注射用荧光示踪剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及示踪剂技术领域，尤其是涉及一种注射用荧光示踪剂及其制备方法。


背景技术：

2.恶性肿瘤是危害人类健康的第二大杀手。目前，手术仍是治疗恶性肿瘤的首选方案。肿瘤能否完全切除是影响预后的直接因素，术前医生可以借助核磁共振、超声、ct等影像手段进行诊断，但在术中，仅能依靠视、触觉经验来判断肿瘤边界，具有较强的主观性，约有40％的患者未完全切除导致复发甚至死亡。
3.近红外荧光影像导航手术技术(nirfgs)是近年来被认为最有可能实现术中肿瘤精准切除的有效办法之一，也是国内外研究的热点和难点。该技术基于近红外波段(700
‑
1800nm)指示剂结合体内蛋白后产生的增强渗透滞留效应(epr效应)选择性的在肿瘤部位富集来区别肿瘤。吲哚菁绿(indocyanine green,icg)是目前唯一同时获得fda和cfda批准可用于人体的近红外指示剂。过去由于受设备灵敏度的限制，icg仅用于血管造影和肝功能检测。近十年，nirfgs飞速发展，设备检测水平有了极大的提高，国内外很多临床机构都尝试借助icg开展了肿瘤导航手术。但是，根据文献报道近年在大量临床及动物活体实验所观察的结果，作为肿瘤荧光示踪剂，icg还存在以下问题:
4.1)背景干扰：临床实践中icg注入人体后会存在部分游离的icg单体，可自由扩散至全身正常组织，造成背景荧光干扰。
5.2)低利用率：高浓度的icg注射液中存在百纳米级以上聚集体，容易被人体的网状内皮系统视为异源体而捕获，不会进入血液循环更不会通过epr效应进入肿瘤，从而对肿瘤显影无贡献。
6.3)临床实践中发现icg在肿瘤及正常组织的代谢速率差别不大，至少需要等待12小时后才能产生足够的荧光强度对比度(肿瘤:正常组织)，增加了医院及病人的负担。
7.由此可见，研制低背景干扰、快速高效增强显影对比的新一代荧光示踪剂，在新型的手术实时成像的应用中具有较高的科研及临床应用价值。
8.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

9.本发明的第一目的在于提供一种注射用荧光示踪剂，以缓解了现有技术中存在的上述技术问题。
10.本发明的第二目的在于提供上述注射用荧光示踪剂的制备方法。
11.为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
12.本发明提供了一种注射用荧光示踪剂，所述注射用荧光示踪剂由以下组分制成：
13.吲哚菁绿、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水；
14.所述吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品的摩尔比为(2
‑
8)：5。
15.进一步的，在本发明上述技术方案的基础之上，所述吲哚菁绿和人血清白蛋白类
制品的摩尔比为(3
‑
6)：5，优选为4：5。
16.进一步的，在本发明上述技术方案的基础之上，所述人血清白蛋白类制品包括人血清白蛋白、亚锡聚合白蛋白、全氟丙烷人血清白蛋白微球、锝聚合白蛋白、碘白蛋白或紫杉醇白蛋白结合型中的任意一种或至少两种的组合。
17.进一步的，在本发明上述技术方案的基础之上，所述注射用荧光示踪剂还添加有稀释剂。
18.进一步的，在本发明上述技术方案的基础之上，所述稀释剂包括葡萄糖注射液。
19.进一步的，在本发明上述技术方案的基础之上，所述吲哚菁绿在所述注射用荧光示踪剂中的浓度为5
×
10
‑4‑2×
10
‑3mol/l。
20.本发明还提供了上述注射用荧光示踪剂的制备方法，包括以下步骤：
21.将配方量的吲哚菁绿、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水混合，得到注射用荧光示踪剂。
22.进一步的，在本发明上述技术方案的基础之上，将配方量的吲哚菁绿、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水混合后，再加入稀释剂，得到注射用荧光示踪剂。
23.进一步的，在本发明上述技术方案的基础之上，所述稀释剂包括葡萄糖注射液。
24.进一步的，在本发明上述技术方案的基础之上，采用旋涡混合器进行混合，混合的时间为1min以内。
25.与现有技术相比，本发明所具有以下有益效果：
26.(1)本发明提供了一种注射用荧光示踪剂，仅由icg、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水制成，无需添加任何表面活性剂和/或有机溶剂(例如甲醇、乙醇)。其中，吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品可结合形成6
‑
8nm左右的纳米粒子，从而降低icg游离单体的数量，最大程度避免其自由扩散造成的背景干扰；同时，还可避免icg因形成聚集体而被人体网状内皮系统捕获造成的示踪剂浪费，而直接通过血液循环经由epr效应在肿瘤组织中富集，达到肿瘤显影，此举大大提高了icg的利用率，降低了成本；而且，实验发现，该注射用荧光示踪剂在5h内即可达到手术要求的荧光对比度(肿瘤：正常组织)，而单独使用icg则需耗时24h之久，即该注射用荧光示踪剂可大为缩短肿瘤背景荧光对比度达到要求时所需的等待时间，极大的减轻了医院与病人的负担。
27.另外，由于icg、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水均为已批准临床用药，采用上述原料制得的注射用荧光示踪剂既解决了现阶段临床采用近红外示踪剂icg造成的技术问题，又一定程度上保障了该注射用荧光示踪剂的安全性，可极大简化临床审批程序。
28.(2)本发明还提供了上述注射用荧光示踪剂的制备方法，工艺简单，安全无菌易操作；在整个制备过程中无有机溶剂和/或表面活性剂参与，无需进行过滤除菌操作，可节约成本。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明提供的由bsa、icg和灭菌注射用水制得的荧光示踪剂的荧光光谱图；
31.图2为本发明提供的由bsa、icg和灭菌注射用水制得的荧光示踪剂以及icg水溶液的动物体内成像图；
32.图3为本发明实施例3提供的注射用荧光示踪剂的荧光光谱图；
33.图4为本发明实施例3提供的注射用荧光示踪剂以及icg水溶液的动物体内成像图。
具体实施方式
34.下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
35.根据本发明的第一方面，提供了一种注射用荧光示踪剂，注射用荧光示踪剂由以下组分制成：
36.吲哚菁绿(icg)、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水；
37.icg和人血清白蛋白类制品的摩尔比为(2
‑
8)：5。
38.在本发明中，icg和人血清白蛋白类制品的摩尔比影响注射用荧光示踪剂总荧光量子产率及icg能否有效分散粘附于人血清白蛋白类制品上。且icg是否有效分散粘附于人血清白蛋白类制品则直接影响其肿瘤利用率和正常组织非特异性扩散，进而影响最终肿瘤成像效果，故icg和人血清白蛋白类制品的摩尔比需控制在适宜的范围内。icg和人血清白蛋白类制品典型但非限制性的摩尔比为2：5、3：5、4：5、5：5、6：5、7：5或8：5。
39.该注射用荧光示踪剂仅由icg、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水制成，无需添加任何表面活性剂和/或有机溶剂(例如甲醇、乙醇)。该注射用荧光示踪剂中icg、人血清白蛋白类制品可结合形成6
‑
8nm的纳米粒子，由于icg、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水均为已批准临床用药，既解决了现阶段临床采用近红外示踪剂icg造成的技术问题，又一定程度上保障了该注射用荧光示踪剂的安全性，可极大简化临床审批程序。
40.该注射用荧光示踪剂中由于icg、人血清白蛋白类制品可结合形成6
‑
8nm左右的纳米粒子，从而降低icg游离单体的数量，最大程度避免其自由扩散造成的背景干扰；同时，可避免icg因形成聚集体而被人体网状内皮系统捕获造成的示踪剂浪费，而直接通过血液循环经由epr效应在肿瘤组织中富集，达到肿瘤显影，此举大大提高了icg的利用率，降低了成本；另外，实验发现，使用注射用荧光示踪剂在5h内即可达到手术要求的荧光对比度(肿瘤：正常组织)，而单独使用icg则需耗时24h之久，即该注射用荧光示踪剂可大为缩短肿瘤背景荧光对比度达到要求时所需的等待时间，极大的减轻了医院与病人的负担。
41.因此，注射用荧光示踪剂在荧光导航肿瘤手术中不仅具有高效增强肿瘤显影对比的潜力，还可快速用于开展临床实验，具有广泛的临床应用前景。
42.作为本发明的一种可选实施方式，icg和人血清白蛋白类制品的摩尔比为(3
‑
6)：5，优选为4：5。
43.通过对icg和人血清白蛋白类制品的摩尔比的进一步限定，使得该注射用荧光示踪剂在具有较好的荧光效果的同时，还能有效分散粘附于人血清白蛋白类制品上。
44.由于本发明的荧光示踪剂为注射剂，故荧光示踪剂中所采用的人血清白蛋白类制品可采用获得临床批准人血清白蛋白类制品。
45.作为本发明的一种可选实施方式，人血清白蛋白类制品包括人血清白蛋白、亚锡聚合白蛋白、全氟丙烷人血清白蛋白微球、锝聚合白蛋白、碘白蛋白或紫杉醇白蛋白结合型中的任意一种或至少两种的组合。
46.人血清白蛋白包括但不限于人血清白蛋白(86900794000067上海新兴医药股份有限公司国药准字s20033048)、人血清白蛋白(86900714000047上海莱士血液制品股份有限公司国药准字s10930020)、人血清白蛋白(86900755000075国药集团上海血液制品有限公司国药准字s10940054)、人血清白蛋白(86902599000105河北大安制药有限公司国药准字s20043061)、人血清白蛋白(86905897000914兰州兰生血液制品有限公司国药准字s10820115)等。
47.亚锡聚合白蛋白包括但不限于注射用亚锡聚合白蛋白(86900193000040北京欣科思达医药科技有限公司国药准字h20013418)、注射用亚锡聚合白蛋白(86901485000113江苏省原子医学研究所江原制药厂国药准字h20059221)等。
48.全氟丙烷人血清白蛋白微球包括但不限于注射用全氟丙烷人血清白蛋白微球(869048590000853厦门力卓药业有限公司国药准字s20191000)、全氟丙烷人血清白蛋白微球注射液(86909515000027湖南康润药业股份有限公司国药准字s20083098)等。
49.锝聚合白蛋白包括但不限于锝[99mtc]聚合白蛋白注射液(86900788000035上海欣科医药有限公司国药准字h10973022)、锝[99mtc]聚合白蛋白注射液(86900351000042广东希埃医药有限公司国药准字h10973011)、锝[99mtc]聚合白蛋白注射液(86900238001407原子高科股份有限公司国药准字h10973050)等。
[0050]
碘白蛋白包括但不限于碘[125i]白蛋白放射免疫分析药盒(86900876000572天津九鼎医学生物工程有限公司国药准字s20093013)、碘[125i]白蛋白放射免疫分析药盒(86900012000077北京北方生物技术研究所有限公司国药准字s10940098)等。
[0051]
紫杉醇白蛋白结合型包括但不限于注射用紫杉醇(白蛋白结合型)(86905847000353齐鲁制药(海南)有限公司国药准字h20193309)、注射用紫杉醇(白蛋白结合型)(86901445002980江苏恒瑞医药股份有限公司国药准字h20183378)等。
[0052]
作为本发明的一种可选实施方式，注射用荧光示踪剂的组分中还添加有稀释剂。
[0053]
若注射用荧光示踪剂无法达到临床注射浓度，故采用稀释剂以稀释注射用荧光示踪剂中icg的浓度。
[0054]
作为本发明的一种可选实施方式，稀释剂包括葡萄糖注射液。
[0055]
葡萄糖注射液为电中性，不含任何离子，可临床使用，且能够将注射用荧光示踪剂稀释至临床使用最佳浓度。若含有离子的稀释剂会加速icg的聚集，降低荧光效率。
[0056]
作为本发明的一种可选实施方式，吲哚菁绿在注射用荧光示踪剂中的浓度为5
×
10
‑4‑2×
10
‑3mol/l，优选为5
×
10
‑4mol/l。
[0057]
通过对吲哚菁绿在注射用荧光示踪剂中浓度的限定，保持了制剂的高稳定性和最大肿瘤荧光显影能力。
[0058]
根据本发明的第二个方面，还提供了上述注射用荧光示踪剂的制备方法，包括以下步骤：
[0059]
将配方量的吲哚菁绿、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水混合，得到注射用荧光示踪剂。
[0060]
该制备方法工艺简单，安全无菌易操作。
[0061]
该注射用荧光示踪剂的制备过程中无有机溶剂和/或表面活性剂参与，无需进行过滤除菌操作，节约成本，所采用的原料均为现有已批准药剂，在使用前现用现配即可。也就是，该荧光示踪剂最终的制剂形式为注射剂，将其制成适宜浓度后可直接注射使用。无需经过冻干工艺，可进一步降低制备工艺难度和制作成本。
[0062]
作为本发明的一种可选实施方式，将配方量的吲哚菁绿、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水混合后，再加入稀释剂，得到注射用荧光示踪剂。
[0063]
作为本发明的一种可选实施方式，稀释剂包括葡萄糖注射液。
[0064]
作为本发明的一种可选实施方式，采用旋涡混合器(vortex
‑
5，qilinbeier)进行混合，混合的时间为1min以内。
[0065]
至于混合的温度不作限定，室温混合即可。
[0066]
下面结合实验模拟验证以及具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。
[0067]
由于牛血白蛋白(bsa)与人血清白蛋白(hsa)理化性质类似，均有两个icg结合位点，都是蛋白疏水部位和icg的疏水苯环进行物理结合，与蛋白其他基团无关。为此，本发明先以bsa与icg、灭菌注射用水混合制作荧光示踪剂，以验证其荧光效果。
[0068]
荧光效果实验，具体步骤如下：
[0069]
(1)将icg和bsa按照1:0、1:5、2:5、4:5、8:5和50:5的摩尔比例混合(icg和bsa质量比为：0.77mg:0mg,0.77mg:340mg,0.77mg:170mg,0.77mg:85mg，0.77mg:42.5mg，0.77mg:6.8mg)，其中icg质量不变，采用的灭菌注射用水的用量为2ml。使用旋涡混合器(vortex
‑
5，qilinbeier)旋转60s(十档)，使其充分混合。为了确保bsa完全溶解，将icg的原始浓度设为5
×
10
‑4mol/l(2ml)，此后呈10倍梯度稀释，直至稀释至5
×
10
‑9mol/l(2ml)。
[0070]
(2)将所有溶液移至96孔板，使用光纤光谱仪(ocean optics)进行光谱测量，以寻找icg
‑
bsa的最佳混合比例。此时，光纤光谱仪的参数设定：激光波长为785nm，激光功率为15.48mw，积分时间为100ms，光谱笔距离96孔板5.53mm。
[0071]
(3)对测得荧光光谱使用origin进行曲线下积分(auc)，具体如图1所示。从图1中可以看出，icg和bsa的摩尔比例为4:5时，荧光谱线的面积积分最大，即荧光总强度最大。在此摩尔比例下，溶液具有最好的荧光性能。
[0072]
动物体内成像实验
[0073]
对摩尔比为4:5的icg和bsa制成的icg
‑
bsa荧光示踪剂进行动物体内成像实验，具体步骤如下：通过尾静脉注射icg和bsa(摩尔比例为4:5)制成的荧光示踪剂以及icg的水溶液(icg的浓度为5
×
10
‑4mol/l)，在时间点15min、30min、1h、2h、3h和5h对肿瘤做成像对比。如图2所示，icg和bsa制成的荧光示踪剂的成像效果显著优于icg水溶液成像(icg
‑
bsa组tbr＝2.02
±
0.22；icg
‑
water组(icg水溶液)tbr＝1.31
±
0.21，tbr＝tumor to background ratio，肿瘤与正常组织荧光强度比值)，具有更优的tbr和更清晰的肿瘤边界。
[0074]
故根据上述结果，将牛血白蛋白(bsa)替换为人血清白蛋白(hsa)，设置以下实施例和对比例。其中，实施例和对比例中人血清白蛋白类制品为人血清白蛋白(86900794000067上海新兴医药股份有限公司国药准字s20033048)。
[0075]
实施例1
[0076]
本实施例提供了一种注射用荧光示踪剂，由以下组分制成：吲哚菁绿0.77mg、人血清白蛋白类制品162.5mg和灭菌注射用水2ml；
[0077]
其中，吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品的摩尔比为2：5。
[0078]
吲哚菁绿在注射用荧光示踪剂中的浓度为5
×
10
‑4mol/l。
[0079]
该注射用荧光示踪剂的制备方法，包括以下步骤：
[0080]
将配方量的吲哚菁绿、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水使用旋涡混合器(vortex
‑
5，qilinbeier)旋转60s(十档)，使其充分混合，得到注射用荧光示踪剂。
[0081]
实施例2
[0082]
本实施例提供了一种注射用荧光示踪剂，由以下组分制成：吲哚菁绿0.77mg、人血清白蛋白类制品162.5mg、灭菌注射用水1ml和稀释剂葡萄糖注射液1ml；
[0083]
其中，吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品的摩尔比为2：5。
[0084]
吲哚菁绿在注射用荧光示踪剂中的浓度为5
×
10
‑4mol/l。
[0085]
该注射用荧光示踪剂的制备方法，包括以下步骤：
[0086]
将配方量的吲哚菁绿、人血清白蛋白类制品和灭菌注射用水使用旋涡混合器(vortex
‑
5，qilinbeier)旋转60s(十档)，使其充分混合，然后加入配方量的葡萄糖注射液进行稀释，得到注射用荧光示踪剂。
[0087]
实施例3
[0088]
本实施例提供了一种注射用荧光示踪剂，除了人血清白蛋白类制品的质量由85mg替换为81.25mg，以使吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品的摩尔比为4：5，其余组分用量以及制备方法与实施例2相同。
[0089]
实施例4
[0090]
本实施例提供了一种注射用荧光示踪剂，除了人血清白蛋白类制品的质量由42.5mg替换为40.6mg，以使吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品的摩尔比为8：5，其余组分用量以及制备方法与实施例2相同。
[0091]
对比例1
[0092]
本对比例提供了一种注射用荧光示踪剂，除了人血清白蛋白类制品的质量由340mg替换为325mg，以使吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品的摩尔比为1：5，其余组分用量以及制备方法与实施例2相同。
[0093]
对比例2
[0094]
本对比例提供了一种注射用荧光示踪剂，除了人血清白蛋白类制品的质量由6.8mg替换为6.5mg，以使吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品的摩尔比为50：5，其余组分用量以及制备方法与实施例2相同。
[0095]
对比例3
[0096]
本对比例提供了一种icg水溶液，由以下组分制成：icg 0.77mg和灭菌注射用水2ml。
[0097]
该icg水溶液的制备方法，包括以下步骤：
[0098]
将配方量的吲哚菁绿、灭菌注射用水(2ml)使用旋涡混合器(vortex
‑
5，qilinbeier)旋转60s(十档)，使其充分混合，得到icg水溶液。
[0099]
为了验证本发明各实施例和对比例所能达到的技术效果，特进行以下实验。
[0100]
实验例1
[0101]
(1)荧光效果体外实验：将各实施例和对比例提供的不同浓度的注射用荧光示踪剂用光谱仪测试其荧光性能，均在同一激发波长(785nm)下的得到的荧光光谱图。考虑传统的icg水溶液(成分只有icg和无菌注射用水)进入人体后完全分散至全血，浓度为10
‑5～10
‑7mol/l，在此范围内对荧光光谱作曲线下面积积分(auc)，具体如图3所示。从图3可以看出，当吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品的摩尔比为(2
‑
8)：5时，荧光谱线的面积积分较大，即该注射用荧光示踪剂的荧光性能较好。其中，当吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品的摩尔比为4：5时，荧光谱线的面积积分最大，此时，具有最好的荧光性能。
[0102]
(2)动物体内成像实验：通过尾静脉注射实施例3提供的注射用荧光示踪剂(吲哚菁绿和人血清白蛋白类制品的摩尔比为4：5)以及对比例3提供的icg水溶液，在时间点15min、30min、1h、2h、3h和5h对肿瘤做成像对比，如图4所示。从图中可以看出，本发明实施例3注射用荧光示踪剂的成像效果显著优于传统icg水溶液成像(注射用荧光示踪剂tbr＝2.15
±
0.19；icg
‑
water组(icg水溶液)tbr＝1.23
±
0.24，tbr＝tumor to background ratio，肿瘤与正常组织荧光强度比值)，具有更优的tbr和更清晰的肿瘤边界。
[0103]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。