一种基于肼屈嗪改善肿瘤微环境的纳米药物及其制备和应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种基于肼屈嗪用于改善肿瘤微环境且增强化疗效果的纳米药物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.纳米粒子由于具有增强的渗透滞留效应(enhanced permeability and retention effect,epr effect)和有效降低化疗药物的毒副作用，已经成为非靶向化疗药物的替代品。然而，这些纳米药物的临床转化受到很大限制，主要是由于复杂的肿瘤微环境所导致。作为肿瘤微环境的主要构成部分，曲折复杂的肿瘤血管是纳米颗粒递送的主要障碍。因此，为了提高纳米粒子的治疗效果并且促进其临床转化，亟需开发新的策略来改善肿瘤微环境从而增强纳米粒子的治疗效果。
3.在过去的数年间，许多研究集中在使肿瘤缺乏营养来抑制肿瘤生长的抗血管生成策略，比如一些抗血管生成抑制剂的应用：青藤碱盐酸盐、贝伐珠单抗、沙利度胺和甲磺酸伊马替尼等。然而，抗血管生成药物的单一疗法并不像预期的那样有效，如申请号为201610299834.6的专利文献中公开利用铁金属有机骨架化合物(fe-mil-101)来抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成，但肿瘤细胞仍旧可以通过其他方式来获取营养，治疗效果和其临床转化受限。因此，抗血管生成策略仍有待进一步改进。与此同时，近年的一系列研究将目光转向了扩张血管的策略。和抗血管生成抑制剂不同，血管扩张剂能够永久扩张肿瘤血管，还可以与化疗药物联合治疗，增强纳米药物的递送，具有很好的临床转化前景。
4.肼屈嗪(hdz)是一种常用的临床抗高血压药物，并且还有增加肿瘤坏死和抑制肿瘤生长的作用。作为一种稳定的dna甲基化抑制剂，肼屈嗪在体内外的毒性很低。文献“vasodilator hydralazine promotes nanoparticle penetration in advanced desmoplastic tumors”表明，装载肼屈嗪的脂质体可以起到扩张肿瘤血管和提高肿瘤组织通透性的作用。然而，该方法仍然存在一些局限性，例如需要重复注射和肼屈嗪的非特异性释放。
5.硼替佐米(btz)是第一个被批准用于治疗癌症患者的蛋白酶体抑制剂，它是一种二肽硼酸类似物，通过其硼酸基团与几种蛋白酶活性位点中的苏氨酸残基之间的直接结合来抑制癌细胞的蛋白酶体。然而，由于周围神经病变、血小板减少症和胃肠道疾病等显著的剂量依赖毒性，硼替佐米对许多实体瘤的治疗效果较低。并且，由于硼替佐米与蛋白质的非特异性结合和血液中的快速清除，它的药代动力学特性受限。
6.因此，开发出一种既可以有效扩张肿瘤血管从而改善肿瘤微环境又可以增强化疗药物如硼替佐米的递送效率，降低其全身毒性的新型纳米药物，是本领域技术人员需要解决的问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供了一种新的纳米药物，该纳米药物可以通过扩张肿瘤血管
来改善肿瘤微环境，从而增强药物输送到肿瘤组织的效率，进一步增强治疗效果。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明提供了一种基于肼屈嗪改善肿瘤微环境的纳米药物，所述纳米药物为两亲性聚合物和含有硼酸基团的疏水性化疗药物在水中自组装形成的胶束型纳米颗粒；所述两亲性聚合物的亲水段为聚乙二醇，疏水段为以ph响应型腙键连接肼屈嗪形成的聚合物。
10.本发明利用两亲性聚肼屈嗪的纳米载体包裹硼酸类疏水化疗药物，两亲性聚合物在自组装成为胶束的过程中，其疏水端肼屈嗪通过疏水作用以及硼氮配位键的相互作用，使得硼酸类疏水化疗药物包裹在聚合物胶束内部，从而制得所述的纳米药物。
11.本发明在构建两亲性聚合物的疏水段时，首先以n-(4-乙酰苯基)甲基丙烯酰胺作为可聚合单体参与聚合，然后通过与肼屈嗪反应形成ph响应的腙键使得肼屈嗪连接到聚合物上。当纳米胶束进入肿瘤组织后，肿瘤组织酸性的ph环境下，腙键断裂释放出大量小分子肼屈嗪，通过扩张血管引起肿瘤微环境的改变，从而加速化疗药的输送和释放。该过程主要发生在酸性的肿瘤组织，因此对正常健康组织毒性较小，大大降低了系统的毒副作用。
12.进一步的，所述两亲性聚合物的制备方法包括：首先在有机碱催化条件下，对氨基苯乙酮与甲基丙烯酰氯反应制得n-(4-乙酰苯基)甲基丙烯酰胺，再利用聚乙二醇大分子链转移剂通过可逆加成-断裂链转移聚合法或者利用聚乙二醇大分子链引发剂通过原子转移自由基聚合法对n-(4-乙酰苯基)甲基丙烯酰胺聚合制得聚合物，然后通过形成腙键将肼屈嗪连到聚合物侧链上制得所述两亲性聚合物。
13.优选的，所述有机碱为三乙胺。
14.优选的，所述聚乙二醇大分子链转移剂为pettc-peg
5k
。
15.优选的，所述两亲性聚合物的结构式如式(ⅰ)所示，
[0016][0017]
其中y＝1-50，m＝10-3000。
[0018]
更为优选，y＝20-50，m＝200-500。
[0019]
进一步的，所述化疗药为带有硼酸基团的疏水性化疗药物，化疗药可以和肼屈嗪形成碳氮配位键并且由于亲疏水的相互作用，高效装载在两亲性纳米粒子内部。在肿瘤的酸性ph下，ph响应的腙键断裂，纳米胶束崩解，化疗药迅速的高效释放和激活。所述化疗药物包括但不限于硼替佐米和伊沙佐米。
[0020]
进一步的，硼替佐米的结构式如式(ⅱ)所示，
[0021][0022]
伊沙佐米的结构式如式(ⅲ)所示：
[0023][0024]
本发明构建的ph响应聚合物纳米载体具有长循环、高肿瘤积累和靶向药物输送特性可以增强化疗药物如硼替佐米的药代动力学特性并提高其对实体瘤的疗效。
[0025]
本发明还提供了一种制备所述的基于肼屈嗪改善肿瘤微环境的纳米药物的方法。具体来说，利用聚合物两亲性胶束制备方法如溶剂置换法、液膜法、透析法或超声法将两亲性聚合物与化疗药在水中自组装形成纳米颗粒。
[0026]
其中，溶剂置换法包括：首先将两亲性聚合物和疏水性化疗药物溶解于良溶剂中，再在振荡条件下将混合液加入到水中，产物自组装形成所述纳米药物。
[0027]
进一步的，所述两亲性聚合物与疏水性化疗药物的质量比为2-5:1。两亲性聚合物的包药效率随着聚合物用量的提高而增加，但聚合物用量过多会造成浪费。在上述质量比范围内，能保证较高的包药率和聚合物利用率。
[0028]
本发明的另一个目的是提供所述的基于肼屈嗪改善肿瘤微环境的纳米药物在制备肿瘤治疗药物中的应用。本发明提供的纳米药物在肿瘤组织酸性环境下响应性释放肼屈嗪，肼屈嗪通过扩张血管引起肿瘤微环境的改变，从而加速化疗药的输送和释放。化疗药物包裹于胶束型纳米颗粒内部，只有在肿瘤酸性组织集中释放，对正常组织毒副作用小，因此，该纳米药物在肿瘤药物开发中具有潜在应用价值。
[0029]
进一步的，所述肿瘤为实体瘤。更进一步的，所述实体瘤包括但不限于乳腺癌。
[0030]
本发明具备的有益效果：
[0031]
(1)本发明提供的纳米药物可以在肿瘤酸性的环境下高效释放小分子肼屈嗪，从而通过扩张肿瘤血管，重塑了肿瘤微环境，进一步提高包载的化疗药物输送至肿瘤组织的效率，因此，有望将其开发成肿瘤治疗药物。
[0032]
(2)本发明提供的纳米药物可以高效装载如硼替佐米等硼酸类疏水化疗药物，并且在肿瘤酸性组织集中释放，增强了化疗药物的治疗效果，并且对正常组织的毒性较小，因此显著增强了纳米药物的肿瘤选择性。
附图说明
[0033]
图1为实施例中纳米药物phdz/btz形成示意图。
[0034]
图2为实施例中纳米药物phdz/btz动态光散射图。
[0035]
图3为实施例中纳米药物phdz/btz透射电镜图。
[0036]
图4为实施例中纳米药物phdz/btz在不同的ph下hdz的释放曲线。
[0037]
图5为实施例中纳米药物phdz/btz在不同的ph下以化疗药btz为示例的药物释放曲线。
[0038]
图6为实施例中纳米药物phdz/btz在不同细胞株上的细胞毒性，其中phdz是单独用载体处理细胞，free hdz btz是用两种小分子药物处理细胞，paa/btz是用未连接hdz的载体paa包裹btz形成的纳米药物处理细胞，free btz是单独用btz处理细胞。
[0039]
图7为实施例中纳米药物phdz/btz在4t1细胞系上凋亡的表征。
[0040]
图8为实施例中纳米药物phdz/btz在c57bl/6小鼠的4t1肿瘤模型中的抑瘤效果的评估，图示为抑瘤曲线。
[0041]
图9为实施例中纳米药物phdz/btz在c57bl/6小鼠的4t1肿瘤模型中的抑瘤效果的评估，图示为抑瘤周期终点时，肿瘤的照片。
[0042]
图10为实施例中纳米药物phdz/btz在c57bl/6小鼠的4t1肿瘤模型中的抑瘤效果的评估，图示为小鼠体重变化曲线。
具体实施方式
[0043]
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0044]
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0045]
实施例中涉及的化合物英文缩写说明如下：
[0046]
dcm-二氯甲烷；aibn-偶氮二异丁腈；dmf-n,n-二甲基甲酰胺。
[0047]
实施例1
[0048]
1、纳米药物的制备
[0049]
(1)将对氨基苯乙酮(4.0g,29.6mmol)、甲基丙烯酰氯(3.6g,34.4mmol)和三乙胺(4.0g,39.6mmol)溶解在二氯甲烷(dcm,100ml)中并用冰浴冷却。将混合物搅拌12小时，然后依次用饱和碳酸氢钠溶液、盐酸、蒸馏水和饱和氯化钠溶液洗涤，通过旋转蒸发除去溶剂，分离出n-(4-乙酰苯基)甲基丙烯酰胺，并用硅胶色谱法(正己烷:乙酸乙酯＝4:1)纯化。真空干燥后的最终可聚合单体为2.8g(产率46.7％)。其反应过程为：
[0050][0051]
(2)聚合物paa通过raft聚合得到。取上一步得到的可聚合单体n-(4-乙酰苯基)甲基丙烯酰胺(0.30g,1.5mmol)、大分子链转移剂pettc-peg
5k
(0.27g,0.05mmol)和aibn(6.56mg,0.04mmol)溶解在二甲基甲酰胺(dmf，4ml)中，并在室温下用n2脱氧30分钟，将反
应在70℃搅拌12小时。反应结束后，将溶液用200ml冰乙醚中沉淀3次真空干燥获得聚合物paa。
[0052][0053]
(3)将paa(0.20g)与过量的盐酸肼屈嗪(0.20g,1.0mmol)在10ml dmf中混合。用盐酸将溶液的ph值调至2，并在70℃下搅拌6小时。用蒸馏水(mw＝3000)透析三天得到两亲性纳米载体phdz(0.05g，23％)。
[0054]
(4)共沉淀法制备phdz/btz：将phdz(20mg)和btz(10mg)溶解在300μl dmso中，并在剧烈搅拌下将溶液加入4ml去离子水中。然后通过透析(mw＝3500)去除dmso。过滤除去沉淀的btz。自组装过程如图1所示。
[0055]
2、纳米药物的粒径分析
[0056]
如图2所示，动态光散射(dls)测得纳米药物phdz/btz的平均粒径是138.4nm(分布系数pdi＝0.11)。
[0057]
如图3所示，透射电镜(tem)观察到纳米药物phdz/btz的粒径为140.0nm左右，与dls测得的粒径结果相符。
[0058]
3、hdz和btz的体外释放
[0059]
phdz/btz(2.0ml)密封在截留分子量为3500da的透析袋中，并在ph分别为7.4、6.0、5.0的40ml含有2％tween 80的pbs中孵育。每隔一定时间收集透析袋外的100μl溶液，用hplc分别测定hdz和btz浓度。
[0060]
药物的肿瘤酸性ph释放能力是评价phdz/btz在体内应用中非常重要的一部分，良好的响应释放能力，能保证药物在肿瘤区域的充分激活，并随后产生细胞毒性，同时对正常组织降低毒性。
[0061]
如图4，5所示，在ph为7.4的pbs中，24h后hdz和btz均释放不到20％，随着ph的降低，在ph为5.0的pbs中，24h后hdz释放了约40％，btz释放了约70％。
[0062]
4、phdz/btz在不同细胞株上的毒性
[0063]
通过使用cck8(cell counting kit-8)测定，用于评估phdz/btz、phdz、free hdz btz、paa/btz和free btz在b16f10、4t1和nih/3t3细胞株上的细胞毒性。其中phdz是单独用载体处理细胞，free hdz btz是用两种小分子药物处理细胞，paa/btz是用未连接hdz的载体paa包裹btz形成的纳米药物处理细胞，free btz是单独用btz处理细胞。
[0064]
将细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔板中并孵育过夜。将细胞暴露于连续稀释的药物中并再培养48小时，然后将培养基更换为含有180μl新鲜培养基和20μl cck-8的混合溶液。在37℃下孵育1.5小时后，使用酶标仪在450nm处测定每个孔中的吸光度，细胞活力通过计算加药孔与空白对照组吸光值的比值即可获得。
[0065]
如图6所示，通过细胞水平的毒性分析，我们可知，在4t1细胞株上，单独用phdz纳
米颗粒处理的细胞中没有观察到明显的细胞生长抑制，与单独使用btz相比，装载btz的纳米颗粒的细胞毒性显着降低，这可以解释为btz可以自由扩散进入肿瘤细胞，而phdz/btz纳米颗粒通过细胞内吞作用进入细胞并在细胞内酸性ph下缓慢释放btz。与paa/btz纳米颗粒相比，phdz/btz纳米颗粒在高浓度btz下表现出中等水平的细胞毒性，在b16f10和3t3细胞株上也观察到类似的趋势。以上结果表明phdz/btz纳米颗粒可以有效降低btz的细胞毒性，而药物载体phdz纳米颗粒几乎没有细胞毒性。
[0066]
5、phdz/btz在4t1细胞株上的细胞凋亡实验
[0067]
用pi/annexin v-fitc细胞凋亡试剂盒测量4t1细胞的细胞凋亡，并通过流式细胞术进行分析。具体来说，在实验前24小时将细胞接种到12孔板(5
×
105个细胞/孔)中。然后分别用phdz/btz、phdz、free hdz btz、paa/btz和free btz(btz浓度：0.02μg/ml，hdz浓度：0.05μg/ml)处理细胞并孵育24小时。之后，将收集的细胞用冷pbs洗涤两次，用annexin v-fitc和pi染色，并通过流式细胞术进行分析。
[0068]
如图7所示，与用游离btz处理的细胞相比，在用phdz/btz纳米颗粒处理的细胞中检测到的凋亡细胞更少，并且在用pbs和phdz纳米颗粒处理的细胞中获得了显著低水平的凋亡，这是与cck8测定的结果一致的，都表明了phdz/btz纳米粒有效降低了btz的细胞毒性，说明药物载体phdz纳米粒具有良好的生物安全性。
[0069]
6、在c57bl/6小鼠的4t1肿瘤模型中的抑瘤效果评估
[0070]
c57bl/6小鼠皮下注射5
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105个4t1细胞。肿瘤体积达到50mm3左右时，小鼠被随机分配到6个治疗组(n＝5)：pbs、free btz、free hdz btz、phdz、paa/btz和phdz/btz。hdz等效剂量为5.0mg/kg，btz等效剂量为0.8mg/kg。药物通过尾静脉注射，每四天注射一次，共给药5次。使用公式计算肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积＝(最短直径)2×
(最长直径)
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0.5。
[0071]
通过在c57bl/6小鼠的4t1皮下瘤模型中的抑瘤评估。如图8-10所示，相比于btz组，phdz/btz表现出显著增强的抑瘤效果。同时，由于其体内循环过程中化疗前药的毒性较低，因此在phdz/btz组中，小鼠的体重降低也较btz组更小。