含有利凡斯的明的长效制剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种包含利凡斯的明的用于预防或治疗阿尔茨海默病的长效组合物及其制备方法，更具体而言，本发明涉及一种用于可注射制剂的缓释微球，其可通过有效控制利凡斯的明的初始释放而最大限度地减少快速初始释放引起的问题，同时通过包含可生物降解聚合物载体和高含量利凡斯的明而显示出长时间的药物疗效；以及包含该缓释微球的用于阿尔茨海默病的持久性治疗剂及其制备方法。


背景技术：

2.近年来，由于寿命延长和老年人口的增加导致痴呆症患者的数量迅速增加，痴呆症患者的管理正成为一个严重的社会问题。痴呆症是指一种以复杂认知障碍为特征的综合征，特征在于记忆丧失、智力衰退、个性改变和行为异常。该症状是一种与大脑(即中枢神经系统)相关的退行性疾病，神经网络的不可逆功能障碍是由缓慢死亡的神经细胞引起的，这最终导致人体功能的永久丧失。痴呆症的病因尚未明确阐明，由于痴呆症有各种病因和病理生理因素，因此没有治疗剂可以从根本上治疗痴呆症。目前用作间接治疗方法的大多数阿尔茨海默病痴呆症治疗剂是乙酰胆碱酯酶抑制剂(一种乙酰胆碱降解酶)和多奈哌齐(商品名：aricept)、他克林(商品名：cognex)、利凡斯的明(商品名：exelon)、加兰他敏(商品名：reminyl)，以及诸如此类。利凡斯的明是一种乙酰胆碱酯酶(ache)抑制剂，广泛用于治疗轻中度阿尔茨海默病。
3.为阿尔茨海默病患者开出的目前商业上使用的利凡斯的明制剂是口服片剂的形式(每天两次)或贴剂的形式(一天一次)。然而，一般情况下，口服利凡斯的明制剂的药物依从性差，血液中利凡斯的明的半衰期短，导致最高和最低浓度之间波动较大，已知会发生恶心、呕吐、腹痛、腹泻、消化不良、食欲减退、头晕、烦躁、抑郁、头痛、失眠、精神错乱、瘫痪、出汗、震颤、不适、上呼吸道和生殖系统感染等。另外，不易使晚期痴呆症患者口服药物。
4.目前用作透皮贴剂的利凡斯的明以4.6mg至13.3mg的剂量施用，每日一次。与口服药物相比，利凡斯的明透皮贴剂具有相对较少的胃肠道副作用，但具有诸如皮肤刺激等副作用，并且具有各种技术问题，诸如粘附力降低、皮肤渗透速率不均匀等。因此，已经提出了一项开发利用可生物降解聚合物的含利凡斯的明的缓释可注射剂的研究。
5.在中国专利cn101708164a中，使用丙交酯和乙交酯或聚丙交酯的共聚物(可生物降解的聚合物)制备并评估了含有利凡斯的明酒石酸盐的微球。然而，该专利未披露利凡斯的明微球的体内试验结果，体外释放结果显示，80％以上的利凡斯的明释放一至两周，因此，存在的问题是它不适合作为显示长期药用效果的制剂。另外，微球中的利凡斯的明含量非常低，作为利凡斯的明酒石酸盐为9.11重量％，作为利凡斯的明为5.69重量％，因此对患者施用时很难施用大量微球。


技术实现要素：

6.技术问题
7.本发明旨在解决传统利凡斯的明试剂的上述问题。本发明的一个目的是提供一种含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球，其在微球中具有利凡斯的明的高药物含量，并具有长时间稳定药物释放的特征且没有初始爆发释放，并且具有优异的可注射性和均匀的粒径分布；提供一种包含该微球的用于预防或治疗阿尔茨海默病的缓释注射制剂，以及该微球的制备方法。
8.技术方案
9.本发明提供一种用于可注射制剂的缓释微球，其包含难溶活性成分和可生物降解聚合物，其中活性成分是选自由利凡斯的明及其药学上可接受的难溶盐组成的组的一种或多种，并且作为利凡斯的明的活性成分的量为基于微球总重量的7重量％或更大，并且具有优异的可注射性和均匀的粒径分布；提供一种包含该微球的用于预防或治疗阿尔茨海默病的缓释可注射制剂，以及该微球的制备方法。
10.有利效果
11.根据本发明的含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球含有高含量的利凡斯的明，并具有优异的可注射性和均匀的粒径，不同于含有利凡斯的明的常规微球，因此，可制备用于长期施用的利凡斯的明可注射制剂，并且有效控制利凡斯的明的释放，以防止利凡斯的明最初的爆发释放。因此，在包含利凡斯的明的缓释可注射制剂中，单次施用可使利凡斯的明以有效浓度在痴呆症患者血液中保持1周或更长至3个月或更长的一段时间，从而提高痴呆症患者的服药依从性，并将副作用降至最低，从而最大限度地提高治疗效果。
附图说明
12.图1a、图1b和图1c分别是根据样品2-3、样品3-3和样品3-4获得的含利凡斯的明的微球的扫描电子显微镜照片。
13.图2是显示根据样品2-3、样品3-3和样品3-4获得的含利凡斯的明的微球随时间(第0天至第49天)体外药物释放率测量结果的图。
14.图3a是显示向大鼠单次肌肉施用根据样品3-7获得的微球后随时间测量的药代动力学结果的图。
15.图3b是显示向大鼠单次肌肉施用根据样品3-8获得的微球后随时间测量的药代动力学结果的图。
16.图3c是显示向大鼠单次肌肉施用根据样品3-9获得的微球后随时间测量的药代动力学结果的图。
具体实施方式
17.本发明的用于可注射制剂的缓释微球包含选自由难溶药物及其难溶盐组成的组的一种或多种作为活性成分，具体而言，选自由利凡斯的明及其药学上可接受的难溶盐组成的组的一种或多种，其中微球中活性成分(作为利凡斯的明)的量为基于微球总重量的7重量％或更多、9重量％或更多、或10重量％或更多，35重量％或更少或30重量％或更少的量。本发明的特征在于包含难溶利凡斯的明或利凡斯的明的难溶盐作为活性成分，不同于包含水溶性利凡斯的明酒石酸盐的含利凡斯的明的微球。
18.可作为活性成分包含的利凡斯的明，具体而言，利凡斯的明游离碱在室温下为液
相，是一种难溶性药物，在水中的溶解度为5mg/ml或更小。
19.在本发明中，利凡斯的明的药学上可接受的难溶盐意味着，当其形成为有机酸加成盐时，所形成的盐在室温下在水中的溶解度为10mg/ml或更小，例如，它可以是一种或多种选自由萘甲酸盐、萘二磺酸盐和巴莫酸盐组成的组的难溶盐。优选地，它可以是利凡斯的明巴莫酸盐。难溶盐的有机酸部分(即萘甲酸、萘二磺酸和巴莫酸)可允许更好地控制利凡斯的明的释放，同时提高利凡斯的明在根据本发明的微球中的包封率。
20.当本发明的微球中包含利凡斯的明巴莫酸盐作为活性成分时，利凡斯的明与利凡斯的明巴莫酸盐中的巴莫酸的摩尔比可以为1:0.3至1:1、1:0.3至1:0.8或1:0.4至1:0.7，但不限于此。从提高利凡斯的明的包封率和更好地控制药物释放的角度来看，上述范围内的利凡斯的明与巴莫酸的摩尔比可能更为优选。
21.在根据本发明的用于可注射制剂的缓释微球中，当利凡斯的明的药学上可接受的难溶盐(例如，利凡斯的明巴莫酸盐)包封在微球中时，可以制备含有高含量的利凡斯的明的微球，其中作为利凡斯的明的含量为基于微球总重量的7重量％或更多、9重量％或更多、或10重量％或更多。相反，当利凡斯的明或利凡斯的明酒石酸盐用在常规含利凡斯的明的微球制剂中时，利凡斯的明不能以高含量包含在微球中，例如，7重量％或更多、9重量％或更多、或10重量％或更多，因此，存在难以开发长效制剂的问题，但根据本发明的用于可注射制剂的缓释微球解决了常规含利凡斯的明的微球制剂的问题。
22.本发明的含利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球可进一步包含碳链中具有4个或更多个碳的脂肪酸或巴莫酸作为释放调节剂。用作释放调节剂的脂肪酸的实例包括选自由丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、异巴豆酸、油酸、反油酸、山梨酸、亚油酸和花生四烯酸组成的组的一种或多种。
23.优选地，根据本发明的用于可注射制剂的缓释微球中包含的利凡斯的明难溶盐中的有机酸部分(例如，萘甲酸、萘二磺酸和巴莫酸)，用作释放调节剂的脂肪酸或巴莫酸的含量可以为基于微球总重量的2.0重量％至50重量％。例如，当根据本发明的用于可注射制剂的缓释微球不包含脂肪酸或巴莫酸作为释放调节剂时，利凡斯的明难溶盐中有机酸部分的含量可以为基于微球总重量的2.0重量％至50重量％。另外，当根据本发明的用于可注射制剂的缓释微球包含利凡斯的明游离碱作为活性成分并包含脂肪酸或巴莫酸作为释放调节剂时，微球中包含的作为释放调节剂的脂肪酸或巴莫酸的含量总和可以为基于微球总重量的2.0重量％至50重量％。此外，当根据本发明的用于可注射制剂的缓释微球包含利凡斯的明难溶盐作为活性成分并包含脂肪酸或巴莫酸作为释放调节剂时，微球中利凡斯的明难溶盐中的有机酸部分的含量，与作为释放调节剂而包含的脂肪酸或巴莫酸的含量之和可以为基于微球总重量的2.0重量％至50重量％。
24.用于可注射制剂的缓释微球包含可生物降解聚合物和活性成分，例如，使用特性粘度为0.16dl/g至1.9dl/g的可生物降解聚合物制备用于可注射制剂的缓释微球。本发明中使用的可生物降解聚合物的特性粘度是指在氯仿中使用乌氏粘度计在25℃以0.1％(w/v)的浓度测量的特性粘度。当可生物降解聚合物的特性粘度为0.16dl/g或更大时，聚合物的分子量足够，利凡斯的明药物的缓释效果可进一步提高，而当特性粘度为1.9dl/g或更小时，利凡斯的明药物的释放不会延迟太多，可以显示出适当的效果。另外，当使用满足上述
特性粘度范围的聚合物时，更具再现性的微球，其不存在由于微球制备期间聚合物的高粘度所致而不得不使用过量制备溶剂的问题(当使用具有高特性粘度的聚合物时可能发生)。
25.本发明中使用的可生物降解聚合物可具有的重均分子量为4,000至240,000。例如，可生物降解聚合物的重均分子量包括上述范围内的所有子数值范围，例如4,000至100,000的重均分子量、7,000至50,000的重均分子量、5,000至20,000的重均分子量、10,000至18,000的重均分子量和18,000至28,000的重均分子量。
26.可生物降解聚合物的实例可以是一种或多种选自由聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)葡萄糖、聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯或其混合物；聚乙交酯、聚丙交酯以及聚乙交酯和聚丙交酯的共聚物组成的组的聚合物，并且优选地，其可以是聚(丙交酯-共-乙交酯)或聚丙交酯。在一个优选的方面中，在聚乙交酯和聚丙交酯的共聚物的情况下，共聚物中丙交酯与乙交酯的摩尔比可以为40:60至90:10、45:55至85:15或50:50至75:25，例如，45:55、50:50、75:25或85:15。
27.当可生物降解聚合物包含2种或更多种类时，其可以是不同种类示例性聚合物的聚合物的组合或共混物，但其可以是具有不同特性粘度和/或单体比率的同类聚合物(例如，两种或更多种具有不同特性粘度的聚(丙交酯-共-乙交酯)的组合或共混物)，或具有不同端基的同类聚合物(例如，端基为酯或端基为酸)。可以在本发明中使用的市售可生物降解聚合物的实例可单独包括rg 502h、rg 503h、rg 504h、rg 502、rg 503、rg 504、rg 653h、rg 752h、rg 753h、rg 752s、rg 755s、rg 756s、rg 858s、r 202h、r 203h、r 205h、r 202s、r 203s、r 205s，其是evonik rohm gmbh的resomer-based，和corbion的pdl 02a、pdl 02、pdl 04、pdl 05、pdlg 7502a、pdlg 7502、pdlg 7507、pdlg 5002a、pdlg 5002、pdlg 5004a、pdlg 5004、pdlg 5010、pl 10、pl 18、pl 24、pl 32、pl 38、pdl 20、pdl 45、pc 02、pc 04、pc 12、pc 17、pc 24，或组合或共混，但不限于此。在一个实施方式中，为制备根据本发明的微球，使用单独的resomer r 203h、r 205s、rg 753h和rg 858s或其组合或共混制备微球。本领域技术人员可考虑可生物降解聚合物的分解速率和由此产生的药物释放率等，适当选择可生物降解聚合物的适当分子量或共混比。
28.基于根据本发明的用于可注射制剂的缓释微球的总重量，基于利凡斯的明游离碱，利凡斯的明的含量可以为7重量％或更多、9重量％或更多，或优选地，10重量％或更多。当微球中利凡斯的明的含量为9重量％或更多时，单个微球中包含的利凡斯的明含量较高，因此即使是相对少量的微球也能代表足够的长期药物释放，减少了长期药物释放所需的单次剂量，因此施用方便，副作用低，疗效好。特别是，由于阿尔茨海默病或阿尔茨海默痴呆(利凡斯的明的目标疾病)需要非常长期的药物施用，因此施用间隔较长是有利的，并且在大多数情况下，很难自行施用药物，本发明的小剂量、长效、长施用间隔和施用方便性对于供利凡斯的明目标疾病的使用特别有利。
29.包封在单个微球中的利凡斯的明含量越高，越优选，因为含有微球的注射制剂的剂量减少，但一般来说，当药物含量高于一定水平时，释放率增加，因此存在无法获得足够缓释效果的问题。本发明通过从一开始就有效地控制利凡斯的明的释放率而显示出足够的缓释效果，同时使包封在单个微球中的利凡斯的明的含量较高。
30.根据本发明的用于可注射制剂的缓释微球具有10μm或更大、优选15μm至120μm或更优选20μm至100μm的平均粒径。当显示平均粒径范围时，可以在不过度增加药物率的情况
下显示适当水平，并且使用的便利性很高。本发明中使用的术语“平均颗粒尺寸”或“平均粒径”是与粒径分布曲线中50体积％相对应的粒径，其表示平均粒径(中值直径)，并用d50或d(v，0.5)表示。
31.优选地，本发明的含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球的特征在于，与在微球制备过程中使用与利凡斯的明相同的含量(目标装载量)制备的其他微球相比，显示出优异的包封率。
32.本发明的含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球不限于此，但可释放一种或多种选自由利凡斯的明及其药学上可接受的盐组成的组的活性成分，持续1周或更长、2周或更长、1个月或更长、2个月或更长，或3个月或更长。此外，本发明的含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球在该释放模式中不受特别限制，但是当体内施用时，一种或多种选自由利凡斯的明及其药学上可接受的盐组成的组的活性成分优选在1小时内释放少于2％的、在1天内释放15％。
33.本发明的含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球是优选的，因为其在微球中包含(包封)高含量的利凡斯的明，并且不存在当过量的药物被包封在微球中时可能会发生的增加药物释放率的问题。此外，根据本发明的制剂是可注射制剂，并且具有相对较少或没有副作用，例如由口服利凡斯的明引起的胃肠道副作用问题以及当用作经皮吸收剂时发生的皮肤刺激问题。
34.下文中，将详细描述本发明的含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球的制备方法。
35.根据本发明的含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球例如，可使用“溶剂萃取和蒸发方法”制备，但制备方法不限于此。
36.作为根据本发明的含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球的制备方法的一个实施方式，该制备方法包括(a)将一种或多种选自由利凡斯的明及其药学上可接受的难溶盐组成的组的活性成分和一种或多种可生物降解聚合物溶解在一种或多种有机溶剂中以制备利凡斯的明-聚合物溶液(分散相)，(b)将步骤(a)中制备的利凡斯的明-聚合物溶液添加至含有表面活性剂的水溶液相(连续相)中以制备乳液，(c)将有机溶剂从步骤(b)中制备的乳液中的分散相萃取并蒸发到连续相中以形成微球，和(d)从步骤(c)的连续相回收微球，以制备含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球。
37.关于步骤(a)中使用的一种或多种选自由利凡斯的明及其药学上可接受的难溶盐组成的组的活性成分和一种或多种可生物降解聚合物的事项，含有利凡斯的明的用于可注射制剂的缓释微球中规定的事项可按原样应用。
38.在优选的方面中，在制备微球之前，利凡斯的明的药学上可接受的难溶盐可冷冻干燥、低压干燥或热风干燥。换句话说，利凡斯的明的药学上可接受的难溶盐可以是冻干粉、低压干粉或热风干粉。更优选地，利凡斯的明的药学上可接受的难溶盐可以是冻干粉。当利凡斯的明不是药学上可接受的难溶盐，即水溶性盐，例如利凡斯的明酒石酸盐或游离碱时，难以通过包括冷冻干燥的干燥方法制备干燥物质，但是，可以通过干燥方法将利凡斯的明的药学上可接受的盐作为干物质包含在微球中，以进一步提高微球的包封率。
39.例如，在利凡斯的明巴莫酸盐的情况下，根据利凡斯的明和巴莫酸的摩尔比，利凡斯的明巴莫酸盐可能以粘性或结晶形式表现出不同的性质，但在显示粘性性质的情况下，
当使用通过冷冻干燥、低压干燥或热风干燥制成粉末的原料时，在微球制备期间可更容易地进行处理，但不限于此。可使用本领域已知的冷冻干燥、低压干燥或热风干燥方法，但不限于此，干燥期间的条件如温度、压力和时间可根据利凡斯的明游离碱或难溶盐的含量适当改变。
40.另外，在步骤a)中，除了一种或多种选自由利凡斯的明及其药学上可接受的难溶盐组成的组的活性成分和一种或多种可生物降解聚合物，脂肪酸或巴莫酸可作为释放调节剂进一步溶解在有机溶剂中。用作释放调节剂的脂肪酸可包括选自由丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、异巴豆酸、油酸、反油酸、山梨酸、亚油酸和花生四烯酸作为实例组成的组的一种或多种。关于脂肪酸或巴莫酸，关于微球的事项可按原样应用。
41.此外，溶解活性成分和可生物降解聚合物的有机溶剂的类型不受特别限制，但优选地，可以使用一种或多种选自由二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲乙酮、丙酮、乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮、乙酸、甲醇、乙醇、丙醇和苯甲醇组成的组的溶剂。在本发明的一个实施方式中，二氯甲烷可用作单一溶剂，或二氯甲烷和n-甲基吡咯烷酮或用作其助溶剂的二甲基亚砜可用于制备根据本发明的用于可注射制剂的缓释微球。
42.另外，活性成分和可生物降解聚合物可以基于重量以1:9至3:1的含量比(活性成分：可生物降解聚合物)制备。优选地，可以为1:7至2:1，更优选地，可以为1:4至3:2。
43.在步骤(b)中，均匀混合含有利凡斯的明-聚合物溶液和表面活性剂的连续相的方法不受特别限制，但可使用高速搅拌器、连续混合器(in-line mixer)、膜乳液法、微流体乳液法等进行。当使用高速搅拌器或连续混合器形成乳液时，难以获得均匀的乳液，因此，优选在步骤(c)和步骤(d)之间另外执行筛分过程。使用膜乳液法或微流体乳液法是更优选的，因为可以获得均匀尺寸的乳液，因此在下述步骤(c)和步骤(d)之间不需要额外的筛分过程等。
44.步骤(b)中使用的表面活性剂的类型不受特别限制，任何一种表面活性剂都可以使用，只要它能够帮助利凡斯的明-聚合物溶液在连续相中形成稳定液滴的分散相。表面活性剂可优选地选自由甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、卵磷脂、明胶、聚乙烯醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯和聚氧乙烯蓖麻油衍生物及其混合物组成的组，最优选地，可以使用聚乙烯醇。
45.在步骤(b)中，基于包含表面活性剂的连续相的总体积，含有表面活性剂的连续相中的表面活性剂的含量可以为0.01％(重量/体积)至20％(重量/体积)，优选地，0.1％(重量/体积)至5％(重量/体积)。当表面活性剂的含量为0.01％(重量/体积)或更高时，分散相或乳液的液滴形式可更好地在连续相中形成，当表面活性剂的含量为20％(重量/体积)或更低时，不包含过多表面活性剂，因此在连续相中形成微球后可能更容易去除表面活性剂。
46.另外，作为步骤(b)的连续相，可使用水或水和选自由甲醇、乙醇、丙醇和乙酸乙酯组成的组的一种或多种的混合溶剂。
47.在步骤(c)中，当包含液滴形式的分散相和含有表面活性剂的连续相的乳液在低于有机溶剂沸点的温度下维持或搅拌一定时间，例如2小时至48小时，有机溶剂可从作为分散相的利凡斯的明-聚合物溶液的液滴形式萃取到连续相中。在连续相中的经萃取的有机溶剂的一部分可从表面蒸发。当有机溶剂从液滴形式的利凡斯的明-聚合物溶液中萃取和
蒸发时，液滴形式的分散相可固化以形成微球。
48.在步骤(c)中，为了另外有效去除有机溶剂，不限于此，但可应用加热以将连续相的温度在25℃或更高、优选35℃或更高、更优选在溶剂的沸点
±
10℃保持一段时间。
49.在步骤(d)中，回收利凡斯的明可注射制剂的缓释微球的方法可使用各种已知技术执行，例如，可使用过滤或离心的方法。
50.在步骤(c)和步骤(d)之间，残余表面活性剂通过过滤和洗涤去除，然后将其再次过滤，以回收利凡斯的明可注射制剂的缓释微球。
51.去除残余表面活性剂的洗涤步骤通常可使用水来执行，且洗涤步骤可重复数次。
52.此外，如上所述，当使用高速搅拌器或连续混合器形成乳液时，可通过在步骤(c)和步骤(d)之间另外使用筛分过程获得均匀微球。筛分过程可使用已知技术执行，并且可通过使用不同尺寸的筛分膜过滤出小颗粒和大颗粒的微球来获得均匀尺寸的微球。
53.在本发明的制备方法中，在步骤(d)之后或在过滤和洗涤步骤之后，所获得的微球使用普通干燥方法干燥，从而最终可获得干燥的微球。
54.在其他方面中，本发明提供了一种用于预防或治疗阿尔茨海默病的长效可注射制剂，其包含一个或多个用于可注射制剂的缓释微球。当配制成可注射制剂时，可通过添加适当赋形剂在水悬浮液或油悬浮液中配制用于可注射制剂的缓释微球。例如，当一个或多个微球配制成悬浮液时，本领域技术人员可通过选择微球可表现出优异分散性的分散介质来配制微球。另外，根据本发明的可注射制剂可进一步包含增稠剂、稳定剂、渗透剂、ph调节剂、表面活性剂、赋形剂和/或载体。可用的渗透剂可包括水性赋形剂或糖类，例如甘露醇、蔗糖、山梨醇、海藻糖、乳糖、氯化钠等，增稠剂可包括羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠、聚维酮等作为实例。作为表面活性剂，可使用聚山梨酯80、聚山梨酯20等作为聚氧乙烯山梨糖醇酐类，且可用span 80、span 20等作为山梨糖醇酯类。另外，作为缓冲剂，可使用磷酸氢钠、无水柠檬酸、氢氧化钠、氯化钠等。在一个实施方式中，当微球被配制成可注射制剂时，微球可以存在于与分散介质分离的小瓶中，并且可以在给患者施用前立即制备为悬浮液。当微球被配制成可注射制剂时，在一个实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其包括用于可注射制剂的缓释微球、分散介质和注射器。作为选择，将用于可注射制剂的缓释微球和分散介质填充在注射器中，但可在注射器内的单独隔室中彼此独立存在。
55.实施例
56.在下文中，将通过以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅说明本发明，但本发明的内容不受以下实施例的限制。
57.实施例1：利凡斯的明巴莫酸盐的制备
58.为制备利凡斯的明巴莫酸盐，将巴莫酸(制造商：acros organics，比利时)4.66g溶解在二甲基亚砜(制造商：samchun chemicals，韩国)100ml中，并将利凡斯的明(制造商：hwail pharm，韩国)10.01g添加到该溶液中，然后将其在50℃搅拌16小时并反应。使其冷却至室温，然后缓慢加入超纯水600ml中，搅拌2小时的同时沉积。沉积的材料经沉淀或过滤来回收，并用超纯水洗涤几次。去除水分并将其冷冻干燥以制备样品1-1。
59.以与样品1-1相同的方式制备样品1-2、1-3和1-4，不同之处在于使用如下表中所示的利凡斯的明和巴莫酸的剂量。
60.【表1】
[0061][0062]
如上表1中所证实的，可以证实在制备利凡斯的明巴莫酸盐后，通过干燥方法(如冷冻干燥)的所有粉末状或结晶状利凡斯的明巴莫酸盐均以用于制备微球的适当形状制备。
[0063]
比较实施例1：包含酒石酸盐的pla缓释微球制剂的制备
[0064]
通过混合生物相容性聚合物resomer r 203h(iv＝0.25dl/g至0.35dl/g；制造商：evonik，德国)3.23g和利凡斯的明酒石酸盐(制造商：msn，印度)1.02g与二氯甲烷(制造商：j.t.baker，美国)7.04g和n-甲基吡咯烷酮(制造商：junsei，日本)9.700ml来制备分散相。通过搅拌30分钟或更久而充分溶解分散相。使用1.0％(重量/体积)聚乙烯醇(粘度：4.8mpa
·
s至5.8mpa
·
s)水溶液作为连续相，并将连续相550ml供应至膜乳化装置，同时，将制备的分散相注入以制备微球，并将微球悬浮液置于制备容器中并以200rpm搅拌。膜乳化装置和制备容器的温度保持为25℃，当分散相的注入完成时，搅拌30分钟，然后将微球悬浮液的温度升至45℃，保持3小时，并去除有机溶剂。当有机溶剂的去除完成后，微球悬浮液的温度降至25℃。微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤数次，然后回收并干燥以制备比较样品1。
[0065]
通过混合生物相容性聚合物resomer r 203h 3.40g和利凡斯的明酒石酸盐1.60g与二氯甲烷11.32g和n-甲基吡咯烷酮3.199ml来制备比较样品2的分散相，以与比较样品1基本上相同的方法制备连续相，不同之处在于使用1.0％(重量/体积)聚乙烯醇水溶液制备连续相1,300ml。
[0066]
实施例2：包含利凡斯的明的缓释微球制剂的制备
[0067]
通过混合生物相容性聚合物resomer r 203h(iv＝0.25dl/g至0.35dl/g；制造商：evonik，德国)6.68g和利凡斯的明(制造商：hwail pharm，韩国)1.18g与二氯甲烷(制造商：j.t.baker，美国)16.68g来制备分散相。通过搅拌30分钟或更久而充分溶解分散相。使用1.0％(重量/体积)聚乙烯醇(粘度：4.8mpa
·
s至5.8mpa
·
s)水溶液作为连续相，并将连续相2,502ml供应至膜乳化装置，同时，将制备的分散相注入以制备微球，并将微球悬浮液置于制备容器中并以200rpm搅拌。膜乳化装置和制备容器的温度保持为25℃，当分散相的注入完成时，搅拌30分钟，然后将微球悬浮液的温度升至45℃，保持3小时，并去除有机溶剂。当有机溶剂的去除完成后，微球悬浮液的温度降至25℃。微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤数次，然后回收并干燥以制备样品2-1的微球。
[0068]
以与样品2-1的微球基本上相同的方式制备样品2-2微球，不同之处在于使用的聚合物、作为活性成分的利凡斯的明、溶剂和连续相的剂量。
[0069]
对于样品2-3的微球，使用pla/plga共混物作为聚合物，具体而言，其以与样品2-1的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用生物相容性聚合物resomer r 205s(iv＝0.55dl/g至0.75dl/g；制造商：evonik，德国)4.45g和resomer rg 753h(iv＝0.32dl/g至0.44dl/g；制造商：evonik，德国)2.22g，并使用如下表所示的作为活性成分的利凡斯的明、
溶剂和连续相的剂量。
[0070]
【表2】
[0071][0072]
实施例3：包含利凡斯的明巴莫酸盐的缓释微球制剂的制备
[0073]
通过混合作为生物相容性聚合物的resomer r 203h(iv＝0.25dl/g至0.35dl/g；制造商：evonik，德国)3.80g、pla和根据实施例1的样品1-2 1.20g与二氯甲烷(制造商：j.t.baker，美国)9.51g和n-甲基吡咯烷酮(制造商：junsei，日本)2.400ml来制备分散相。通过搅拌30分钟或更久而充分溶解分散相。使用1.0％(重量/体积)聚乙烯醇(粘度：4.8mpa
·
s至5.8mpa
·
s)水溶液作为连续相，在制备容器中制备1,100ml连续相，并将均质器浸入连续相中并安装。将制备的分散相注入均质器并制备微球，以200rpm搅拌制备容器中的微球悬浮液。均质器和制备容器的温度保持为25℃，当分散相的注入完成时，搅拌30分钟，然后将微球悬浮液的温度升至45℃并保持3小时以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液的温度降至25℃。微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤数次，然后回收并干燥以制备样品3-1的微球。
[0074]
使用pla/plga共混物作为分散相，具体而言，其通过混合resomer r 205s(iv＝0.55dl/g至0.75dl/g；制造商：evonik，德国)4.12g和resomer rg 753h(iv＝0.32dl/g至0.44dl/g；制造商：evonik，德国)2.06g和根据实施例1的样品1-4 3.83g与二氯甲烷dichloromethane(制造商：j.t.baker，美国)21.70g和二甲基亚砜(制造商：samchun chemicals，韩国)8.418ml来制备。通过搅拌30分钟或更久而充分溶解分散相。使用1.0％(重量/体积)聚乙烯醇(粘度：4.8mpa
·
s至5.8mpa
·
s)水溶液作为连续相，并将连续相4,630ml供应至膜乳化装置，同时，将制备的分散相注入以制备微球，并将微球悬浮液置于制备容器中并以200rpm搅拌。膜乳化装置和制备容器的温度保持为25℃，当分散相的注入完成时，搅拌30分钟，然后将微球悬浮液的温度升至45℃，保持3小时，并去除有机溶剂。当有机溶剂的去除完成后，微球悬浮液的温度降至25℃。微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤数次，然后回收并干燥以制备样品3-2。
[0075]
对于样品3-3，使用pla/plga共混物作为聚合物，具体而言，其以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用聚合物，resomer r 205s(iv＝0.55-0.75dl/g；制造商：evonik，德国)4.40g和resomer rg 753h(iv＝0.32-0.44dl/g；制造商：evonik，德国)2.20g，并使用如下表所示的作为活性成分的根据实施例1的样品1-2、溶剂和连续相的剂量。
[0076]
对于样品3-4，使用pla/plga共混物作为聚合物，具体而言，其以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用resomer r 205s(iv＝0.55-0.75dl/g；制造商：evonik，德国)3.81g和resomer rg 753h(iv＝0.32-0.44dl/g；制造商：evonik，德国)1.91g，并使用如下表所示的作为活性成分的根据实施例1的样品1-3、溶剂和连续相的剂量。
[0077]
样品3-5的微球以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用
resomer rg 858s(iv＝1.3-1.7dl/g；制造商：evonik，德国)作为plga聚合物，并使用如下表所述的根据实施例1的样品1-4、溶剂和连续相的剂量。
[0078]
样品3-6的微球以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用resomer r 203h(iv＝0.25-0.35dl/g；制造商：evonik，德国)和resomer r 205s(iv＝0.55-0.75dl/g；制造商：evonik，德国)作为pla聚合物，并使用如下表所述的根据实施例1的样品1-2、溶剂和连续相的剂量，及使用膜乳化装置代替均质器。
[0079]
样品3-7的微球以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用resomer rg 503h(iv＝0.32-0.44dl/g；制造商：evonik，德国)作为plga聚合物，并使用如下表所述的根据实施例1的样品1-2、溶剂和连续相的剂量。
[0080]
样品3-8的微球以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用resomer rg 653h(iv＝0.32-0.44dl/g；制造商：evonik，德国)作为plga聚合物，并使用如下表所述的根据实施例1的样品1-2、溶剂和连续相的剂量。
[0081]
样品3-9的微球以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用resomer rg 753h(iv＝0.32-0.44dl/g；制造商：evonik，德国)作为plga聚合物，并使用如下表所述的根据实施例1的样品1-2、溶剂和连续相的剂量。
[0082]
样品3-10的微球以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用resomer r 203h(iv＝0.25-0.35dl/g；制造商：evonik，德国)作为pla聚合物，并使用如下表所述的根据实施例1的样品1-2、溶剂和连续相的剂量。
[0083]
对于样品3-11的微球，使用pla/plga的共混物作为聚合物，具体而言，其以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用resomer r 205s(iv＝0.55-0.75dl/g；制造商：evonik，德国)和resomer rg 858s(iv＝1.3-1.7dl/g；制造商：evonik,germany)，并使用如下表所述的根据实施例1的样品1-2、溶剂和连续相的剂量。
[0084]
样品3-12的微球以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用resomer rg 858s(iv＝1.3-1.7dl/g；制造商：evonik，德国)作为plga聚合物，并使用如下表所述的根据实施例1的样品1-2、溶剂和连续相的剂量。
[0085]
样品3-13的微球以与样品3-2的微球基本上相同的方式制备，不同之处在于使用resomer rg 858s(iv＝1.3-1.7dl/g；制造商：evonik，德国)作为plga聚合物，并使用如下表所述的根据实施例1的样品1-2、溶剂和连续相的剂量。
[0086]
【表3】
[0087][0088]
实施例4：包含利凡斯的明和脂肪酸的pla缓释微球制剂的制备
[0089]
通过混合生物相容性聚合物，resomer r 203h(iv＝0.25-0.35dl/g；制造商：evonik，德国)3.31g和利凡斯的明(制造商：hwail pharm，韩国)1.00g与癸酸(制造商：alfa aesar，美国)0.69g和二氯甲烷(制造商：j.t.baker，美国)8.27g来制备分散相。通过搅拌30分钟或更久而充分溶解分散相。使用2.0％(重量/体积)聚乙烯醇(粘度：4.8mpa
·
s至5.8mpa
·
s)水溶液作为连续相，并将连续相950ml供应至膜乳化装置，同时，将制备的分散相注入以制备微球，并将微球悬浮液置于制备容器中并以200rpm搅拌。
[0090]
膜乳化装置和制备容器的温度保持为25℃，当分散相的注入完成时，搅拌30分钟，然后将微球悬浮液的温度升至35℃，保持3小时，并去除有机溶剂。当有机溶剂的去除完成后，微球悬浮液的温度降至25℃。微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤数次，然后回收并干燥以制备样品4-1的微球。
[0091]
除了分别地，样品4-2的微球使用月桂酸、样品的4-3微球使用肉豆蔻酸、样品4-4的微球使用棕榈酸和样品4-5的微球使用硬脂酸作为脂肪酸，并使用如下表4所示的其他聚合物、作为活性成分的利凡斯的明、溶剂和连续相的剂量外，以与样品4-1的微球基本相同的方式制备样品4-2、样品4-3、样品4-4和样品4-5。
[0092]
【表4】
[0093][0094]
实施例5：包含利凡斯的明和利凡斯的明巴莫酸盐的缓释微球制剂的制备
[0095]
通过混合生物相容性聚合物，resomer rg 858s(iv＝1.3-1.7dl/g；制造商：evonik，德国)3.61g和利凡斯的明(制造商：hwail pharm，韩国)0.76g与样品1-2 0.89g和二氯甲烷(制造商：j.t.baker，美国)32.82g和二甲基亚砜(制造商：samchun chemicals，韩国)1.850ml来制备分散相。通过搅拌30分钟或更久而充分溶解分散相。使用1.0％(重量/体积)聚乙烯醇(粘度：4.8mpa
·
s至5.8mpa
·
s)水溶液作为连续相，并将连续相4,923ml供应至膜乳化装置，同时，将制备的分散相注入以制备微球，并将微球悬浮液置于制备容器中并以200rpm搅拌。
[0096]
膜乳化装置和制备容器的温度保持为25℃，当分散相的注入完成时，将微球悬浮液的温度在45℃保持3小时，并去除有机溶剂。当有机溶剂的去除完成后，微球悬浮液的温度降至25℃。
[0097]
微球悬浮液用超纯水反复洗涤数次以去除残留的聚乙烯醇，并将微球冷冻干燥以制备样品5的微球。
[0098]
实验实施例1：利凡斯的明巴莫酸盐中的利凡斯的明和巴莫酸盐的含量的测量
[0099]
为了测量实施例1中制备的利凡斯的明巴莫酸盐的利凡斯的明和巴莫酸盐的含量，样品10mg用二甲基亚砜完全溶解，然后稀释到流动相中。将稀释溶液20ul注入hplc，并在210nm检测波长下测量。本次测量中使用的柱为inertsil ods-3，5μm，4.6x 250mm，通过将磷酸盐缓冲溶液(ph 6.0)和乙腈以65:35(体积/体积)的比例混合使用流动相。测量结果显示在表5中。
[0100]
【表5】
[0101]
利凡斯的明巴莫酸盐的药物含量比较
[0102][0103]
实验实施例2：根据药物类型对微球中利凡斯的明的含量的测量
[0104]
为了测量实施例和比较实施例中制备的微球中的利凡斯的明的含量，用二甲基亚砜完全溶解10mg微球，然后稀释到流动相中。将稀释溶液20ul注入hplc，并在210nm检测波
长下测量。本次测量中使用的柱为inertsil ods-3，5μm，4.6x 250mm，通过将磷酸盐缓冲溶液(ph 6.0)和乙腈以65:35(体积/体积)的比例混合使用流动相。测量的包封率显示在表6中。
[0105]
【表6】
[0106]
根据药物种类和药物输入量比较药物含量和包封率
[0107][0108][0109]
(tl(目标负载)(％)：微球制备过程中利凡斯的明的目标负载量，riv(％)：利凡斯的明在实际微球中的包封率，e.e.(包封率)(％)：利凡斯的明的包封率)
[0110]
根据上面表6的结果，可以证实，与使用相同目标负载量的利凡斯的明酒石酸盐和利凡斯的明游离碱制备的微球相比，根据本发明的包含利凡斯的明巴莫酸盐的用于可注射制剂的缓释微球显示出优异的利凡斯的明包封率，并且可以证实，不同种类的可生物降解聚合物的情况也是如此。
[0111]
实验实施例3：通过电子显微镜进行的微球形态学分析
[0112]
为了分析样品3-3、3-4和样品2-3中制备的微球的形态特性，进行了扫描电子显微镜观察。在用碳胶带将微球固定在支架中后，使用金属涂覆机(cressington,208hr，英国)在表面涂覆铂。将支架安装在扫描电子显微镜(hitachi，s4800，日本)上，并在3.0kv的加速电压下观察微球的形态特性。结果显示在图1a至1c中。
[0113]
如图1a至1c所证实的，可以证实样品3-3和3-4中包含利凡斯的明游离碱和可生物降解聚合物的微球和包含利凡斯的明巴莫酸盐的微球的粒径都是均匀的。
[0114]
实验实施例4：根据药物类型测量微球体外药物释放率
[0115]
为了测量在上述每个实施例和比较实施例中制备的微球中利凡斯的明的体外释放率，进行以下实验。将10mg微球置于hdpe广口瓶中，并填充释放试验溶液10ml(ph 7.4)，然后将其储存在37℃培养箱中。对于样品溶液，取上清液0.2ml并固定，并将新的释放试验溶液0.2ml添加到广口瓶中。在设定时间收集样品，并在与实验实施例1相同的分析条件下使用hplc分析含量和释放率。
[0116]
结果显示在表7和图2中。
[0117]
【表7】
[0118][0119]
如上文表7和图2所证实的，在释放试验后3小时(0.13天)，包含利凡斯的明游离碱的样品2-3的微球显示出的利凡斯的明的释放率为40％或更多，并且在第1天的时间点显示出接近90％的释放率，因此，可以证实药物在早期迅速释放，大部分药物在第7天的时间点释放，而包含利凡斯的明巴莫酸盐的样品3-3和3-4的微球在释放试验后直至第7天的时间点具有良好的受控释放率，无快速药物释放，药物在49天的长时间段内缓慢释放，因此，可以证实，就药物释放而言，包含利凡斯的明巴莫酸盐更为优选。
[0120]
实验实施例5：根据添加剂(通过脂肪酸碳链长度)测量微球中的含量
[0121]
为了测量以上样品4-1、4-2、4-3、4-4和4-5以及样品2-2中制备的微球中的利凡斯的明的含量，用dmso完全溶解10mg微球，然后稀释到流动相中。将稀释溶液20ul注入hplc，并在271nm检测波长下测量。本次测量中使用的柱为inertsil ods-3，5μm，4.6x 150mm，通过将磷酸盐缓冲溶液(ph 5.0)和乙腈以6:4(体积/体积)的比例混合使用流动相。测量的包封率显示在表8中。
[0122]
【表8】
[0123]
根据添加剂比较微球中的药物含量和包封率
[0124][0125][0126]
(tl(％)：微球制备过程中利凡斯的明的目标负载量，riv(％)：利凡斯的明在实际微球中的包封率，e.e.(包封率)(％)：利凡斯的明的包封率，c10:0脂肪酸：癸酸，c12:0脂肪酸：月桂酸，c14:0脂肪酸：肉豆蔻酸，c16:0脂肪酸：棕榈酸，c18脂肪酸：硬脂酸)
[0127]
根据上表8的结果，可以证实与不包含脂肪酸的微球相比，进一步包含作为添加剂的脂肪酸与利凡斯的明的微球显示出更优异的利凡斯的明包封率。
[0128]
实验实施例6：使用激光衍射法对微球粒径的分析
[0129]
为了定量测量所制备微球的平均粒径、分布和均匀性，采用激光衍射法对微球的粒径进行了分析。将样品2-1、3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6、3-9、3-11、3-12和4-1，以及比较样品1和2中制备的微球100mg与9％(重量/体积)吐温20水溶液1ml混合并用移液管分配。将制备的微球分散液置于粒径分析仪(cilas，990l，法国)中，并测量10秒。
[0130]
结果显示在下表9中。
[0131]
【表9】
[0132]
制备的微球的粒径分析结果(平均粒径：10μm至120μm)
[0133]
分类d50(μm)比较样品171.74比较样品2100.54样品2-154.62样品3-1119.50样品3-2137.94样品3-345.42样品3-454.67样品3-564.87样品3-641.25样品3-941.07样品3-1152.88样品3-12106.87样品4-153.57
[0134]
如上表9所证实的，可以证实包含利凡斯的明巴莫酸盐的微球的平均粒径为150μm或更小。
[0135]
实验实施例7：sprague-dawley大鼠单次肌肉施用药代动力学试验
[0136]
为了评估根据本发明的含有利凡斯的明的缓释微球作为缓释治疗剂的可能性，采用以下方法测量大鼠血液中的利凡斯的明浓度。用于实验的微球是样品3-7、3-8和3-9中制备的微球。
[0137]
测量微球，使利凡斯的明剂量为57.9mg/kg，并将其分散在0.350ml悬浮液中，然后肌肉注射到sd大鼠体内。在预定时间，采集0.25ml至0.5ml血液，并使用hplc测量血液中的利凡斯的明浓度，结果显示在表10和图3a、3b和3c中。如表10和图3中所证实的，可以证实根据本发明的利凡斯的明微球通过连续释放药物最短14天和最长56天显示出优异的缓释效果，在施用后没有初始的爆发释放。
[0138]
【表10】
[0139]
根据施用后流逝天数的药物累积释放率(％)
[0140]