β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法与流程

1.本发明涉及一种β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定，属于药物分析技术领域。


背景技术：

2.β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotimamide mononucletide,nmn)是人体内一种内源性物质，由烟酰胺在烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化下生产，随后nmn又在烟酰胺单核苷酸转移酶的催化下生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad

)。nmn在人体内的生理作用都是通过体内转化为nad

实现，已有的可选研究表明，nmn主要包括参与多种疾病的预防，如2型糖尿病、肥胖症和心力衰竭等。2016年，代谢领域研究最有影响的刊物《cell metabolism》(mills等，2016,24：795
–
806)报道了给实验鼠补充饲喂nmn可有效减轻小鼠与年龄相关的生理衰竭，在没有任何明显毒性或有害影响的情况下，nmn可抑制与年龄相关的体重增加，可增加能量代谢，促进体力活动，改善胰岛素敏感性和血脂水平，并改善眼功能和其他病理性疾病，证明了nmn在抗衰老方面的巨大潜力。因此，nmn是医药、功能性食品、化妆品等行业的珍贵原料。
3.目前，nmn的制备方法主要包括以下三种：1、酵母菌发酵法；2、化学合成法；3、酶催化合成法。其中酶催化合成法是以烟酰胺、三磷酸腺苷和d-核糖作为底物，在核糖激酶(pk)和烟酰胺核糖磷酸转移酶(nampt)作为催化剂的作用下催化制备nmn，是一种绿色环保无公害的nmn制备方法。
4.在nmn的酶催化合成过程中会产生多个重要的有关物质，这些有关物质如果过多引入药物成品中，将可能导致严重的用药安全性问题。因此，在原料药合成阶段和制剂阶段都需要对这些有关物质进行严格控制。enrico balducci等人报道了用液相色谱法，色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶柱，100mmol/l、ph6.0的磷酸二氢钾缓冲盐和甲醇为流动相，柱温16.5℃，流速1.3ml/min，波长254nm，梯度洗脱方式对nmn进行分析(analytical biochemistry,1995,228,64-68)。leonardo sorci等人报道用100mmol/l磷酸二氢钾、8mmol/l四丁基溴化铵、ph6.0的缓冲盐和甲醇为流动相流速1.0ml/min，梯度洗脱方式对nmn进行分析(pnas,2009,106(9):3083-3088)。这两种方法流动相中缓冲盐浓度过大，易伤色谱柱，且特定杂质烟酰胺核糖(nr)与主峰nmn间不能基线分离，无法实现准确分析。因此寻求一种能够有效分离且尽可能多的检出nmn中有关物质的高效液相色谱法，对于nmn的精确质量控制具有十分重要的意义。
5.cn 113358776a公开了一种hplc-uv同时检测nmn中5种有关物质的方法，色谱柱采用c18-aq柱，流动相a为磷酸二氢钾缓冲盐溶液，流动相b为甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.5～1.5ml/min，柱温为15～35℃，可以定量检测nmn中三磷酸腺苷(atp)、二磷酸腺苷(adp)、腺苷酸(amp)、烟酰胺(na)和nho3的含量。烟酰胺核糖(nr)是合成nmn的起始物料，也是酸破坏和氧化降解nmn时易产生的降解产物，是nmn制备工艺中需要严格控制的特定杂质，但该专利未提及建立的方法是否可以用于同时检测nr。我们将该专利公开的方法用于
同时检测nmn、nr、na、atp、adp、amp和烟酸(vb3)时，发现nr和atp不能达到基线分离。因而，急需开发操作简便、专属性强、准确度高、适用性广、能同时检测nmn制备过程中多种有关物质的hplc方法，更好的控制nmn的品质，为食品安全提供保障。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种能同时检测β-烟酰胺单核酸的含量和有关物质的方法。
7.为解决上述技术问题，本发明的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法包括：
8.采用hplc-uv法；所述hplc的色谱柱采用sinochrom ods-bp，4.6
×
250mm 5μm或柱效相当的色谱柱；流动相a为0.1～0.3％磷酸二氢钾和0.05～0.15％四丁基氢氧化铵的混合水溶液，流动相b为甲醇；流速为1
±
0.3ml/min，柱温为35℃
±
10℃；
9.所述β-烟酰胺单核酸含量的测定的洗脱梯度为等度或梯度，所述有关物质的测定的洗脱为梯度；
10.所述等度为流动相a运行7～10min；
11.所述梯度为：0～6分钟，流动相a为100％，流动相b为0；6～20分钟，流动相a由100％变为70％，流动相b由0变为30％；20～30分钟，流动相a为70％，流动相b为30％；30～31分钟，流动相a由70％变为100％，流动相b由30％变为0；31～40分钟，流动相a为100％，流动相b为0；
12.所述uv检测波长为265
±
10nm。
13.在一种具体实施方式中，所述流动相a中磷酸二氢钾的浓度为0.2％。
14.在一种具体实施方式中，所述流动相a中四丁基氢氧化铵的浓度为0.1％。
15.在一种具体实施方式中，所述流速为1ml/min。
16.在一种具体实施方式中，所述柱温为35℃。
17.在一种具体实施方式中，所述检测波长为260nm。
18.在一种具体实施方式中，所述hplc的对照品和供试品溶液的制备：取nmn对照品适量和待测样品适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含50μg，作为对照品溶液和供试品溶液。
19.在一种具体实施方式中，所述的β-烟酰胺单核酸含量的测定方法，其特征在于，所述hplc的供试品溶液的制备：取待测的nmn样品，用水溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg，作为供试品溶液；所述hplc的自身对照溶液的制备：取供试品溶液适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含5μg，作为自身对照溶液。
20.在一种具体实施方式中，所述的β-烟酰胺单核酸有关物质的测定方法，其特征在于，所述有关物质为烟酰胺核糖(nr)、烟酰胺(na)、三磷酸腺苷(atp)、二磷酸腺苷(adp)、腺苷酸(amp)和烟酸(vb3)中的至少一种。
21.有益效果：
22.1.本发明溶剂和杂质均不干扰主峰的检出，各杂质之间均能达到基线分离，具体表现在可以定量检测nmn中烟酰胺核糖(nr)、烟酰胺(na)、三磷酸腺苷(atp)、二磷酸腺苷(adp)、腺苷酸(amp)和烟酸(vb3)等6个已知杂质的含量，其中杂质nr即是合成nmn的起始物
料，也是酸破坏、氧化易产生的降解杂质，是nmn合成工艺中需要严格控制的特定杂质，本发明能准确测定杂质nr的含量，方法操作简便，专属性强，准确度高，适用性广，可以更好的控制nmn的品质，为食品安全提供保障；
23.2.同时，本发明还有效避免了现有技术中流动相高盐浓度对色谱仪的损害。
附图说明
24.图1nmn有关物质测定——系统适用性溶液色谱图；
25.图2nmn有关物质测定——高温破坏样品溶液色谱图；
26.图3nmn有关物质测定——碱破坏样品溶液色谱图；
27.图4nmn有关物质测定——酸破坏样品溶液色谱图；
28.图5nmn有关物质测定——氧化破坏样品溶液色谱图；
29.图6nmn含量测定——系统适用性溶液色谱图；
30.图7nmn含量测定——线性关系图；
31.图8对比例1——系统适用性溶液色谱图
32.图9对比例2——系统适用性溶液色谱图
33.图10对比例3——系统适用性溶液色谱图
具体实施方式
34.为解决上述技术问题，本发明的β-烟酰胺单核酸含量和有关物质的测定方法包括：
35.采用hplc-uv法；所述hplc的色谱柱采用sinochrom ods-bp，4.6
×
250mm 5μm或柱效相当的色谱柱；流动相a为0.1～0.3％磷酸二氢钾和0.05～0.15％四丁基氢氧化铵的混合水溶液，流动相b为甲醇；流速为1
±
0.3ml/min，柱温为35℃
±
10℃；
36.所述β-烟酰胺单核酸含量的测定的洗脱梯度为等度或梯度，所述有关物质的测定的洗脱为梯度；
37.所述等度为流动相a运行7～10min；
38.所述梯度为：0～6分钟，流动相a为100％，流动相b为0；6～20分钟，流动相a由100％变为70％，流动相b由0变为30％；20～30分钟，流动相a为70％，流动相b为30％；30～31分钟，流动相a由70％变为100％，流动相b由30％变为0；31～40分钟，流动相a为100％，流动相b为0；
39.所述uv检测波长为265
±
10nm。
40.在一种具体实施方式中，所述流动相a中磷酸二氢钾的浓度为0.2％。
41.在一种具体实施方式中，所述流动相a中四丁基氢氧化铵的浓度为0.1％。
42.在一种具体实施方式中，所述流速为1ml/min。
43.在一种具体实施方式中，所述柱温为35℃。
44.在一种具体实施方式中，所述检测波长为260nm。
45.在一种具体实施方式中，所述hplc的对照品和供试品溶液的制备：取nmn对照品适量和待测样品适量，分别用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含50μg，作为对照品溶液和供试品溶液。
46.在一种具体实施方式中，所述的β-烟酰胺单核酸含量的测定方法，其特征在于，所述hplc的供试品溶液的制备：取待测的nmn样品，用水溶解并定量稀释制成每1ml中含0.5mg，作为供试品溶液；所述hplc的自身对照溶液的制备：取供试品溶液适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含5μg，作为自身对照溶液。
47.在一种具体实施方式中，所述的β-烟酰胺单核酸有关物质的测定方法，其特征在于，所述有关物质为烟酰胺核糖(nr)、烟酰胺(na)、三磷酸腺苷(atp)、二磷酸腺苷(adp)、腺苷酸(amp)和烟酸(vb3)中的至少一种。
48.下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
49.实施例1
50.(1)供试品溶液的制备：取nmn适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；
51.(2)自身对照溶液的制备：精密量取供试品溶液适量，加水定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液，作为自身对照溶液；
52.(3)检测：分别取供试品溶液、自身对照溶液注入高效液相色谱仪，其中色谱条件如下：
53.色谱柱为sinochrom ods-bp，4.6
×
250mm 5μm；流动相a为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，流动相b为甲醇；流速为1ml/min，柱温35℃，检测波长为260nm。洗脱梯度为：
54.表1：实施例1洗脱梯度
55.时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0100061000207030307030311000401000
56.实施例2
57.(1)供试品溶液的制备：取nmn适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1ml中约含50μg的溶液，作为供试品溶液；
58.(2)对照品溶液的制备：精密量取nmn对照品适量，加水定量稀释制成每1ml中约含50μg的溶液，作为对照品溶液；
59.(3)检测：分别取供试品溶液、对照品溶液注入高效液相色谱仪，其中色谱条件如下：
60.色谱柱为sinochrom ods-bp，4.6
×
250mm 5μm；流动相为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，等度洗脱；流速为1ml/min，柱温35℃，检测波长为265nm。
61.实施例3
62.样品制备同实施例1。
63.色谱柱为sinochrom ods-bp，4.6
×
250mm 5μm；流动相a为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，流动相b为甲醇；流速为1ml/min，柱温25℃，检测波长为260nm。洗脱梯度为：
64.表2：实施例3洗脱梯度
[0065][0066][0067]
实施例4
[0068]
样品制备同实施例1。
[0069]
色谱柱为sinochrom ods-bp，4.6
×
250mm 5μm；流动相a为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，流动相b为甲醇；流速为1ml/min，柱温45℃，检测波长为260nm。洗脱梯度为：
[0070]
表3：实施例4洗脱梯度
[0071]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0100061000207030307030311000401000
[0072]
实施例5
[0073]
样品制备同实施例1。
[0074]
色谱柱为sinochrom ods-bp，4.6
×
250mm 5μm；流动相a为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，流动相b为甲醇；流速为0.7ml/min，柱温35℃，检测波长为260nm。洗脱梯度为：
[0075]
表4：实施例5洗脱梯度
[0076]
[0077][0078]
实施例6
[0079]
样品制备同实施例1。
[0080]
色谱柱为sinochrom ods-bp，4.6
×
250mm 5μm；流动相a为0.2％磷酸二氢钾和0.1％四丁基氢氧化铵的混合溶液，流动相b为甲醇；流速为1.3ml/min，柱温35℃，检测波长为260nm。洗脱梯度为：
[0081]
表5：实施例6洗脱梯度
[0082]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0100061000207030307030311000401000
[0083]
实施例7
[0084]
色谱条件同实施例1。
[0085]
实验步骤：
[0086]
1.专属性试验
[0087]
取nr、na、amp、adp、atp、烟酸和nmn适量，用水稀释制成含各50μg的混合溶液，过滤后取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例1中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图1。
[0088]
表6：实施例7的nmn与六个工艺杂质保留时间与分离度
[0089]
样品保留时间(min)分离度nr3.682/nmn4.9606.2na13.59041.8amp20.75134.4adp22.7268.7
atp29.57025.9烟酸36.0579.0
[0090]
通过计算分析可知，nmn与nr出峰最接近，分离度大于5.0，因此nmn与nr完全分离。nmn的理论塔板数为8304，大于5000，其他峰均不干扰nmn的检出，且各杂质峰均能被检出。该有关物质方法可用于检测这六个工艺杂质的检出。
[0091]
2.强制降解试验
[0092]
(1)高温破坏样品检测：精密称取nmn 12.5mg至25ml量瓶，加水溶解并稀释至刻度，60℃加热4小时，过滤后取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例1中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图2。
[0093]
(2)碱破坏样品检查：精密称取nmn 12.5mg至25ml量瓶，加0.2mol/l氢氧化钠1ml，室温放置10min，加0.2mol/l盐酸1ml，用水稀释至刻度，过滤后取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例1中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图3。
[0094]
(3)酸破坏样品检查：精密称取nmn12.5mg至25ml量瓶，加0.2mol/l盐酸1ml，室温放置30min，加0.2mol/l氢氧化钠1ml，用水稀释至刻度，过滤后取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例1中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图4。
[0095]
(4)氧化破坏样品检查：精密称取nmn 12.5mg至25ml量瓶，加5％双氧水1ml，室温放置30min，用水稀释至刻度，过滤后取续滤液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例1中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图5。
[0096]
由强制降解试验得到的色谱图可以发现，nmn在酸、氧化降解条件下均降解出了特定杂质nr，高温破坏、碱破坏条件下均有较大程度的降解。各个降解杂质与主峰之间均得到很好的分离，本发明有关物质分析方法可用于检测降解杂质。
[0097]
实施例8
[0098]
色谱条件同实施例2。
[0099]
实验步骤：
[0100]
(1)系统适应性溶液的制备：取nr和nmn适量，用水稀释制成含各杂质50μg的混合溶液作为供试品溶液，取供试品溶液20μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测，图谱见图6。
[0101]
(2)线性溶液的制备：取nmn对照品适量，用水溶解并稀释制成0.2mg/ml，作线性储备液，将此溶液用水稀释制成浓度为66.6、50.0、40.0、23.5、18.2、9.5、6.4μg/ml的线性溶液，取各溶液20μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测，线性关系图见图7。
[0102]
(3)精密度试验溶液：取nmn线性溶液浓度为50μg/ml的溶液20μl，按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测。
[0103]
(4)回收率试验溶液的制备：取nmn对照品适量，加水溶解并稀释制成浓度为50μg/ml的溶液，作对照品溶液。取nmn样品适量，用水稀释制成浓度分别为60μg/ml、50μg/ml、40μg/ml的溶液，每个浓度各配置三份。取各试验溶液20μl按照实施例2中的色谱条件进行色谱检测。
[0104]
由系统适用性溶液可知，nr与nmn的分离度为15.37，分离良好，nmn理论塔板数为6107.3，大于5000；由线性试验可知，nmn浓度范围在6.4～200μg/ml范围内，r2为0.9997，线性关系良好；由精密度试验可知，试验溶液连续测定6次，峰面积rsd为0.19％，精密度良好；
由回收率试验可知，在80％、100％、120％三个浓度下，nmn的回收率在99.1.3％～101.9％之间，rsd％为2.73％，证实方法有良好准确度。综上所述，该方法可以准确可靠的测定nmn的含量。
[0105]
对比例1
[0106]
根据enrico balducci等人报道的hplc方法进行操作(analytical biochemistry,1995,228:64-68)。
[0107]
系统适用性溶液的制备：取nr和nmn适量，用水稀释制成含nmn 200μg和含nr 50μg的混合溶液。
[0108]
取系统适用性溶液10μl注入高效液相色谱仪，其中色谱条件如下：
[0109]
色谱柱为sinochrom ods-bp，4.6
×
250mm 5μm；流动相为0.1mol/l磷酸二氢钾，用磷酸或氢氧化钠调ph为6.0-甲醇(95：5)；流速为1.3ml/min，柱温20℃，检测波长为260nm。洗脱梯度，色谱图见图8。
[0110]
对比例2
[0111]
根据专利cn 113358776 a中报道的hplc方法进行操作。
[0112]
取nr、na、amp、adp、atp、烟酸和nmn适量，用水稀释制成含各50μg的混合溶液，过滤后取续滤液作为系统适用性溶液。
[0113]
取系统适用性溶液20μl注入高效液相色谱仪，其中色谱条件如下：
[0114]
色谱柱为welchultimate aq-c18，4.6
×
250mm 5μm；流动相a为0.05mol/l磷酸二氢钾，用磷酸或氢氧化钠调ph为4.5，流动相b为甲醇；流速为0.5ml/min，柱温25℃，检测波长为260nm。洗脱梯度，梯度如下，色谱图见图9。
[0115]
表7：对比例2洗脱梯度
[0116]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0100010100020505025208030208030.11000351000
[0117]
对比例3
[0118]
根据leonardo sorci等人报道的hplc方法进行操作(pnas,2009,106(9):3083-3088)。
[0119]
系统适用性溶液的制备：取nr和nmn适量，用水稀释制成含nmn 200μg和含nr 50μg的混合溶液。
[0120]
取系统适用性溶液10μl注入高效液相色谱仪，其中色谱条件如下：
[0121]
色谱柱为kromasil c18，4.6
×
250mm 5μm；流动相为0.1mol/l磷酸二氢钾和8mmol/l四丁基溴化铵的混合水溶液，用磷酸或氢氧化钠调ph为6.0-甲醇(95：5)；流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长为260nm。洗脱梯度，色谱图见图10。
[0122]
试验结果：
[0123]
实施例1、3、4、5、6考察不同流速、不同柱温对nmn与各杂质之间的分离度影响，结果表明，流速为0.7～1.3ml/min、柱温为25～45℃范围内变化，各杂质之间、杂质与nmn之前的分离度均大于2.0，说明方法耐用性良好。实施例7，nmn在有关物质检查方法下的强制降解试验中，nmn在酸、氧化降解条件下均降解出了特定杂质nr，高温破坏、碱破坏条件下均有较大程度的降解。各个降解杂质与主峰之间均得到很好的分离，说明方法专属性良好，能准确测定nmn中有关物质的含量。
[0124]
实施例2，在nmn有关物质控制方法上，将梯度改为等度，运行时间10min，大大节约nmn含量测定时间。实施例8，nmn含量测定方法经过验证，nmn浓度范围在6.4～200μg/ml范围内，r2为0.9997，线性关系良好；试验溶液连续测定6次，峰面积rsd为0.19％，精密度良好；在80％、100％、120％三个浓度下，nmn的回收率在99.1.3％～101.9％之间，rsd％为2.73％，证实方法有良好准确度。综上所述，该方法可以准确可靠的测定nmn的含量。
[0125]
对比例1中，nr与nmn不能基线分离，且出峰过快，溶剂易干扰检测；对比例2中，hplc流速降为0.5ml/min时，杂质nr与atp均不能基线分离，因此不能准确测定nr与atp的残留量；对比例3中，nr与nmn仍不能基线分离。
[0126]
由于nr是nmn合成工艺的起始物料，易残留在原料中，且原料nmn在氧化、酸破坏下易产生此杂质，因此nr是nmn原料中最重要的工艺和降解杂质，需要严格控制其残留量。atp是nmn酶法合成过程中易产生的工艺杂质，也要严格控制其残留量。采用本发明检测方法，各杂质之间分离度符合要求，各杂质也不干扰nmn的检出、特别是杂质nr不干扰nmn的检测，nr与atp之间分离度良好。
[0127]
综上所述，本发明显优于enrico balducci等人报道的液相色谱方法(对比例1)、优于cn 113358776 a专利中一种hplc-uv同时检测nmn中多种有关物质的方法(对比例2)、优于leonardo sorci等人报道的液相色谱方法(对比例3)，选择本发明的检测方法可以更准确可靠的控制nmn的质量。