天津奥普升化工有限公司)。
[0042]
2.试验方法与试验结果
[0043]
本实施例以葡萄糖、阿拉伯糖和岩藻糖为例，通过盐酸甲醇解
→
部分甲基化
→
水解
→
还原
→
乙酰化合成葡萄糖、阿拉伯糖和岩藻糖的系列衍生物，在agilent 7890a-5975c气质联用仪和db-1701毛细管柱(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)的基础上，对不同单糖衍生物进行分离，升温程序为柱温130℃，平衡1min，以5℃/min至230℃平衡2min，以10℃/min至280℃平衡2min，氦气作载气，进样口温度250℃，柱流速1.2ml/min；ei 70ev，接口温度250℃，离子源温度230℃，扫描范围:m/z 50-550，扫描率：2.5scan/s。
[0044]
图1a在agilent 7890a-5975c气质联用仪的基础上，使用db-1701气相色谱柱检测的自制葡萄糖衍生物ei-ms总离子流图，图1b为使用db-1701气相色谱柱检测的自制阿拉伯糖衍生物ei-ms总离子流图，图1c为使用db-1701气相色谱柱检测的自制岩藻糖衍生物ei-ms总离子流图，图1d c
14-c
23
正构烷烃同色谱条件ei-ms总离子流图，依据保留指数计算公式计算保留指数，构建不同苷键连接类型的糖腈乙酰化衍生物保留指数数据库。如表1所示，以其中的五碳醛糖(ara)为例，建立了单糖保留指数分析数据库。
[0045]
[0046][0047]
试验例1单糖部分甲基化糖腈乙酰化保留指数分析数据库在同分异构体鉴别中的应用
[0048]
1.同种单糖的异构体的鉴别
[0049]
本发明在实施例1的基础上，对于同种类糖不同甲基化位点得到衍生物质谱图如图2所示，两个衍生物分别为2,4-di-o-methyl-3,5,6-tri-o-acetyl-1-cyano-glucitol(图2a)和2,3-di-o-methyl-4,5,6-tri-o-acetyl-1-cyano-glucitol(图2b)，从质谱数据可以得出，2,4-di-o-methyl-3,5,6-tri-o-acetyl-1-cyano-glucitol的一级碎片特征性碎片为145、186、189、261，级次碎片为87、112、129、154、159；然而，2,3-di-o-methyl-4,5,6-tri-o-acetyl-1-cyano-glucitol的一级碎片特征性碎片为186、217、261，次级碎片为85、88、99、115、127、159、201，通过对比分析可以发现，两种衍生物的主要碎片离子峰差异较大，因此，同种单糖的不同异构体可直接通过nist数据库检索对其进行定性鉴别。
[0050]
同时，2,4-di-o-methyl-3,5,6-tri-o-acetyl-1-cyano-glucitol的保留时间为21.67min，该峰前后的正构烷烃的保留时间分别为21.62min和23.37min，根据线性程序升温条件下的保留指数计算公式，计算出保留指数为2103，同样地，2,3-di-o-methyl-4,5,6-tri-o-acetyl-1-cyano-glucitol的保留时间为22.47，保留指数为2149，可以发现同种单糖的异构体具有不同的保留指数，因此，当化合物含量较低时，质谱碎片离子给出的信号较少，只通过丰度和细微差异分析离子更难对化合物进行鉴别，可根据保留指数辅助质谱信息对其进行快速准确的鉴别。
[0051]
2.异构单糖的异构体的鉴别
[0052]
本发明在实施例1的基础上，对于不同种类单糖相同苷键连接类型立体异构体质谱图的分析如图3所示，分别为4-o-methyl-2,3,5,6-tetra-o-acetyl-1-cyano-glucitol(图3a)、4-o-methyl-2,3,5,6-tetra-o-acetyl-1-cyano-galactitol(图3b)、4-o-methyl-2,3,5,6-tetra-o-acetyl-1-cyano-mannitol(图3c)，从nist数据库检索质谱图中可以看出三种化合物的一级特征碎片为145、189、214，次级碎片为87、103、112、129、154，可以发现不同种类单糖相同苷键连接类型立体异构体的离子碎片几乎相同，很难对其进行鉴别。
[0053]
然而，进一步对比本发明中三种化合物的保留指数，4-o-methyl-2,3,5,6-tetra-o-acetyl-1-cyano-glucitol、4-o-methyl-2,3,5,6-tetra-o-acetyl-1-cyano-galactitol、4-o-methyl-2,3,5,6-tetra-o-acetyl-1-cyano-mannitol的保留时间分别为24.02min、24.91min、24.29min，根据线性程序升温条件下的保留指数计算公式，计算出保留指数为分别为2237、2288、2253，经对比可以发现三种化合物的保留指数差异性较大，因此，可通过保留指数不同种类单糖相同苷键连接类型立体异构体的进行准确鉴别分析。
[0054]
试验例2保留指数法在苷类化合物甲基化分析中的应用
[0055]
本试验在实施例1的基础上，对桔梗皂苷、松果菊苷、金石蚕甘、巴豆苷、桔梗皂苷d、人参皂苷rc、金丝桃苷等多种苷类化合物中单糖的连接方式进行分析进行分析，其中人参皂苷rc的ei-ms总离子流图见图4。查阅相关资料，人参皂苷rc中包括
→
1)-araf、
→
1)-glcp、
→
2)-glcp(1
→
和
→
6)-glcp(1
→
四种单糖连接方式，首先对其ei-ms总离子流图中色谱峰进行质谱分析，并与nist数据库检索质谱图信息进行匹配，其中人参皂苷rc中峰1(图5a)、峰2(图5b)、峰3(图5c)、峰4(图5d)的质谱信息分别与数据库中
→
1)-araf、
→
1)-glcp、
→
2)-glcp(1
→
和
→
6)-glcp(1
→
的质谱信息相吻合。
[0056]
同时，人参皂苷rc中峰1的保留时间为12.71min，该峰前后的正构烷烃的保留时间分别为11.99min和13.97min，根据线性程序升温条件下的保留指数计算公式，计算出保留
指数为1636，同样地，峰2、峰3、峰4的保留时间分别为16.74min、19.80min和19.22min，保留指数为1841、2001和2007。查阅本发明数据库中
→
1)-araf、
→
1)-glcp、
→
2)-glcp(1
→
和
→
6)-glcp(1
→
的保留指数分别为1636、1840、2001和2007，通过比较人参皂苷rc实测和本发明所建数据库中的保留指数，可以准确的鉴别单糖的不同苷连接方式。因此，该发明所建立的数据库可以快速准确的对苷类化合物中单糖的苷连接进行定性分析。
[0057]
试验例3保留指数法在中药多糖甲基化分析中的应用
[0058]
本试验在实施例1的基础上，对木耳多糖、猴头多糖、川芎多糖、桔梗多糖、香菇多糖的单糖苷连接方式进行分析，其中木耳多糖的ei-ms总离子流图见图6。中药多糖甲基化分析成分组成复杂，采用保留指数的方式进行鉴别，以峰1和2为例说明保留指数的鉴别过程：总离子流图中木耳多糖峰1保留时间为18.54min，该峰前后的正构烷烃的保留时间分别为17.89min和19.78min，根据线性程序升温条件下的保留指数计算公式，计算出保留指数为1934；同样地，总离子流图中木耳多糖峰2保留时间为21.09min，保留指数为2071。
[0059]
首先，对木耳多糖色谱峰对应的质谱图进行分析，其中峰1和峰2的质谱图如图7所示，通过对比nist数据库检索质谱图可以初步确定峰1(图7a)和峰2(图7b)可能的结构为
→
3)-glcp(1
→
(图8a)、
→
3)-galp(1
→
(图8b)和
→
3)-manp(1
→
(图8c)，为进一步准确地鉴定化合物的结构，对比峰1和峰2与待定化合物的保留指数，其中，待定化合物
→
3)-glcp(1
→
、
→
3)-galp(1
→
和
→
3)-manp(1
→
在本发明中保留指数分别为1934、1973和2072。通过比较各个异构体实测和本发明所建数据库中保留指数，可以毫无疑问的鉴定峰1为
→
3)-glcp(1
→
，而峰2为
→
3)-manp(1
→
。