一种负载纳米银多孔有机聚合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医疗技术领域，具体涉及一种负载纳米银多孔有机聚合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.皮肤作为人类最大的器官和天然屏障，可以有效地防止和保护我们免受外界细菌和病毒的入侵和感染。然而，皮肤在任何事故或手术中都很容易断裂。一旦受伤，伤口，如战伤和剖腹产伤口，将导致皮肤容易受到外界病原体的攻击，引起伤口感染。而细菌感染的伤口愈合困难一直是严重威胁人类健康的问题。对于执行强效杀菌作用，临床抗生素治疗总是需要持续、长时间的高剂量抗生素，这不仅增加了抗生素耐药的可能性，而且会对人体造成严重的副作用。因此，开发新的抗菌剂，实现对细菌感染的有效治疗势在必行。
3.纳米技术的飞速发展大大加速了金属纳米抗菌剂的发展。迄今为止，开发了各金属抗菌材料，如金属纳米颗粒、金属氧化物、碳纳米材料以及它们的复合材料。二十世纪八十年代兴起的纳米技术为新型材料的结构设计和性质探索开辟了新的方向。各种各样的纳米材料在生物医学中的应用受到人们越来越多的关注，特别是作为抗生素替代物的纳米抗菌材料，如纳米金、纳米银、纳米铜、纳米氧化锌和纳米二氧化钛等。那些金属基杀菌剂中，具有广谱抗菌活性的基于纳米银的材料引起了人们的显著关注。
4.然而，大多数制备的材料的ag

负载效率较低。而且作为典型的重金属元素，裸露的agnps颗粒更容易与不相关的蛋白质相互作用，引起严重的自聚集，极大地损害了它们的抗菌活性。所有这些都阻碍ag

纳米颗粒抗菌剂的广泛应用。因此，开发一种具有高ag负载效率的新型agnps杀菌系统是非常必要的，它不仅可以降低agnps的生物毒性，而且可以同时增强治疗效果。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中的上述技术问题，本发明提供一种负载纳米银多孔有机聚合物及其制备方法和应用。
6.本发明的第一个目的是提供一种负载纳米银多孔有机聚合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
7.s1、制备咪唑基有机多孔聚合物：将咪唑-2-甲醛与三聚氰胺在dmso中混合加热反应，反应结束后，收集固体产物，除去未反应组分，纯化，干燥，得到咪唑基有机多孔聚合物；
8.s2、制备负载纳米银多孔有机聚合物：
9.s2-1、将s1得到的咪唑基有机多孔聚合物与少量甲醇混合研磨，研磨结束后加入甲醇，使咪唑基有机多孔聚合物在甲醇中的浓度为1～2mg/ml，得到反应体系；在某个特定的实施例中，研磨时间为30分钟至纳米级。咪唑基有机多孔聚合物在甲醇中的浓度为1.6mg/ml。
10.s2-2、向s2-1得到的反应体系中加入agno3溶液，所述agno3与咪唑基有机多孔聚合
物的质量比例为1.2:1～1.4:1，优选的，所述agno3溶液的浓度为8.75mg/ml；除去反应产物中未反应的agno3和游离的纳米银后，获得负载银离子的多孔有机聚合物；
11.s2-3、将s2-2得到的负载银离子的多孔有机聚合物中的银离子还原为纳米银，密封搅拌，用蒸馏水清洗，离心，收集沉淀，得到负载纳米银多孔有机聚合物。
12.进一步的，s1所述咪唑-2-甲醛与三聚氰胺的物质的量之比例为3:1～3.5:1；优选的，s1所述咪唑-2-甲醛与三聚氰胺的物质的量之比例3:1。
13.进一步的，s1所述咪唑-2-甲醛在dmso中的浓度0.068g/ml,三聚氰胺在dmso的浓度0.03g/ml。
14.进一步的，s1所述混合加热反应为在惰性气体保护下180℃搅拌3～4天。在某个特定的实施例中，所述混合加热反应的反应条件为在惰性气体保护下180℃搅拌3天。
15.进一步的，s1所述除去未反应组分为将收集的固体产物加入丙酮中，在30～60℃下搅拌3～9h，在某个特定的实施例中，在45℃下搅拌6h。
16.进一步的，s1所述纯化为将固体产物用四氢呋喃55℃下搅拌3h，随后用二氯甲烷60℃下搅拌6h～9h。
17.进一步的，s1所述干燥为80℃真空干燥。
18.s2-2所述除去未反应的agno3和游离的纳米银的具体操作为：将反应产物除去溶剂后用蒸馏水清洗，离心，收集沉淀，获得负载银离子的多孔有机聚合物；优选的，离心条件为9000rpm,5min。
19.进一步的，s2-3所述还原为，将s2-2得到的负载银离子的多孔有机聚合物加入甲醇和水的混合溶剂中，再加入硼氢化钠的甲醇溶液，使负载银离子的多孔有机聚合物中的银离子还原为纳米银，所述混合溶剂为体积比为3:2的甲醇和水的混合，所述负载银离子的多孔有机聚合物在混合溶剂中的浓度为3～4mg/ml，所述硼氢化钠甲醇溶液的浓度为15～16mg/ml，所述负载银离子的多孔有机聚合物在硼氢化钠甲醇溶液中的浓度为6～8mg/ml，所述搅拌时间为1-2天，所述洗涤为采用水和甲醇洗涤。
20.本发明的第二个目的是提供采用上述负载纳米银多孔有机聚合物的制备方法制备得到的负载纳米银多孔有机聚合物。
21.在某个特定的实施例中，所述负载纳米银多孔有机聚合物粒径为：500nm。
22.本发明的第三个目的是提供上述负载纳米银多孔有机聚合物在制备抗菌药物中的应用，优选的，所述抗菌药物为能够加快伤口愈合的抗菌药物。
23.进一步的，所述抗菌药物为抗革兰氏阴性菌药物和/或革兰氏阳性菌药物，优选的，所述抗菌药物为抗大肠杆菌药物和/或金黄色葡萄球菌药物。
24.本发明所述im是指：咪唑基；
25.本发明所述pop是指：有机多孔聚合物；
26.本发明所述im-pop是指：咪唑基有机多孔聚合物；
27.本发明所述im-pop-ag是指：负载纳米银多孔有机聚合物；
28.本发明所述agnps是指：纳米银。
29.本发明技术方案相对于现有技术具有以下有益效果：
30.本发明制备方法采用化学还原法简便地制备了一种低成本、可批量生产的负载纳米银多孔有机聚合物(im-pop-ag)。im-pop是在无催化剂条件下，通过席夫碱化学，通过廉
价、易得、工业化生产的咪唑-2-甲醛和三聚氰胺的共聚，容易制备的。独特的咪唑基pop骨架，其n含量高达30.43at％，为ag 提供了丰富的n配位位点，通过配位自组装不仅可以保证26wt％的高ag负载能力，而且可以有效地将ag锚定在多孔骨架中，避免了纳米ag的自聚集。一方面，ag在n位的锚定(30.43at％)，可以有效地阻止银的聚集，大大增强抗菌作用。另一方面，银的配位使咪唑框架变成咪唑鎓，赋予载体抗菌活性。
31.与纯ag纳米粒相比，所制备的im-pop-ag不仅表现出低毒性和良好的生物相容性，而且在体外对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均呈现优越的抗菌活性。在相同的银含量下，im-pop-ag的抗菌活性显著高于agnps。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对200μg ml-1
im-pop-ag(相当于50μg ml-1
agnps)的存活率为3.44％和9.62％.然而，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对50μg ml-1
agnps的存活率为12.19％和20.20％。
32.此外，体内小鼠实验验证了im-pop-ag可显著杀灭伤口中的感染细菌并促进伤口愈合。这种新策略可以大大减少ag的使用量，节约成本。同时，也为在不久的将来应用具有更高功效和生物相容性的银纳米颗粒提供了理论依据。
附图说明
33.图1.用于抗菌和伤口愈合的ag纳米颗粒-包封多孔有机聚合物(im-pop)的合成示意图。
34.图2a).傅里叶变换红外(ftir)光谱；b)im-pop的固态
13
cnmr光谱。
35.图3.制备样品的物理表征：a)im-pop-ag和im-pop样品的ftir谱图；b)制备im-pop-ag的xrd谱图；c)制备im-pop和im-pop-ag的tga谱图；d)im-pop和im-pop-ag在77k下的低温n2吸收等温线谱图；e)样品im-pop的孔径分布曲线；f)样品im-pop-ag的孔径分布曲线。
36.图4a).agnps的粒径分布；b)im-pop-ag的粒径分布；c)im-pop、agnps、im-pop-ag的zate电位。
37.图5.im-pop-ag的sem和tem。a、b)在im-pop-ag的sem分别为5μm和500nm比例尺；c、d、e)im-pop-ag的比例尺分别为1000、100和50nm；f)im-pop-ag的hrtem比例尺是10nm；g)100nm比例尺中im-pop-ag的元素图，h)碳元素的分布图，i)氮元素的分布图，j)银元素的分布图，h)氧元素的分布图。
38.图6.xps的im-pop-ag。a)im-pop-ag的xps测量光谱；b)im-pop-ag的n1s谱c)im-pop-ag的ag 3d谱。
39.图7.体外细菌生长抑制试验。a)大肠杆菌形成的细菌菌落照片和d)金黄色葡萄球菌im-pop-ag和agnps处理基于平板计数法(由左至右浓度：im-pop-ag＝0、50、100、200μg ml-1
,agnps＝0、12.5、25、50μg ml-1
)。b)是agnps对大肠肠杆菌处理后的细菌成活率；c)是im-pop-ag对大肠肠杆菌处理后的细菌成活率；e)是agnps对金黄色葡萄球菌处理后的细菌成活率；和f)是im-pop-ag对金黄色葡萄球菌处理后的细菌成活率。
40.图.8对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌球的抗菌活性。a)大肠杆菌菌和b)金黄色葡萄球的抑菌圈。c)大肠杆菌和d)金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径直方图。
41.图9.pi和syto 9共染pbs、im-pop、agnps、im-pop-ag孵育的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的荧光图像(比例尺＝100μm)。
42.图10.细菌的tem图像。a-d)pbs、im-pop、agnps和im-pop-ag处理后获得金黄色葡萄球菌；e-h)pbs、im-pop、agnps和im-pop-ag处理后获得大肠杆菌。
43.图11.溶血试验和细胞活力试验。用不同浓度的a)im-pop，b)agnps，c)im-pop-ag的溶血试验。用不同浓度的d)im-pop、e)agnps、f)im-pop-ag孵育l929细胞的存活率(％)(与对照相比，p《0.05)。
44.图12.im-pop、agnps、im-pop-ag的体内抗菌效力。a)各时间点im-pop、agnps、im-pop-ag以及相应对照组pbs对km小鼠背部金黄色葡萄球菌感染伤口的代表性伤口照片；b)相应伤口收缩率与时间曲线；c)给药期间小鼠体重的变化d)4个组第14天创面组织h&e和masson三色染色图像。比例尺为200μm。
45.图13.建模第一天和治疗第十天各组伤口处的细菌量。
46.图14.不同处理后小鼠主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的h&e染色(比例尺为200μm)。
47.图15.各组小鼠再治疗14天后的血常规。图15a)红细胞(rbc)、图15b)白细胞(wbc)、图15c)平均红细胞体积(mcv)、图15d)平均红细胞血红蛋白浓度(mchc)、图15e)血红蛋白(hgb)、图15f)红细胞比容(hct)、图15j)平均红细胞血红蛋白量(mch)、图15h)血小板(plt)。
具体实施方式
48.实施例1制备本发明抗菌剂im-pop-ag
49.1.咪唑基有机多孔聚合物im-pop的制备
50.向圆底烧瓶中加入咪唑-2-甲醛(3.42g，35.7mmol)和三聚氰胺(1.50g，11.9mmol)，加入50ml dmso作为溶剂。然后在氩气保护下，在180℃下搅拌混合物3天，加热反应结束后，收集固体产物。
51.为除去未反应的组分，将收集的固体加入100ml丙酮中，并在45℃下搅拌6h。
52.然后，在搅拌下，先后用四氢呋喃(100ml，55℃下3h)和二氯甲烷(100ml，60℃下6h)清洗固体。
53.最后收集固体，在真空干燥箱中80℃干燥，得到咪唑基有机多孔聚合物im-pop 3.1g。
54.2.负载纳米银多孔有机聚合物im-pop-ag的制备
55.s2-1、准确称取咪唑基有机多孔聚合物im-pop(75.0mg)，置于玛瑙研钵中在甲醇(1ml)中，研磨30min至纳米级。用甲醇(45ml)从研钵中冲洗研磨的im-pop，并收集到100ml圆底烧瓶中，使咪唑基有机多孔聚合物在甲醇中的浓度为1.6mg/ml，充分分散，得到反应体系。
56.s2-2、向s2-1得到的反应体系中注射agno3溶液(12ml，8.75mg/ml)加入圆底烧瓶中，所述agno3与咪唑基有机多孔聚合物的质量比例为1.4：1。
57.然后除去未反应的agno3和游离的纳米银，具体操作为：将反应产物通过旋转蒸发器在50℃下除去溶剂。完全除去溶剂后，用蒸馏水(30ml)清洗所得固体5次，以9000rpm,5min离心，收集沉淀，获得负载银离子的多孔有机聚合物110mg。
58.s2-3、将s2-2得到的负载银离子的多孔有机聚合物溶于体积比为3:2的甲醇和水
的混合溶剂(30ml)中，随后在磁力搅拌下缓慢加入15ml nahb4(227mg，6.0mmol)甲醇溶液。用滤纸密封烧杯，持续搅拌2天。样品用水和甲醇洗涤3次，除去游离的agnps和其他杂质。最后，用真空干燥箱干燥样品。本实施例制备得到的负载纳米银多孔有机聚合物im-pop-ag粒径为：500nm。
59.对比例1合成agnps
60.按上述实验工艺制备agnps。向30ml水中加入agno3(105.0mg，0.618mmol)。涡1min后，在磁力搅拌下向溶液中缓慢加入15ml nabh4的甲醇溶液(227mg nahb4)，用滤纸密封烧杯，搅拌2天。用水和甲醇清洗产物3次，并在真空干燥箱中干燥。
61.实验例1表征
62.本发明im-pop-ag复合材料是通过两步法合成的。最初，pop载体是通过无催化剂席夫碱化学方法，通过容易获得和工业批量生产的咪唑-2-甲醛和三聚氰胺的共聚制备的。然后，ag

通过配位自组装螯合到富含n的pop上。随后，ag

螯合pop被nabh4进行原位化学还原，得到agnps包裹的im-pop复合材料(图1)。
63.为了验证agnps成功地装载进多孔的im-pop，经行了一系列表征，包括x射线衍射(xrd)，傅里叶变换红外光谱法(ftir)，元素分析(ea)，电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)，热重分析(tga)，比表面积测试(bet)和x射线光电子能谱(xps)。
64.(1)用zetasizernanozs90(malvern instruments,malvern,uk)在25℃温度下测量im-pop-ag和agnps的粒度分布(图4)。
65.结果显示：利用zetasizernanozs90提供的数据采集软件通过动态光散射(dls)测量制备材料的粒度分布(psd)和zeta电位值从可以看出，发现agnps的psd主要在200nm左右(图4a)，而，加载agnps后，psd集中在500nm左右(图4b)。在图4中，im-pop和agnps的zeta电位分别约为 20和-40mv。这样的电位差有利于银纳米颗粒的负载。将agnps包封后，im-pop的电位从 20mv下降到-20mv，证明带负电荷的agnps成功地装载到im-pop的骨架中(图4c)。通过icp-oes精确测量的im-pop-ag的agnps装载内容是26wt％，比在表1总结的以前报导的多孔的负载高得多。
66.表1.比较其他多孔抗菌剂的载银含量
[0067][0068]
(2)通过透射电镜(tem)和扫描电子显微镜(sem,jsm-6510)观察im-pop-ag的形貌(图5)。
[0069]
结果显示：从sem(图5a和5b)可以清楚地看出，im-pop-ag由不规则球形颗粒组成。图5c-e所示的tem验证了agnps在多孔骨架中的存在，由此可以清楚地观察到分配给纳米级ag颗粒的广泛分布的纳米颗粒(黑点)。而且，与xrd结果相似，im-pop-ag中agnps的晶体结构可以通过hrtem进一步验证(图5f)，其中可以观察到分配给agnps的(111)板的晶格间距为0.24nm的清晰晶格间距。im-pop-ag的元素图谱显示ag、c、o和n在多孔骨架上均匀分布(图5g)。
[0070]
(3)通过傅里叶变换红外光谱法(ft-ir，vertex70)获得红外数据(图2a和3a)。
[0071]
结果显示：可以清楚地观察到三嗪环的象限(1549cm-1
)和半圆伸缩(1481cm-1
)对应的明显条带，以及3124-2540(nh-n)、1543(n-h)和1448(三嗪环伸缩)之间咪唑区的特征振动峰。同时，归因于各自三聚氰胺和咪唑单体的-nh2(3465、3419和1651cm-1
)和-cho(1641和2842cm-1
)的特征伸缩振动几乎减弱。相反，由于-cho和-nh2的聚合，在2910cm-1
处出现了亚甲基(-ch-)的新振动带。所有这些结果表明三聚氰胺和咪唑成功地掺入了im-pop的多孔骨架中。如图2a所示，除了归因于ag与富含n骨架配位的1000～1600cm-1
处的微小红移外，im-pop-ag的ftir与纯im-pop几乎重叠。这样的结果表明，在加载agnps后，pop的结构被很好地保留了。
[0072]
(4)通过固态核磁测定im-pop的碳谱
[0073]
结果显示：从im-pop的
13
cnmr中可以同时观察到三聚氰胺(164ppm)和咪唑(130.9、136.6和150.6)ppm的清晰碳信号。同时，还可以检测到55ppm的清晰碳信号，这归因于新形成的亚甲基(图2b)。
[0074]
(5)通过电感耦合等离子体(icp)原子发射光谱仪(icp-oes730,agilent technologies,japan)测定im-pop-ag中的银元素含量。
[0075]
结果显示：im-pop-ag的银含量为26wt％。
[0076]
(6)通过科学的x射线衍射仪(xrd)测量了银元素的价态(图3b)。
[0077]
结果显示：图3b中im-pop的xrd显示了无特征峰，证明为无定形骨架结构。然而，在38.12
°
，44.19
°
，64.35
°
，77.19
°
，81.53
°
的清晰衍射山峰，分配到agnps的(111)，(200)，(220)，(331)，(222)晶面从im-pop-ag的xrd模式被检测，证明agnps的成功地封装进n丰富的im-pop网络。
[0078]
(7)采用物理气体吸附性能试验(bet，asap 2460，us)检测im-pop和im-pop-ag的比表面积和孔隙分布(图3e、图3f)。
[0079]
结果显示：im-pop(图3d)遵循ⅱ型可逆吸附等温线，表明大孔的广泛存在，有利于agnps的负载。28计算的brunauer-emmett-teller(bet)表面区域为im-pop-ag是31.55m2 g，比im-pop(137.69m2g)小得多，进一步证实了纳米银的装载。
[0080]
(8)通过thermos重量分析仪(tg,ta discover,us)检测im-pop和im-pop-ag的热稳定性(图3c)。
[0081]
结果显示：im-pop-ag，在800℃时仍保持初始值的66.5％，比impop高36.5％。
[0082]
(9)采用x射线光电子能谱技术(xps)检测im-pop-ag中n、c、ag和o的共存性(图6a)。
[0083]
结果显示：im-pop-ag中n、c、ag和o的原子含量分别为30.43、55.23、7.44和6.91(％)(表2)。
[0084]
表2.根据xps光谱计算的im-pop-ag表面元素含量
[0085][0086]
(9)高分辨率xps光谱检测im-pop-ag(图6b和图6c)。
[0087]
结果显示：367.4和373.4ev处的峰值，自旋能量分离为6.0ev，表明im-pop-ag中存在金属ag0，揭示了agnps在富含n的多孔骨架上的成功组装。397.8ev处的峰证明存在ag-n，证明agnps通过n元素作为结合位点固定在im-pop骨架上。
[0088]
上述所有表征表明，agnps成功地加载到im-pop中。
[0089]
实验例2体外细菌生长抑制试验
[0090]
将分别作为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌模型的大肠杆菌(atcc 8739)和金黄色葡萄球菌(atcc 25922)的单个菌落分别转移至3ml luria-bertani(lb)培养基(含胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 10g/l、ph＝7.4)，在37℃振荡培养箱中以230rpm过夜生长。在lb培养基中用磷酸盐缓冲液(pbs，ph＝7.4)稀释新鲜菌株，以获得所需浓度。接种于900μl agnps(200、100、50μg ml-1
)或im-pop-ag(50、25、12.5μg ml-1
)不同处理的lb培养基中的细菌(100μl 105cfu ml-1
)在37℃振荡培养箱中培养12h。取各样品处理后的菌液70μl均匀涂布于lb平板上。在恒温培养箱中于37℃下倒置孵育16小时。计数平板上生长的菌落数。(图7)。
[0091]
图7a)为实施例1制备的im-pop-ag和对比例1制备的agnps处理大肠杆菌形成的细菌菌落照片，其中第一排由左至右分别为0、12.5、25、50μg/ml的agnps处理，第二排由左至右分别为0、50、100、200μg/ml的im-pop-ag处理。
[0092]
图7b)为不同浓度(0、12.5、25、50μg/ml)对比例1制备的agnps对大肠肠杆菌处理后的细菌存活率。
[0093]
图7c)为不同浓度(0、50、100、200μg/ml)实施例1制备的im-pop-ag对大肠肠杆菌处理后的细菌存活率。
[0094]
图7d)为实施例1制备的im-pop-ag和对比例1制备的agnps处理金黄色葡萄球菌形成的细菌菌落照片，其中第一排由左至右分别为0、12.5、25、50μg/ml的agnps处理，第二排由左至右分别为0、50、100、200μg/ml的im-pop-ag处理。
[0095]
图7e)为不同浓度(0、12.5、25、50μg/ml)对比例1制备的agnps对金黄色葡萄球菌处理后的细菌存活率。
[0096]
图7f)为不同浓度(0、50、100、200μg/ml)实施例1制备的im-pop-ag对金黄色葡萄球菌处理后的细菌存活率。
[0097]
结果显示：采用平板计数法对实施例1制备的合成的im-pop-ag和对比例1制备的agnps的抗菌性能进行了估算。
[0098]
图7a-c给出了对大肠杆菌平板的抗菌结果。对照组设定为0μg ml-1
浓度，可以清楚地看到，随着浓度的增加，agnps的抗菌作用略有增加。然而，由于纯agnps在使用过程中的严重聚集，即使在50μg ml-1
的浓度下，细菌仍然表现出12.19％的存活率，这远不能令人满意。在等量的银浓度的条件下，im-pop-ag组的抑菌效果远优于agnps组。当im-pop-ag的浓
度为200μg/ml(相当于50μg/ml agnps)时，大肠杆菌存活率仅为3.44％。
[0099]
制备样品对金黄色葡萄球菌的抗菌结果见图7d-f。与对大肠杆菌的结果一致，随着浓度的增加，agnps对金黄色葡萄球菌的抗菌作用也略有增加。agnps浓度为50μg/ml时细菌存活率为20.20％。而在相同含银浓度下，200μg/ml im-pop-ag金黄色葡萄球菌存活率为9.62％。
[0100]
这些结论证实agnps在im-pop上的固定后可以有效地提高对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用。
[0101]
实验例3抑菌圈试验
[0102]
将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌悬液(100μl 106cfu ml-1
)均匀涂布在琼脂平板表面。然后，在每个培养板的中心放置直径为6mm的无菌滤纸。然后，将完全溶于pbs的实施例1制备的im-pop-ag(8μl，200μg ml-1
，相当于50μg ml-1
agnps)和对比例1制备的裸agnps(8μl，50μg ml-1
)加入相应的滤纸中。pbs(8μl)和实施例1步骤(1)制备的im-pop(8μl，50μg ml-1
)用作阴性对照组。将所有平板置于37℃培养箱中24h。用直尺测量的抑菌圈周围的平均直径表示对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性。pbs和实施例1步骤(1)制备的im-pop用作阴性对照组。将所有平板置于37℃培养箱中24h。通过抑菌圈直径指示对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的潜在活性(图8)。
[0103]
图8a)为pbs、实施例1步骤(1)制备的im-pop、实施例1制备的im-pop-ag和对比例1制备的agnps处理大肠杆菌形成的抑菌圈照片。
[0104]
图8b)为pbs、实施例1步骤(1)制备的im-pop、实施例1制备的im-pop-ag和对比例1制备的agnps处理金黄色葡萄球菌形成的抑菌圈照片。
[0105]
图8c)为pbs、实施例1步骤(1)制备的im-pop、实施例1制备的im-pop-ag和对比例1制备的agnps处理大肠杆菌的抑菌圈直径直方图。
[0106]
图8d)为pbs、实施例1步骤(1)制备的im-pop、实施例1制备的im-pop-ag和对比例1制备的agnps处理金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径直方图。
[0107]
结果显示：通过纸片抑菌法进一步测定了im-pop-ag、im-pop和agnps对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抗菌活性，pbs组提供阴性对照，zoi(zone of inhibition，抑菌圈)的大小反映了样品生长细菌的能力，或细菌对试剂的敏感性，分别如图8a和8b所示。im-pop-ag组的zoi明显优于pbs、im-pop和agnps组。
[0108]
图8c和8d展示了孵育24h后pbs、im-pop、agnps和im-pop-ag在各自大肠杆菌和金黄色葡萄球菌上的zoi直径。与大肠杆菌24h后，im-pop-ag的zoi为12.37
±
0.41mm，远大于im-pop组(0.3
±
0.28mm)和agnps组(7.39
±
0.37mm)(图6c)。在金黄色葡萄球菌中也出现了同样的现象，im-pop-ag的zoi(11.46
±
0.21mm)在金黄色葡萄球菌处理24h后明显强于im-pop(0.3
±
0.28mm)和agnps(6.82
±
0.1mm)组。说明im-pop-ag对细菌敏感，比im-pop和agnps具有更强的抗菌活性。由此可见，将agnps包裹到im-pop中可以有效提高抗菌能力，这与细菌平板计数法得到的结论一致。
[0109]
实验例4细菌活/死染色
[0110]
碘化丙啶(propidium iodide,pi)和绿色荧光核酸染料syto-9的作用用于区分活细菌和死细菌。使用混合染料碘pi和syto-9进行活/死细菌细胞染色。syto-9是一种绿色染料，能够将细菌细胞标记为绿色，这是由于穿透了所有的细菌细胞膜(完整和受损)可以同
时染色活细菌和死细菌。pi是一种红色染料，只能穿透损伤的细胞膜来标记细胞为红色，仅染色细胞膜受损的死细菌。如果细菌存活得更多，细菌被活/死染料染色后，被染成绿色的细菌就越多。如果存活的细菌较少，则活/死染料染色后染成红色的细菌越多。
[0111]
本实验培养用pbs、im-pop(150μg/ml)、agnps(50μg/ml)、im-pop-ag(200μg/ml)处理的100μl大肠杆菌或金黄色葡萄球菌(108cfu ml-1
)，并用1μl pi(1.0
×
10-3
μm)和2μlsyto-9(1.5
×
10-3
μm)在37℃避光条件下处理15min进行活/死染色。染色后，用pbs离心处理样本，以除去过量的syto-9和pi。使用共聚焦荧光显微镜捕获染色的金黄色葡萄球菌和大肠(图9)。
[0112]
结果显示：im-pop组与pbs对照组相似，几乎未见红色荧光，表明im-pop组对金黄色葡萄球菌和大肠的杀灭作用不大。而agnps和im-pop-ag中出现大量红色荧光，表明agnps和im-pop-ag能有效杀灭细菌。im-pop-ag几乎没有绿色荧光，而agnps有少许绿色荧光，表明im-pop-ag的杀菌作用优于agnps。
[0113]
实验例5细菌的透射电子显微镜扫描
[0114]
透射电镜(tem)对细菌内部结构变化进行了较深入的观察，为了了解im-pop-ag的抗菌机制，我们采集了细菌的透射电镜图像。离心(5000rpm，3min)后收集细菌。细菌用2.5％戊二醛溶液(4℃，24h)固定，pbs洗涤，琼脂包埋，封闭，锇酸固定，梯度乙醇溶液(30％、50％、70％、90％、95％、100％)室温脱水10min，丙酮室温脱醇3h，并经包埋剂梯度穿透包埋，负染，切片后置于镍网上进行tem观察(图10)。
[0115]
图10a-d)依次为pbs、im-pop、agnps和im-pop-ag处理后获得金黄色葡萄球菌；
[0116]
图10e-h)依次为pbs、im-pop、agnps和im-pop-ag处理后获得大肠杆菌。
[0117]
结果显示：im-pop以150μg ml-1
的浓度处理金黄色葡萄球菌12h后与pbs(对照)组的结果相似，很好地保留金黄色葡萄球菌的光滑表面。相比之下，与裸agnps(50μg ml-1
)孵育12h后，金黄色葡萄球菌的细胞表面变得粗糙。用im-pop-ag(200μg ml-1
)孵育12h后，金黄色葡萄球菌失去细胞膜的完整性。同时，在细菌表面形成了许多水泡，这可以归因于带正电荷的聚合物通过静电相互作用渗透到带负电荷的细胞膜中。类似地，用pbs(对照)和im-pop处理后，杆状大肠肝菌也显示表面光滑。而im-pop-ag和agnps处理的大肠杆菌形态发生了显著变化，其细胞膜不完整和塌陷。因此，银纳米粒子与带正电荷的咪唑基聚合物骨架的协同作用共同损伤细菌细胞膜，不仅导致细胞内成分从细胞质中漏出，而且扰乱细菌功能，最终导致细菌死亡。
[0118]
实验例6溶血试验
[0119]
溶血试验是评价材料生物相容性的重要指标之一。如果材料与红细胞的相容性较低，则会破坏红细胞的结构，引起溶血。根据国际标准化组织(iso)规定，溶血率超过5％可被视为溶血。从而进行溶血试验，检查实施例1步骤(1)制备的im-pop、agnps和im-pop-ag对红细胞是否有破坏作用。从km小鼠(源自swiss小鼠)获得新鲜血液。1500rpm离心20min收集红细胞(rbc)，然后用pbs洗涤3次。然后将rbc(4％w/w)与不同浓度(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的im-pop、agnps和im-pop-ag以1：9v/v的比例在37℃孵育3h，然后以12000rpm离心20min。然后，通过紫外可见光谱法在540nm处测定。蒸馏水作为阳性对照，pbs作为阴性对照。使用公式计算溶血。
[0120]
溶血率(％)＝(as-an/(ap-an)
×
100％
[0121]
其中“as”是向红细胞悬液中加入im-pop、agnps和im-pop-ag产生的吸光度。“an”代表向红细胞悬液(阴性对照)中加入pbs产生的吸光度。“ap”是指向红细胞悬液(阳性对照)中加入蒸馏水产生的吸光度(图11)。
[0122]
图11a)为pbs、水、实施例1步骤(1)制备的im-pop(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)溶血率直方图和图片。
[0123]
图11b)为pbs、水、对比例1制备的agnps(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)溶血率直方图。
[0124]
图11c)为pbs、水、实施例1制备的im-pop-ag(12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)溶血率直方图。
[0125]
结果显示：随着浓度的增加，im-pop和im-pop-ag的溶血率略有增加，在12.5～200μg/ml浓度范围内的总体水平保持在4％以下，表明im-pop-ag和im-pop均具有良好的生物相容性。然而，随着浓度的增加，裸agnps组的溶血率逐渐增加。即使在50μg/ml的低浓度下，裸agnps组的溶血率也为9.35％。当浓度增加到200μg/ml时，溶血率达到23.14％，表明裸agnps对红细胞有毒性。且主要是由于溶液中裸agnps与rbc的细胞膜直接接触，导致溶血。im-pop-ag可以有效减少其中锚定的ag与红细胞的直接接触，从而降低溶血率。
[0126]
实验例7细胞毒性试验
[0127]
细胞毒性是评价材料生物相容性的又一重要指标。我们选择小鼠成纤维细胞上(l929细胞，源自美国atcc细胞库)来测试im-pop、agnps和im-pop-ag的细胞毒性。mtt活力测定法测定对比例1步骤(1)制备的im-pop材料、对比例1制备的agnps和实施例1制备的im-pop-ag对l929细胞的细胞毒性，在含10％(v/v)胎牛血清和1％青霉素/链霉素的培养基中37℃、5％co2气氛中培养。将细胞(每孔8
×
103)接种于96孔培养板中，孵育24h，去除培养基后，加入含不同浓度(6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的im-pop、agnps、im-pop-ag的新鲜培养基。孵育20h后，加入10μl mtt溶液(5mg/ml)，再孵育细胞4h，然后用150μl二甲基亚砜(dmso)替换各孔中的培养基。通过bio-tekelx800酶标仪(biotek,us)测定490nm波长处的吸光度值。计算细胞活力(％)。体外生物相容性研究中，用不同浓度的im-pop、agnps、im-pop-ag孵育细胞24h，标准mtt法计算细胞活力。
[0128]
图11d)为pbs、水、实施例1步骤(1)制备的im-pop(6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的细胞活力直方图。
[0129]
图11e)为pbs、水、对比例1制备的agnps(6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的细胞活力直方图。
[0130]
图11f)为pbs、水、实施例1制备的im-pop-ag(6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的细胞活力直方图。
[0131]
结果显示：随着im-pop和im-pop-ag浓度的增加，细胞存活率基本不变，可维持在85％以上。而从图11e可以看出，细胞存活率在很大程度上与agnps溶液的浓度有关，随着agnps浓度的增加，agnps溶液的浓度显著下降。在ag浓度为50μg ml-1
时，裸agnps的细胞毒性最低，细胞存活率为73.86％(im-pop-ag为93.95％)。当agnps浓度为200μg ml-1
时，降低至63.93％(图11e)。这样的结果揭示了agnps包裹到im-pop中可以显著提高生物相容性，使其能够在体内应用。
[0132]
实验例8体内伤口愈合试验
pop和pbs覆盖的伤口相比已经结痂，这些伤口的收缩分别为27.81％(pbs)、28.31％(im-pop)、33.45％(agnps)和41.24％(im-pop-ag)。第14天，pbs和im-pop组处理的创面收缩分别为66.19％和69.19％。但是，im-pop-ag治疗伤口在第14天几乎完全愈合。而agnps处理14d后创面收缩仅为86.53％。说明im-pop-ag能减少创面处细菌侵袭，加速创面愈合过程(图12a和图12b)。
[0148]
同时，在14天给药期间，动物行为无显著异常，体重无显著变化(图12c)。
[0149]
使用苏木精和伊红(h&e)以及masson’s三色染色估计14天后不同材料的伤口愈合情况。对金黄色葡萄球菌感染的伤口进行组织学分析表明，agnps组和im-pop组有新的毛细血管和皮肤生长，而对照组和im-pop组未发现表皮结构。与agnps组相比，im-pop-ag组呈现较少的炎性细胞和较多新产生的腺体、毛细血管和胶原沉积。低水平的炎症可加速伤口愈合，尤其是在早期阶段。因此，im-pop-ag可以加速伤口的重建得益于低生物毒性和高抗菌性的整合特性(图12d)。
[0150]
治疗后第10天，创面取细菌再次培养。结果发现，对照组和im-pop组伤口中呈现大量的金色细菌，而agnps和im-pop-ag中的细菌明显减少。有趣的是，im-pop-ag在伤口处几乎没有细菌滋生，结果表明agnps和im-pop-ag确实可以显著减少伤口处的细菌，持续高效地杀死细菌(图13)。
[0151]
毒理研究证实，im-pop-ag、im-pop和agnps对主要脏器(心、肝、脾、肾和肺)无明显炎性损伤或形态学损伤(图14)。
[0152]
组间所有血常规分析均无明显差异(图15)。