沙蚕蛋白酶降解冠状病毒刺突蛋白作用在医药中的应用的制作方法

1.本发明公开了沙蚕蛋白酶降解肺炎冠状病毒刺突蛋白（spikeprotein，简称s蛋白）的药物应用，可以降解破坏病毒s蛋白，此s蛋白是指sars-cov-1， sars-cov-2病毒的刺突蛋白。提供了沙蚕蛋白酶新的药用用途，属于医学制药技术领域。
技术背景
2.上述二类肺炎冠状病毒，均可引起重症急性呼吸系统综合症（sars）。这二类病毒是均单股正链rna病毒，其编码的s 蛋白的结构和功能类似，是病毒感染宿主的关键结构。病毒感染过程：s蛋白中的受体结合域（rbd）与宿主肺泡表面的受体（血管紧张素转化酶-2，简称ace-2）结合，宿主细胞的弗林酶（furin）、跨膜丝氨酸蛋白酶ii（tmprss2）等蛋白酶水解s蛋白，断裂成2段，简称s1蛋白和s2蛋白，s1蛋白含有rbd，s1蛋白还可通过结合宿主细胞上的nrp（neuropilin，神经毡蛋白）受体继续感染细胞。s2蛋白中的融合肽结构域与受体细胞膜蛋白融合，病毒rna基因组进入细胞，完成感染细胞过程，在细胞中病毒基因组进行复制，产生新的病毒；s蛋白是新冠病毒的结构基础和感染宿主细胞的功能基础，因此，降解破坏s蛋白将阻断病毒的感染过程。
3.s蛋白是疫苗和药物研发的重要靶点，迄今为止，还没有以降解破坏s蛋白为目标的药物或制剂出现。
4.沙蚕蛋白酶是从沙蚕分离提取加工的一类蛋白酶，包括：酸性丝氨酸蛋白酶和碱性丝氨酸蛋白酶。例如，njf（日本刺沙蚕纤溶酶 neanthes japonica(iznka) fibrinolytic enzyme，uni prot ，p86330），属于酸性丝氨酸蛋白酶，njp(日本刺沙蚕新的碱性丝氨酸蛋白酶, novel alkaline serine protease, uni prot, p86834）属于碱性丝氨酸蛋白酶。从日本刺沙蚕和双齿围沙蚕提取分离加工的酸性丝氨酸和碱性丝氨酸蛋白酶，统称沙蚕丝氨酸蛋白酶（serine proteinase from nereis succinea ），或简称沙蚕蛋白酶。从沙蚕制备的纤溶酶也属于沙蚕蛋白酶。例如，双齿围沙蚕纤溶酶也是沙蚕蛋白酶，有纤维蛋白溶解作用，故也称为纤溶酶。前期实验用生色底物s-2238,s-2251和s-2444证实，沙蚕蛋白酶裂解底物蛋白的靶点，在于蛋白中的赖氨酸残基（k）和精氨酸残基（r）的羧基端（c）肽键。


技术实现要素：

5.本发明公开了沙蚕蛋白酶降解冠状病毒刺突蛋白作用在医药中的应用，可以降解破坏冠状病毒刺突蛋白，制备治疗药物。
6.本发明所述的沙蚕蛋白酶包括：从日本刺沙蚕和双齿围沙蚕提取制备的酸性丝氨酸蛋白酶、碱性丝氨酸蛋白酶、沙蚕丝氨酸蛋白酶、沙蚕纤溶酶等。
7.本发明中所述的冠状病毒s蛋白为统称，包括：全长刺突蛋白s(spike protein, 简称s蛋白),刺突蛋白s1亚基（spike protein s1,简称s1蛋白），刺突蛋白受体结合域（receptor binding domain），所述的是rbd融合蛋白，rbd-mousefc，简称rbd。本发明中所
述的全长s蛋白，包括野生型、alpha、delta新冠肺炎（sars-cov-2）病毒和sars(sars-cov-1)的s蛋白。s1蛋白为野生型新冠肺炎（sars-cov-2）的s1蛋白，rbd为新冠肺炎病毒（sars-cov-2）的融合蛋白。本发明所述的沙蚕蛋白酶降解破坏s蛋白和相关蛋白的实验1、s蛋白、s1蛋白、rbd蛋白皆为，皆为商品化试剂，冻干蛋白粉剂。按实施例中的说明，溶解于反应体系中；沙蚕蛋白酶为提取的冻干粉剂，按实施例中的说明，溶于反应体系中；s蛋白表观分子量，大约150kd；s1蛋白表观分子量，大约110kd；rbd蛋白表观分子量，大约55kd；2、反应体系是在eppendorf反应管中，先后按计划加入酶和底物（s蛋白，或s1蛋白，或rbd蛋白）；反应条件，20
µ
l，40℃,按计划持续保温时间60分钟；3、反应结束后，加入上样缓冲液，常规变性处理。然后将各管中反应物，做十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page），浓缩凝胶浓度为5%，分离胶为12%；工作电压，浓缩胶80v,分离胶120v；电泳时间约3小时。电泳分离样品后，做考马斯亮蓝r250染色、乙酸乙醇溶液常规脱色，观察；4、sds-page体系试剂盒、普通page体系试剂盒、蛋白质分子量标准品，皆为商品化产品。
8.上述实验验表明：本发明利用沙蚕蛋白酶降解s蛋白（全长s蛋白分子中含s1、rbd和s2片段）、s1蛋白、rbd蛋白，具有高度敏感性和显著性。以沙蚕蛋白酶作为药物制剂的主要成分，能迅速降解全长s蛋白和局部s1蛋白、rbd蛋白及s2蛋白。
9.s蛋白是冠状病毒的结构成分和感染宿主细胞的功能基础，因此，降解破坏s蛋白将阻断病毒的感染过程。
10.本发明的积极效果在于：提供了沙蚕蛋白酶新的药用作用，能够降解破坏冠状病毒s蛋白，可以迅速降解全长s蛋白和局部s1蛋白及rbd蛋白，具有高度敏感性和显著性；提供了以沙蚕蛋白酶作为药物制剂的主要成分，制备制剂。本发明具有直观、灵敏、高度可重复性，高度可信性。
11.本发明涉及的沙蚕蛋白酶对冠状病毒的s蛋白和其片段s1蛋白、rbd蛋白具有显著降解作用，降解作用强而迅速。沙蚕蛋白酶的注射制剂，可以作为以降解s蛋白为目标的药物，可能成为一种全新的治疗冠状病毒肺炎的药物。
12.本发明公开了沙蚕蛋白酶降解破坏病毒s蛋白的作用，沙蚕蛋白酶可以迅速降解破坏全长s蛋白和s1蛋白及rbd蛋白，其作用具有高度敏感性和显著性；提供了以沙蚕蛋白酶作为药物制剂的主要成分，用于制备以降解破坏冠状病毒s蛋白为目标的药物的实验基础，本发明使用的方法，具有直观、灵敏、高度可重复性，高度可信性。
13.以沙蚕蛋白酶为主要活性成分制成的注射制剂，可以作为以降解s蛋白、s1蛋白、rbd蛋白为靶标的药物，可成为一种全新的治疗冠状病毒肺炎的药物。
附图说明
14.图1为本发明酸性丝氨酸蛋白酶（asp）降解野生型s蛋白的剂量动力学实验电泳图；图2为本发明酸性丝氨酸蛋白酶（asp）降解野生型s1蛋白的剂量动力学实验电泳
图；图3为本发明酸性丝氨酸蛋白酶（asp）降解野生型rbd重组蛋白实验电泳图；图4为本发明碱性丝氨酸蛋白酶（bsp）降解野生型s1蛋白的剂量动力学实验电泳图；图5为本发明沙蚕纤溶酶（c）降解野生型s蛋白实验电泳图；图6为本发明酸性丝氨酸蛋白酶（asp）降解alpha突变株s蛋白的剂量动力学实验电泳图；图7为本发明酸性丝氨酸蛋白酶（asp）降解delta突变株s蛋白的剂量动力学实验电泳图；图8为本发明酸性丝氨酸蛋白酶（asp）降解sars（sars-cov-1）s蛋白的剂量动力学实验电泳图；图9为沙蚕蛋白酶制剂图。
具体实施方式
15.通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
16.实施例1酸性丝氨酸蛋白酶（asp）降解s蛋白的剂量动力学实验取5只eppendorf试管，加入相关试剂，每个反应管中含有10
µ
g底物，s蛋白（即野生型肺炎新冠病毒spike protein ），酶（酸性丝氨酸蛋白酶，asp）含量分别为：50
µ
g、1
µ
g、0.2
µ
g、0.04
µ
g、0.008
µ
g。反应条件为40℃,60分钟；结果见图1，图中1泳道为蛋白分子量标准，单位kd；2泳道为s蛋白对照，剂量为10
µ
g，3泳道为沙蚕蛋白酶asp对照，表观分子量约30kd，剂量为50
µ
g；4、5、6、7、8为5个沙蚕蛋白酶降解反应实施例，即：例1：反应管中10
µ
g s蛋白，a1酶50
µ
g， 4泳道；例2：反应管中10
µ
g s蛋白，a2酶 1
µ
g， 5泳道；例3：反应管中10
µ
g s蛋白，a3酶 0.2
µ
g， 6泳道；例4：反应管中10
µ
g s蛋白，a4酶0.04
µ
g，7泳道；例5：反应管中10
µ
g s蛋白，a5酶 0.008
µ
g，8泳道。
17.总结：各个反应管中，都没有完整的底物s蛋白存留，0.008
µ
g酶，足以在60分钟内，使全部的10
µ
g病毒s蛋白被降解，没有完整的s蛋白残留（8泳道），而1
µ
g酶可以使10
µ
gs蛋白完全彻底降解；由于s蛋白的降解，结构破坏，病毒必定失去感染宿主细胞的能力；10
µ
g底物与0.008
µ
g酶剂量比为1250倍；此实施例证明，酶有强力降解病毒s蛋白的能力。
18.实施例2asp降解s1蛋白的剂量动力学实验取5只eppendorf试管，加入相关试剂，每个反应管中，含有10
µ
g底物s1蛋白（即肺炎新冠病毒s1亚单位蛋白），酶（酸性丝氨酸蛋白酶，asp）含量分别为50
µ
g、1
µ
g、0.2
µ
g、0.04
µ
g、0.008
µ
g；反应条件为40℃,60分钟；
结果见图2，图中，1泳道是牛血清白蛋白，分子量66kd，2泳道和10泳道为蛋白分子量标准，单位kd；3泳道为s1蛋白对照，表观分子量约为110kd，含量10
µ
g，4泳道为asp蛋白酶对照，表观分子量为30kd，含量为50
µ
g；5、6、7、8、9道为5个沙蚕蛋白酶降解反应实施例，即：例1：反应管中10
µ
g s1蛋白，a1酶50
µ
g， 5泳道；例2：反应管中10
µ
g s1蛋白，a2酶 1
µ
g， 6泳道；例3：反应管中10
µ
g s1蛋白，a3酶 0.2
µ
g，7泳道；例4：反应管中10
µ
g s1蛋白，a4酶0.04
µ
g，8泳道；例5：反应管中10
µ
g s1蛋白，a5酶0.008
µ
g，9泳道。
19.结论：各个反应管中，都没有完整的底物s1蛋白残留，而残留的s1降解产物，其分子量也远远低于s蛋白的降解产物（8、9泳道与图1中7、8泳道比较）；0.008
µ
g酶，足以使10
µ
g的病毒s1蛋白降解，没有完整s1蛋白残留，而1
µ
g酶量，可以使10
µ
g底物彻底降解；s1蛋白的降解，由于结构破坏，病毒必定失去感染宿主细胞的能力，达到治疗的目的。10
µ
g s1底物与0.008
µ
g酶剂量比为1250倍。此实施例证明，酶有强力降解病毒s1蛋白的能力,与s蛋白的降解比较，s1降解成更小的分子，更碎片化；s1蛋白是s蛋白的部分序列，其中含受体结合域rbd；与图1相比可见，s1蛋白更容易被沙蚕蛋白酶降解。
20.实施例3asp沙蚕蛋白酶降解rbd作用实验在eppendorf试管，加入相关试剂，每个反应管中，含有10
µ
g底物rbd蛋白（即肺炎新冠病毒rbd蛋白），酶（酸性丝氨酸蛋白酶，asp）含量分别为50
µ
g、1
µ
g、0.2
µ
g；反应条件为40℃,60分钟；例1：反应管中10
µ
grbd蛋白，b1酶50
µ
g，4泳道；例2：反应管中10
µ
grbd蛋白，b2酶 1
µ
g，5泳道；例3：反应管中10
µ
grbd蛋白，b3酶 0.2
µ
g，6泳道；结果见图3，即：4、5、6道为沙蚕蛋白酶降解反应实施例；结论：沙蚕蛋白酶50
µ
g、1
µ
g、0.2
µ
g都可以降解rbd重组蛋白；rbd是病毒s蛋白与受体ace-2结合的蛋白结构域，一旦rbd被降解破坏，病毒将不能感染宿主细胞。
21.实施例4碱性丝氨酸蛋白酶（bsp）降解s1蛋白的剂量动力学试验取5只eppendorf试管，加入相关试剂，每个反应管中，含有10
µ
g底物s1蛋白（即肺炎新冠病毒s1亚单位蛋白），酶（碱性丝氨酸蛋白酶，bsp）含量分别为50
µ
g、1
µ
g、0.2
µ
g、0.04
µ
g、0.008
µ
g；反应条件为40℃,60分钟；结果见图4：图中，1泳道b是牛血清白蛋白，分子量66kd，2泳道为s1蛋白，表观分子量大约110kd，含量10
µ
g；3泳道为碱性丝氨酸蛋白酶b1对照，表观分子量大约30kd,含量为50
µ
g；9泳道，11泳道是碱性丝氨酸蛋白酶bsp和酸性丝氨酸蛋白酶asp对照；碱性丝氨酸蛋白酶和酸性丝氨酸蛋白酶相比，表观分子量相似；4、5、6、7、8为bsp降解s1蛋白实施例，反应体积20
µ
l,反应时间60分钟，40℃；例1：反应管中10
µ
g s1蛋白，b1酶50
µ
g，4泳道；例2：反应管中10
µ
g s1蛋白，b2酶 1
µ
g，5泳道；例3：反应管中10
µ
g s1蛋白，b3酶 0.2
µ
g，6泳道；例4：反应管中10
µ
g s1蛋白，b4酶0.04
µ
g，7泳道；
例5：反应管中10
µ
g s1蛋白，b5酶0.008
µ
g，8泳道。
22.结果见图4。各个反应管中，都没有完整的底物s1蛋白存留；0.008
µ
g酶，反应60分钟，足以使10
µ
g的病毒s1蛋白降解；而1
µ
g酶量，足以使10
µ
g的病毒s1蛋白彻底降解；s1蛋白的降解，结构破坏，病毒必定失去结合与感染宿主细胞的能力，病毒结构被破坏，达到治疗的目的；10
µ
g病毒蛋白s1，与0.008
µ
g碱性丝氨酸蛋白酶bsp的酶剂量比，为1250倍。此实施例证明，bsp酶也具有强力降解病毒s1蛋白的能力,s1降解成更小的分子，更碎片化。
23.上述实验表明，碱性丝氨酸蛋白酶分子量与酸性相似，大约30kd，与酸性沙蚕丝氨酸蛋白酶相比，其降解新冠肺炎病毒s1蛋白同样是强有力和迅速的。
24.实施例5沙蚕纤溶酶对s蛋白的降解作用试验结果见图5。本试验采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法（native page）观察双齿围沙蚕纤溶酶（c）对s（即肺炎新冠病毒s蛋白）的降解作用，10%聚丙烯凝胶，常规电泳，考马斯亮蓝染色，醋酸乙醇液脱色。；实施例：双齿围沙蚕纤溶酶（c）200
µ
g，s蛋白20
µ
g，反应体积30
µ
l,40℃,60分钟；反应结束后，加入上样缓冲液，进行常规非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色脱色，进行观察。
25.结果见图5：图中，1泳道：s蛋白，含量为20ug；2泳道：双齿围沙蚕纤溶酶（c）100ug，3泳道：c酶100ug,s蛋白20
µ
g；结果显示，双齿围沙蚕纤溶酶能降解新冠肺炎病毒s蛋白。
26.实施例6酸性丝氨酸蛋白酶（asp）降解alpha变异株s蛋白的剂量动力学实验取5只eppendorf试管，加入相关试剂，每个反应管中含有10
µ
g底物，即s蛋白（即alpha肺炎新冠病毒spike protein ），酶（酸性丝氨酸蛋白酶，asp）含量分别为：100
µ
g、1
µ
g、0.2
µ
g、0.04
µ
g、0.008
µ
g，反应条件为40℃,60分钟。
27.结果见图6，图中1泳道为蛋白分子量标准，单位kd；2泳道为s蛋白对照，表观分子量约150kd,剂量为10
µ
g，3泳道为沙蚕蛋白酶asp对照，表观分子量约30kd，剂量为100
µ
g；4、5、6、7、8为5个沙蚕蛋白酶降解反应实施例，即：例1：反应管中10
µ
g s蛋白，a1酶100
µ
g， 4泳道；例2：反应管中10
µ
g s蛋白，a2酶 1
µ
g， 5泳道；例3：反应管中10
µ
g s蛋白，a3酶 0.2
µ
g， 6泳道；例4：反应管中10
µ
g s蛋白，a4酶0.04
µ
g，7泳道；例5：反应管中10
µ
g s蛋白，a5酶 0.008
µ
g，8泳道。
28.总结：各个反应管中，都没有完整的底物alpha株s蛋白存留，0.008
µ
g酶，足以在60分钟内，使全部的10
µ
g病毒s蛋白被降解，没有完整的s蛋白残留（8泳道），而1
µ
g酶可以使10
µ
gs蛋白完全彻底降解；由于s蛋白的降解，结构破坏，病毒必定失去感染宿主细胞的能力；10
µ
g底物与0.008
µ
g酶剂量比为1250倍；此实施例证明，酶有强力降解病毒s蛋白的能力。
29.实施例7酸性丝氨酸蛋白酶（asp）降解delta变异株s蛋白的剂量动力学实验取5只eppendorf试管，加入相关试剂，每个反应管中含有10
µ
g底物，即s蛋白（即delta肺炎新冠病毒spike protein ），酶（酸性丝氨酸蛋白酶，asp）含量分别为：30
µ
g、1
µ
g、
0.2
µ
g、0.04
µ
g、0.008
µ
g。反应条件为40℃,60分钟；结果见图7，图中1泳道为蛋白分子量标准，单位kd；2泳道为s蛋白对照，表观分子量约150kd,剂量为10
µ
g，3泳道为沙蚕蛋白酶asp对照，表观分子量约30kd，剂量为30
µ
g；4、5、6、7、8为5个沙蚕蛋白酶降解反应实施例，即：例1：反应管中10
µ
g s蛋白，a1酶 30
µ
g， 4泳道；例2：反应管中10
µ
g s蛋白，a2酶 1
µ
g， 5泳道；例3：反应管中10
µ
g s蛋白，a3酶 0.2
µ
g， 6泳道；例4：反应管中10
µ
g s蛋白，a4酶0.04
µ
g，7泳道；例5：反应管中10
µ
g s蛋白，a5酶 0.008
µ
g，8泳道。
30.总结：各个反应管中，都没有完整的底物delta株s蛋白存留，0.008
µ
g酶，足以在60分钟内，使全部的10
µ
g病毒s蛋白被降解，没有完整的s蛋白残留（8泳道），由于s蛋白的降解，结构破坏，病毒必定失去感染宿主细胞的能力；10
µ
g底物与0.008
µ
g酶剂量比为1250倍；此实施例证明，酶有强力降解病毒s蛋白的能力。
31.实施例8酸性丝氨酸蛋白酶（asp）降解sars-cov-1的s蛋白剂量动力学实验取5只eppendorf试管，加入相关试剂，每个反应管中含有10
µ
g底物，即s蛋白（即sars-cov-1肺炎冠病毒spike protein ），酶（酸性丝氨酸蛋白酶，asp）含量分别为：20
µ
g、4
µ
g、0.8
µ
g、0.16
µ
g、0.032
µ
g。反应条件为40℃,60分钟；结果见图8，图中1泳道为蛋白分子量标准，单位kd；2泳道为s蛋白对照,剂量为10
µ
g，3泳道为沙蚕蛋白酶asp对照，表观分子量约30kd，剂量为20
µ
g；4、5、6、7、8为5个沙蚕蛋白酶降解反应实施例，即：例1：反应管中10
µ
g s蛋白，a1酶 20
µ
g， 4泳道；例2：反应管中10
µ
g s蛋白，a2酶 4
µ
g， 5泳道；例3：反应管中10
µ
g s蛋白，a3酶 0.8
µ
g， 6泳道；例4：反应管中10
µ
g s蛋白，a4酶0.16
µ
g，7泳道；例5：反应管中10
µ
g s蛋白，a5酶 0.032
µ
g，8泳道实验表明，沙蚕蛋白酶也能够降解sars-cov-1的s蛋白。各个反应管中，都没有完整的底物delta株s蛋白存留，0.032
µ
g酶，足以在60分钟内，使全部的10
µ
g（sars）病毒s蛋白被降解，没有完整的s蛋白残留（8泳道），由于s蛋白的降解，结构破坏，病毒必定失去感染宿主细胞的能力；10
µ
g底物与0.032
µ
g酶剂量比为大约300倍；此实施例证明，沙蚕蛋白酶有较强降解sars病毒（sars-cov-1）s蛋白的能力,但是比降解sars-cov-2的s蛋白差。
32.以上实施例表明，沙蚕蛋白酶对新冠肺炎病毒的s蛋白和其片段s1蛋白、rbd蛋白具有显著降解作用，降解作用强而迅速，对sars病毒的s蛋白也有降解作用。
33.实施例9以沙蚕蛋白酶为主要活性成分制成降解s蛋白、s1蛋白、rbd蛋白为靶标的药物，包括按照药剂学的常规方法，将沙蚕蛋白酶加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂或修饰剂混合制成注射剂。