一种兼有抗菌和益生活性的蒲公英花多糖提取物及方法与流程

1.本发明涉及天然产物化学有效成分提纯富集制备高附加值精细化学品的天然产物化学领域，具体涉及的是一种兼有抗菌和益生活性的蒲公英花多糖提取物及方法。


背景技术：

2.蒲公英始载于唐代《本草纲目》，《本草纲目》作地丁蒲公英属taraxacum webar.全世界约2000余种。我国有70种，1变种。蒲公英(taraxacum mogonon，tm)是药食同源的菊科多年生草本植物，被卫生部列入既是食品又是药品的名单，具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋、健胃消炎、保肝利胆等功效。
3.蒲公英花作为蒲公英种植产业的副产物，含有很多其他生物活性物质，如多糖、酚酸和黄酮类等。黄酮类包括木樨草素、槲皮素、芹菜素和芸香苷及其糖苷类的衍生物，如木犀草素-7-β-d-葡萄糖苷，槲皮素-3-o-葡萄糖苷。蒲公英花中酚酸包括绿原酸和咖啡酸等具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用。关于蒲公英花中多糖富集，黄酮和酚酸的提取分离，国内外申请的专利发现，国外专利对蒲公英花专利报道较少，尤其是水溶性活性多糖提取物，国外专利申请号为us201113068283，该专利记载了蒲公英的根中提取橡胶和碳水化合物的方法，与本发明中涉及的目标产物蒲公英花多糖、酚酸显著不同。国内申请涉及蒲公英花中多糖的专利包括：一种蒲公英提取物及其制备方法，专利申请号：cn201110062814.4，cn201210521873.8，该专利在提取黄酮的过程中，使用了65％醇-水提取，石油醚脱色，存在有机溶剂残留，添加了无机强酸(盐酸)或乙酸，浸提过程中容易造成金属提取容器的腐蚀，提高了生产成本不利于提高企业的生产效益。此外，该专利使用的原料是整株蒲公英，而本发明使用的原料为蒲公英花，可定向精准获取活性物，减少其他杂质的引入。专利名称为一种蒲公英制剂及制备方法，专利申请号为cn02111738.1，该专利在制备蒲公英药物制剂时，直接制备水提取物和药用辅料配伍成蒲公英制剂，主要用于蒲公英有机酸富集。一种蒲公英提取物及其制备方专利号为201910729006.5，制得的蒲公英提取物主要用于获得蒲公英黄酮和蒲公英色素，作为天然着色剂。
4.近年来，研究表明，植物多糖发挥多种功能活性可能与其调节肠道菌群密切相关。由于机体缺乏多糖水解酶，经口服摄入的多糖绝大多数不能被人体直接消化吸收，但体内的肠道菌群在以下两方面发挥功效，1)肠道菌群能够对多糖进行降解产生单糖，促进机体对其吸收和利用，还能产生功能代谢产物，如短链脂肪酸，2)多糖能够直接通过调节肠道菌群的比例，来增加有益菌的数量，降低有害菌的数量，从而达到改善机体的生理水平。肠道菌群通过分泌糖苷水解酶、裂解酶和酯酶等作用分解多糖链获取能量，其中多糖被酵解为一些终产物的短链脂肪酸，如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等，这些物质不仅参与动物的能量代谢，可以作为肠道菌群的“食物”，也具有良好的生物活性。同时短链脂肪酸的种类、含量与肠道菌群的种类和组成比例直接相关。此外，短链脂肪酸还能降低肠道ph值、抑制部分有害菌落的繁衍，提高肠粘膜免疫功能等作用。这可能是由于乳酸菌、双歧杆菌利用这类基质生长的效率比其他微生物相对更高，并且能耐受短链脂肪酸和发酵所引起的酸化微环境
的原因。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于充分有效利用蒲公英花，提取其中多糖、黄酮和酚酸活性成分复合物，为蒲公英花精深加工开发提供支持。
6.本发明所采取的技术方案包括如下：一种兼有抗菌和益生活性的蒲公英花多糖提取物及方法，以蒲公英花为原料，采用水提醇沉法得到蒲公英花多糖提取物，所述的蒲公英花多糖提取物，除主含多糖外，还富含黄酮如木犀草素、槲皮素、木犀草苷和有机酸，所述的有机酸包括p-香豆酸、咖啡酸、绿原酸；所述的同时具有高效抗菌和益生活性的蒲公英花多糖提取物对金黄色葡萄球菌(s.aureus)、志贺氏菌(s.castellani)、大肠杆菌(e.coli)和沙门氏菌(s.enteritidis)中的一种或多种具有抑制作用；对乳酸杆菌(l.bulgaricus)和双歧杆菌(bifidobacterium)中的一种或两种有增殖效应。
7.以蒲公英花为原料，采用水提醇沉法得到蒲公英花多糖提取物，所述的蒲公英花多糖提取物。
8.所述的蒲公英花是以江苏泗阳产的新鲜锯齿蒲公英(taraxacum mongolicum hand.-mazz.)，经采摘后太阳晒干后使用，含水量＜4％。
9.所述的蒲公英花粉碎，以水为溶剂，沸腾条件下，搅拌均匀后，趁热真空抽滤收集滤液，旋蒸浓缩冷却至是室温后，加入无水乙醇与浓缩液进行醇沉，真空抽滤后收集醇沉物再经真空冷冻干燥或加水复溶后喷雾干燥制备蒲公英花多糖提取物。
10.沸腾条件指温度100℃的水为蒸馏水或去离子水，蒲公英花粉与水的固液比范围1:1～60g/ml，机械搅拌速率10～1000r/min，搅拌时间1～240min。
11.旋蒸浓缩条件是指温度45～75℃，最终浓缩体积范围200～300ml。
12.所述的无水乙醇与浓缩液的体积比范围为1:1～10，醇沉的温度范围为-4～4℃。
13.所述的真空冷冻干燥的时间范围为36～72h，真空度压力范围80～110pa，或喷雾干燥时间范围为1～3h，真空度压力范围0.09～0.1m pa。
14.有益效果：
15.(1)本发明制备的蒲公英花多糖提取物同时富含有机酸如绿原酸与咖啡酸和黄酮化合物；(2)具有强效抗菌如金黄色葡萄球菌(s.aureus)、志贺氏菌(s.castellani)、大肠杆菌(e.coli)和沙门氏菌(s.enteritidis)和益生活性如乳酸杆菌(l.bulgaricus)和双歧杆菌(bifidobacterium)的增殖。
16.(2)本发明采用水提醇沉法，无有机溶剂残留，和有机溶剂、强酸强碱相比，可减少投资成本，为药品、化妆品和保健品提供了安全优质助剂。
17.(4)本发明工艺简便、稳定，产品收率高且结果重现性好，所获产品品质好，投资效益高且易于实现工业化生产。
18.(5)蒲公英花多糖提取物较蒲公英叶、全株多糖提取物具有更强的益生菌增殖能力。
附图说明
19.图1本发明的蒲公英花多糖提取物加工工艺流程图。
20.图2蒲公英花多糖提取物中hplc图。
21.图3蒲公英花多糖提取物抗菌效果。
22.图4蒲公英花多糖提取物益生效果。
23.图5蒲公英花多糖提取物较蒲公英叶多糖提取物和整株蒲公英多糖提取物的益生活性对比效果。
具体实施方式
24.一种兼有抗菌和益生活性的蒲公英花多糖提取物及方法，所述的蒲公英花，是以江苏泗阳产的新鲜锯齿蒲公英(taraxacum mongolicum hand.-mazz.)，经采摘后太阳晒干后，粉碎至60目的花粉为原料(含水量＜4％)，以蒸馏水为溶剂，沸腾条件下，按照一定固液比经过机械搅拌一段时间后，趁热真空抽滤收集滤液，旋蒸浓缩冷却至是室温后，加入适量无水乙醇与浓缩液按一定体积比在适宜温度下进行醇沉一段时间，真空抽滤后收集醇沉物再经真空冷冻干燥或加适量水复溶后喷雾干燥制备蒲公英花多糖提取物。该蒲公英花多糖提取具有高效抑制金黄色葡萄球菌(s.aureus)、志贺氏菌(s.castellani)、大肠杆菌(e.coli)和沙门氏菌(s.enteritidis)，和具有乳酸杆菌(l.bulgaricus)和双歧杆菌(bifidobacterium)增殖效应。
25.同时具有高效抗菌和益生活性的蒲公英花多糖提取物的制备方法，所述沸腾条件指温度100℃的水为蒸馏水或去离子水，蒲公英花粉与水的固液比范围1:1～1:60(g/ml)，机械搅拌速率10～1000r/min，搅拌时间1～240min。
26.所述的旋蒸浓缩条件是指温度45～75℃，最终浓缩体积范围200～300ml。
27.所述的无水乙醇与浓缩液的体积比范围为1:1～1:10，醇沉的温度范围为-4～4℃
28.所述的真空冷冻干燥的时间范围为36～72h，真空度压力范围80～110pa或喷雾干燥时间范围为1～3h真空度压力范围0.09～0.1m pa。
29.制备的蒲公英花多糖提取物，除主含多糖外，还富含黄酮如木犀草素、槲皮素、木犀草苷等，有机酸如p-香豆酸、咖啡酸、绿原酸等，高效抑菌指的是对金黄色葡萄球菌(s.aureus)、志贺氏菌(s.castellani)、大肠杆菌(e.coli)和沙门氏菌(s.enteritidis)中的一种或多种。高效益生活性是指对乳酸杆菌(l.bulgaricus)和双歧杆菌(bifidobacterium)中的一种或两种有显著增殖效应。
30.实施例1
31.称取100g蒲公英花干粉，加入3000ml蒸馏水于大烧杯中，在100℃沸腾下机械搅拌速率1000r/min提取4h，重复提取2次，趁热抽滤，收集2次虑液在55℃下旋蒸浓缩至浓缩液约300ml，浓缩液冷却至室温后加入800ml乙醇沉淀析出多糖，并置于-4℃下静置24h，真空抽滤后真空冷冻干燥(干燥48h，真空度压力范围100pa)，获得蒲公英花多糖提取物固体含量1.86g，其中可得到含总多糖可达60.39％，绿原酸、咖啡酸和p-香豆酸的含量分别为1.36％、3.76％和9.88％，总黄酮约为8.7％。当蒲公英花多糖提取物浓度为1.0mg/ml时，菌志贺氏菌和沙门氏菌的抑菌效率分别为60％和40％，益生菌增殖效率超过15％如乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖效率分别为17.5％和15.2％。
32.实施例2
33.称取125g蒲公英花干粉，加入3750ml蒸馏水于大烧杯中，在100℃沸腾下机械搅拌
速率700r/min提取4h，重复提取2次，趁热抽滤，收集2次虑液在60℃下旋蒸浓缩至浓缩液约400ml，浓缩液冷却至室温后加入1600ml乙醇沉淀析出多糖，并置于-2℃下静置24h，真空抽滤后真空冷冻干燥(干燥60h，真空度压力范围90pa)，获得蒲公英花多糖提取物固体含量2.23g，其中可得到含总多糖可达55.43％，绿原酸、咖啡酸和p-香豆酸的含量分别为1.51％、4.05％和10.13％，总黄酮约为9.12％。当蒲公英花多糖提取物浓度为1.0mg/ml时，菌志贺氏菌和沙门氏菌的抑菌效率分别为61.13％和39.28％，益生菌如乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖效率分别为19.3％和16.8％。
34.实施例3
35.称取200g蒲公英花干粉，加入6000ml蒸馏水于大烧杯中，在100℃沸腾下机械搅拌速率800r/min提取4h，重复提取2次，趁热抽滤，收集2次虑液在50℃下旋蒸浓缩至浓缩液约520ml，浓缩液冷却至室温后加入2100ml乙醇沉淀析出多糖，并置于0℃下静置24h，真空抽滤后真空冷冻干燥(干燥72h，真空度压力范围100pa)，获得蒲公英花多糖提取物固体含量3.36g，其中可得到含总多糖可达58.64％，绿原酸、咖啡酸和p-香豆酸的含量分别为1.39％、3.96％和12.06％，总黄酮约为10.08％。当蒲公英花多糖提取物浓度为10.0mg/ml时，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效率分别为90.52％和62.34％，益生菌如乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖效率分别为-10.1％和-12.5％。
36.实施例4
37.称取150g蒲公英花干粉，加入4500ml蒸馏水于玻璃提取器中，在100℃沸腾下机械搅拌速率900r/min提取3.5h，重复提取2次，趁热抽滤，收集2次虑液在60℃下旋蒸浓缩至浓缩液约350ml，浓缩液冷却至室温后加入1400ml乙醇沉淀析出多糖，并置于4℃下静置24h，真空抽滤后真空冷冻干燥(干燥72h，真空度压力范围80pa)，获得蒲公英花多糖提取物固体含量2.72g，其中可得到含总多糖可达62.01％，绿原酸、咖啡酸和p-香豆酸的含量分别为1.86％、4.18％和11.32％，总黄酮约为9.51％。当蒲公英花多糖提取物浓度为1.0mg/ml时，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效率分别为63.63％和22.56％，益生菌如乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖效率分别为18.72％和16.09％。
38.实施例5
39.称取133g蒲公英花干粉，加入4000ml蒸馏水于玻璃提取器中，在100℃沸腾下机械搅拌速率100r/min提取4h，重复提取2次，趁热抽滤，收集2次虑液在55℃下旋蒸浓缩至浓缩液约400ml，浓缩液冷却至室温后加入1600ml乙醇沉淀析出多糖，并置于0℃下静置24h，真空抽滤后加900ml蒸馏水复溶，喷雾干燥(进风温度135℃，出风温度80℃，进样量15ml/min，干燥1h，干燥腔内范围0.09～0.1m pa)，获得蒲公英花多糖提取物固体含量2.23g，其中可得到含总多糖可达58.39％，绿原酸、咖啡酸和p-香豆酸的含量分别为1.02％、3.11％和8.77％，总黄酮约为7.87％。当蒲公英花多糖提取物浓度为1.0mg/ml时，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效率分别为60.01％和19.48％，益生菌如乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖效率分别为15.28％和11.36％。
40.以上实施案例中表述的蒲公英花多糖提取物浓度是指用蒸馏水加热至完全溶解。此外，通过gc-ms测定，发现蒲公英花由五种单糖组成分别为d-鼠李糖、葡萄糖、d-半乳糖、d-木糖和d-阿拉伯糖。
41.对比例
42.蒲公英花较其他组织部位含有更高的酚类或黄酮类化合物，抑制有害菌能力更强。且多糖中的单糖组成、结构也有差异，产生的对肠道微生态调节能力也有差异。如果采用整株蒲公英，采用同样的提取方法(水提醇沉法)，会引入大量非益生活性的杂质，同时得到的多糖组分、结构产生差异，益生活性反而不如纯花瓣组织的富含多酚或黄酮的多糖提取物，具体效果见图5。
43.对比例中所述的提取方法具体情况如下：
44.将干燥粉碎后的蒲公英花或叶或全株样品分别各称量120.0g均匀分散在4000ml蒸馏水中并调节该体系温度约100℃保持沸腾状态，在机械搅拌条件下(3000r/min)提取4h。将提取液于8000g下离心处理10min，合并上清液。旋转蒸发浓缩后加入4倍体积的无水乙醇，并置于4℃过夜以沉淀多糖。离心收集沉淀的多糖，冷冻干燥后，最终分别获得蒲公英花多糖提取物、蒲公英叶多糖提取物和蒲公英全株提取物。以上所有蒲公英样品均为同一品种称作大叶蒲公英，同一时间2021年3月下旬采自江苏宿迁泗阳蒲公英种植基地，同一干燥(在50℃下烘干至恒重)和粉碎(过60目约0.42mm)加工条件下处理获得的。测定的蒲公英样品中结果如表1所示，蒲公英花多糖提取物中单糖组成主要有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖，其摩尔比为1:25.7:23.0:130.7:92.0:320.5:22.4，主要成分为半乳糖和半乳糖醛酸；蒲公英全株多糖提取物中单糖组成主要有主要有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖，其摩尔比为1.0:1.0:0.8:6.6:5.5:8.1:0.7，主要成分为半乳糖及其醛酸和葡萄糖。蒲公英叶多糖提取物中有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖，其摩尔比为1:1.2:0.5:4.4:13.2:16.9:4.7，主要成分为半乳糖和葡萄糖。此外，蒲公英花提取物中总多糖含量66.8％，蒲公英全株提取物和蒲公英叶提取物中总多糖含量分别为61.3％和59.86％，均低于蒲公英花提取物中总多糖含量。
45.表1不同蒲公英样品多糖提取物中单糖组成
46.[0047][0048]
备注：样品蒲公英多糖提取物的总多糖是通过苯酚硫酸法测定的；样品蒲公英多糖提取物中单糖组成是依次通过三氟乙酸水解，pmp衍生化，结合外标法在254nm下通过hplc反相色谱进行检测确定的。
[0049]
综上所述，以蒲公英花为原料制备多糖提取物具有强效抗菌和益生活性是本发明的特色，通过本发明制备的蒲公英花多糖提取物可直接应用于保健品、药品和化妆品中，安全性使用的问题。本发明对制备水提取蒲公英花多糖活性物的浓缩液，采用了冷冻干燥技术，最大限度的保留蒲公英花多糖提取物中的活性成分，针对本发明制备蒲公英花多糖提取物的过程中，减少了有机溶剂使用和后处理需要，降低了成本利于蒲公英产业化发展。因此，精细化利用蒲公英花制备富含酚酸和黄酮的多糖提取物，是蒲公英加工利用的一条新途径，同时对其应用基础研究发展具有重要意义。