一种热带假丝酵母菌株EP1及其应用的制作方法

concentration by the yeast candida tropicalis[j],biochem.eng.j.,2005, 24:243-247)以及丝状真菌(santos v l&linardi v r,biodegradation of phenol bya filamentous fungi isolated from industrial effluents-identification and degradationpotential[j],process biochem.2004,39:1001-1006)等，其中假丝酵母耐苯酚浓度可达2000mg/l，投加于活性污泥中可成为处理含酚废水的优势菌群，苯酚降解率可达95％以上，未投加菌种的活性污泥其对照苯酚降解率低60％(朱永光等, 活性污泥系统处理苯酚废水的生物强化效果[j],应用与环境生物学报,2006， 12(4):559-561)，皮状丝孢酵母(trichosporon cutaneum)(andras gaal&halina y. neujahr,metabolism of phenol and resorcinol in trichosporon cutaneum[j],j. bacteriol.,1979,137(1):12-31)以及trichosporon montevideense phe1(liu hui,yuqiming jimmy,wang guoxiang,ye fan,cong yanyan.biodegradation of phenol athigh concentration by a novel yeast trichosporon montevideense phe1.processbiochem,2011,46(8):1678-1681.)的耐酚浓度亦可达2000mg/l及以上。
[0005]
作为一种石油化工衍生产物和化工主要原料之一，苯酚以废物形式存在于环境之中时对环境构成威胁，而活性污泥法处理苯酚废水虽有成本低廉、处理简单等优势，但效率却受到制约，因为苯酚具有原生质毒性，多数菌种难以耐受浓度高于500mg/l的苯酚的毒性，导致去除速度缓慢；其次苯酚废水往往还含有高盐度，在一定的浓度范围内会对苯酚的生物降解产生抑制作用。因此寻求、开发能耐受高浓度苯酚、高盐度以及可快速生物降解苯酚的菌株具有重要的经济和科学意义。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术的不足，本发明提供一种热带假丝酵母菌株(candida tropicalis) ep1及其应用，该菌株具有降解高浓度苯酚及耐高kcl浓度、耐缺氧的能力。
[0007]
本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008]
一种热带假丝酵母菌株ep1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日：2021年7月13日，保藏编号：cgmcc no.22875。
[0009]
优选地，所述热带假丝酵母菌株ep1的rdna的its序列如seq id no.1 所示。
[0010]
一种热带假丝酵母菌株ep1在降解苯酚中的应用。
[0011]
一种热带假丝酵母菌株ep1在降解苯酚中的应用，实施以下方案之一：
[0012]
(1)将所述热带假丝酵母菌株ep1经至少一级种子培养后，接种于苯酚废水中进行降解；
[0013]
(2)将所述热带假丝酵母菌株ep1经苯酚废水驯化及活化处理后，接种于苯酚废水中进行降解；
[0014]
(3)将所述热带假丝酵母菌株ep1直接接种苯酚废水中进行降解。
[0015]
优选地，所述降解的温度为25℃～40℃。
[0016]
优选地，所述苯酚废水中还含有氯化钾，所述氯化钾的浓度≤30g/l。
[0017]
优选地，所述降解的过程中调节ph至碱性。
[0018]
优选地，步骤(1)所述苯酚废水中苯酚的浓度≤2000mg/l；当苯酚废水中苯酚的浓
度为2000mg/l时，降解时间为2天。
[0019]
优选地，步骤(2)所述苯酚废水中苯酚的浓度≤16000mg/l；当苯酚废水中苯酚的浓度≤12000mg/l时，所述热带假丝酵母菌株ep1可再生；当苯酚废水中苯酚的浓度＞12000mg/l时，所述热带假丝酵母菌株ep1不可再生；当苯酚废水中苯酚的浓度≤1500mg/l时，降解时间≤12h。
[0020]
优选地，步骤(3)所述苯酚废水中苯酚的浓度≤1000mg/l。
[0021]
本发明的有益效果如下：
[0022]
本发明提供了一株可降解、耐受高浓度苯酚及耐高kcl浓度(高盐度)的热带假丝酵母菌株candida tropicalis ep1，经过测试发现其具有快速降解去除浓度≤2000mg/l的苯酚的能力，耐受苯酚毒性能力达12000mg/l以上。可用于处理高浓度苯酚废水，降解过程嗜中温，能耐受氯化钾浓度高达30g/l，并可利用碱性ph的调节大幅提高其降解效率，有助于降低运行成本。
附图说明
[0023]
图1为candida tropicalis ep1的平板培养菌落图片；
[0024]
图2为candida tropicalis ep1的菌丝形态的显微图片：(a)为5倍镜；(b) 为40倍镜；(c)为100倍镜；
[0025]
图3为candida tropicalis ep1的降解温度范围；
[0026]
图4为candida tropicalis ep1对氯化钾的耐受情况；
[0027]
图5为candida tropicalis ep1在不同ph下对苯酚的降解情况；
[0028]
图6为经苯酚驯化及活化的candida tropicalis ep1细胞降解苯酚动力学；
[0029]
图7为经苯酚驯化及活化的candida tropicalis ep1细胞对不同浓度苯酚的降解情况。
具体实施方式
[0030]
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0031]
本发明中，除非特别指明，术语“苯酚降解菌”是指可以苯酚为唯一碳源和能源进行生长的微生物菌株，即菌株在增殖或代谢过程中可将苯酚降解为二氧化碳和水而去除。
[0032]
本发明中，除非特别指明，术语“含酚废水”或者“苯酚废水”是指工业过程中产生的含苯酚的有机污水。
[0033]
本发明中，除非特别指明，术语“碳源”是指微生物可利用的含碳物质，微生物利用该含碳物质合成自身细胞的含碳物质。术语“能源”是微生物细胞可氧化其产生电子，在电子传递过程中产生atp供细胞利用的物质。
[0034]
实施例1
[0035]
一种热带假丝酵母菌株ep1，该菌株为假丝酵母属菌株(candida tropicalis)，命名为candida tropicalis ep1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日：2021年7月13日，保藏编号：cgmcc no.22875。
[0036]
该菌株属于真菌酵母类，如图1、图2(a)及图2(b)所示，在预培养固体培养基上生
长有大量菌丝，菌落中间突起，边缘有毛状辐射菌丝，无皱褶，乳白色，于30℃左右好氧生长。如图2(c)所示，在光学显微镜下细胞呈椭球状及圆柱状，有出芽生殖，圆柱状细胞构成菌丝主干，菌丝顶端生有延长状的柱状细胞，柱状细胞连接处有出芽长出的椭球状细胞或者多个椭球状细胞连接的藕节状假菌丝构成的分支。
[0037]
(1)培养基
[0038]
种子培养基(预培养)：磷酸氢二钠15g/l、磷酸二氢钾15g/l、氯化钠2.5 g/l、氯化铵10.0g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、无水氯化钙0.05g/l、酵母膏2.0g/l、葡萄糖10.0g/l，固体培养基加入琼脂粉2.0％。
[0039]
人工含酚废水培养基盐溶液
①
(人工苯酚废水
①
)：磷酸氢二钠0.05g/l、磷酸二氢钾0.05g/l、氯化钠2.5g/l、氯化铵0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、无水氯化钙0.05g/l。苯酚50～2000mg/l根据情况调整，固体培养基中加入琼脂粉 2.0％。对不同氯化钾浓度的影响考察时，对培养基进行调整，去掉所有卤化物，使用等摩尔钠盐代替相应钾盐，使用硫酸铵代替氯化铵。
[0040]
人工含酚废水培养基盐溶液
②
(人工苯酚废水
②
)：磷酸氢二钠5g/l、磷酸二氢钾5g/l、氯化钠2.5g/l、氯化铵6g/l、七水合硫酸镁0.15g/l、无水氯化钙0.05g/l。苯酚500～16000mg/l根据情况调整，固体培养基中加入琼脂粉2.0％。
[0041]
种子培养基、盐溶液
①②
及各种固体培养基在121℃高压蒸汽灭菌器中灭菌 15min备用，液体培养基中苯酚于使用前补加。
[0042]
(2)菌株的来源
[0043]
本实验保藏假丝酵母。
[0044]
(3)菌株的分子生物学鉴定
[0045]
菌株鉴定采用rdna的its序列分析进行，采用的引物its1如seq id no.2 所示(5
′‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
′
)，引物its2如seq id no.3所示(5
′‑
tcctccgcttattgatatgc-3
′
)，pcr(abi 9700)条件：95℃预变性5min， 94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，72℃延伸10min，30个循环，测序使用abi 3730dna测序仪。测得其rdna的its序列如seq id no.1所示。 ncbi blast搜索its序列结果与candida tropicalis菌株同源性大于99％，命名为candida tropicalis ep1，于2021年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号：cgmcc no.22875。
[0046]
(4)苯酚的降解实验
[0047]
菌种自斜面接种种子培养基，置于30℃，200r/min的摇床中进行振荡培养 24hr。取一定体积种子培养液，离心(4000rpm，下同)，菌体采用生理盐水洗涤离心后转移至上述人工苯酚废水中，置于30℃，200r/min的摇床中进行振荡培养一定时间后取培养液5ml进行离心。
[0048]
(5)苯酚浓度测试：使用4-氨基安替比林直接光度法(国家环保局《水和废水监测分析方法》编委会，《水和废水监测分析方法》[m].北京:中国环境科学出版社,1997,408-410)。
[0049]
(6)细胞干重：培养液5ml进行离心，下层菌体使用去离子水洗涤三次后放置烘箱中80℃烘干至恒重测细胞干重。
[0050]
(7)苯酚降解率计算
[0051][0052]
c0指的是初始苯酚浓度，c
*
指的是降解结束时测试苯酚浓度。
[0053]
实施例2candida tropicalis ep1的最适降解温度范围
[0054]
将candida tropicalis ep1菌株自斜面接种于种子培养基中，30℃、180rpm 振荡过夜培养后取10ml菌液离心(4000rpm，10min)后水洗2次后，菌体接入50ml人工苯酚废水
①
中，菌体接种量1.0g(dcw)/l，苯酚浓度1.0g/l，30℃、 180rpm振荡培养，24小时后降解结果如图3所示。
[0055]
由图3可以看出，candida tropicalis ep1菌株最优降解温度范围为25～40℃，嗜中温降解，对35～40℃间高温具有一定耐受能力。
[0056]
实施例3candida tropicalis ep1菌株对氯化钾的耐受情况
[0057]
按照实施例2所示的实验条件和实验方法，将candida tropicalis ep1菌株接种于种子培养基中，过夜培养后取10ml菌液离心后水洗接入50ml不同浓度(0～30g/l)氯化钾的人工苯酚废水
①
中，苯酚浓度1.0g/l，30℃振荡培养，24 小时后降解结果如图4所示。
[0058]
由图4可以看出，candida tropicalis ep1菌株对氯化钾有一定的浓度需求，在kcl浓度高达30g/l时候，苯酚的降解率与无添加时的降解水平接近，结果说明菌株具有比较优秀的耐氯化钾(即耐氯化物或耐高盐度)的能力，耐受氯化钾浓度≤30g/l。
[0059]
实施例4candida tropicalis ep1在碱性ph下对苯酚降解的促进效果
[0060]
人工废水苯酚浓度1.0g/l，ph使用2m的naoh和hcl调节，按照实施例 2所示的实验条件和实验方法，将ep1菌株接种于种子培养基中，过夜培养后取 10ml菌液离心后水洗接入50ml人工苯酚废水
①
，苯酚浓度1.0g/l，30℃振荡培养，24小时后降解结果如图5所示。
[0061]
由图5可以看出，candida tropicalis ep1菌株在酸性ph条件下，降解率较低，从ph 7.0开始，降解率大幅改善，碱性ph条件利于苯酚降解，可以利用碱性ph的调节来大幅提高降解效率。
[0062]
实施例5经一级种子培养的candida tropicalis ep1细胞降解不同浓度苯酚所需时间
[0063]
按照实施例1所示的实验条件和实验方法，将candida tropicalis ep1菌株接种于种子培养基中，过夜培养后取10ml菌液离心后水洗2次后，菌体接入300 ml不同浓度的人工苯酚废水
①
中，接种量约5.1g(dcw)/l，苯酚浓度500～2000 mg/l，30℃振荡培养，降解所需时间如表1所示。
[0064]
表1 经一级种子培养的candida tropicalis ep1细胞对不同浓度的苯酚降解所需时间
[0065][0066]
结果表明，经一级种子培养的candida tropicalis ep1对500～2000mg/l苯酚都具有降解能力，对2000mg/l苯酚去除大约需要2天。
[0067]
实施例6经苯酚驯化的candida tropicalis ep1细胞的苯酚降解动力学
[0068]
按照实施例1所示的实验条件和实验方法，将candida tropicalis ep1菌株接种
于种子培养基中。过夜培养后取10ml菌液离心后水洗接入100ml的人工苯酚废水
②
中，每天补加苯酚浓度为500mg/l，30℃振荡培养，驯化一周后，搅拌活化后菌液使用人工苯酚废水
②
稀释3倍，取50ml，接种量0.4g(dcw)/l，补加苯酚浓度约为900mg/l，降解动力学如图6所示。
[0069]
由图6可以看出，经过驯化及活化处理过的candida tropicalis ep1菌株，具有快速去除苯酚能力，苯酚的最大比去除率达到220g/(hr.g dcw)以上。
[0070]
实施例7驯化及活化处理过的candida tropicalis ep1细胞对不同浓度苯酚的降解能力
[0071]
将实施例6中经过驯化及活化处理过的candida tropicalis ep1菌株菌液，直接补加不同浓度的苯酚(500～4000mg/l)，30℃振荡培养，降解12小时，如图 7所示，1500mg/l苯酚已经完全降解，而2000mg/l苯酚可去除约80％。
[0072]
由图7可以看出，利用驯化及活化处理过的candida tropicalis ep1细胞，对 2000mg/l以下浓度的苯酚，具有快速去除能力，可在12小时内完全去除1500 mg/l苯酚，去除80％的2000mg/l的苯酚。
[0073]
实施例8驯化及活化处理过的candida tropicalis ep1细胞的耐受苯酚能力评估
[0074]
将实施例6中经过驯化及活化处理过的candida tropicalis ep1菌株菌液，以约30％接种量接种10ml人工苯酚废水
②
，补加极高浓度的苯酚8000～16000 mg/l，额外补加4g/l氯化铵，保证氮源充足，30℃振荡培养3周后，苯酚去除率及细胞重新生长能力如表2所示，candida tropicalis ep1细胞对＞10000mg/l 的苯酚仍然具有缓慢去除能力。
[0075]
培养液使用无菌自来水重新稀释5～10倍以后，使其最高可能苯酚浓度低于 1500mg/l，30℃振荡培养3～7天。生长情况如表2所示，candida tropicalis ep1 细胞接种8000～12000mg/l人工苯酚废水
②
中3周后，经过稀释，30℃重新振荡培养3天后，细胞瓶内变明显浑浊，苯酚浓度测试为0。而接种过16000mg/l 的苯酚，经过3周降解后的菌液，虽有苯酚去除，但经过稀释后培养1周，未见培养瓶内液体明显变浑浊。
[0076]
表2 经苯酚驯化的candida tropicalis ep1细胞对高浓度苯酚的耐受情况评估
[0077][0078]
结果表明，candida tropicalis ep1细胞具有强大的耐受苯酚毒性能力，可以耐受浓度高达12000mg/l以上苯酚的毒性。
[0079]
实施例9苯酚固体培养基上生长的candida tropicalis ep1菌株直接接种人工苯酚废水
[0080]
按照实施例1所示的实验条件和实验方法，将candida tropicalis ep1菌株自预培养斜面培养基上接种苯酚浓度500mg/l的人工苯酚废水
②
固体培养基，室温培养约1周后接种苯酚浓度为1000mg/l的人工苯酚废水
②
，30℃振荡培养6 天后od
510
＝1.04，苯酚浓度测试为0。