一种硬件相关明场显微镜拍摄系统及方法与流程

1.本发明涉及显微镜的明场技术领域，具体涉及一种硬件相关明场显微镜拍摄系统及方法。


背景技术：

2.显微镜的明场技术是生物学中最基本的应用技术，以临界照明或科勒照明为主的明场成像，相差成像和微分干涉成像是目前主要的显微镜明场成像技术。将led等光源的光通过聚光镜聚焦到样品上，相机或者眼睛通过物镜观察到样品的像。无需导入荧光蛋白或者染色即可获取生物样本的像，显微镜明场成像在原位观测细胞或细菌等生物的生长和形态上有着不可替代的作用。
3.普通的显微镜明场成像在对比度上不够清晰，研究学者相继开发了提升对比度的方法，比如相差显微镜，微分干涉显微镜等，这些方法都要改变照明方式，相差显微镜需要相差物镜及聚光镜中带有相差环形成具有相位差的光路系统，同样的微分干涉显微镜需要成像光路中加入起偏镜和检偏镜。相差显微镜提升图像的对比度而微分干涉能够使图像看上去更加立体，两者都需要特殊的光学元件组成成像光路。样品表面不平整引起折射会影响到相差显微镜的成像效果，相差显微镜要求比较严格。在一些特殊成像需求中，显微镜系统无法组成相差成像光路。随着机器学习等图像自动识别技术的发展，显微镜图像的大数据处理也跟上信息化的潮流，获取高对比度的显微镜图像是高通量数据处理的一个重要步骤，因此迫切需要一种快速成像高对比度显微镜图像的方法。
4.文献1中公开了一种获取相关明场图像的方法，通过显微镜的z扫描获取一系列的明场图像，通过加入内核函数计算z方向每个像素的光强得到一张对比度清晰的细菌图像。但是此获取相关图像的方法需要拍摄一组z扫描的图像，以文献中公开为例，需要采集31张图像并对31张图像进行图像积分从而获得一张相关图像。拍摄图像多以及后续的数据处理多是此公开方法的主要弊端，如此会明显降低相关明场成像的速度。
5.1.julou,t.；mora,t.；guillon,l.；croquette,v.；schalk,i.j.；bensimon,d.；desprat,n.,cell-cell contacts confine public goods diffusion inside pseudomonas aeruginosa clonal microcolonies.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america 2013,110(31),12577-12582.


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种硬件相关明场显微镜拍摄系统及方法，以克服现有技术的缺陷，本发明采用硬件积分和调制光源的方法将拍摄明场图像缩短至两张，大大缩短此方法中显微镜成像的时间，同时获得对比度清晰的硬件相关明场图像。
7.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种硬件相关明场显微镜拍摄系统，包括从上至下依次设置的光源、压电z台、显微镜和相机，还包括信号控制系统，所述信号控制系统用于同步控制所述光源、压电z台和
相机。
9.进一步地，所述光源采用led光源。
10.进一步地，所述相机采用scmos相机。
11.一种硬件相关明场显微镜拍摄方法，包括：
12.相机拍摄准备开始后，等待信号控制系统的外触发信号，当外触发信号到达时相机开始曝光，在此次曝光时间内进行压电z台移动和光源开启，压电z台从定位0点焦面位置以下
‑∝
微米开始步进，每步进一步光源开启一次，当压电z台移动到定位0点焦面位置时，第一次相机曝光结束，从相机中读取第一张图像；
13.相机开始第二次等待接受外触发信号，当外触发信号到达时相机开始曝光，在此次曝光时间内压电z台从定位0点焦面位置步进到
∝
微米，每步进一步光源开启一次，当压电z台移动到
∝
微米时，第二次相机曝光结束，从相机中读取第二张图像；
14.将第二张图像和第一张图像进行图像差分，即获得硬件相关明场图像。
15.进一步地，所述曝光时间采用以下方程调制：
[0016][0017]
其中，h是显微镜z轴距离显微镜物镜聚焦平面的位移，fz为常数，表示z扫描成像中心平面的z位置，δ为常数，表示k(h)函数调制的幅度。
[0018]
进一步地，所述第一次相机曝光或第二次相机曝光后，相机中所得图像表示如下：
[0019]
image_c＝∫image(h)
×
k(h)dh
[0020]
其中，image(h)表示在h位置采集的图像。
[0021]
进一步地，所述硬件相关明场图像表示如下：
[0022][0023]
其中，为第二次相机曝光后，相机中所得图像；为第一次相机曝光后，相机中所得图像。
[0024]
进一步地，所述
∝
≤2。
[0025]
进一步地，所述压电z台的步进步长为0.2微米。
[0026]
进一步地，所述压电z台的移动范围为150微米，所述压电z台用0-10v的模拟信号控制移动，其中，设定中间初始位置电压5v，即将fz＝0的位置定义为定位0点焦面位置。
[0027]
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0028]
本发明系统通过设置光源、压电z台、显微镜、相机以及信号控制系统，通过信号控制系统同步控制所述光源、压电z台和相机，使用时，本发明在显微镜样品成像焦面上下做快速z扫，对成像焦面上和成像焦面下进行两次成像，每次成像时，根据z轴的位置分别调制光源的开关时间，最后对拍摄的焦面上下的图像进行图像差分得到硬件相关明场图像，本发明采用硬件相关的方法将拍摄图像缩短至两张，大大缩短此方法中显微镜成像的时间，同时获得对比度清晰的相关图像。
[0029]
本发明方法能够很好的解决相关明场拍摄速度慢的问题，不需要后期大量的图像
处理。优势于相关明场的是硬件相关明场拍摄时相机只需要采集两次明场图像，每次采集图像将原本需要在软件中进行重组的图像分别在焦平面的正或者负位移进行相对应曝光时间的图像积分，如此将两张图像通过简单处理可得相关明场图像。同比于其他显微镜技术而言，硬件相关明场的图像对比度高于相差显微镜，在图像分析上具有优势，而且不需要考虑样品制备的平整度引起的光路上的变化，具有更广的适用性。
附图说明
[0030]
说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0031]
图1为本发明的硬件相关明场拍摄原理；a)以焦面为零点的调制函数绝对值|k(h)|；b)相机的控制时序图；c)控制硬件相关明场的压电z台信号；d)调制led信号的同步控制时序图；
[0032]
图2为本发明的硬件相关明场拍摄示意图；
[0033]
图3为本发明的硬件相关明场拍摄流程图；
[0034]
图4为细菌拍摄图像，(a)为硬件相关明场图像，(b)为明场图像；
[0035]
图5为图4中黑线处光强的分布图，(a)为硬件相关明场图像的分布图，(b)为相同位置明场图像的光强分布图。
具体实施方式
[0036]
以下结合附图及具体实施例对本发明进行进一步详细说明。
[0037]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0038]
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
[0039]
本发明提供一种提高显微镜明场对比度的硬件相关明场拍摄技术，采用硬件积分的方法将相关明场的成像速度提升，快速拍摄高对比度的显微镜细菌图像。实现实时快速的相关明场拍摄，可用于实时预览，图像追踪等。另一方面通过硬件积分的方法降低相关明场采集的数据图像处理量，最后缩短至2张图像差分。将相关明场技术发展到实际可使用的拍摄速度和数据处理量。
[0040]
具体来说，本发明在显微镜样品成像焦面上下做快速z扫，对成像焦面上和成像焦面下进行两次成像。每次成像时，根据z轴的位置分别调制光源的开关时间。最后对拍摄的
焦面上下的图像进行图像差分得到硬件相关明场图像。
[0041]
本实例中采用scmos相机高速采集显微镜明场图像，使用高精度的同步信号控制系统控制图像采集，对明场光源进行精确调制，曝光时间采用以下方程|k(h)|调制：
[0042][0043]
其中h是显微镜z轴距离焦平面的位移，fz是成像焦面的z位置，为常数，δ为常数，表示k(h)函数调制的幅度。由于调制函数对h是焦平面对称(如图1.a)，所以采取相机曝光两次再相减得到硬件相关明场图像(如图1.b)。每次曝光后，相机所得图像image_c定义如下：
[0044]
image_c＝∫image(h)
×
k(h)dh
[0045]
其中image(h)表示在h位置采集的图像。所拍摄硬件相关明场图像image_h定义如下：
[0046][0047]
在一次显微镜硬件相关明场成像中，相机的曝光由外部ttl信号触发开启。因为相机是滚动快门模式，所以在延时一定时间后压电z台由模拟信号控制移动，根据|k(h)|的有效值，压电z台步长范围不超过
±
2微米。本实例中设定步长0.2微米，如图1中c所示移动范围150微米的压电z台由0-10v的模拟信号控制移动，其中设定中间初始位置电压5v，即是fz＝0的位置定位0点焦面。压电z台完成一次移动后led开启一次(led信号高电平有效)，led开启时间由调制函数|k(h)|确定(图1中d)。
[0048]
本实例在常规的具有压电z台的显微镜上即可实现，如图2包含显微镜，压电z台，相机，led光源以及一套高精度的信号控制系统。显微镜主机，相机，led光源均由信号控制完成设备间的同步。选用压电z台的原因是拍摄过程z轴需要快速控制，实验常规的200毫秒内拍摄完成一组图像，而机械z轴将大大降低成像速度。本实例中选用的是asi的压电z台。
[0049]
整体硬件相关明场拍摄流程如图3所示，相机拍摄准备开始后，相机等待外触发信号，信号如前文所述，当上升沿信号到达时相机开始曝光，在此次曝光时间内进行压电z台移动和led开启，压电z台从焦面0点位置以下-1.6微米开始步进，每步进一步led开启一次，led开启时间根据z台位置信息进行相应的调制，如公式(1)所示。当压电z台移动到0时，第一次相机曝光结束。随后相机开始第二次等待接受外触发信号，当上升沿信号到达时相机开始曝光，在此次曝光时间内压电z台从焦面0点位置步进到1.6微米，同理led开启时间根据z台位置信息进行如公式(1)所述的调制。压电z台步进到1.6微米时相机结束曝光。从相机内读取两张图像进行图像差分即可获得相关明场图像。
[0050]
本发明采用图像积分与曝光调制的拍摄方法提升相关明场拍摄速度，压电z台扫描时调制光源的开关时间，在相机曝光时间内作为图像积分获取相关明场图像，同时本发明使用高精度的同步控制信号控制硬件相关明场的拍摄。对光源的开关时间，相机的曝光时间，压电z台的步进进行精确的控制，保障高质量图像的获取，另外本发明将图像处理算法内置在软件中，相机拍摄完成后软件实时处理拍摄的显微镜图像，获取高对比度的硬件相关明场图像。
[0051]
经过实际使用，本发明获取硬件相关明场的拍摄图像，获取高对比度的明场图像，
背景均一，可广泛适用于细菌图像识别，如图4所示，从图4可以看出，在标尺5微米下，相对于明场图像，本发明获得的硬件相关明场图像背景均一，图像对比更清晰。
[0052]
从图5可以看出，在相同位置处，相对于明场图像，本发明获得的硬件相关明场图像的对比度明显大于明场图像的对比度，更加容易识别细菌。
[0053]
最后应当说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解:本领域技术人员阅读本发明后依然可对发明的具体实施方式进行种种变更、修改或者等同替换，但这些变更、修改或者等同替换，均在发明待批的权利要求保护范围之内。