一种阿魏根、茎部组织的石蜡切片的制备方法与流程

1.本发明涉及一种阿魏根、茎部组织的石蜡切片制作方法，属于生物组织学技术领域，具体涉及一种多伞阿魏根、茎部组织的石蜡切片快速制作方法。


背景技术：

2.多伞阿魏ferula ferulaeoides(steud.) korov.为伞形科阿魏属多年生一次结果的草本，广泛分布在我国新疆准噶尔盆地边沿地区，其根和植物树脂入药，无葱蒜样臭味，具有消积、杀虫、祛湿、止痛、治龋的功效。
3.石蜡切片法常被用于临床病理诊断和植物解剖学特征观察，用于观察、判断细胞组织的形态变化，具有切片薄、可清晰观察细胞、染色条件可控、可永久保存等优点，是组织学常规制片技术中最为普遍的方法，但传统石蜡切片制片周期长，操作过程较为复杂，耗材多，且通常会使用3类致癌物二甲苯，长时间接触可致神经系统功能紊乱。
4.微波法制作石蜡切片，就是在短波高频电磁波的照射下，极性分子和离子高速振动、并相互碰撞，产生大量热能，使组织细胞或介质的受热均匀一致，试剂与组织细胞间液体交换效率也明显提高，切片制作的时间缩短。除此之外，本方法将透明和浸蜡步骤中的二甲苯试剂替换为同样具备软化组织作用的正丁醇，这样既有利于切出完整的组织切片，又减少了有毒试剂的使用，且正丁醇的密度小于熔融的石蜡，包埋时易被熔融石蜡替代，从而简化透明、浸蜡、包埋等步骤。另外，本方法把透明剂改为无水乙醇与正丁醇混合浓度梯度的溶液，再用正丁醇处理，这样能完全除去组织中的水分，缩短了脱水过程中无水乙醇的处理时间，又能避免长时间使用无水乙醇使组织变脆的问题。
5.本发明以多伞阿魏的根、茎为主要试验材料，对传统植物石蜡切片方法的主要技术环节进行了长时间的探究和大胆的改进；成功以正丁醇代替二甲苯作为透明剂，这样即减少了有毒试剂的使用，又提高了石蜡切片的质量，而微波法的使用则提高了试剂和细胞组织间的液体交换效率，大大缩短了石蜡切片制作的时间；综上所述，微波快速石蜡切片法，研究器具方便易得，制片时间大大缩短，是阿魏根、茎部组织研究的一种高效快捷的方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对传统石蜡切片方法进行改良，解决制片前处理时间长的问题并针对多伞阿魏根和茎采用微波改良石蜡切片方法可以缩短制片时间。
7.本实验的技术方案如下： 1.取材与固定：取多伞阿魏根和茎，将其置于faa固定液（含福尔马林-70%乙醇-乙酸的比例为1︰18︰1）抽真空固定，用抽滤泵对其进行抽真空至液体中没有气泡（约20 min），过夜保存。
8.2.冲洗：取包埋盒存放组织体，在流水中冲洗3 d。
9.3.脱水：取500 ml烧杯，在烧杯中加入150 ml水及适量沸石，放进微波炉，解冻档
加热10 min（预热），取25 ml小烧杯放在上述大烧杯里，倒入脱水剂50%乙醇15 ml，将烧杯放进微波炉加热6 min。再依次将植物组织先后转入浓度60%乙醇、浓度70%乙醇、浓度80%乙醇、浓度95%乙醇进行梯度脱水，各梯度处理方法如上，注意每次更换脱水剂时要保证前一次脱水剂在小烧杯中留存少许保证植物处于湿润状态。之后加入无水乙醇微波处理3 min，最后再更换一次无水乙醇微波加热3 min彻底脱水。
10.注意：脱水第一步后取出小烧杯，观察脱水剂的量及组织体情况，若脱水会出现白痕。注意观察大烧杯中水的量，水量不能低于100 ml。
11.4.透明：正丁醇可以和水互溶，既可以再次脱水又可以起到透明的作用，配制无水乙醇和正丁醇的体积比为3︰1的溶液，将植物体放入15 ml该溶液中，并装入小烧杯内，将小烧杯放入装有足量水的大烧杯中微波处理6 min。以同样的操作依次将植物组织放入无水乙醇与正丁醇体积比为1︰1的溶液、无水乙醇与正丁醇体积比为1︰3的溶液、再置于正丁醇中2次进行透明。
12.5.浸蜡：配制正丁醇与石蜡体积比为2︰1的溶液、正丁醇和石蜡体积比为1︰1的溶液和正丁醇与石蜡体积比为1︰2的溶液各15 ml，将透明好的材料依次转移到上述溶液中。之后再将植物组织分别放入石蜡中3次进行微波处理。采用低火档，共微波处理6次，每次12 min。
13.6.包埋：利用hb-l4生物组织包埋机，对浸蜡后的组织体进行包埋，尽可能保证蜡块完整无裂缝。
14.7.烘片：将蜡块放置在hk-4生物组织摊烤片机烘片箱中35 ℃加热2~3 min至石蜡面比手心稍热。
15.8.切片：修整石蜡块，得到切面平整，截面为矩形或梯形的实验材料蜡块，将蜡块置于轮转切片机上切片，切片厚度20~40
µ
m。
16.9.烤片：将切好的切片放入hk-4生物组织摊烤片机中，45 ℃加热至石蜡融化欲往下流时取出冷却，此步骤重复3~4次，代替长时间烘片。
17.10.染色：利用1%的番红和0.5%的固绿染色，先将切片浸入二甲苯中处理2 min，再依次浸入无水乙醇与二甲苯体积比为1︰1的溶液、无水乙醇、95%乙醇溶液、85%乙醇溶液、70%的乙醇溶液，每次处理2 min，之后用1%的番红染色4 h，染色后取出切片，将其依次浸入50%的乙醇溶液、70%的乙醇溶液、80%的乙醇溶液和95%的乙醇溶液，每次处理2 min，后用0.5%的固绿染色5 s、蒸馏水冲洗10 s，冲洗干净后将切片浸入无水乙醇溶液中处理2 min，用二甲苯与无水乙醇体积比为1︰1的溶液浸没切片处理5 min，最后用二甲苯浸没切片5 min。
18.11.封片：将切片从二甲苯中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除。封好的切片放在室温下干燥，制成永久切片。
19.发明具有以下突出优点1.本发明在石蜡切片脱水、透明、浸蜡步骤中都采用微波技术，提高了试剂和细胞组织间的液体交换效率，使得切片制作所需要的时间缩短，得到的切片质量高效果好、组织结构清晰。在保证切片高质量的前提下，大大提高制作效率。
20.2.本发明提出把透明剂改为无水乙醇与正丁醇混合浓度梯度溶液，接着用正丁醇
处理，这样能完全除去组织中的水分，缩短了脱水过程中无水乙醇的处理时间，又能避免长时间使用无水乙醇使组织变脆的问题，同时也减少了有毒试剂二甲苯的使用，减少对操作人员的伤害。
21.3.本发明在烤片过程中，45 ℃加热至石蜡融化欲往下流时取出冷却，此步骤重复3~4次，可代替长时间烘片的操作，短时间内使蜡片与载玻片贴合紧密防止掉片。
22.4.本发明在包埋过程中滴加二甲苯其能够软化蜡块，减少刀片对蜡带造成的损伤。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
24.图1示实施例1本发明提供的一种阿魏根部组织的石蜡切片方法获得的切片效果图10
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10；图2示实施例2本发明提供一种阿魏茎部组织的石蜡切片方法获得的切片效果图10
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10；图3示对比例1传统石蜡切片操作获得的石蜡切片效果图10
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10；图4示对比例2传统石蜡切片操作获得的石蜡切片效果图10
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10。
具体实施方式
25.本发明提供的植物组织的石蜡切片方法中所用的原料及试剂均可由市场购得。
26.下面结合实例进一步阐述本发明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
27.实施例一1.取材与固定：取多伞阿魏的根切成长约3 mm小段，置于玻璃瓶中并加入faa固定液（含福尔马林-70%乙醇-乙酸的比例为1︰18︰1）利用试剂杀死细胞，固定形态，确定固定液盖过组织体，且不超过玻璃瓶容积的4/5，防止固定液被抽出导致组织体固定不完全。抽真空处理约20 min（不产生气泡即可）后过夜保存。
28.2.冲洗：取包埋盒存放组织体，在流动水中冲洗3 d。
29.3.脱水：脱水：利用梯度乙醇室温浸泡脱水。乙醇梯度依次为70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、95%乙醇溶液、无水乙醇、无水乙醇。取500 ml大烧杯向其加入150 ml水及适量沸石，然后将其放进微波炉，进行解冻档加热10 min（预热），取25 ml小烧杯放在上述大烧杯里，倒入脱水剂70%乙醇15 ml，保温档加热6 min，取出观察脱水剂的量及组织体情况，若脱水会出现白痕，观察的量，水量不能低于100 ml。同上操作，依次将植物组织先后转入浓度浓度80%乙醇溶液、浓度95%乙醇溶液进行梯度脱水，每次更换脱水剂时要保证前一次脱水剂在小烧杯中留存少许保证植物处于湿润状态。加入85%乙醇溶液以后产生剧烈的液体交换，植物体有冒气泡的现象，说明有空化效应。最后换无水乙醇2次，每次加热3 min。检测方法：植物体放到二甲苯溶液中，观察是否出现水雾，若有水雾则说明脱水不彻底。
30.4.透明：透明剂为正丁醇和无水乙醇混合溶液及正丁醇，透明过程使用溶液依次为无水乙醇和正丁醇的体积比为3︰1的溶液、无水乙醇与正丁醇体积比为1︰1的溶液、无水乙醇与正丁醇体积比为1︰3的溶液、正丁醇溶液、正丁醇溶液。正丁醇能与水互溶，不仅可以再次脱水还可以起到透明的作用，取一小烧杯依次更换15 ml上述试剂置于盛有150 ml水的大烧杯中。多伞阿魏的根段放在小烧杯中，连带大烧杯将其整体置与微波炉中加热6 min进行透明。
31.5.浸蜡：准备正丁醇与石蜡体积比为2︰1的溶液、正丁醇与石蜡体积比为1︰1的溶液、正丁醇与石蜡体积比为1︰2的溶液以及两份熔融的石蜡各15 ml于西林瓶中，将透明好的材料依次转移到相应的西林瓶中，西林瓶放在含水的大烧杯中，每次低火微波处理12 min。及时观察水位、补水。
32.6.包埋：待包埋机中的石蜡熔化后，滴加熔融石蜡至包埋盒底部完全覆盖，滴一滴二甲苯搅匀，加一部分石蜡，再加植物体（将植物体正立放置各个植物体之间保持距离），当石蜡呈现半凝固状态时继续滴加石蜡直至包埋盒内石蜡充盈，盖包埋盒，再次滴加石蜡至充盈状态。最后将包埋盒移至4 ℃冷冻台上使其迅速冷却凝固，最后卸下蜡块。
33.7.烘片：将蜡块放置在hk-4生物组织摊烤片机烘片箱中35 ℃加热2~3 min至石蜡面比手心稍热，或者在热水中化。
34.8.切片：将蜡块置于轮转切片机上切片，切片厚度20~40
µ
m。
35.9.烤片：将切好的切片放入hk-4生物组织摊烤片机中，45 ℃加热至石蜡融化欲往下流时取出冷却，此步骤重复3~4次，代替长时间烘片。
36.10.染色：利用1%的番红和0.5%的固绿染色，先将切片浸入二甲苯中处理2 min，再依次浸入无水乙醇与二甲苯体积比为1︰1的溶液、无水乙醇、95%乙醇溶液、85%乙醇溶液、70%的乙醇溶液，每次处理2 min，之后用1%的番红染色4 h，染色后取出切片，将其依次浸入50%的乙醇溶液、70%的乙醇溶液、80%的乙醇溶液和95%的乙醇溶液，每次处理2 min，后用0.5%的固绿染色5 s、蒸馏水冲洗10 s，冲洗干净后将切片浸入无水乙醇溶液中处理2 min，用二甲苯与无水乙醇体积比为1︰1的溶液浸没切片处理5 min，最后用二甲苯浸没切片5 min。
37.11.封片：将切片从二甲苯溶液中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除。封好的切片放在室温下干燥，制成永久切片。
38.实施例二1.取材与固定：取多伞阿魏的茎切成长约3 mm小段，置于玻璃瓶中加入faa固定液（含福尔马林-70%乙醇-乙酸的比例为1︰18︰1）利用试剂杀死细胞，固定形态，确定固定液盖过组织体，且不超过玻璃瓶容积的4/5，防止固定液被抽出导致组织体固定不完全。抽真空处理约20 min（不产生气泡即可）后过夜保存。
39.2.如实例一中描述。
40.3.脱水：利用梯度乙醇室温浸泡脱水。乙醇梯度依次为50%乙醇溶液、60%乙醇溶液、70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、95%乙醇溶液、无水乙醇、无水乙醇。取500 ml大烧杯向其加入150 ml水及适量沸石，然后将其放进微波炉，进行解冻档加热10 min（预热），取25 ml小烧杯放在上述大烧杯里，倒入脱水剂50%乙醇15 ml，保温档加热6 min，取出观察脱水剂的
量及组织体情况，若脱水会出现白痕，观察水的量，保持水量不低于100 ml。同上操作，依次将植物组织先后转入浓度60%乙醇溶液、浓度70%乙醇溶液、浓度80%乙醇溶液、浓度95%乙醇溶液进行梯度脱水，每次更换脱水剂时要保证前一次脱水剂在小烧杯中留存少许保证植物处于湿润状态。加入80%乙醇溶液以后产生剧烈的液体交换，植物体有冒气泡的现象，说明有空化效应。最后换无水乙醇2次，每次加热3 min。检测方法：植物体放到二甲苯溶液中，观察是否出现水雾，若有水雾则说明脱水不彻底。
41.4.透明：透明剂为正丁醇和无水乙醇混合溶液及正丁醇，透明过程使用溶液依次为无水乙醇和正丁醇的体积比为3︰1的溶液、无水乙醇与正丁醇体积比为1︰1的溶液、无水乙醇与正丁醇体积比为1︰3的溶液、正丁醇溶液、正丁醇溶液。正丁醇能与水互溶，不仅可以再次脱水还可以起到透明的作用，取一小烧杯依次更换15 ml上述试剂置于盛有150 ml水的大烧杯中。多伞阿魏的茎段放在小烧杯中，连带大烧杯将其整体置于微波炉中加热6 min进行透明。
42.5~11如实例一中描述。