一种卵巢癌诱导慢性静脉血栓动物模型的构建方法及其应用与流程

1.本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种卵巢癌诱导慢性静脉血栓动物模型的构建方法及其应用。


背景技术：

2.静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism，vte)作为恶性肿瘤患者常见的合并症，是仅次于肿瘤本身引起患者死亡的原因，但肿瘤相关vte如何发生仍有待进一步探讨。vte动物模型是理解vte发生机制的重要模型工具。
3.根据目的的不同，vte动物模型从动物类型、血栓制作到评价指标都存在很大差异。血栓的形成是构建血栓动物模型的关键，主要包括体外血栓形成和体内血栓形成，体外血栓形成是通过在无菌条件下抽取动物静脉血，通过体外静置或加入凝血酶形成血栓，将形成的血栓注射到动物体内构建血栓模型，然而体外血栓形成并不能体现人体在形成血栓时机体的高凝状态、凝血机制失衡等。体内血栓形成主要包括：
①
使用经fecl3浸润后的滤纸覆盖于动物的颈静脉或下腔静脉，导致血管内膜的氧化应激损伤，激活内源性凝血系统，促使血管内血栓形成，血栓形成的程度与fecl3的浓度及处理时间呈正相关；
②
动
–
静脉旁路血栓形成模型：一般在大鼠或家兔中分离一侧颈总动脉和另一侧颈外静脉，通过三段相连的、充满肝素生理盐水的聚乙烯管形成旁路动
–
静脉血流，在中段管管腔内放一段丝线，血流中的血小板在接触丝线粗糙面后发生黏附、聚集、形成血小板血栓；
③
采用尾静脉注射含胶原/肾上腺素，引起血小板血栓形成，进而达到构建血栓模型的目的。然而，以上三种造模方法只适用于短期观察急性血栓形成，而肿瘤引起的血栓相对而言属于慢性过程。因此，以上模型均不能很好地模拟肿瘤相关血栓形成的血流动力学变化以及细胞分子在血栓形成的作用。
4.据报道静脉结扎法和静脉狭窄法适用于模拟血栓形成的慢性过程。静脉结扎法是通过阻断(结扎)深静脉血液的回流，导致静脉血液回流障碍，局部血流淤滞、缺氧，血管内皮细胞损伤，启动凝血过程。此外，血小板与局部形成的凝血因子也因血流受阻停留在局部致使血栓形成。虽然该方法适合作为动态的动物模型，然而该方法同样存在结扎血管时对血管内皮造成损伤，仍不适合模拟肿瘤血栓形成。静脉狭窄法建立在静脉结扎法的基础上，通过部分结扎静脉造成狭窄，使得静脉血液回流障碍，局部血流淤滞，血小板与局部形成的凝血因子也因血流受阻停留在局部致使血栓形成，与静脉结扎法不同的是，静脉狭窄法保留了部分管腔内血流，同时未造成血管内皮的损伤。


技术实现要素：

5.为克服现有技术的上述不足，本发明的第一目的是提供一种卵巢癌诱导慢性静脉血栓动物模型的构建方法，采用肿瘤动物模型和vte动物模型相结合的方式，在卵巢癌腹腔移植瘤动物模型的基础上通过静脉狭窄法形成血栓得到。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案为：
7.本发明提供一种卵巢癌诱导(腹腔)慢性静脉血栓动物模型的构建方法，包括以下步骤：
8.(1)选取严重联合免疫缺陷(scid)小鼠，在其腹腔内按照注射剂量为每只scid小鼠注射1
×
107个细胞/200ulpbs注射skov3卵巢癌细胞系，注射后7
–
21天内持续观察scid小鼠，待体内形成8
–
10枚肿瘤病灶且肿瘤不足以使scid小鼠在短时间内死亡，得到腹腔移植瘤scid小鼠；
9.(2)选择20％
–
80％的下腔静脉狭窄程度对上述腹腔移植瘤scid小鼠进行静脉狭窄手术处理，术后1
–
14天进行下腔静脉超声检查和下腔静脉取样he染色，直至血栓形成，得到卵巢癌诱导慢性静脉血栓动物模型。
10.优选地，所述skov3卵巢癌细胞系为人卵巢浆液性腺癌细胞系skov3。
11.优选地，步骤(1)中，所述scid小鼠选自4
–
6周龄、体重16
–
18g的scid型雌性小鼠。
12.优选地，步骤(1)中，腹腔注射所述skov3卵巢癌细胞系后第14天得到腹腔移植瘤scid小鼠。
13.优选地，步骤(1)中，所述肿瘤病灶位于所述scid小鼠的肝表面腹腔和小肠系膜表面腹腔。
14.优选地，步骤(2)中，所述下腔静脉狭窄程度为50％。
15.优选地，步骤(2)中，狭窄手术后第3天下腔静脉超声检查，同时狭窄手术后第5天下腔静脉取样he染色，确定血栓形成。
16.优选地，步骤(2)中，下腔静脉取样为下腔静脉结扎段近心端和远心端各0.5cm长度的血管。
17.本发明还提供了通过上述构建方法得到的卵巢癌诱导慢性静脉血栓动物模型在确定促进卵巢癌发生vte的关键分子及其下游调控靶向分泌型蛋白中的应用。
18.本发明首次以肿瘤动物模型和vte动物模型相结合，在卵巢癌腹腔移植瘤动物模型的基础上通过静脉狭窄法形成血栓得到卵巢癌诱导慢性静脉血栓动物模型，建模稳定且安全可操作，符合卵巢癌诱导vte的生物学行为，通过其研究合并血栓和不合并血栓卵巢癌患者形成vte血栓成分的差异性，可用于寻找促进卵巢癌发生vte的关键分子及其下游调控靶向分泌型蛋白，进一步探究关键分子调控卵巢癌发生vte的关键信号通路。
附图说明
19.图1是实施例中构建卵巢癌诱导慢性静脉血栓小鼠模型的方法流程图。
20.图2是实施例中skov3卵巢癌细胞系腹腔注射成瘤scid小鼠模型；其中：(a)肝表面腹腔移植瘤病灶；(b)小肠系膜表面腹腔移植瘤病灶。
21.图3是实施例中scid小鼠腹腔注射skov3卵巢癌细胞诱导vte模型的下腔静脉血栓he染色。
22.图4是实施例中高频超声评价卵巢癌诱导慢性静脉血栓动物模型的下腔静脉血栓形成。
具体实施方式
23.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例的
附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
24.以下实施例中选用scid型雌性小鼠，4
–
6周龄，体重16
–
18g，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，批号：20170011006984。饲养条件：实验动物饲养于复旦大学附属中山医院实验动物科学部，室温(23
±
2)℃，相对湿度50％
–
70％，光照12h，黑暗12h，每笼5只，饲料为spf级，维持鼠料(购自上海普路腾生物科技有限公司)，饮水为净化水，自由饮水、自由摄食；所有动物抵达后驯化至少1周。
25.实施例1
26.按照如图1所示的方法构建卵巢癌诱导慢性静脉血栓动物模型，步骤如下：
27.第一步：先进行细胞培养和试剂筛选，获得人卵巢浆液性腺癌细胞系skov3，所有细胞均使用rpmi-1640培养基(上海森布生物)，含10％胎牛血清(上海科川生物)、2mm谷胱甘肽(上海科川生物)和100u/ml青霉素(上海肇启生物技术有限公司)，细胞培养环境为37℃，95％空气
–
5％co2加湿培养箱。收取的skov3细胞按照1
×
107的数量腹腔注射到每只scid小鼠体内，建立腹腔移植瘤scid小鼠，从注射癌细胞之日起第14天开始评估腹腔肿瘤形成情况及scid小鼠的存活率，直至其体内有8
–
10个肿瘤灶形成量，且肿瘤不足以在短时间内杀死scid小鼠，小鼠每周称重一次。
28.第二步：在scid小鼠腹腔注射skov3建立腹腔移植瘤后第14天，所有存活scid小鼠均接受下腔静脉狭窄手术诱导体内vet形成，具体如下：用戊巴比妥钠腹腔麻醉scid小鼠并使其处于仰卧位，待剖腹术后使其肠外翻，全程用无菌生理盐水防止腹部干燥；游离下腔静脉顺血管壁放置22号针头并结扎肾下腔静脉(ivc)，然后取出针头进行部分血流限制(狭窄)；其中针被放置在血管外，可以完全避免穿刺或任何其他对ivc壁损伤情况的发生，该操作流程允许标准化的血流限制而无内皮损伤，所有侧支均未结扎，并将血管腔面积减少至管腔横截面积的50％(用卡尺测量并计算血流横截面积为πr2)。手术操作后注意scid小鼠苏醒的保温、补充丢失体液，术后分别用单丝和6.0丝可吸收缝合线缝合腹膜和皮肤。再饲养5天后处死scid小鼠，取下腔静脉含血栓部位或者取下腔静脉不低于缝合线(朝向尾部)部位进一步分析。所有手术操作均由同一位实验动物技术人员进行，手术后青霉素抗感染治疗3天，待ivc术后存活超过5天且能观察到vte形成的scid小鼠即为卵巢癌诱导慢性静脉血栓动物模型。
29.每只scid小鼠在结扎后第5天进行超声显像，观察下腔静脉结扎处血流受阻、血管横切面和纵切面的充盈缺损等标志血栓形成的指标情况，使用“vivo 2100”超声扫描仪和24.0兆赫线性阵列换能器来采集超声数据。由于在完成超声成像后静脉循环内的血流停滞，选择在下腔静脉形成血栓前对动物实施安乐死后，取下腔静脉结扎段近心端和远心端各0.5cm长度血管进行石蜡切片he染色。
30.如图2所示，通过人源卵巢癌细胞系skov3腹腔注射入scid小鼠体内第14天scid小鼠腹腔成瘤情况可见，scid小鼠体内肝脏及肠系膜出现肿瘤病灶。
31.如图3所示，模型scid小鼠在50％下腔静脉狭窄程度的狭窄术后第5天其血栓形成的超微结构，其血管腔面积减至总管腔横截面积的50％(图3c
–
d)；血栓的多层结构在垂直剖面上是规则的，血栓头部含血小板和红细胞，中间有红细胞聚集，血栓尾部有血小板和红
细胞混合物(图3e
–
f)；单纯狭窄静脉腔的结构光滑，无血栓形成(图3a
–
b)。
32.如图4所示，模型scid小鼠高频超声成像评估发现，在接受狭窄术后第3天可见狭窄部位的下游血管明显狭窄，但无血栓形成(图4a
–
b)；在接受狭窄术后5天，在狭窄部位的上游观察到血栓形成(图4c)；使用彩色多普勒对血管中的血流进行定量显示，在模型scid小鼠手术后第5天，狭窄的ivc没有血液流动(图4d)，表明ivc内存在血栓。
33.另外，按照实施例1的方法共构建卵巢癌诱导慢性静脉血栓动物模型82例，成功率50％，死亡率0％，表明本发明建模稳定且安全可操作，通过其研究合并血栓和不合并血栓卵巢癌患者形成vte血栓成分的差异性，可用于寻找促进卵巢癌发生vte的关键分子及其下游调控靶向分泌型蛋白。另外，在卵巢癌细胞系中进行基因敲除或过表达还可以进一步探究关键分子调控卵巢癌发生vte的关键信号通路。