一种基于Treg细胞外泌体的靶向协同药物体系及其制备方法与流程

一种基于treg细胞外泌体的靶向协同药物体系及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种基于treg细胞外泌体的靶向协同药物体系及其制备方法。


背景技术：

2.脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,cnv)的形成是多种眼底疾病发生过程中的重要环节。常见于年龄相关性黄斑病变、病理性近视、眼外伤、葡萄膜炎和特发性脉络膜新生血管等，患病人群多为青壮年，若得不到有效治疗将严重影响生活及工作。
3.目前，抗vegf治疗是针对cnv类疾病常用的治疗方式，但在应用上仍存在关键问题亟待解决。针对cnv的促进因子-血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,vegf)的av类药物，如bevacizumab、aflibercept、conbercept等，以促血管新生最重要的因子vegf为靶点，在临床上已被证明能有效抑制cnv，但仍存在效果不理想、需反复注射等问题。
4.研究表明，在眼底新生血管类疾病的形成过程中，“炎症”发挥着至关重要的作用，可导致血管通透性增高、白细胞渗出和促炎因子释放，是产生vegf的“上游”。炎症和vegf二者存在相互作用，协同促进新生血管的形成。临床实践证实，“抗vegf 抗炎”治疗cnv类疾病有效，但目前激素类抗炎药物存在毒副作用。“抗炎”作用的曲安奈德与av联合使用，治疗效果较单纯使用av效果更好，甚至对av不敏感的患者也有很好的疗效。但曲安奈德等激素类药物尚存在致青光眼、白内障等毒副作用问题有待解决。
5.另有研究证实，传统av不能主动靶向cnv病灶，单纯玻璃体腔注射的av会在玻璃体腔内扩散，并且会随着房水代谢迅速流失，除此之外，由于浓度梯度，药物跨越视网膜到达脉络膜病灶过程中会有一定量的耗损，从而导致av在病灶区的生物利用度不高。
6.因此，提高av精准靶向cnv病灶的能力，应用天然的抗炎药物更安全的抗炎治疗，将抗vegf治疗和抗炎治疗高效协同是需要解决的难题。


技术实现要素：

7.为了有效的解决上述技术难题，本发明提供了一种基于treg细胞外泌体的靶向协同药物体系(rte-c-av)及其制备方法。
8.第一方面，本发明要求保护一种基于treg细胞外泌体的靶向协同药物体系。
9.本发明要求保护的基于treg细胞外泌体的靶向协同药物体系，是利用对基质金属蛋白酶(mmps)敏感的linker(c)将treg细胞外泌体(rte)与抗vegf抗体(av)连接而成(该药物体系简称为rte-c-av体系)。
10.进一步地，所述对基质金属蛋白酶敏感的linker为两端分别修饰以6-马来酰亚胺基(n端)和活化的羧基(c端)的seq id no.1所示多肽。其中，这里“活化的羧基(c端)”是指seq id no.1所示多肽的c末端最后一个氨基酸自带的羧基为活化的羧基。
11.更进一步地，所述药物体系可按照包括如下步骤的方法制备得到：
12.(a1)所述对基质金属蛋白酶敏感的linker通过一端活化的羧基与所述抗vegf抗体上的氨基发生反应，实现所述对基质金属蛋白酶敏感的linker与所述抗vegf抗体的连接；
13.(a2)所述对基质金属蛋白酶敏感的linker通过另一端6-马来酰亚胺基与所述treg细胞外泌体的磷脂双分子膜上的二硫键被打开后形成的巯基反应，实现所述对基质金属蛋白酶敏感的linker与所述treg细胞外泌体的连接。
14.在本发明的具体实施方式中，所述抗vegf抗体具体为anti-vegf抗体(r&d systems，no.af-493-na)。
15.第二方面，本发明要求保护前文第一方面所述药物体系的制备方法。
16.本发明所要求保护的前文第一方面所述药物体系的制备方法，可包括前文所述步骤(a1)和(a2)。
17.在本发明的具体实施方式中，是通过tcep打开所述treg细胞外泌体的磷脂双分子膜上的二硫键的。
18.在本发明的具体实施方式中，所述treg细胞外泌体的粒径约为120nm。
19.所述药物体系(rte-c-av体系)平均粒径为120nm，平均电势为-30mv，av释放量可达装载量的80％以上。
20.第三方面，本发明要求保护前文所述的药物体系在制备用于治疗脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,cnv)类疾病的产品中的应用。
21.前文所述的药物体系在治疗脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,cnv)类疾病中的应用也属于本发明的保护范围。
22.第四方面，本发明要求保护如下任一应用：
23.p1、treg细胞外泌体(rte)在制备用于治疗脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,cnv)类疾病的产品中的应用。
24.treg细胞外泌体(rte)在治疗脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,cnv)类疾病中的应用也属于本发明的保护范围。
25.在所述应用中，treg细胞外泌体(rte)作为抗vegf抗体(av)的转运载体。
26.p2、抗vegf抗体(av)在制备用于治疗脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,cnv)类疾病的产品中的应用。
27.抗vegf抗体(av)在治疗脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,cnv)类疾病中的应用也属于本发明的保护范围。
28.在所述应用中，抗vegf抗体(av)以treg细胞外泌体(rte)作为转运载体。
29.p3、treg细胞外泌体在制备具有抗眼底新生血管功能的产品中的应用。
30.treg细胞外泌体在抗眼底新生血管中的应用也属于本发明的保护范围。
31.在所述应用中，treg细胞外泌体(rte)作为抗vegf抗体(av)的转运载体。
32.p4、抗vegf抗体在制备具有抗眼底新生血管功能的产品中的应用。
33.抗vegf抗体在抗眼底新生血管中的应用也属于本发明的保护范围。
34.在所述应用中，抗vegf抗体(av)以treg细胞外泌体(rte)作为转运载体。
35.进一步地，所述脉络膜新生血管类疾病可选自：年龄相关性黄斑病变、病理性近视、眼外伤、葡萄膜炎和特发性脉络膜新生血管等。
36.在本发明的具体实施方式中，所述抗眼底新生血管具体体现为降低脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,cnv)类疾病患者的脉络膜新生血管的面积和/或其侵入视网膜的高度。
37.第五方面，本发明要求保护前文所述的药物体系在如下任一中的应用：
38.(a1)制备用于治疗和/或预防疾病甲的产品；
39.(a2)制备用于缓解所述疾病甲症状的产品；
40.所述疾病甲满足如下条件：1)能够采用抗vegf抗体进行治疗和/或预防，或采用抗vegf抗体能够改善症状；2)病灶部位存在炎症反应，且表达基质金属蛋白酶(mmps)。
41.第六方面，本发明要求保护如下任一应用：
42.q1、treg细胞外泌体(rte)在制备用于治疗和/或预防疾病甲或缓解所述疾病甲症状的产品中的应用。
43.treg细胞外泌体(rte)在治疗和/或预防疾病甲或缓解所述疾病甲症状中的应用也属于本发明的保护范围。
44.在所述应用中，treg细胞外泌体(rte)作为抗vegf抗体(av)的转运载体。
45.q2、抗vegf抗体(av)在制备用于治疗和/或预防疾病甲或缓解所述疾病甲症状的产品中的应用。
46.抗vegf抗体(av)在治疗和/或预防疾病甲或缓解所述疾病甲症状中的应用也属于本发明的保护范围。
47.在所述应用中，抗vegf抗体(av)以treg细胞外泌体(rte)作为转运载体。
48.所述疾病甲满足如下条件：1)能够采用抗vegf抗体进行治疗和/或预防，或采用抗vegf抗体能够改善症状；2)病灶部位存在炎症反应，且表达基质金属蛋白酶(mmps)。
49.第七方面，本发明要求保护treg细胞外泌体(rte)在作为抗vegf抗体(av)的转运载体中的应用。
50.在本发明中，所述treg细胞为foxp3、cd4和cd25均阳性。
51.本发明所提供的基于rte的靶向协同药物体系及其制备方法，所述药物体系基于rte的抗炎与趋炎特性和载体功能，利用对mmps敏感的linker将av与rte连接，构建可对cnv病灶部位mmps响应的rte-c-av体系。该体系通过玻璃体腔注射，联合递送av与rte靶向到眼底病灶部位，在病灶mmps响应下释放出av与rte分别作用vegf与炎症细胞，从而通过抗vegf与抗炎的“时空耦合”协同作用，高效抑制cnv。解决了传统av单独用药时生物利用度不高、注射次数过多的临床难题，并显著提高抑制cnv的效果。
附图说明
52.图1为基于treg细胞外泌体的靶向协同药物体系构建方案示意图。
53.图2为实施例1中rte的透射电子显微镜(tem)图。
54.图3为实施例2中rte-c-av的透射电子显微镜(tem)图。
55.图4为实施例2中纳米颗粒跟踪分析仪测量rte-c-av粒径和电势的统计图。
56.图5为实施例2中elisa法检测rte-c-av体系中av的释放量。
57.图6为实施例2中rte-c-av体系稳定性的统计分析图。
58.图7为实施例3中elisa法检测transwell共培养体系上清中细胞因子的含量。
59.图8为实施例3中激光扫描共聚焦显微镜示cec迁移量的成像图。
60.图9为实施例3中流式分析仪检测cec凋亡率。
61.图10为实施例4中激光扫描共聚焦显微镜示cnv小鼠模型新生血管的面积。
62.图11为实施例4中he染色示cnv小鼠模型新生血管的侵袭高度。
具体实施方式
63.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
64.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
65.下述实施例将从如下几方面展开，图1为基于treg细胞外泌体的靶向协同药物体系构建方案示意图：
66.1、原代treg细胞的体外扩增和rte的富集
67.利用磁珠分选法分选出c57bl/6小鼠脾脏来源的naive cd4

t细胞，并用tgf-β诱导其分化为cd4

cd25

treg细胞，同时用anti-cd3、anti-cd28和il-2刺激其体外扩增。收集treg细胞的培养基上清，以超速离心法富集rte。
68.2、rte-c-av体系的构建和表征
69.利用对mmps敏感的linker，将av与rte连接，完成rte-c-av体系构建。利用透射电子显微镜(tem)观察其形貌，利用纳米颗粒跟踪分析仪(nta)测量其粒径和电势，利用elisa法检测av的释放量。
70.3、体外及体内疗效的验证
71.利用巨噬细胞和脉络膜血管内皮细胞(cec)共培养体系，对药物体系进行体外疗效验证；利用激光诱导的c57bl/6小鼠cnv模型，对药物体系进行体内疗效验证。
72.实施例1、原代treg细胞的体外扩增和rte的富集
73.(1)6-8周c57bl/6小鼠(雌雄不限)颈椎脱臼法处死后75％酒精冲洗浸泡整只小鼠；剪开小鼠腹腔(左侧上腰部)，可见脾脏(鲜红色)，无菌颞轻扯分离取出；剥离脂肪组织及结缔组织，置50ml离心管中，pbs冲洗一次后研磨，收集研磨液置离心管；加入红细胞裂解液后离心(400g，10min)；弃上清，润洗细胞后重悬，细胞计数。使用miltenyi(货号：130-104-453)naive cd4

t细胞磁珠分选试剂盒分选出naive cd4

t细胞。
74.(2)将分选出的naive cd4

t细胞置于事先包被10μg/ml anti-cd3的培养瓶，并加入配制好的无外泌体培养基(10％无外泌体胎牛血清 1％青链霉素 anti-cd28抗体(2μg/ml) tgf-β(5ng/ml) il2(20ng/ml) x-vivo培养基)，于37℃，co2体积分数为5％的恒温培养箱中培养，2-3天根据扩增情况1:2或1:3传代。刺激5天后，流式细胞仪鉴定treg细胞的标志物foxp3、cd4和cd25，均阳性表达的细胞占比为60-70％。
75.(3)收集7-14天的细胞培养基上清，以300g离心15min以除去杂质；然后以10,000g离心15min以去除细胞碎片；以100,000g离心120min，弃上清，收集沉淀，然后重悬于pbs中，得到rte溶液，并用tem观察其形貌，结果示：rte呈杯托状，粒径约为120nm(图2)。
76.实施例2、rte-c-av体系的构建和表征
77.(1)linker((6-mal)-plgvr-nhs)为湖北强耀生物科技有限公司(cne190404034)产品，该linker主体由5个氨基酸(pro-leu-gly-val-arg，seq id no.1)构成，可在gly-val之间对mmps敏感性断裂；并在两端分别修饰以6-马来酰亚胺基和活化的羧基(nhs ester)。这里“活化的羧基”是指seq id no.1所示多肽的c末端最后一个氨基酸自带的羧基为活化的羧基。
78.(2)将过量的linker和抗vegf抗体(anti-vegf抗体(r&d systems，no.af-493-na)混合后，室温混悬12h，用10kd超滤管滤掉多余的linker。linker一端活化的羧基将与抗vegf抗体上的氨基通过化学反应而连接，得到-c-av。
79.(3)用1mm tcep加入实施例1获得的rte溶液中，以打开rte磷脂双分子膜上的二硫键，获得巯基，然后将过量的步骤(2)中获得的-c-av与之混合，室温混悬12h后，用100kd超滤管滤掉多余的-c-av。rte的巯基与-c-av的6-马来酰亚胺基反应而连接，最终获得rte-c-av。
80.(4)用10nm的免疫金标记rte-c-av中的av后，tem观察其形貌，结果显示：av成功装载于rte上(图3)。利用nta测量rte装载av前后的粒径和电势，结果显示：装载前后粒径大小几乎不变，电势由装载前的-20mv变为装载后的-30mv(图4)。利用elisa法检测av的释放量，结果显示：av释放量可达装载量的80％以上(图5)。且rte-c-av稳定性好(图6)。
81.实施例3、rte-c-av体系的体外效果验证
82.(1)利用tranwell小室(8μm膜)构建cecs和共培养体系。上层接种约4-5
×
104个cecs，下层接种约4-5
×
105个同时培养基中加入lps(100ng/ml)以模拟cnv体外模型。24小时后分别用pbs、av、rte和rte-c-av(除了pbs组，每组总蛋白浓度均为2μg/ml)处理。
83.(2)处理24小时后收集培养基上清，elisa法分别检测上清中的细胞因子(vegf、il-1β、il-6、tnfα)的含量，结果显示：经rte-c-av处理后，上清中上述细胞因子含量均是最少(图7，p《0.05)。激光扫描共聚焦显微镜观察cecs的迁移情况，结果显示：rte-c-av处理组cecs的迁移能力最低(图8)。流式细胞仪检测cecs的凋亡情况，结果显示：rte-c-av处理组cecs的凋亡率最高(图9)。上述结果表明，在体外细胞模型上验证了rte-c-av的有效性。
84.实施例4、rte-c-av体系的体内疗效验证
85.(1)构建激光诱导的cnv小鼠模型。c57bl/6小鼠采用0.5％(体积百分含量)戊巴比妥(0.1 ml/10g
·
bw)腹腔注射麻醉，1％(体积百分含量)复方托匹卡胺滴眼液扩瞳。角膜表面放置盖玻片后，采用激光光凝法(75个光斑大小，100mw功率，100毫秒持续时间)，照射每只眼睛视神经周围的视网膜。气泡表明bruch膜的破裂，提示cnv小鼠模型构建成功。
86.(2)造模3天后，经玻璃体腔注射途径给药。再用0.5％(体积百分含量)戊巴比妥(0.1ml/10g
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bw)腹腔注射麻醉cnv模型小鼠后，用hamilton’s微量注射器分别将pbs、av、rte和rte-c-av注入玻璃体腔内(除了pbs组，每组蛋白含量均为0.4μg/眼)。
87.(3)给药7天后，通过脉络膜铺片和视网膜切片he染色对疗效进行观察。小鼠左心室灌注1ml含50mg fitc-右旋糖酐(2
×
106)的pbs。摘除眼球后立即固定于固定液中1h，在立体显微镜下清除前节段，将神经细胞层视网膜与脉络膜分离。保留rpe层-脉络膜-巩膜复合体，做四或六个放射状的切割线后，将其平铺在载玻片上，激光共焦显微镜观察新生血管
的面积并量化分析。眼球摘除后用固定液固定，石蜡包埋后，制作3-4μm/片的切片，苏木精和伊红(he)染色，使用光学显微镜观察，使用image j软件对图像进行量化分析。
88.激光扫描共聚焦显微镜示cnv小鼠模型新生血管的面积如图10(p《0.05)所示。he染色显示cnv小鼠模型新生血管的侵袭高度如图11(p《0.05)所示。由图可见在cnv动物模型上验证了rte-c-av的有效性。
89.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。