一种低温环境下获取脐带间充质干细胞外泌体的制备工艺的制作方法

1.本发明涉及干细胞外泌体制备领域，特别涉及一种低温环境下获取脐带间充质干细胞外泌体的制备工艺。


背景技术：

2.外泌体，是指包含了复杂 rna 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，如今，特指直径在40-100nm的盘状囊泡。人体几乎所有类型的细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。干细胞也不例外，干细胞外泌体是指由干细胞分泌而来的一种直径为30-100 nm的膜囊泡，含有蛋白质、脂质、转录因子、mirna、非编码rna和核酸，相比于干细胞，干细胞外泌体细胞因子分子量较小，渗透性较强，因此能够通过人体的皮肤角质层进入表皮层和真皮层，最终作用于细胞。使成纤维细胞分泌的i型、iii型胶原、糖性蛋白量的提高、增加血管内皮细胞管状形成率从而使皮肤深层细胞得到激活、滋养和修复，从而起到美容抗衰的作用，充质干细胞外泌体的制备一般采用超速离心法制备，用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒，但是其过程比较费时，且回收率不稳定，纯度较低，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量，为打破超速离心法存在的桎梏，其采用新型的超滤离心法进行制备，但是超滤离心法在制备时存在以下问题，其超滤离心装置数量为单数时并且放置在离心转子中，因为高速转动，离心转子两侧重量不同，容易发生偏移，导致离心转子损坏，影响后续使用，为此，我们提出一种低温环境下获取脐带间充质干细胞外泌体的制备工艺。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的在于提供一种低温环境下获取脐带间充质干细胞外泌体的制备工艺，可以有效解决背景技术中的问题。
4.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种低温环境下获取脐带间充质干细胞外泌体的制备工艺，包括超滤离心设备、无菌培养皿、t-25 cm2 培养瓶中脐带间充质干细胞，在无菌培养皿内培养脐带间充质干细胞，接种于t-25 cm2 培养瓶中， 加入完全培养基6 ml，于37 ℃、体积分数为5%co2细胞培养箱中培养；培养完成后将其放置在超滤离心设备进行工作；所述超滤离心装置的使用方法如下：步骤s1：在5-20℃低温环境下进行超滤工作，将超滤离心装置通过导向块准确的插入所提供的一个微量离心管中；步骤s2：向超滤离心装置中均匀加入不超过500 μl的样本,并盖上盖子；步骤s3：将盖好盖子的超滤管放入离心转子中，让盖子的连接带一侧朝着转子的中央，离心可调平衡模块放置在离心转子另一侧进行平衡；步骤s4：以14000
ꢀ×
g离心约10-30分钟,具体时间取决于所使用超滤管的nmwl；步骤s5：离心结束后将整个超滤管从离心机中取出,并且取出超滤离心装置；
步骤s6：为了回收浓缩后的溶质,将超滤离心装置倒过来插在-个干净的微量离心管中，放在离心机中,让打开的盖子朝着转子的中央；离心可调平衡模块放置在超滤离心装置另一侧进行平衡工作，此时以1000
ꢀ×ꢀ
g离心2分钟,使浓缩后的样本从超滤超滤离心装置转移到滤出液收集管中，超滤液可以保存在浓缩液收集管中。
5.进一步的，所述超滤离心设备包括超滤管和离心机，所述超滤管包括滤出液收集管（微量离心管）、浓缩液收集管（微量离心管）和超滤离心装置，所述超滤离心装置内置在滤出液收集管内部或者内置在浓缩液收集管内部进一步的，所述超滤离心装置外侧设置四个呈竖直设置的导向块，并且导向块的长度为超滤离心装置长度的1/3，导向块上方与超滤离心装置上方平齐。
6.进一步的，所述微量离心管内侧设置有四个呈竖直开设的滑槽，其内侧的滑槽与导向块配合使用，呈上下滑动，并且超滤离心装置外侧与微量离心管内壁紧密接触。
7.进一步的，所述离心可调平衡模块包括超滤离心装置和内置可上下滑动的内管，且还包含一个重量注射针，重量注射针外侧分布均匀分布的刻度，所述重量注射针内部设有平衡液体，所述重量注射针外侧分布的刻度表示其重量。
8.进一步的，所述内管上方开设有注入孔，注入孔的孔径与重量注射针的针头外径一致，所述离心可调平衡模块放置在离心转子中，并且呈一定倾斜角度。
9.进一步的，在细胞融合度为65％-75％以上时，进行传代培养，培养至第四代时，收集无菌培养上清。
10.进一步的，收集无菌培养上清时去除所述培养上清中的脐带间充质干细胞、细胞碎片和细胞器等杂质，得到粗提液。
11.进一步的，所述脐带间充质干细胞外泌体是由脐带间充质干细胞分泌。
12.进一步的，所述超滤离心装置内部的滤膜采用聚醚砜膜，其截留分子量（nmwl）为3000时左右采用3k超滤管，其截留分子量（nmwl）为10000左右时采用10k超滤管，其截留分子量（nmwl）为30000左右时采用30k超滤管，其截留分子量（nmwl）为50000左右时采用50k超滤管，其截留分子量（nmwl）为100000左右时采用100k超滤管。
13.进一步的，所述超滤离心装置内部的超滤膜含有微量甘油。
14.进一步的，所述超滤离心装置内部的超滤管中的滤膜一旦润湿后应避免变干，如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
15.本发明具有如下有益效果：与现有技术相比，由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(mwco)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体，超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，保证外泌体的质量，离心可调平衡模块包括超滤离心装置和内置可上下滑动的内管，且还包含一个重量注射针，其可以通过重量注射针向内管内部注入平衡液体，进而使其重量达到与盛放在超滤管内部的样品质量一致，此时可以保证离心机在运转时，其离心转子稳定转动，保证离心转子运行时，不宜发生晃动的情况，保证其外泌体可以稳定制备，超滤离心装置外侧设置的导向块和微量离心管内侧设置的滑槽可以保证超滤离心装置稳定滑动至微量离心管内部，在使用时，其不会发生相互转动，保证超滤质量。
具体实施方式
16.实施例1一种低温环境下获取脐带间充质干细胞外泌体的制备工艺，包括超滤离心设备、无菌培养皿、t-25 cm2 培养瓶中脐带间充质干细胞，在无菌培养皿内培养脐带间充质干细胞，接种于t-25 cm2 培养瓶中， 加入完全培养基6 ml，于37 ℃、体积分数为5%co2细胞培养箱中培养；培养完成后将其放置在超滤离心设备进行工作；所述超滤离心装置的使用方法如下：步骤s1：在无菌环境下，在15℃低温环境下进行超滤工作，将超滤离心装置通过导向块准确的插入所提供的一个微量离心管中；步骤s2：向超滤离心装置中均匀加入400μl的样本,并盖上盖子；步骤s3：将盖好盖子的超滤管放入离心转子中，让盖子的连接带一侧朝着转子的中央，离心可调平衡模块放置在离心转子另一侧进行平衡；步骤s4：以14000
ꢀ×
g离心10分钟，具体时间取决于所使用超滤管的nmwl；步骤s5：离心结束后将整个超滤管从离心机中取出,并且取出超滤离心装置；步骤s6：为了回收浓缩后的溶质,将超滤离心装置倒过来插在-个干净的微量离心管中，放在离心机中,让打开的盖子朝着转子的中央；离心可调平衡模块放置在超滤离心装置另一侧进行平衡工作，此时以1000
ꢀ×ꢀ
g离心2分钟,使浓缩后的样本从超滤超滤离心装置转移到滤出液收集管中，超滤液可以保存在浓缩液收集管中。
17.所述超滤离心设备包括超滤管和离心机，所述超滤管包括滤出液收集管（微量离心管）、浓缩液收集管（微量离心管）和超滤离心装置，所述超滤离心装置内置在滤出液收集管内部或者内置在浓缩液收集管内部，所述超滤离心装置外侧设置四个呈竖直设置的导向块，并且导向块的长度为超滤离心装置长度的1/3，导向块上方与超滤离心装置上方平齐，这种设置可以保证超滤离心装置可以通过导向块稳定滑动至微量离心管内部，同时避免超滤离心装置与微量离心管发生相对转动。
18.所述微量离心管内侧设置有四个呈竖直开设的滑槽，其内侧的滑槽与导向块配合使用，呈上下滑动，并且超滤离心装置外侧与微量离心管内壁紧密接触，这种设置可以避免超滤离心装置与微量离心管在离心工作时，发生晃动。
19.所述离心可调平衡模块包括超滤离心装置和内置可上下滑动的内管，且还包含一个重量注射针，重量注射针外侧分布均匀分布的刻度，所述重量注射针内部设有平衡液体，所述重量注射针外侧分布的刻度表示其重量，这种设置可以根据注入样品的重量对离心可调平衡模块的重量进行调节，保证质量一致，此时在离心工作时，其离心转子不易发生晃动，保证离心工作正常进行。
20.所述内管上方开设有注入孔，注入孔的孔径与重量注射针的针头外径一致，所述离心可调平衡模块放置在离心转子中，并且呈一定倾斜角度，这种设置在保证在离心转子转动时，其不易被甩出，保证超滤工作正常进行。
21.在细胞融合度为65％-75％以上时，进行传代培养，培养至第四代时，收集无菌培养上清，因为第4代脐带间充质干细胞融合可高达90%，保证超滤工作正常进行。
22.收集无菌培养上清时去除所述培养上清中的脐带间充质干细胞、细胞碎片和细胞
器等杂质，得到粗提液，这种设置保证超滤后外泌体的纯度。
23.所述脐带间充质干细胞外泌体是由脐带间充质干细胞分泌。
24.所述超滤离心装置内部的滤膜采用聚醚砜膜，其截留分子量（nmwl）为3000时左右采用3k超滤管，其截留分子量（nmwl）为10000左右时采用10k超滤管，其截留分子量（nmwl）为30000左右时采用30k超滤管，其截留分子量（nmwl）为50000左右时采用50k超滤管，其截留分子量（nmwl）为100000左右时采用100k超滤管。
25.所述超滤离心装置内部的超滤膜含有微量甘油，如果担心干扰后续分析,可用缓冲液或milli-q水进行预清洗，如果干扰仍然存在,可用0.1m naoh清洗,再用缓冲液或milli-q8水清洗并甩干。
26.所述超滤离心装置内部的超滤管中的滤膜一旦润湿后应避免变干，如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
27.通过采用上述技术方案：可以根据重量注射针将平衡液体注入至离心可调平衡模块内部的内管中，进而使其重量达到与盛放在超滤管内部的样品质量一致，此时可以保证离心机在运转时，其离心转子稳定转动，保证离心转子运行时，不宜发生晃动的情况，保证其外泌体可以稳定制备，超滤离心装置外侧设置的导向块和微量离心管内侧设置的滑槽可以保证超滤离心装置稳定滑动至微量离心管内部，并且超滤离心装置外壁与微量离心管紧密接触，此时在转动离心时，超滤离心装置不易与微量离心管不会发生晃动，保证离心转子质量，同时保证超滤质量。
28.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。