一种SARM1酶抑制剂及其筛选方法和应用与流程

一种sarm1酶抑制剂及其筛选方法和应用
技术领域
1.本技术涉及sarm1酶抑制剂技术领域，特别是涉及一种sarm1酶抑制剂及其筛选方法和应用。


背景技术：

2.sarm1是新发现的信号酶，在轴突变性过程中起着执行者的作用，而轴突变性是创伤性脑损伤、帕金森疾病、化疗药物诱导的周围神经病变等许多神经性疾病的早期事件。在多种神经退行性疾病中，sarm1被激活，导致nad和atp耗竭，线粒体功能障碍，进而启动一个全新的细胞死亡机制；敲除sarm1能够抑制轴突变性和疾病进程，因此被认为是治疗轴突变性相关疾病的潜在药物靶点。
3.虽然，基因敲除sarm1，能够抑制轴突变性和疾病进程；但是，在临床应用中，对于患病个体很难有效的实施sarm1基因敲除技术，或者说，通过基因敲除sarm1实现治疗的效果有限。因此，如何有效的阻断sarm1执行的轴突变性相关的神经退行性疾病，从而起到有效治疗的效果，仍然是目前sarm1研究的重点和难点。


技术实现要素：

4.本技术的目的是提供一种新的sarm1酶抑制剂的筛选方法，以及由此筛选获得的sarm1酶抑制剂及其应用。
5.本技术采用了以下技术方案：
6.本技术的一方面公开了一种sarm1酶抑制剂的筛选方法，包括：
7.将sarm1酶、候选抑制剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和荧光探针混合，制成反应体系，在常温进行反应，检测反应过程中荧光产生的速率，标记为第一荧光速率；
8.如果第一荧光速率小于标准荧光速率，则判断候选抑制剂具有sarm1酶抑制剂活性；第一荧光速率小于标准荧光速率的程度越大，相应的候选抑制剂的抑制活性越强；
9.其中，标准荧光速率是指在相同条件下，没有添加候选抑制剂时检测的反应过程中荧光产生的速率，即将相同量sarm1酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针混合，制成反应体系，在相同反应条件进行反应，检测反应过程中荧光产生的速率，标记为标准荧光速率；荧光探针为吡啶环与苯烯基或苯烯基衍生物偶联而成的用于sarm1酶促活性检测的荧光探针。
10.需要说明的是，本技术的筛选方法，其关键在于利用sarm1酶的nad碱基交换活性。在荧光探针存在的情况下，荧光探针与nad的烟酰胺发生交换，形成具有荧光的物质，即产物pads，sarm1酶能够促进nad碱基交换。也就是说，可以通过酶标仪检测底物pcs和产物pads的吸光波谱动力学以及产物pads的荧光波谱动力学，表征sarm1的酶促活性；即可以根据荧光产生的速率判断sarm1酶的活性强度。因此，如果候选抑制剂能够抑制sarm1酶活性，则荧光产生的速率会减小；抑制剂作用越强，减小的程度越大。本技术正是基于以上研究进行的sarm1酶抑制剂筛选。
11.还需要说明的是，本技术的sarm1酶抑制剂筛选方法，其关键在于基于sarm1酶活性检测；也就是说，sarm1酶抑制剂筛选方法的准确性和有效性，是基于特异性强、灵敏度高的sarm1酶活性检测才成立的。其中，吡啶环与苯烯基或苯烯基衍生物偶联而成的荧光探针，就是本技术发明人在之前的专利申请中提出的一种新的检测物质，其具有特异性强、灵敏度高和膜透性强等优点，能够在体外或活细胞内实时检测sarm1的酶促活性或其激活过程。本技术的荧光探针可以参考专利申请202010489831.5，该专利申请中与sarm1酶促活性检测相关的全部内容引用至本技术。
12.本技术的一种实现方式中，荧光探针为pc1所示结构至pc15所示结构中的至少一种；
[0013][0014]
优选的，荧光探针为pc5、pc6、pc7、pc8、pc10或pc11所示结构，更优选pc6和pc11。
[0015]
需要说明的是，pc1所示结构至pc15所示结构的荧光探针是本技术发明人已经证实的能够用于检测sarm1酶促活性的荧光探针，在此基础上，还可以设计合成更多的荧光探针，例如，在吡啶环或苯烯基的基础上修饰，从而制备获得更多的新的荧光探针。
[0016]
还需要说明的是，pc5、pc6、pc7、pc8、pc10和pc11是本技术一种实现方式中证实活性较佳的荧光探针，其它荧光探针的活性相对较差；因此，在优选的方案中优选pc5、pc6、pc7、pc8、pc10或pc11。当然，在要求较低的情况下，也可以采用其它九种荧光探针。
[0017]
本技术的一种实现方式中，还包括在反应体系中添加激活剂，促进反应进行。
[0018]
优选的，激活剂为烟酰胺单核苷酸或其类似物。
[0019]
需要说明的是，激活剂的作用是解除sarm1分子内自抑制，激活酶促活性；可以理
解，只要具备该作用都可以作为本技术的激活剂或者激活方法使用。本技术的一种实现方式中具体采用的是烟酰胺单核苷酸或cz-48。当然，如果使用的是克隆的已经解除自抑制的sarm1酶，则可能不需要激活剂。
[0020]
本技术的一种实现方式中，第一荧光速率的反应体系和反应条件具体包括，先将sarm1酶和候选抑制剂在tris-hcl溶液中孵育至少10分钟，然后向其中加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针，常温下反应至少30分钟，检测反应过程中荧光产生的速率，即第一荧光速率。如果需要添加烟酰胺单核苷酸或其类似物激活剂，则将其与荧光探针一起加入。
[0021]
同样的，标准荧光速率的反应体系和反应条件具体包括，先将sarm1酶在tris-hcl溶液中孵育至少10分钟，然后向其中加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针，常温下反应至少30分钟，检测反应过程中荧光产生的速率，即标准荧光速率。如果需要添加烟酰胺单核苷酸或其类似物激活剂，则将其与荧光探针一起加入。
[0022]
至于反应体系中sarm1酶、候选抑制剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针等的浓度，以能够有效的产生荧光为准，可以参考本技术实施例的浓度或根据检测需求进行调整。
[0023]
本技术的另一方面公开了一种采用本技术的筛选方法获得的sarm1酶抑制剂。
[0024]
需要说明的是，本技术筛选方法获得的sarm1酶抑制剂，可以根据需求筛选所需要的抑制剂活性，更好的满足轴突变性相关的神经退行性疾病临床应用。
[0025]
本技术的一种实现方式中，本技术筛选方法获得的sarm1酶抑制剂包括硝苯地平(nifedipine,nfdp)、尼索地平(nisodipine,nsdp)、尼卡地平(nicardipine,ncdp)、尼莫地平(nimodipine,nmdp)、氨氯地平(amlodipine)、非洛地平(felodipine)、丁酸氯维地平(clevidipine butyrate)、依拉地平(isradipine)、地尔硫(diltiazem)、维拉帕米(verapamil)、脱氢亚硝基硝苯地平(dhn-nifedipine,dhn-nfdp)、脱氢亚硝基尼索地平(dhn-nisodipine,dhn-nsdp)、脱氢亚硝基尼卡地平(dhn-nicardipine,dhn-ncdp)、脱氢亚硝基尼莫地平(dhn-nimodipine,dhn-nmdp)、脱氢氨氯地平(dh-amlodipine)、脱氢非洛地平(dh-felodipine)、脱氢丁酸氯维地平(dh-clevidipine butyrate)、脱氢依拉地平(dh-isradipine)、盐酸表柔比星(epirubicin hydrochloride)、奥利万星二磷酸盐(oritavancin diphosphate)、苄索氯铵(benzethonium chloride)、盐酸小檗碱(berberine hydrochloride)、双烯雌酚(dienestrol)、帕西替尼(pacritinib)、戊酸雌二醇(estradiol valerate)、汞溴红(merbromin)、苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)、甲萘醌(menadione)、次水杨酸铋(bismuth subsalicylat)、酚酞(phenolphthalein)、碱式没食子酸铋(bismuth subgallate)、血根碱盐酸盐(sanguinarine chloride)、埃文斯蓝(evans blue)、甲紫(crystal violet)、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、吡啶硫酮锌(zinc pyrithione)、卡铂(carboplatin)、两性霉素b(amphotericin b)、奥美拉唑(omeprazole)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、替加环素(tigecycline)、十一烯酸锌(zinc undecylenate)、拉帕替尼二糖基一水合物(lapatinib ditosylate monohydrate)、盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride)、金诺芬(auranofin)、盐酸金霉素(chlortetracycline hydrochloride)、异甘草素(isoliquiritigenin)、利福平(rifampicin)、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridiniumchloridemonohydrate)、厚朴酚(magnolol)、原花青素(proanthocyanidins)、盐酸四环素(tetracycline hydrochloride)、头孢磺啶钠(cefsulodin sodium)、硫双二氯酚(bithionol)、丁苯羟酸
(bufexamac)、依帕司他(epalrestat)、恩他卡朋(entacapone)、利血平(reserpine)、丹宁酸(tannic acid)、卡络磺钠(carbazochrome sodium sulfonate)、盐酸甲氟喹(mefloquine hydrochloride)、盐酸非那吡啶(phenazopyridine hydrochloride)、阿昔替尼(axitinib)、奥替溴铵(otilonium bromide)、硫链球菌素(thiostrepton)、孟鲁司特钠(montelukast sodium)、帕比司他(panobinostat)、左西孟旦(levosimendan)、二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)、盐酸头孢噻呋(ceftiofur hydrochloride)、盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)、甲钴胺(mecobalamin)、阿法替尼(afatinib)、二巯丁二酸(succimer)、藏红花素(crocin)、聚维酮碘(povidone-iodine)、丹参酮ila磺酸钠(tanshinone ila sulfonate sodium)、盐酸地美环素(demeclocycline hydrochloride)、拉帕替尼(lapatinib)、伽马谷维素(gamma-oryzanol)、枸橼酸铋钾(gastrodenol)、丁苯那嗪(tetrabenazine)、骨化二醇(calcifediol)、替考拉宁(teicoplanin)、利福喷丁(rifapentine)、曲格列酮(troglitazone)、磺胺嘧啶银(silver sulfadiazine)、托卡朋(tolcapone)、度米芬(domiphen bromide)、盐酸依达比星(idarubicin hcl)、吡柔比星(pirarubicin)、马来酸阿法替尼(afatinibdimaleate)、利福布丁(rifabutin)、奥替尼啶盐酸盐(octenidine dihydrochloride)、丹曲林钠盐半七水合物(dantrolene sodium hemiheptahydrate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、磺达肝癸钠(fondaparinux sodium)、非达霉素(fidaxomicin)、visomitin、(e/z)恩多昔芬((e/z)-endoxifen)、艾尔巴韦(elbasvir)、呋喃硫胺(fursutiamine)、盐酸头孢替安(cefotiam hydrochloride)、马拉硫磷(malathion)、士的宁(strychnine)、硫柳汞(thimerosal)、亚甲基蓝(methylene blue)、佐他莫司(zotarolimus)、头孢雷特(ceforanide)、顺铂(cisplatin)、来那替尼(neratinib)、甲基巴多索隆(bardoxolone methyl)、pracinostat、视黄醇(retinol)、番泻苷a(sennoside a)、氯吡硫磷(chlorpyrifos)、维帕他韦(velpatasvir)、小檗碱(berberine)、阿尼芬净(anidulafungin)、多韦替尼(dovitinib)。
[0026]
需要说明的是，以上具体的sarm1酶抑制剂只是本技术的一种实现方式中筛选获得的能够抑制sarm1酶促活性的化合物；在相同的发明构思下，采用本技术的筛选方法还可以筛选出更多的sarm1酶抑制剂，在此不作具体限定。
[0027]
本技术的再一面公开了本技术的sarm1酶抑制剂在制备治疗轴突变性相关的神经退行性疾病的药物中的应用。
[0028]
需要说明的是，本技术研究发现了这些化合物具有sarm1酶抑制剂活性，基于此，本领域技术人员能够明白无误的知道，本技术sarm1酶抑制剂必然可以用于制备治疗轴突变性相关的神经退行性疾病的药物。至于药物剂型，可以根据需求而定，在此不作具体限定。
[0029]
可以理解，本技术将sarm1酶抑制剂用于制备治疗轴突变性相关的神经退行性疾病的药物，其中轴突变性相关的神经退行性疾病包括但不仅限于帕金森疾病、阿尔兹海默症、青光眼、肌萎縮性脊髓侧索硬化症、化疗药物诱导的周围神经病变、糖尿病诱导的周围神经病变和中风诱导的轴突变性。
[0030]
本技术的再一面公开了一种治疗轴突变性相关的神经退行性疾病的药物，包括本技术的sarm1酶抑制剂。
[0031]
同样的，本技术的药物能够治疗包括但不仅限于帕金森疾病、阿尔兹海默症、青光
眼、肌萎縮性脊髓侧索硬化症、化疗药物诱导的周围神经病变、糖尿病诱导的周围神经病变和中风诱导的轴突变性等轴突变性相关的神经退行性疾病。
[0032]
本技术的一种实现方式中，本技术的药物还包括药学上可接受的载体。
[0033]
需要说明的是，本技术关键在于研究发现本技术的sarm1酶抑制剂能用于治疗轴突变性相关的神经退行性疾病，至于将其制成药物具体采用的载体、添加的辅助成分，可根据所需药物剂型而定，在此不作具体限定。另外，本技术的药物中也可以根据需求添加其他活性成分，起到协同治疗效果；具体的，可以参考现有的药学相关知识，在此不作具体限定。
[0034]
本技术的有益效果在于：
[0035]
本技术的sarm1酶抑制剂筛选方法，能简单有效的筛选获得大量不同活性的sarm1酶抑制剂；并且，所获得的sarm1酶抑制剂，能有效的抑制sarm1酶的活性，从而为抑制轴突变性和疾病进程，治疗轴突变性相关的神经退行性疾病，提供了一种新的方案和途径。
附图说明
[0036]
图1为本技术实施例中dn-sarm1蛋白的蛋白免疫印迹结果图；
[0037]
图2为本技术实施例中通过pc6探针荧光分析法高通量筛选药物库对sarm1活性抑制的抑制效率统计图；
[0038]
图3为本技术实施例中通过pc6荧光法和高效液相色谱分析法检测抑制剂的半数抑制浓度(ic50)的结果图；
[0039]
图4为本技术实施例中脱氢亚硝基尼索地平、脱氢亚硝基硝苯地平、脱氢亚硝基尼莫地平、脱氢亚硝基尼卡地平、脱氢依拉地平对sarm1活性的抑制的结果图；
[0040]
图5为本技术实施例中9个化合物在细胞内的抑制曲线，包括硝苯地平、尼卡地平、尼莫地平、非洛地平、氨氯地平、丁酸氯维地平、依拉地平、维拉帕米、地尔硫；
[0041]
图6为本技术实施例中证明dhnn对sarm1的抑制是时间依赖的，其中烟酰胺(nam)为对照，其抑制是非时间依赖的；
[0042]
图7为本技术实施例中证明dhnn对sarm1的抑制是不可逆的，其中烟酰胺(nam)为对照，其抑制不可逆；
[0043]
图8为本技术实施例中证明dhnn对sarm1的抑制主要抑制蛋白的激活，对于完全激活的截短体sam-tir的抑制能力较弱；
[0044]
图9为本技术实施例dhnn在细胞中对诱导型的isarm1和isam-tir的抑制的结果图；
[0045]
图10为本技术实施例中dhnn对sarm1半胱氨酸的修饰的质谱二级多肽谱图；
[0046]
图11为本技术实施例中dhnn对长春新碱诱导的原代背根神经元细胞的sarm1激活引起的cadpr生成的抑制的结果图；
[0047]
图12为本技术实施例中dhnn对长春新碱诱导的原代背根神经元细胞的sarm1激活引起的轴突变性的抑制的结果图；
[0048]
图13为本技术实施例中dhnn对长春新碱诱导的原代背根神经元细胞的sarm1激活引起的轴突变性的抑制的时间曲线统计图；
[0049]
图14为本技术实施例中dhnn对损伤诱导的原代背根神经元细胞的sarm1激活引起的轴突变性的抑制的结果图；
[0050]
图15为本技术实施例中dhnn对损伤诱导的原代背根神经元细胞的sarm1激活引起的轴突变性的抑制的时间曲线统计图。
具体实施方式
[0051]
神经退行性疾病的致病机理非常复杂，仍需深入研究。一般认为，神经退行性疾病主要由细胞内的基因突变引起，导致大脑或脊髓中大量错误折叠的蛋白或多肽的聚集和累积、突触连接丧失和多种信号通路障碍，包括蛋白质的降解途径障碍、自噬溶酶体功能障碍、线粒体功能失衡等，进一步造成大量的神经细胞死亡，从而破坏了神经网络引起严重的神经疾病。随着人们对神经退行性疾病的分子机制研究，越来越多的机理被认识和完善。轴突变性逐渐被认为是包括阿尔兹海默症(alzheimer’s disease，ad)、帕金森疾病(parkinson’s disease，pd)、创伤性脑损伤(traumatic brain injury，tbi)、化疗药物诱导性周围神经病变(chemotherapy-induced peripheral neuropathy，cipn)和肌肉萎缩症(amyotrophic lateral sclerosis，als)等神经退行性疾病发生和发展的早期事件以及重要的推动者。由于轴突变性发生在大量神经损伤之前，因此也被认为是缓解神经病变的潜在靶点。
[0052]
sarm1是一个多功能信号酶，能催化多种底物nad、nadp和na等生成信号分子cadpr、adpr和naadp等。在多种神经退行性疾病中，sarm1被激活，导致nad耗竭，进而启动一个全新的细胞死亡机制；敲除sarm1能抑制轴突变性和疾病进程，被认为是相关神经疾病的潜在药物靶点，包括tbi、cipn和asl等。sarm1在轴突变性发挥的作用与其酶活密不可分，因此，针对其酶活筛选抑制剂是治疗sarm1依赖的轴突变性的有效策略。
[0053]
sarm1由三个结构域组成，分别是氮端的arm(armadillo/heat repeat)结构域、两个串联的sam(sterile alpha motif)结构域、和碳端tir(toll/interleukin receptor)结构域，此外在氮端还有一段线粒体定位信号肽。sarm1是一个多功能蛋白酶，能够和多种底物反应，包括nad、nadp、na和cadpr，可能通过活性位点e642催化产生反应中间体，最后被不同的亲核分子(如：水、腺嘌呤n1、烟酸)进攻生成adpr、cadpr或naadp等。
[0054]
sarm1介导的轴突变性是酶活依赖的。轴突损伤激活sarm1，导致nad耗竭和轴突变性。在sarm1敲除的神经元中，过表达不含tir活性结构域的sarm1截短体无法引起损伤诱导的轴突变性。tir上的e642突变成丙氨酸导致sarm1失去酶活同时丧失其介导的轴突变性功能。在过表达sarm1的细胞系中，加入膜透性激活剂cz-48来激活sarm1能够诱导细胞死亡。
[0055]
正常状态下，sarm1处于自抑制状态。受到刺激后，自抑制的arm结构域被释放使sarm1构象发生改变，tir二聚化，激活sarm1催化nad发生水解和环化反应，生成adpr和cadpr并释放nam。越来越多的证据支持这个模型。首先，去除arm结构域使sam-tir组成性活化，导致未损伤的神经元发生轴突变性，说明arm在正常状态下抑制sarm1的酶活。仅表达tir结构域未检测到轴突变性，说明sam和tir是sarm1酶活所必需的。将tir与fkbp/frb融合表达，雷帕霉素处理诱导二聚化，能激活tir的nad 水解活性，导致轴突变性，说明tir是sarm1的酶活结构域，sam介导蛋白二聚化激活tir。
[0056]
轴突变性中nmnat2含量降低能够激活sarm1。nmnat2可能通过调控其代谢物水平来调控sarm1的活性。nmnat2含量降低时，产物nad减少，底物nmn累积，nmn/nad比值的升高促进轴突变性。这些结果暗示nmn/nad水平可能调控sarm1的激活。膜透性激活剂cz-48进一
步证明了nmn能够直接激活sarm1，而多个sarm1全长结构显示高浓度nad能够有效的抑制sarm1蛋白活性，将其固定在自抑制结构中。
[0057]
钙离子释放能够促进轴突变性，敲除sarm1会影响轴突变性中的钙离子信号通路，其作用机制可能与其代谢小分子cadpr和adpr等相关。sarm1的敲除能够抑制促氧化剂处理诱导的轴突变性和细胞死亡。激活剂cz-48诱导sarm1激活和细胞死亡的过程伴随着线粒体ros的升高、去极化增强和atp耗竭。这些结果表明，sarm1诱导的轴突变性和细胞死亡过程是一个全新的死亡机制，可能涉及钙信号通路和线粒体功能障碍等。
[0058]
总而言之，sarm1是一个多功能信号酶，能够催化多种底物nad、nadp和na等生成信号分子cadpr、adpr和naadp等。在多种神经退行性疾病中，sarm1被激活，导致nad耗竭，进而启动一个全新的细胞死亡机制；敲除sarm1能够抑制轴突变性和疾病进程，因此被认为是相关神经疾病的潜在药物靶点，包括tbi、cipn和asl等。所以，针对sarm1的活性开发抑制剂，不仅能够推动神经退行性疾病的治疗和药物开发，同时有助于揭示sarm1具体的酶活机制、蛋白结构解析和信号通路。
[0059]
本技术的部分英文缩写解释如下：
[0060]
cadpr：cyclic adp-ribose，即环腺苷二磷酸核糖。
[0061]
adpr：adp-ribose，即腺苷二磷酸核糖。
[0062]
naadp：nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate，即烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸。
[0063]
drg：dorsal root ganglion，即背根神经节。
[0064]
nmn：nicotinamide mononucleotide，即烟酰胺单核苷酸。
[0065]
下面通过具体实施例对本技术作进一步详细说明。以下实施例仅对本技术进行进一步说明，不应理解为对本技术的限制。
[0066]
实施例
[0067]
一、sarm1蛋白的表达纯化
[0068]
(1)质粒构建
[0069]
本例采用pcr扩增dn-sarm1的基因序列，去除sarm1的n端线粒体定位信号肽，将pcr扩增产物构建到plenti-cmv-puro-dest质粒(addgene catalog#17452)中，具体如下：
[0070]
在上海生工公司合成bc2t-tev多肽基因片段、dn-sarm1-f和dn-sarm1-r。其中，bc2t-tev多肽基因片段为seq id no.1所示序列，dn-sarm1-f为seq id no.2所示序列，dn-sarm1-r为seq id no.3所示序列。
[0071]
seq id no.1：
[0072]5’‑
ctcatgccagacagaaaagcggctgttagtcactggcagcaagatatcggcggaggcggatctggcggaggcggatctggcggaggcggatctgagaatttgtattttcagggtggcggaggcggaggtaccctg-3’[0073]
seq id no.2：5
’‑
ggtaccctggcggtgcctgggccag-3’[0074]
seq id no.3：5
’‑
gcggccgcctaggttggacccatgggtgcagcaccc-3’[0075]
采用hindiii/kpni酶切位点将合成的bc2t-tev多肽基因片段连接到pentr载体上pentr1a-gfp-n2(addgene:catalog#19364)。用引物dn-sarm1-f和dn-sarm1-r将dn-sarm1基因片段扩增出来，通过kpni和noti酶切位点将扩增获得的dn-sarm1基因片段构建到带有bc2t-tev的pentr载体上。本例的所有核酸内切酶购买于thermofisher。
[0076]
pcr扩增获得的dn-sarm1基因片段为seq id no.4所示序列。
[0077]
seq id no.4：
[0078]
ggtaccctggcggtgcctgggccagatgggggcggtggcacgggcccatggtgggctgcgggtggccgcgggccccgcgaagtgtcgccgggggcaggcaccgaggtgcaggacgccctggagcgcgcgctgccggagctgcagcaggccttgtccgcgctgaagcaggcgggcggcgcgcgggccgtgggcgccggcctggccgaggtcttccaactggtggaggaggcctggctgctgccggccgtgggccgcgaggtagcccagggtctgtgcgacgccatccgcctcgatggcggcctcgacctgctgttgcggctgctgcaggcgccggagttggagacgcgtgtgcaggccgcgcgcctgctggagcagatcctggtggctgagaaccgagaccgcgtggcgcgcattgggctgggcgtgatcctgaacctggcgaaggaacgcgaacccgtagagctggcgcggagcgtggcaggcatcttggagcacatgttcaagcattcggaggagacatgccagaggctggtggcggccggcggcctggacgcggtgctgtattggtgccgccgcacggaccccgcgctgctgcgccactgcgcgctggcgctgggcaactgcgcgctgcacgggggccaggcggtgcagcgacgcatggtagagaagcgcgcagccgagtggctcttcccgctcgccttctccaaggaggacgagctgcttcggctgcacgcctgcctcgcagtagcggtgttggcgactaacaaggaggtggagcgcgaggtggagcgctcgggcacgctggcgctcgtggagccgcttgtggcctcgctggaccctggccgcttcgcccgctgtctggtggacgccagcgacacaagccagggccgcgggcccgacgacctgcagcgcctcgtgccgttgctcgactctaaccgcttggaggcgcagtgcatcggggctttctacctctgcgccgaggctgccatcaagagcctgcaaggcaagaccaaggtgttcagcgacatcggcgccatccagagcctgaaacgcctggtttcctactctaccaatggcactaagtcggcgctggccaagcgcgcgctgcgcctgctgggcgaggaggtgccacggcccatcctgccctccgtgcccagctggaaggaggccgaggttcagacgtggctgcagcagatcggtttctccaagtactgcgagagcttccgggagcagcaggtggatggcgacctgcttctgcggctcacggaggaggaactccagaccgacctgggcatgaaatcgggcatcacccgcaagaggttctttagggagctcacggagctcaagaccttcgccaactattctacgtgcgaccgcagcaacctggcggactggctgggcagcctggacccgcgcttccgccagtacacctacggcctggtcagctgcggcctggaccgctccctgctgcaccgcgtgtctgagcagcagctgctggaagactgcggcatccacctgggcgtgcaccgcgcccgcatcctcacggcggccagagaaatgctacactccccgctgccctgtactggtggcaaacccagtggggacactccagatgtcttcatcagctaccgccggaactcaggttcccagctggccagtctcctgaaggtgcacctgcagctgcatggcttcagtgtcttcattgatgtggagaagctggaagcaggcaagttcgaggacaaactcatccagagtgtcatgggtgcccgcaactttgtgttggtgctatcacctggagcactggacaagtgcatgcaagaccatgactgcaaggattgggtgcataaggagattgtgactgctttaagctgcggcaagaacattgtgcccatcattgatggcttcgagtggcctgagccccaggtcctgcctgaggacatgcaggctgtgcttactttcaacggtatcaagtggtcccacgaataccaggaggccaccattgagaagatcatccgcttcctgcagggccgctcctcccgggactcatctgcaggctctgacaccagtttggagggtgctgcacccatgggtccaacctag
[0079]
pcr扩增反应体系为：5
×
primestar buffer(mg
2
plus)10μl、dntp mixture(2.5mm each)4μl、加入终浓度0.2μmol/l的dn-sarm1-f、加入终浓度0.2μmol/l的dn-sarm1-r、dna模板100ng、primestar hs dna polymerase(2.5u/μl)0.5μl，最后补充灭菌ddh2o至50μl。全长的sarm1由维真生物公司全合成到puc57质粒中，以puc57-sarm1作为dna模版进行pcr。
[0080]
pcr扩增条件为：98℃变性4分钟，然后进入30个循环：98℃10s、60℃5s、72℃2分钟，循环结束后72℃延伸5分钟，4℃待机。
[0081]
pcr扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳，然后用omega胶回收试剂盒d2500-02回收纯化，切胶回收具体步骤参考试剂盒说明书。回收纯化的pcr扩增产物用于构建到带有bc2t-tev的pentr载体上。
[0082]
重组质粒的构建体系步骤如下：
[0083]
酶切反应体系：pcr扩增回收产物或质粒800ng、核酸内切酶(fastdigest)各1μl、缓冲液1μl，补充灭菌水至体积10μl。酶切反应条件为37℃恒温30分钟。
[0084]
质粒连接：酶切反应结束后，将酶切的pcr扩增回收产物300ng、酶切的质粒50ng，与t4 dna连接酶1μl、t4 dna连接酶缓冲液1μl混合均匀，并补充灭菌水至体积20μl。连接条件为16℃恒温过夜。
[0085]
连接产物采用琼脂糖凝胶电泳，然后用omega胶回收试剂盒d2500-02回收纯化，回收纯化产物即本例的重组质粒，标记为pentr1a-bc2t-dn-sarm1。
[0086]
pentr1a-bc2t-dn-sarm1质粒构建完成后，通过lr反应将dn-sarm1重组至plenti-cmv-puro-dest。
[0087]
重组反应体系：150ng的pentr1a-bc2t-dn-sarm1、50ng的plenti-cmv-puro-dest、1μl的5
×
lr clonasereaction buffer，补充灭菌水至总体积5μl。
[0088]
(2)转染
[0089]
本例通过脂质体lipofectamine 2000(life technologies公司)将构建的plenti-cmv-puro-dest和病毒包装质粒pspax2、pmd2.g(addgene pspax2:#12260,pmd2.g:#12259)共同转染到hek293t细胞(atcc)中，制备带有dn-sarm1阅读框的病毒。具体如下：
[0090]
在3.5cm皿中铺1
×
106个细胞，第二天转染。
[0091]
质粒混合物：1.7μg的plenti-dn-sarm1、1.7μg的pspax2、0.6μg的pmd2.g、8μllipofectamine 2000转染试剂，根据说明书进行转染，8小时后换液，收集48小时的病毒。
[0092]
(3)细胞筛选
[0093]
采用dn-sarm1病毒感染“(2)转染”步骤获得的hek293t细胞，通过加入嘌呤霉素筛选获得稳定表达dn-sarm1蛋白的细胞。具体如下：
[0094]
病毒：80μl/3.5cm感染2
×
105，感染48小时后，加2μg/ml的嘌呤霉素进行筛选，筛选48小时后，不感染病毒的细胞已完全死亡。感染病毒的细胞大部分存活，再次加入2μg/ml的嘌呤霉素二次筛选48小时。
[0095]
(4)蛋白质提取
[0096]
培养并收集“(3)细胞筛选”步骤获得的稳定表达dn-sarm1蛋白的细胞，通过洋地黄皂甙裂解的方式获得细胞质中表达的dn-sarm1蛋白，用于体外活性测定实验。具体如下：
[0097]
细胞培养用dmem培养于10cm皿中，用trypsin-edta将细胞消化下来，然后1000rpm离心5分钟，加入pbs洗一次，然后用含有100μm毛地黄皂苷的pbs将细胞重悬，0.6ml pbs/10cm细胞，裂解5分钟。取细胞加入台盼蓝显微镜下观察，90％以上的细胞已经被裂解。将5000rpm离心10分钟，收集dn-sarm1蛋白的上清。
[0098]
采用蛋白免疫印迹对收集的dn-sarm1蛋白进行检测，结果如图1所示。图1中，第一和第二泳道为sarm1-dn蛋白样品，第三至第七泳道为不同量的bsa标准品。图1的结果显示每毫克的总蛋白中包含了10μg的sarm1-dn，能够满足后续使用需求。
[0099]
二、采用pc6荧光法体外筛选sarm1的抑制剂
[0100]
采用“一、sarm1蛋白的表达纯化”“(4)蛋白质提取”获得的dn-sarm1蛋白，采用“上市药物”作为药物(陶素生物，l1000)筛选化合物库。
[0101]
本例的筛选方法包括，将sarm1酶、候选抑制剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针混合，制成反应体系，在常温进行反应，检测反应过程中荧光产生的速率，标记为第一荧光速率；如果第一荧光速率小于标准荧光速率，则判断候选抑制剂具有sarm1酶抑制剂活性；第一荧光速率小于标准荧光速率的程度越大，相应的候选抑制剂的抑制活性越强；其中，标准荧光速率是指在相同条件下，没有添加候选抑制剂时检测的反应过程中荧光产生的速率，即将相同量的sarm1酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针混合，制成反应体系，在相同的反应条件进行反应，检测反应过程中荧光产生的速率，标记为标准荧光速率；荧光探针为吡啶环与苯烯基或苯烯基衍生物偶联而成的用于sarm1酶促活性检测的荧光探针。本例具体采用的是pc6荧光探针。
[0102]
本例的具体筛选方法如下：
[0103]
反应条件：首先将1.5μg/ml dn-sarm1和50μm的候选抑制剂化合物在50mm tris-hcl(ph 7.5)溶液中孵育10分钟，然后50μm nad、20μm pc6作为底物和50μm nmn作为激活剂加入与药物孵育后的dn-sarm1蛋白中，常温下反应30分钟。其中，各组分的浓度为反应体系中的终浓度。
[0104]
作为对照，将1.5μg/ml dn-sarm1在50mm tris-hcl(ph 7.5)溶液中孵育10分钟，然后50μm nad、20μm pc6作为底物和50μm nmn作为激活剂加入与药物孵育后的dn-sarm1蛋白中，常温下反应30分钟。
[0105]
在反应过程中，通过酶标仪检测产物pad6的荧光波谱动力学，其中检测激发波长和发射波长分别为390nm和520nm。最终采用反应速率表示蛋白的活性，反应速率越高表明蛋白活性越强，化合物的抑制效率越低；对比添加和不添加候选抑制剂的荧光产生的速率，即可判断候选抑制剂的活性。
[0106]
本例对l1000中的2015个化合物进行了筛选，筛选结果如图2所示。图2中，横坐标为不同的抑制剂，纵坐标为抑制效率。图2的结果显示，抑制剂活性高达80％的化合物有34个。本例根据使用需求，最终确定具有较好抑制剂活性的化合物有120个，具体包括：硝苯地平(nifedipine,nfdp)、尼索地平(nisodipine,nsdp)、尼卡地平(nicardipine,ncdp)、尼莫地平(nimodipine,nmdp)、氨氯地平(amlodipine)、非洛地平(felodipine)、丁酸氯维地平(clevidipine butyrate)、依拉地平(isradipine)、地尔硫(diltiazem)、维拉帕米(verapamil)、脱氢亚硝基硝苯地平(dhn-nifedipine,dhn-nfdp)、脱氢亚硝基尼索地平(dhn-nisodipine,dhn-nsdp)、脱氢亚硝基尼卡地平(dhn-nicardipine,dhn-ncdp)、脱氢亚硝基尼莫地平(dhn-nimodipine,dhn-nmdp)、脱氢氨氯地平(dh-amlodipine)、脱氢非洛地平(dh-felodipine)、脱氢丁酸氯维地平(dh-clevidipine butyrate)、脱氢依拉地平(dh-isradipine)、盐酸表柔比星(epirubicin hydrochloride)、奥利万星二磷酸盐(oritavancin diphosphate)、苄索氯铵(benzethonium chloride)、盐酸小檗碱(berberine hydrochloride)、双烯雌酚(dienestrol)、帕西替尼(pacritinib)、戊酸雌二醇(estradiol valerate)、汞溴红(merbromin)、苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)、甲萘醌(menadione)、次水杨酸铋(bismuth subsalicylat)、酚酞(phenolphthalein)、碱式没食子酸铋(bismuth subgallate)、血根碱盐酸盐(sanguinarine chloride)、埃文斯蓝(evans blue)、甲紫(crystal violet)、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、吡啶硫酮锌(zinc pyrithione)、卡铂(carboplatin)、两性霉素b(amphotericin b)、奥美拉唑
(omeprazole)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、替加环素(tigecycline)、十一烯酸锌(zinc undecylenate)、拉帕替尼二糖基一水合物(lapatinib ditosylate monohydrate)、盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride)、金诺芬(auranofin)、盐酸金霉素(chlortetracycline hydrochloride)、异甘草素(isoliquiritigenin)、利福平(rifampicin)、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridiniumchloridemonohydrate)、厚朴酚(magnolol)、原花青素(proanthocyanidins)、盐酸四环素(tetracycline hydrochloride)、头孢磺啶钠(cefsulodin sodium)、硫双二氯酚(bithionol)、丁苯羟酸(bufexamac)、依帕司他(epalrestat)、恩他卡朋(entacapone)、利血平(reserpine)、丹宁酸(tannic acid)、卡络磺钠(carbazochrome sodium sulfonate)、盐酸甲氟喹(mefloquine hydrochloride)、盐酸非那吡啶(phenazopyridine hydrochloride)、阿昔替尼(axitinib)、奥替溴铵(otilonium bromide)、硫链球菌素(thiostrepton)、孟鲁司特钠(montelukast sodium)、帕比司他(panobinostat)、左西孟旦(levosimendan)、二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)、盐酸头孢噻呋(ceftiofur hydrochloride)、盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)、甲钴胺(mecobalamin)、阿法替尼(afatinib)、二巯丁二酸(succimer)、藏红花素(crocin)、聚维酮碘(povidone-iodine)、丹参酮ila磺酸钠(tanshinone ila sulfonate sodium)、盐酸地美环素(demeclocycline hydrochloride)、拉帕替尼(lapatinib)、伽马谷维素(gamma-oryzanol)、枸橼酸铋钾(gastrodenol)、丁苯那嗪(tetrabenazine)、骨化二醇(calcifediol)、替考拉宁(teicoplanin)、利福喷丁(rifapentine)、曲格列酮(troglitazone)、磺胺嘧啶银(silver sulfadiazine)、托卡朋(tolcapone)、度米芬(domiphen bromide)、盐酸依达比星(idarubicin hcl)、吡柔比星(pirarubicin)、马来酸阿法替尼(afatinibdimaleate)、利福布丁(rifabutin)、奥替尼啶盐酸盐(octenidine dihydrochloride)、丹曲林钠盐半七水合物(dantrolene sodium hemiheptahydrate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、磺达肝癸钠(fondaparinux sodium)、非达霉素(fidaxomicin)、visomitin、(e/z)恩多昔芬((e/z)-endoxifen)、艾尔巴韦(elbasvir)、呋喃硫胺(fursutiamine)、盐酸头孢替安(cefotiam hydrochloride)、马拉硫磷(malathion)、士的宁(strychnine)、硫柳汞(thimerosal)、亚甲基蓝(methylene blue)、佐他莫司(zotarolimus)、头孢雷特(ceforanide)、顺铂(cisplatin)、来那替尼(neratinib)、甲基巴多索隆(bardoxolone methyl)、pracinostat、视黄醇(retinol)、番泻苷a(sennoside a)、氯吡硫磷(chlorpyrifos)、维帕他韦(velpatasvir)、小檗碱(berberine)、阿尼芬净(anidulafungin)、多韦替尼(dovitinib)。
[0107]
120个sarm1酶抑制剂的结构式如下：
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112][0113]
三、采用pc6荧光法和hplc体外检测sarm1抑制剂的半数抑制浓度
[0114]
采用“二、体外筛选sarm1的抑制剂”的化合物及其sar化合物作为候选抑制剂，通过pc6荧光法检测药物在体外对sarm1的半数抑制浓度(ic50)。
[0115]
反应条件：首先将200μm的化合物加入到含有0.4μg/ml dn-sarm1的50mm tris-hcl(ph 7.5)溶液中，然后取一半加入等体积含有0.4μg/ml dn-sarm1的50mm tris-hcl(ph 7.5)溶液混合，以此类推将药物稀释6次，终浓度分别为200μm、100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm，不加入抑制剂的为对照组，在室温孵育10分钟。
[0116]
然后50μm nad、50μm pc6作为底物和50μm nmn作为激活剂加入与抑制剂孵育后的dn-sarm1蛋白中，常温下反应30分钟。其中，各组分的浓度为反应体系中的终浓度。
[0117]
在反应过程中，通过酶标仪检测产物pad6的荧光波谱动力学，其中检测激发波长
[0128]
seq id no.6：5
’‑
gaattcttaggttggacccatgggtg-3’[0129]
(2)检测抑制剂对细胞系中sarm1蛋白的活性抑制的ec50
[0130]
选择化合物检测细胞系中sarm1蛋白的活性；具体如下：
[0131]
首先用0.05mg/ml多聚赖氨酸处理96孔培养皿5分钟，用pbs清洗一次。将3
×
104的isarm1(hek293)铺板到96孔板中，在37℃和5％的培养箱中培养过夜。第二天，加入终浓度30、7.5和1.87、0.47μm的抑制剂到细胞中，在培养箱中孵育1.5小时；然后，加入终浓度100μm的激活剂cz-48，在共同孵育16小时，同时设置不加cz-48或不加药物的对照组。最后检测细胞内cadpr水平来表示sarm1的活性，绘制cadpr水平和抑制剂浓度曲线，最终计算出抑制剂在细胞中的半数有效浓度(ec50)。
[0132]
cadpr测定方法具体如下：首先用pbs将细胞清洗一次，加入150μl预冷的0.6m高氯酸(pca)将细胞快速裂解并沉淀蛋白。将pca上清转移至1.5ml的离心管中，培养基中的蛋白用100μl 1m naoh重新溶解。上清加入0.5ml有机试剂混合液(三辛胺：氯仿＝1：3)，将pca从水中萃取出来。充分震荡后，12000rpm离心10分钟，溶液分为3层：上层水相，包含目的小分子；下层有机相，pca溶于其中；而上下两层之间为薄薄的一层蛋白层，取上层转移至新的离心管中。按1：100的比例向溶液中加1m tris-mg(1m tris(ph 8.0)：1m mgcl2＝9：1)，按1：250的比例加入nadase，在37℃处理过夜，去除混合液中的nad 。处理完成后，用millipore的10k 96孔滤膜板过滤除去nadase。
[0133]
通过cycling分析法测定溶液中cadpr的含量，具体操作如下，取20μl待测样品或cadpr标准品加入96孔不透明白板中。制备反应液：9.6ml pbs(ph 7.4)，200μl ethanol，150μl 1mg/ml ad，10μl 10mm fmn，5μl 18mg/ml diaphorase，10μl 10mm resazurin，100μl1m nam。分出一半反应液加入0.2μg/ml cyclase，不加入cyclase的反应液为对照实验。每个样品分为两组，每组3个重复，分别加入含有或不含有cyclase的反应液开始反应，记录30分钟内的反应动力学曲线(ex:em＝544/599)。计算反应平均斜率，并且通过cadpr标准品换算得到准确的cadpr含量。
[0134]
本例测试了硝苯地平、尼卡地平、尼莫地平、非洛地平、氨氯地平(amlodipine)、丁酸氯维地平(clevidipine butyrate)、依拉地平、维拉帕米(verapamil)、地尔硫(diltiazem)在细胞内的抑制曲线，结果如图5所示。图5中，横坐标为以十为对数的药物浓度，纵坐标为sarm1的活性。图5的结果显示，除了丁酸氯维地平(clevidipine butyrate)和地尔硫(diltiazem)外，其他化合物对sarm1均有显著的抑制。
[0135]
五、蛋白质谱鉴定dhnn共价抑制sarm1的活性
[0136]
本例选择脱氢亚硝基尼索地平(dhn-nisodipine,dhn-nsdp或dhnn)检测sarm1蛋白抑制的修饰。
[0137]
(1)dtsarm1-dn表达载体的构建
[0138]
本例采用pcr扩增dn-sarm1的基因序列，去除sarm1的n端线粒体定位信号肽，将pcr扩增产物构建到plenti-cmv-puro-dest质粒(addgene catalog#17452)中，具体如下：
[0139]
在上海生工公司合成flag-strep tag ii多肽基因片段、dn-sarm1-f和dn-sarm1-r。其中，flag-strep tag ii多肽基因片段为seq id no.7所示序列，dn-sarm1-f为seq id no.8所示序列，dn-sarm1-r为seq id no.9所示序列。
[0140]
seq id no.7：
trypsin过夜酶解。
[0155]
第二天，加入10μl的5％的甲酸终止酶解反应，将液体吸出加入新的离心管中。随后加入5％甲酸和50％乙腈，在80rpm的振荡器中振荡，将酶解的多肽提出出来，每次振荡15分钟，重复三次，并将提取出的多肽收集到相同的离心管中。用液氮将样品冷冻起来，用真空冻干机将样品冻干。用0.1％的甲酸重新溶解多肽后，使用赛默飞的q exactive hf-x仪器进行一级和二级质谱鉴定。最后使用protein discoverer分析修饰的多肽。dhnn修饰后可能增加多肽分子量包括：370.15287da，354.15796da，402.14270da，386.14779da。
[0156]
本例dhnn对sarm1的抑制测试结果如图6至图10所示，图6为dhnn对sarm1活性抑制的时间曲线图，图7为超滤去除游离dhnn对sarm1活性抑制的结果图。图6的结果显示，dhnn对sarm1的抑制是时间依赖的，其中烟酰胺(nam)为阴性对照。图7的结果显示，dhnn对sarm1的抑制是不可逆的，其中烟酰胺(nam)为阴性对照。图8的结果显示，dhnn对sarm1的抑制主要抑制蛋白的激活，对于完全激活的截短体sam-tir的抑制能力较弱。图9的结果显示，dhnn在细胞中对诱导型的isarm1和isam-tir都具有抑制作用，但对isam-tir的抑制能力较弱，表明其主要作用是抑制sarm1的激活。
[0157]
图10为sarm1蛋白上被dhnn修饰上的多肽，图10结果显示，多肽图谱中能够检测到dhnn的修饰，表明dhnn通过半胱氨酸共价修饰抑制sarm1的活性。进一步的研究结果显示，sarm1蛋白上有13个多肽都能够检测到dhnn的修饰。
[0158]
六、药物抑制神经元中sarm1蛋白的活性和轴突变性
[0159]
本例选择dhnn检测神经元中sarm1蛋白的活性和周突变型抑制作用，具体如下：
[0160]
(1)培养皿处理
[0161]
本例用300微升0.1mg/ml poly-d-lysine 0.02mg/ml laminin在37度处理24孔贴壁细胞培养皿24小时，吸掉后，pbs洗一次，加入300微升5％fbs在37度处理24小时，随后，用pbs清洗1次，晾干。
[0162]
(2)背根神经节神经元获取
[0163]
本例从小鼠胚胎e12.5-e14.5中分离出背根神经节神经元，加入培养基铺板的培养皿中，培养3天后，加入抑制剂终浓度为5μm的5-氟-2
’‑
脱氧尿苷(5-fluoro-2
’‑
deoxyuridine)和5μm的尿苷(uridine)。其中，小鼠胚胎e12.5-e14.5由本实验室配种，小鼠来源于广东省实验动物中心的c57/bl6j。
[0164]
其中，培养皿为经过“(1)培养皿处理”的培养皿。培养基的成份为：神经元基础培养基(neuronbasal plus medium(thermo))，并添加终浓度为2％的b27 plus、1％的谷氨酰胺(glutamax)、1％的青霉素/链霉亲和素溶液(penicillin/streptavidin solution)，以及终浓度50ng/ml的ngf。
[0165]
(3)药物处理抑制化疗药物长春新碱对sarm1的激活作用
[0166]
本例选择dhnn抑制剂检测抑制剂对背根神经元细胞中sarm1蛋白的活性影响。背根神经元细胞在体外培养9-13天后，分别采用dmso和不同浓度的dhnn与神经元细胞孵育1.5小时，接着加入50nm的长春新碱激活细胞内sarm1蛋白的活性。在处理16小时后，采用“四、在诱导型过表达sarm1的细胞系中检测药物抑制的ec50”中cadpr的提取检测方法，检测细胞内cadpr的含量反应神经元细胞中sarm1蛋白的活性。
[0167]
测试结果如图11所示，图11中纵坐标为cadpr的水平，横坐标为不同浓度长春新碱
(vcr)或dhnn的处理分组。图11的结果显示，dhnn能够显著抑制vcr在drg神经元中诱导的sarm1激活，使cadpr水平下降。
[0168]
(4)药物处理抑制长春新碱诱导的sarm1依赖的轴突变性
[0169]
本例选择dhnn抑制剂检测抑制剂对长春新碱诱导的背根神经元轴突变性的影响。背根神经元细胞在体外培养9-13天后，采用dmso或不同浓度dhnn与50nm的长春新碱同时处理背根神经元细胞。在处理后0，24，48，72小时，用倒置荧光显微镜在20倍镜头下拍摄明场图片，记录轴突变性进程。
[0170]
轴突损伤定量方法具体如下：首先将图片裁剪成147
×
147像素的图片，每个药物处理均裁剪出60张照片。然后使用threshold将照片转换为二进制图片，通过analyze particle计算图片中的全部轴突像素点(大小为16到infinity)以及损伤轴突的像素点(像素大小为16到10,000)，最后计算轴突损伤的量/总轴突量即为轴突损伤的程度。
[0171]
测试结果如图12和图13所示，图12中长春新碱处理72小时后轴突变性成像图，图13的横坐标为长春新碱的处理时间，纵坐标为轴突变性进程统计图。图12的结果显示，dhnn能够显著抑制长春新碱诱导的轴突变性，sarm1敲除的drg为对照组；图13的结果显示，长春新碱诱导的轴突变性随时间增加，而dhnn显著抑制了轴突变性进程，基本和阴性对照(dmso组)一致。
[0172]
(5)药物处理抑制损伤诱导的sarm1依赖的轴突变性
[0173]
本例选择dhnn抑制剂检测抑制剂对损伤诱导的本根神经元轴突变性的影响。背根神经元细胞在体外培养5-7天后，分别采用dmso和不同浓度的dhnn与神经元细胞孵育0.5小时，然后在显微镜下用3mm的平刀片损伤轴突，将轴突与胞体分离同时移除胞体防止神经元再生。在处理后0，24，48，72小时，用倒置荧光显微镜在20倍镜头下拍摄明场图片，记录轴突变性进程。最后，使用imagej对轴突损伤的程度进行定量。轴突损伤程度采用“(4)药物处理抑制长春新碱诱导的sarm1依赖的轴突变性”的计算方法。
[0174]
测试结果如图14和图15所示，图14中损伤切割后24和48小时轴突变性成像图，图15的横坐标为损伤切割后的时间，纵坐标为轴突变性进程统计图。图14的结果显示，dhnn能够显著抑制轴突变性进程。图15的结果显示，损伤后24小时导致轴突完全变性，而dhnn能够延缓轴突变性进程。
[0175]
七、结论
[0176]
根据以上试验方案，本例最终筛选出以下化合物对sarm1酶具有抑制性，能够抑制轴突变性，维持细胞内nad的水平，抑制代谢物cadpr的生成：硝苯地平、尼索地平、尼卡地平、尼莫地平、氨氯地平、非洛地平、丁酸氯维地平、依拉地平、地尔硫、维拉帕米、脱氢亚硝基硝苯地平、脱氢亚硝基尼索地平、脱氢亚硝基尼卡地平、脱氢亚硝基尼莫地平、脱氢氨氯地平、脱氢非洛地平、脱氢丁酸氯维地平、脱氢依拉地平、盐酸表柔比星、奥利万星二磷酸盐、苄索氯铵、盐酸小檗碱、双烯雌酚、帕西替尼、戊酸雌二醇、汞溴红、苹果酸舒尼替尼、甲萘醌、次水杨酸铋、酚酞、碱式没食子酸铋、血根碱盐酸盐、埃文斯蓝、甲紫、西曲溴铵、吡啶硫酮锌、卡铂、两性霉素b、奥美拉唑、己烯雌酚、替加环素、十一烯酸锌、拉帕替尼二糖基一水合物、盐酸阿霉素、金诺芬、盐酸金霉素、异甘草素、利福平、氯化十六烷基吡啶、厚朴酚、原花青素、盐酸四环素、头孢磺啶钠、硫双二氯酚、丁苯羟酸、依帕司他、恩他卡朋、利血平、丹宁酸、卡络磺钠、盐酸甲氟喹、盐酸非那吡啶、阿昔替尼、奥替溴铵、硫链球菌素、孟鲁司特
钠、帕比司他、左西孟旦、二甲苯磺酸拉帕替尼、盐酸头孢噻呋、盐酸柔红霉素、甲钴胺、阿法替尼、二巯丁二酸、藏红花素、聚维酮碘、丹参酮ila磺酸钠、盐酸地美环素、拉帕替尼、伽马谷维素、枸橼酸铋钾、丁苯那嗪、骨化二醇、替考拉宁、利福喷丁、曲格列酮、磺胺嘧啶银、托卡朋、度米芬、盐酸依达比星、吡柔比星、马来酸阿法替尼、利福布丁、奥替尼啶盐酸盐、丹曲林钠盐半七水合物、米托蒽醌、磺达肝癸钠、非达霉素、visomitin、(e/z)恩多昔芬、艾尔巴韦、呋喃硫胺、盐酸头孢替安、马拉硫磷、士的宁、硫柳汞、亚甲基蓝、佐他莫司、头孢雷特、顺铂、来那替尼、甲基巴多索隆、pracinostat、视黄醇、番泻苷a、氯吡硫磷、维帕他韦、小檗碱、阿尼芬净和多韦替尼。
[0177]
以上化合物，可以用于治疗轴突变性相关的神经退行性疾病，例如帕金森疾病、阿尔兹海默症、青光眼、肌萎縮性脊髓侧索硬化症、化疗药物诱导的周围神经病变、糖尿病诱导的周围神经病变和中风诱导的轴突变性等。这些抑制剂为抑制轴突变性和疾病进程，治疗轴突变性相关的神经退行性疾病，提供了一种新的方案和途径。
[0178]
以上内容是结合具体的实施方式对本技术所作的进一步详细说明，不能认定本技术的具体实施只局限于这些说明。对于本技术所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。