一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法及其应用与流程

技术特征：
1.一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)构建pta04-nirk
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重组表达质粒：首先基于嗜盐古菌(haloterrigena sp.)kzca68-1的基因组获得一条新型的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的基因nirk
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，进一步设计含有酶切位点ecori和bamhi的目的片段引物，利用常规pcr技术扩增目的片段nirk
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；通过分子克隆技术将nirk
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连接到pta04载体上构建重组质粒；(2)转化嗜盐古菌(haloferax volcanii)：将步骤(1)成功构建的重组质粒转化嗜盐古菌宿主，得到转化后的重组宿主细胞；所述宿主为菌株haloferax volcanii；将转化后的重组宿主细胞接种于hv-ypc液体培养基中进行活化培养，培养后得到培养液；再取培养液接种至hv-ypc液体培养基中摇瓶培养至稳定期，进一步离心收集菌体，低温保存备用；(3)重组亚硝酸盐还原酶的纯化收集步骤(2)保存的菌体于细胞裂解液中进行重悬，重悬后超声破碎细胞，离心后收集上清液，即粗酶液，将粗酶液用于重组蛋白纯化；首先采用镍柱亲和层析纯化获得含有咪唑的目的蛋白；最后利用凝胶过滤层析去除咪唑，获得高纯度的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶，记为nirk
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。2.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述嗜盐古菌(haloterrigena sp.)kzca68-1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种保藏号为cgmcc 22195，保藏日期为2021年4月16日。3.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述嗜盐古菌(haloferax volcanii)购自日本微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为：jcm 8879。4.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述hv-ypc培养基成分为：酵母提取物5.0g，大豆蛋白胨1.0g，酸水解酪素1.0g，kcl 4.2g，mgso4
·
7h2o 33.0g，mgcl2
·
6h2o 30.0g，nacl 144.0g，1m tris-hcl(ph 8.0)12.0ml，cacl2 0.33g，上述组分定容于1l蒸馏水中，调节ph至7.5，115℃灭菌30min。5.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述活化培养的条件为：37℃，180rpm培养3～4天；所述的低温保存的温度为-20℃。6.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的镍柱亲和层析纯化的具体操作为：首先20倍柱床体积的lysis buffer用于平衡镍柱；将离心后的上清液上样；然后使用缓冲液i洗脱杂蛋白；缓冲液ii洗脱目的蛋白，最后获得含有咪唑的目的蛋白。7.根据权利要求6所述的一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，所述缓冲液i成分为2m nacl，20mm tris-hcl，40mm咪唑，ph 8.0；所述缓冲液ii成分为2m nacl，20mm tris-hcl，250mm咪唑，ph 8.0；所述lysis buffer成分为2m nacl，20mm tris-hcl，ph 8.0。8.根据权利要求1所述的一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，
所述步骤(3)中所述凝胶过滤层析为利用pure蛋白分离纯化系统，hitrap
tm desalting层析柱去除咪唑，以lysis buffer为流动相，通过凝胶过滤层析获得高纯度的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶，即为nirk
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。9.根据权利要求8所述的一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，所述lysis buffer成分为2m nacl，20mm tris-hcl，ph 8.0。10.根据权利要求1～9任意一项所述的方法制备的嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶用于腌制食品、废水处理过程中降解亚硝酸盐的用途。

技术总结
本发明属于基因工程领域，涉及一种新型嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的制备方法及其应用；步骤为：首先基于嗜盐古菌(Haloterrigena sp.)KZCA68-1的基因组获得编码基因nirK


技术研发人员：崔恒林 殷雪矇 侯靖
受保护的技术使用者：江苏大学
技术研发日：2021.05.28
技术公布日：2022/3/3