一种具有抗眼底新生血管协同作用的混合物及其用途的制作方法

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种具有抗眼底新生血管协同作用的混合物及其用途。


背景技术：

2.眼底新生血管疾病是一种进行性退行性疾病，会导致严重的视力下降，甚至致盲。眼底新生血管主要包括两类疾病：一种是脉络膜新生血管(cnv)类疾病，例如新生血管年龄相关性黄斑变性(amd)；另一种是视网膜新生血管(rnv)，例如糖尿病视网膜病变(dr)。均具有很高的发病率，据统计，2017年全球amd的患病人数大约有3000-5000万人，预计到2040年将增加到2.88亿；全球dr的患病人数预计到2040年将增加到1.91亿。目前，针对眼部新生血管疾病的促进因子-血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,vegf)的av类药物，如bevacizumab、aflibercept、conbercept等，以促血管新生最重要的因子vegf为靶点，在临床上已被证明能有效抑制cnv，但仍存在效果不理想、需反复注射等问题，接近67.4％的amd患者和40％的dr患者对单纯的vegf抗体治疗效果不佳。
3.造成效果不佳的主要原因在于：在眼底新生血管类疾病的形成过程中，除了vegf因子，“炎症”也发挥着至关重要的作用，甚至是产生vegf的“上游”。炎症和vegf二者存在相互作用，协同促进新生血管的形成。临床实践证实，“抗vegf 抗炎”治疗cnv类疾病有效，但目前激素类抗炎药物存在毒副作用，例如临床常用的曲安奈德尚存在致青光眼、白内障等毒副作用问题有待解决。
4.目前来看，眼底新生血管疾病的治疗现状是
①
缺少一种安全性高的、天然的抗炎药物；
②
缺少一种“抗vegf 抗炎”的联合药物以实现协同抗眼底新生血管的作用。


技术实现要素：

5.为了有效的解决上述技术问题，本发明提供了一种具有抗眼底新生血管协同作用的混合物及其用途。
6.第一方面，本发明要求保护一种具有抗眼底新生血管协同作用的混合物。
7.本发明要求保护的具有抗眼底新生血管协同作用的混合物，由treg细胞来源的外泌体和抗vegf抗体混合而成。
8.进一步地，所述treg细胞来源的外泌体和所述抗vegf抗体两者的蛋白质量比可为1:1至10:1。
9.其中，所述treg细胞来源的外泌体的蛋白含量可通过bca蛋白定量技术来测定，是本领域公知的现有技术。
10.更进一步地，所述treg细胞来源的外泌体和所述抗vegf抗体两者的蛋白质量比具体为5:1。
11.在本发明的具体实施方式中，所述抗vegf抗体具体为anti-vegf抗体(鼠：r&d systems，no.af-493-na；非人灵长类：medchemexpress，no.hy-p9906)。
12.在本发明的具体实施方式中，所述treg细胞来源的外泌体的粒径约为120nm，平均电势为-15mv。
13.该混合物一次用量为：c57小鼠0.4μg/眼，食蟹猴1.25mg/眼。
14.第二方面，本发明要求保护一种具有抗眼底新生血管协同作用的混合物的制备方法。
15.本发明要求保护的具有抗眼底新生血管协同作用的混合物的制备方法，可包括将所述treg细胞来源的外泌体和所述抗vegf抗体进行混合的步骤。
16.进一步地，所述treg细胞来源的外泌体和所述抗vegf抗体两者混合时的蛋白质量比可为1:1至10:1。
17.更进一步地，所述treg细胞来源的外泌体和所述抗vegf抗体两者混合时的蛋白质量比具体为5:1。
18.在本发明的具体实施方式中，所述抗vegf抗体具体为anti-vegf抗体(鼠：r&d systems，no.af-493-na；非人灵长类：medchemexpress，no.hy-p9906)。
19.在本发明的具体实施方式中，所述treg细胞来源的外泌体的粒径约为120nm，平均电势为-15mv。
20.第三方面，本发明要求保护前文第一方面所述的混合物在制备具有抗眼底新生血管功能的产品中的应用。
21.第四方面，本发明要求保护前文第一方面所述的混合物在制备用于治疗眼底新生血管类疾病的产品中的应用。
22.第五方面，本发明要求保护前文第一方面所述的混合物在如下任一中的应用：
23.p1、制备用于降低眼底新生血管类疾病患者眼内液中vegf因子和/或炎症因子的产品；
24.p2、制备用于降低眼底新生血管类疾病患者的病灶数量和/或病灶大小的产品；
25.p3、制备用于降低眼底新生血管类疾病患者的眼底新生血管数量的产品；
26.p4、制备用于降低眼底新生血管类疾病患者的病灶处vegf因子含量的产品；
27.p5、制备用于降低眼底新生血管类疾病患者的病灶处炎症细胞数量的产品；
28.p6制备用于降低眼底新生血管类疾病患者的脉络膜新生血管侵入视网膜的高度的产品。
29.在p1中，所述炎症因子具体可为il-1β、il-6、tnfα和/或mcp-1；
30.在p5中，所述炎症细胞具体可以巨噬细胞为代表。
31.在本发明中，所述眼底新生血管类疾病具体可为脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,cnv)类疾病或视网膜新生血管(retinal neovascularization)类疾病。
32.进一步地，所述眼底新生血管类疾病可选自：年龄相关性黄斑病变，病理性近视、眼外伤、葡萄膜炎所致脉络膜新生血管，特发性脉络膜新生血管，糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉栓塞所致视网膜新生血管等。
33.本发明提供了一种具有抗眼底新生血管协同作用的混合物，所述混合物由tregexo和antivegf以蛋白量比5:1的比例混合而成，兼具抗vegf和“天然”抗炎的功能。该体系通过玻璃体腔注射后，tregexo发挥抑制炎症细胞及炎症因子的功能，同时antivegf发
挥中和vegf因子的功能，从而通过抗vegf与抗炎的协同作用，高效抑制眼底新生血管，并且安全性高。本发明弥补目前临床抗眼底新生血管治疗的不足。
附图说明
34.图1为实施例1中mscexo的透射电子显微镜(tem)图。
35.图2为实施例1中蛋白质印迹法分析mscexo的标志物。
36.图3为实施例1在眼底新生血管疾病中比较tregexo与mscexo的疗效。其中，a为激光扫描共聚焦显微镜示cnv小鼠模型新生血管的面积及定量统计。b为he染色示cnv小鼠模型新生血管的侵袭高度及定量统计。
37.图4为实施例2中流式细胞仪检测treg细胞的纯度。
38.图5为实施例2中tregexo的透射电子显微镜(tem)图。
39.图6为实施例2中纳米颗粒跟踪分析仪测量tregexo粒径和电势的统计图。
40.图7为实施例3中蛋白质印迹法分析该混合物的主要蛋白成分。
41.图8为实施例3中elisa法检测antivegf结合vegf的能力。
42.图9为实施例3中mmt法检测cecs存活率，以选择混合物成分最佳配比。
43.图10为实施例4中细胞因子微球技术检测cnv模型小鼠眼内液中细胞因子含量。
44.图11为实施例4中眼底荧光造影法观察cnv模型小鼠新生血管灶数量和大小。
45.图12为实施例4中opal多色免疫荧光标记观察cnv病灶处的免疫微环境。
46.图13为实施例4中小动物眼压测量仪检测cnv模型小鼠眼压。
47.图14为实施例4中组织切片he染色观察cnv模型小鼠脏器情况。
48.图15为实施例5中细胞因子微球技术检测cnv模型食蟹猴眼内液细胞因子含量。
49.图16为实施例5中光学相干断层扫描血管成像技术观察cnv模型食蟹猴新生血管灶数量和大小。
50.图17为实施例5中眼前节照相术观察cnv模型食蟹猴角膜、前房及晶状体情况。
51.图18为实施例5中接触式眼压测量仪检测cnv模型食蟹猴眼压。
52.图19为实施例5中静脉采血检测cnv模型食蟹猴的血常规和肝肾功能。
具体实施方式
53.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
54.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
55.下述实施例中的抗vegf抗体(antivegf)为anti-vegf抗体(鼠：r&dsystems，no.af-493-na；非人灵长类：medchemexpress，no.hy-p9906)。
56.实施例1、在眼底新生血管疾病中比较tregexo与mscexo的疗效
57.(1)原代msc细胞(骨髓来源)的体外扩增和mscexo的富集
58.采用全骨髓法提取骨髓间充质干细胞。5-6周的雌性balb/c小鼠处死后消毒备用，
取出小鼠的股骨和胫骨，两端钻孔后将骨髓冲出，过筛网后转移至50ml无菌离心管，1 500r/min离心5min。加入红细胞裂解液裂解红细胞，重复洗涤2次。获取的细胞接种在6孔板内，然后将细胞放入37℃，含5％co2的培养箱中静置。细胞培养，培养48～72h以后第一次给细胞换液，之后视情况每隔2～3天给细胞换液。培养至第10～14d时，进行细胞传代。收集msc细胞的培养基上清，以超速离心法富集mscexo。图1为mscexo的透射电子显微镜(tem)图。图2为蛋白质印迹法分析mscexo的标志物。由图1和图2可见，mscexo呈杯托状，直径约120nm，cd9和cd63高表达。
59.(2)原代treg细胞的体外扩增和tregexo的富集
60.利用磁珠分选法分选出c57bl/6小鼠脾脏来源的naive cd4

t细胞，并用tgf-β诱导其分化为cd4

cd25

treg细胞，同时用anti-cd3、anti-cd28和il-2刺激其体外扩增。收集treg细胞的培养基上清，以超速离心法富集tregexo，并利用透射电子显微镜(tem)观察其形貌，利用纳米颗粒跟踪分析仪(nta)测量其粒径和电势(详见实施例2)。
61.(3)制备混合药物
62.分别将tregexo和mscexo与antivegf按蛋白质量比1:1均匀混合，制备成antivegf tregexo和antivegf mscexo。
63.(4)cnv模型小鼠体内效果验证
64.①
构建激光诱导的cnv小鼠模型。c57bl/6小鼠采用体积百分比为0.5％戊巴比妥(0.1ml/10g
·
bw)腹腔注射麻醉，体积百分比为1％复方托匹卡胺滴眼液扩瞳。角膜表面放置盖玻片后，采用激光光凝法(75μm光斑大小，100mw功率，100毫秒持续时间)，照射每只眼睛视神经周围的视网膜。气泡表明bruch膜的破裂，提示cnv小鼠模型构建成功。
65.②
造模3天后，经玻璃体腔注射途径给药。再用体积百分比0.5％的戊巴比妥(0.1ml/10g
·
bw)腹腔注射麻醉cnv模型小鼠后，用hamilton’s微量注射器分别将pbs、antivegf tregexo和antivegf mscexo注入玻璃体腔内(除了pbs组，每组蛋白含量均为0.4μg/眼)。
66.③
给药7天后，用上述方法麻醉小鼠后，腹腔注射2％荧光素钠溶液，以行眼底荧光造影检查，并用眼底照相仪记录图像，结果显示：antivegf tregexo治疗组荧光渗漏灶所指示的cnv病灶大小是最低的(图3中a，p《0.0001)。将小鼠颈椎脱臼处死后，摘除眼球，包埋固定后做3-4μm/片的石蜡切片，苏木精和伊红(he)染色，使用光学显微镜观察，结果显示：antivegf tregexo治疗组的新生血管的侵袭高度最小(图3中b，p《0.0001)。
67.图3中a为激光扫描共聚焦显微镜示cnv小鼠模型新生血管的面积及定量统计结果。图3中b为he染色显示cnv小鼠模型新生血管的侵袭高度及定量统计结果。由图3可见，antivegf tregexo治疗组的新生血管面积和侵袭高度均最小，说明tregexo与antivegf搭配比mscexo与antivegf搭配治疗cnv的效果好。
68.实施例2、原代treg细胞的体外扩增和tregexo的富集
69.(1)6-8周c57bl/6小鼠(雌雄不限)颈椎脱臼法处死后75％酒精冲洗浸泡整只小鼠；剪开小鼠腹腔(左侧上腰部)，可见脾脏(鲜红色)，无菌颞轻扯分离取出；剥离脂肪组织及结缔组织，置50ml离心管中，pbs冲洗一次后研磨，收集研磨液置离心管；加入红细胞裂解液后离心(400g，10min)；弃上清，润洗细胞后重悬，细胞计数。使用miltenyi(货号：130-104-453)naive cd4

t细胞磁珠分选试剂盒分选出naive cd4

t细胞。
70.3-3.5岁雄性食蟹猴通过肘静脉穿刺采血，淋巴细胞分离液分离出外周血淋巴细胞后，使用miltenyi naive cd4

t细胞磁珠分选试剂盒分选出naive cd4

t细胞。
71.(2)将分选出的naive cd4

t细胞置于事先包被10μg/ml anti-cd3的培养瓶，并加入配制好的无外泌体培养基(10％无外泌体胎牛血清 1％青链霉素 anti-cd28抗体(2μg/ml) tgf-β(5ng/ml) il2(20ng/ml) x-vivo培养基)，于37℃，co2体积分数为5％的恒温培养箱中培养，2-3天根据扩增情况1:2或1:3传代。刺激5天后，流式细胞仪鉴定treg细胞的标志物foxp3、cd4和cd25，均阳性表达的细胞占比为60-70％(图4)。
72.(3)收集7-14天的细胞培养基上清，以300g离心15min以除去杂质；然后以10,000g离心15min以去除细胞碎片；以100,000g离心120min，弃上清，收集沉淀，然后重悬于pbs中，得到tregexo溶液，并用tem观察其形貌，纳米颗粒跟踪分析仪测量tregexo粒径和电势。结果显示：tregexo呈杯托状(图5)，粒径约为120nm，电势为-15mv(图6)。
73.实施例3、混合物的构建和成分分析
74.(1)将tregexo与antivegf均匀混合，并利用蛋白印迹法对混合物主要蛋白成分进行检测，结果显示：在该混合物体系中，antivegf和tregexo的标志蛋白cd9、cd63均阳性(图7)。
75.(2)利用elisa法检测混合物中antivegf对vegf因子的结合能力，结果显示：与tregexo混合不会影响antivegf对vegf因子的结合能力(图8)。
76.(3)利用tranwell小室(8μm膜)构建cecs和共培养体系，上层接种约4-5
×
104个cecs，下层接种约4-5
×
105个同时培养基中加入lps(100ng/ml)，以模拟cnv体外模型。分别用10:1、5:1、1:1(tregexo与antivegf的蛋白量比)的混合物处理24小时后，利用mmt法检测脉络膜血管内皮细胞(cec)经处理后的存活率，同时设置了单独tregexo和单独antivegf两个对照组，以及pbs对照组(除了pbs组，每组蛋白浓度均为20μg/ml)。结果显示：抑制cec的最佳混合物比例为5:1(tregexo与antivegf的蛋白量比)(图9)。
77.实施例4、cnv模型小鼠体内效果和安全性验证
78.(1)构建激光诱导的cnv小鼠模型。c57bl/6小鼠采用0.5％(体积百分含量)戊巴比妥(0.1ml/10g
·
bw)腹腔注射麻醉，1％(体积百分含量)复方托匹卡胺滴眼液扩瞳。角膜表面放置盖玻片后，采用激光光凝法(75个光斑大小，100mw功率，100毫秒持续时间)，照射每只眼睛视神经周围的视网膜。气泡表明bruch膜的破裂，提示cnv小鼠模型构建成功。
79.(2)造模3天后，经玻璃体腔注射途径给药。再用0.5％(体积百分含量)戊巴比妥(0.1ml/10g
·
bw)腹腔注射麻醉cnv模型小鼠后，用hamilton’s微量注射器分别将pbs、单独antivegf、单独tregexo和tregexo antivegf(tregexo和antivegf的蛋白质量比为5:1)注入玻璃体腔内(除了pbs组，每组蛋白含量均为0.4μg/眼)。
80.(3)给药7天后，用hamilton’s微量注射器采集小鼠眼内液，利用细胞因子微球技术检测cnv模型小鼠眼内液中vegf因子和炎症因子(il-1β、il-6、tnfα、mcp-1)含量，结果显示：tregexo antivegf治疗组上述细胞因子的含量均为最低(图10)。麻醉后，腹腔注射2％荧光素钠溶液，以行眼底荧光造影检查，并用眼底照相仪记录图像，结果显示：tregexo antivegf治疗组荧光渗漏灶所指示的cnv病灶数量和大小都是最低的(图11)。将小鼠颈椎脱臼处死后，摘除眼球，包埋固定后做3-4μm/片的石蜡切片，opal多色免疫荧光标记染色，使用激光共聚焦荧光显微镜观察，结果显示：tregexo antivegf治疗组的脉络膜新生血管
(用cd105指示)数量最少，病灶处vegf因子最少，炎症细胞(f4/80标记的巨噬细胞指示)最少(图12)。
81.(4)给药7天后，将cnv模型小鼠麻醉后，使用小动物眼压测量仪检测其眼压，结果显示：tregexo antivegf治疗不会对眼压造成影响(图13)。给药7天测完眼压后，将cnv模型小鼠处死，取其内脏(心、肝、脾、肺、肾)，固定，石蜡包埋后制作3-4μm/片的切片，苏木精和伊红(he)染色，使用光学显微镜观察，结果显示：tregexo antivegf治疗后内脏未见明显异常(图14)。
82.实施例5、cnv模型食蟹猴体内效果和安全性验证
83.(1)构建激光诱导的cnv食蟹猴模型。采用氯胺酮(10mg/kg
·
bw)肌肉注射麻醉，1％(体积百分含量)复方托匹卡胺滴眼液扩瞳。角膜表面放置接触式眼底镜后，采用激光光凝法(75μm光斑大小，500-700mw功率，100-200毫秒持续时间)，照射每只眼睛黄斑区视网膜，每只眼睛造9个激光点。气泡表明bruch膜的破裂，提示cnv小鼠模型构建成功。
84.(2)造模7天后，经玻璃体腔注射途径给药。在氯胺酮(10mg/kg
·
bw)肌肉注射麻醉后，用33g针头注射器分别将pbs、单独antivegf、单独tregexo和tregexo antivegf(tregexo和antivegf的蛋白质量比为5:1)注入玻璃体腔内(除了pbs组，每组蛋白含量均为1.25mg/眼)。
85.(3)给药14天后，经前房穿刺收集眼内液，利用细胞因子微球技术检测cnv模型食蟹猴眼内液中vegf因子和炎症因子(il-1β、il-6、tnfα、mcp-1)含量，结果显示：tregexo antivegf治疗组上述细胞因子的含量均为最低(图15)。氯胺酮(10mg/kg
·
bw)肌肉注射麻醉后，利用光学相干断层扫描血管成像仪检测cnv病灶的范围和浸润高度，结果显示：tregexo antivegf治疗组的脉络膜新生血管范围最小，侵入视网膜的高度最低(图16)。
86.(4)给药21天后，将cnv模型食蟹猴麻醉后，利用眼前节照相技术观察cnv模型食蟹猴角膜、前房及晶状体情况，结果显示：tregexo antivegf治疗不会对眼前节组织造成影响(图17)。利用goldmann眼压测量仪检测其眼压，结果显示：tregexo antivegf治疗不会对眼压造成影响(图18)。静脉穿刺采血检测cnv模型食蟹猴的血常规(白细胞计数wbc、红细胞计数rbc、血小板计数plt)和肝肾功能(碱性磷酸酶alp、谷丙转氨酶alt、谷草转氨酶ast、血尿素氮bun、乳酸脱氢酶ldh)。结果显示：tregexo antivegf治疗后，上述血液指标未见明显异常(图19)。
87.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。