用于治疗及预防肥胖的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法与流程

1.本发明涉及用于治疗及预防肥胖的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法。


背景技术：

2.肥胖是因能量的消耗和储存失衡引起的，是世界范围内引起严重的健康问题的首要原因(参考文献(reference)1)。肥胖与许多高危疾病(心血管疾病、糖尿病、高血脂症、癌症等)有关。脂肪组织由许多脂肪细胞构成，已知这对能量代谢的稳态非常重要。脂肪组织分为棕色脂肪(bat：brown adipose tissue)和白色脂肪(wat：white adipose tissue)两种。白色脂肪用于储存能量，棕色脂肪起到燃烧脂肪来产生热量的作用(参考文献2)。
3.脂肪细胞的增殖由脂肪和脂质的生成形成，这是通过脂肪细胞的前体分化为脂肪细胞来增殖的(参考文献(reference)3)。脂肪细胞的分化是动态的，并且通过复杂的过程进行，诱导细胞的形态学变化和胰岛素敏感性，通过分泌的分子连续出现转录、翻译的基因表达。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(pparγ：peroxisome proliferator activated receptor-γ)和ccaat/增强子结合蛋白α(c/ebpα)是脂肪细胞分化初期调节脂肪生成的重要因子(参考文献4)。ppar-γ是脂肪细胞分化的主要调节子，这是脂肪形成分化中最特异性的标志物中的一种(参考文献5)。c/ebpα是在脂肪细胞的成熟和分化期间与ppar-γ一同最协调地显出效果的蛋白质中的一种(参考文献6)。
4.3t3-l1脂肪细胞前体随着葡萄糖的消耗和中性脂肪的增加分化为脂肪细胞。分化的早期表达的ppar-γ和c/ebpα还表达固醇调节因子结合蛋白-1(srebp-1：sterol regulatory element binding protein-1)。该蛋白是脂肪生成转录因子调节中非常重要的蛋白质之一，参与生物合成胆固醇、脂肪酸、中性脂肪。并且，脂肪组织中富含脂蛋白脂肪酶(lpl：lipoprotein lipase)，起到催化中性脂肪的水解的作用(参考文献7)。该lpl信使核糖核酸(mrna)的表达也考虑为确认脂肪细胞分化初期的标志物，所有转录因子共同诱导如脂肪酸合成酶(fas：fatty acid synthase)和脂联素的脂质合成基因的表达(参考文献8、参考文献9)。因此，只要在脂肪生成的早期调节上述蛋白质，就可以阻止肥胖，也可以预防与之相关的疾病。因此，我们为了诱导抗肥胖效果而使用了光动力治疗(pdt：photo dynamic therapy)方法。
5.光动力治疗是用于治疗癌症及其他疾病(抗氧化、抗炎症、抗菌、抗真菌、抗老化等)的非常吸引人的方式之一，是利用在特定波长的激光(660nm)下反应的光敏剂生成的高度的活性氧簇(ros)来治疗疾病的方式(参考文献10)。在上述光敏剂中，二氢卟吩e6复合物为二代光敏剂，具有如下优点：最大吸收波长为662nm，向可治疗的疾病细胞的渗透可达12nm，给药光敏剂后至激光照射的时间短，实际上药物最多3天就可清除，从而缩短了需阻隔光线的时间。
6.本发明通过利用二氢卟吩e6复合物的光动力治疗方法在细胞实验阶段确认到如
ppar-γ、c/ebpα、ampk、lpl、fas的蛋白质的表达，在动物实验阶段确认到白色脂肪减少了多少，从而证明了利用二氢卟吩e6复合物的光动力治疗方法还具有潜在的抗肥胖效果。


技术实现要素：

7.技术问题
8.根据本发明的一实施例，本发明提供用于治疗及预防肥胖的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法。
9.根据本发明的再一实施例，本发明提供用于治疗及预防对象的肥胖或代谢疾病的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法。
10.技术方案
11.根据一实施例，本发明可以提供用于治疗及预防肥胖的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法，其包括：向对象注射或给药二氢卟吩e6复合物的步骤；以及对注射或给药上述二氢卟吩e6复合物的对象进行光动力治疗的步骤。
12.根据本发明的再一实施例，本发明可以提供用于治疗及预防对象的代谢疾病的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法，其包括：向对象注射或给药二氢卟吩e6复合物的步骤；以及对注射或给药上述二氢卟吩e6复合物的对象进行光动力治疗的步骤。
13.在上述实施例中，定期进行2次以上的如下步骤：向对象注射或给药上述二氢卟吩e6复合物的步骤；以及对注射或给药上述二氢卟吩e6复合物的对象进行光动力治疗的步骤。
14.上述向对象注射或给药二氢卟吩e6复合物的步骤可以为向对象每1kg给药1.0mg至10.0mg的上述二氢卟吩e6复合物的步骤。
15.上述光动力治疗的步骤可以为使对象暴露于具有660nm的波长和1.0j/cm2至5.0j/cm2的强度的发光二极管(led)激光的步骤。
16.上述二氢卟吩e6复合物可以包含二氢卟吩e6、衍生自二氢卟吩e6的化合物中的二氢卟吩k、二氢卟吩p6、罗多二氢卟吩、紫红素18、二氢卟吩e4、罗丁g7、卟啉k、卟啉e4中的一种以上。
17.上述二氢卟吩e6复合物可以包含二氢卟吩e6、衍生自二氢卟吩e6的化合物中的二氢卟吩k、二氢卟吩p6、罗多二氢卟吩、紫红素18、二氢卟吩e4、罗丁g7、卟啉k、卟啉e4中的一种以上和添加剂。
18.发明的效果
19.根据本发明的一个以上的实施例，在向对象使用用于治疗及预防肥胖的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法的情况下，可有效治疗或预防肥胖。
20.根据本发明的一个以上的实施例，用于治疗及预防对象的肥胖或代谢疾病的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法是有效的。
附图说明
21.图1a至图1i示出在本发明一实施例的光动力治疗方法中使用的二氢卟吩e6及衍生自二氢卟吩e6的化合物中的二氢卟吩k、二氢卟吩p6、罗多二氢卟吩、紫红素18、二氢卟吩e4、罗丁g7、卟啉k、卟啉e4的结构。
22.图2为将利用二氢卟吩e6复合物的光动力治疗应用于3t3-l1细胞后确认存活的图。
23.图3为示出3t3-l1脂肪细胞的分化和应用由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗的实验计划的图。
24.图4为通过油红o(oil-red-o)染色确认应用二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗抑制3t3-l1脂肪细胞的脂质积聚和分化的效果的图。
25.图5为通过尼罗红(nile red)染色确认抑制3t3-l1脂肪细胞的中性脂肪合成和积聚的效果的图。
26.图6a和图6b为通过蛋白印迹法确认在分化的3t3-l1细胞中通过由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗调节脂肪生成转录因子和ampk的表达量的效果的图。
27.图7为在分化的3t3-l1细胞中确认通过由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗调节脂质生成信使核糖核酸的表达量的效果的图。
28.图8为整理出由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗抑制分化的3t3-l1细胞的脂肪重量增加及生成的机制的图。
29.图9为整理出由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗对于诱导肥胖的小鼠的白色脂肪和棕色脂肪组织的效果的图。
30.图10和图11是为确认通过由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗是否对高脂饮食诱导肥胖的比格犬具有肥胖的改善效果而进行电子计算机断层扫描(ct)拍摄的图。
具体实施方式
31.以下，通过实施例更为详细地说明本发明的结构及效果，这些实施例仅为本发明的例示性记载，本发明的范围不限定于这些实施例。
32.本说明书中所使用的术语用于说明实施例，并不限制本发明。在本说明书中，除非特别提及，否则单数的文句还包括复数的含义。说明书中所使用的“包含(comprises)”和/或“包含
……
的(comprising)”表示所提及的结构要素不排除一个以上的其它结构要素的存在或追加。
33.在本说明书中，术语“治疗”包括去除进行中的症状或症状的原因、缓解症状或者抑制症状的继续进行的含义。
34.根据本发明，二氢卟吩e6为在多种皮肤和癌症疾病模型中长久以来使用的有效光敏剂。
35.二氢卟吩为以三个吡咯环与一个还原的吡咯环通过四个甲基键连接的基团为中心的大的双环芳香族化合物。含镁的二氢卟吩被称为叶绿素，是大部分植物、海藻以及蓝细菌的叶绿体中的主要光敏色素。上世纪八十年代，二氢卟吩被介绍为光动力治疗的潜在性光敏剂。查明二氢卟吩e6与血卟啉衍生物的混合物存在于细胞质和如线粒体膜的细胞膜中。若将光敏剂特定于靶向细胞的表面抗原/受体表面来与抗体或配体结合，则可以增加光敏作用。
36.已有将二氢卟吩e6与单克隆抗体一同作用于癌细胞的结果，可以在癌细胞表面特异性反应来提高卟啉光敏作用的选择度。这样相互作用的靶向细胞是细胞膜。例如，如细胞核与溶酶体的细胞内器官成为更敏感的靶标的可能性可以通过光照敏感性来示出。根据本
发明，用于治疗肥胖的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法对治疗肥胖是有效的，这将在后述内容中叙述。
37.根据本发明的一实施例，将包含二氢卟吩e6和/或衍生自二氢卟吩e6的化合物中的二氢卟吩k、二氢卟吩p6、罗多二氢卟吩、紫红素18、二氢卟吩e4、罗丁g7、卟啉k及卟啉e4中的一种以上并与如聚乙烯吡咯烷酮的添加剂形成的复合物用作光敏剂的光动力治疗方法对治疗肥胖有效。
38.根据本发明的一实施例，有关二氢卟吩k、二氢卟吩p6、罗多二氢卟吩、紫红素18、二氢卟吩e4、罗丁g7、卟啉k或卟啉e4的结构分别如图1a至图1i所示。
39.在本发明中，“二氢卟吩e6复合物”是指包含二氢卟吩e6与一种以上的二氢卟吩e6衍生物来构成的复合物。
40.根据“二氢卟吩e6复合物”的一实施例，包含二氢卟吩e6与一种以上的二氢卟吩e6衍生物来构成。作为一例，包含二氢卟吩e6与二氢卟吩k、二氢卟吩p6、罗多二氢卟吩、紫红素18、二氢卟吩e4、罗丁g7、卟啉k及卟啉e4中的一种以上来构成。例如，二氢卟吩e6复合物可以包含二氢卟吩e6与二氢卟吩k来构成。例如，二氢卟吩e6复合物可以包含二氢卟吩e6与卟啉k来构成。再举一例，二氢卟吩e6复合物可以包含二氢卟吩e6与二氢卟吩p6来构成。还有一例，二氢卟吩e6复合物可以包含二氢卟吩e6、二氢卟吩p6以及罗多二氢卟吩来构成。通过这种方式，二氢卟吩e6复合物除包含二氢卟吩e6外，还可以包含一种以上的二氢卟吩e6衍生物来构成。
41.根据“二氢卟吩e6复合物”的再一实施例，二氢卟吩e6可以包含一种以上的二氢卟吩e6衍生物与添加剂来构成。添加剂可以为例如聚乙烯吡咯烷酮，但不限定于此。作为二氢卟吩e6复合物的一例，二氢卟吩e6复合物可以包含二氢卟吩e6、罗丁g7以及添加剂来构成。例如，二氢卟吩e6复合物可以包含二氢卟吩e6、卟啉k以及添加剂来构成。再举一例，二氢卟吩e6复合物可以包含二氢卟吩e6、二氢卟吩p6以及添加剂来构成。还有一例，二氢卟吩e6复合物可以包含二氢卟吩e6、二氢卟吩p6、罗多二氢卟吩以及添加剂来构成。通过这种方式，二氢卟吩e6复合物除包含二氢卟吩e6外，还可以包含一种以上的二氢卟吩e6衍生物与添加剂来构成。
42.本发明一实施例的用于治疗及预防肥胖的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法使用上述二氢卟吩e6复合物。例如，可以通过向对象静脉注射或口服给药二氢卟吩e6复合物后进行光动力治疗来减少体重。并且，可以通过向对象静脉注射或口服给药二氢卟吩e6复合物后进行光动力治疗来预防或治疗对象的肥胖及代谢疾病。
43.根据本发明的实施例，可以通过向对象给药二氢卟吩e6复合物后进行光动力治疗来表现出减少甘油三酯、减少低密度蛋白质及增加高密度蛋白质等效果，从而可以治疗对象的肥胖。
44.根据本发明的实施例，可以通过向对象静脉注射或口服给药二氢卟吩e6复合物并在4周内或者每周数次进行特定强度的光动力治疗来治疗对象的肥胖。
45.根据本发明的实施例，可以通过向对象每1kg给药1.0mg至10.0mg的二氢卟吩e6复合物后进行光动力治疗来治疗对象的肥胖。例如，若对象的体重为50kg，则向对象给药50.0mg至500.0mg的二氢卟吩e6复合物。
46.根据本发明的实施例，可以通过向对象给药二氢卟吩e6复合物后使其暴露于具有
660nm的波长及1.0j/cm2至5.0j/cm2的强度的发光二极管激光后进行光动力治疗来治疗对象的肥胖。
47.根据本发明的实施例，可以通过向对象给药包含二氢卟吩e6和一种以上的二氢卟吩e6衍生物(例如二氢卟吩k、二氢卟吩p6、罗多二氢卟吩、紫红素18、二氢卟吩e4、罗丁g7、卟啉k、卟啉e4中的一种以上)来构成的二氢卟吩e6复合物后进行光动力治疗来治疗对象的肥胖。
48.根据本发明的实施例，可以通过向对象给药包含二氢卟吩e6、一种以上的二氢卟吩e6衍生物(例如二氢卟吩k、二氢卟吩p6、罗多二氢卟吩、紫红素18、二氢卟吩e4、罗丁g7、卟啉k、卟啉e4中的一种以上)以及如聚乙烯吡咯烷酮的添加剂来构成的二氢卟吩e6复合物后进行光动力治疗来治疗对象的肥胖。
49.根据本发明的一实施例，本发明可以提供用于治疗及预防肥胖的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法，其包括：向对象注射或给药二氢卟吩e6复合物的步骤；以及对注射或给药上述二氢卟吩e6复合物的对象进行光动力治疗的步骤。
50.根据本发明的再一实施例，本发明可以提供用于治疗及预防对象的代谢疾病的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法，其包括：向对象注射或给药二氢卟吩e6复合物的步骤；以及对注射或给药上述二氢卟吩e6复合物的对象进行光动力治疗的步骤。
51.以下，参照附图，通过实验本发明一实施例的用于治疗及预防肥胖的由二氢卟吩e6光敏剂复合物介导的光动力治疗方法的实验结果进行说明。
52.材料及方法
53.1)制备用于细胞培养和分化的mdi培养液
54.3t3-l1脂肪细胞前体是从美国的atcc公司购入的。向该细胞加入包含10％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素的杜氏改良伊戈尔培养基(dulbecco'smodified eagle's medium，dmem)进行培养。然后，为了分化，向6孔培养板(6-well-plate)的各孔加入1
×
105cells的3t3-l1细胞后，利用包含0.5mm的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methyl xanthine，ibmx)、1μm的地塞米松及10μg/ml的胰岛素的培养基来诱导分化。3天后，使用包含10μg/ml的胰岛素和10％的胎牛血清的培养基替换mdi培养液，在将细胞用于实验之前，每两天更换新鲜的培养液。
55.2)用于以由二氢卟吩e6和/或二氢卟吩e6衍生物组成的复合物介导的光动力治疗实验的发光二极管
56.向在6孔培养板中培养的3t3-l1细胞加入多种浓度的二氢卟吩e6复合物后在37℃、5％co2的暗室中处理30分钟。在暗室中3小时后，使加入上述多种浓度的二氢卟吩e6复合物的3t3-l1细胞暴露于具有660nm波长和3j/cm2的强度的发光二极管激光中。使用mdi培养液更换包含二氢卟吩e6复合物的培养液后，在暗室中培养3天。然后在第3天以与第0天相同的方式进行由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗(photodynamic therapy)(以下称“光动力治疗”)的处理。然后更换包含10μg/ml的胰岛素和10％的胎牛血清的培养基后在暗室中培养2天后，在第5天再进行由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗。然后在第7天获得细胞。
57.3)mtt实验
58.在37℃、5％co2的暗室中在96孔培养板(96-well-plate)中培养3t3-l1细胞。在37
℃、5％co2的暗室中使用4μm～10μm的二氢卟吩e6复合物处理上述细胞30分钟。并且，3小时后，使上述细胞暴露于具有660nm波长和3j/cm2的强度的发光二极管激光中。然后，使用未加入血清的培养液更换培养液后培养44小时。然后，形成甲臜(formazan)后加入二甲基亚砜(dmso，dimethyl sulfoxide)，并在570nm波长下检测吸光度。
59.4)通过油红o染色确定脂质的含量
60.准备从美国sigma公司购入的油红o溶液，以3∶2的比例将异丙醇稀释于水中。在室温下使用10％的福尔马林溶液固定上述3t3-l1细胞10分钟。清洗福尔马林溶液后，将上述3t3-l1细胞在室温下置于油红o溶液中染色1小时后，使用60％的异丙醇清洗。使用美国imt i-solution inc.公司的ccd pro 2照相机拍摄染色的细胞来获得图像。使用显微镜获得细胞形态的图像。利用异丙醇洗脱脂质颗粒被染色的细胞后在96孔培养板的各孔中接种200μl。使用瑞士tecan公司的酶联免疫吸附测定(elisa)分析仪器sunrise在420nm的波长下检测各孔的吸光度。
61.5)尼罗红染色
62.在60mm共聚焦光学显微镜培养皿中培养3t3-l1细胞。诱导3t3-l1细胞的分化后进行由二氢卟吩e6介导的光动力治疗，使用10％的福尔马林溶液在室温下固定上述细胞10分钟。然后，清洗福尔马林溶液后将其置于美国sigma公司的尼罗红(nile red)中在室温下染色1小时后，在暗室中使用磷酸盐缓冲溶液(pbs)清洗。然后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，4
′
,6-diamidino-2-phenylindole)染色5分钟后，使用磷酸盐缓冲溶液(pbs，phosphate buffer solution)清洗后使用日本奥林巴斯公司的fv10-asw共聚焦光学显微镜进行观察。
63.6)蛋白印迹法分析
64.前体细胞裂解物利用包含苯甲基磺酰氟(pmsf，phenylmethylsulfonyl fluoride)和蛋白溶解酶抑制剂的ripa缓冲液来准备。这些样品都是将25μg的蛋白质放入5x十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(5x sds-page)上样(loading)缓冲液中来准备，之后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离蛋白质。然后将分离的凝胶中包含的蛋白质移到聚偏氟乙烯(pvdf，polyvinylidene fluoride)膜后，置于5％的牛血清白蛋白(bsa：bovine serum albumin)中2小时。可使利用牛血清白蛋白封闭(blocking)的聚偏氟乙烯膜在4℃的温度下分别与各自的一抗结合18小时。然后，在室温下放置50分钟以使附着有辣根过氧化物酶(hrp，horseradish peroxidase)的二抗能够与一抗结合。使用supernova ecl western检测溶液激活上述聚偏氟乙烯膜后使用韩国lugen sci co.公司的sensi-q 2000获得图像。利用imagej程序检测通过上述方式获得的图像的定量。
65.7)实时聚合酶链式反应(rt-pcr)
66.总rna是收获3t3-l1细胞后分离的，互补脱氧核糖核酸(cdna)是利用美国bio-rad公司的cdna kit从1μg的总rna合成的。合成条件设定25℃5分钟、46℃20分钟、95℃1分钟为一个周期。聚合酶链式反应(pcr，polymerase chain reaction)扩增设定95℃5分钟、95℃30秒钟、60℃30秒钟、72℃1分钟、72℃5分钟为一个周期，共25个周期，来扩增dna。将该聚合酶链式反应产物放入2％的琼脂糖凝胶中进行电泳。本实验中所使用的引物如下。
67.c/ebpα正向引物(forward)：5
′‑
tgttggggatttgagtctgtg-3
′
,反向引物(reverse)：5
′‑
ggaaacctggcctgttgtaag-3
′
68.fas正向引物：5
′‑
gctgcggaaacttcaggaaat-3
′
,
69.反向引物：5
′‑
agagacgtgtcactcctggactt-3
′
70.lpl正向引物：5
′‑
gggagtttggctccagagttt-3
′
,
71.反向引物：5
′‑
tgtgtcttcaggggtccttag-3
′
72.8)利用诱导肥胖的小鼠的由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗的抗肥胖效果实验
73.从韩国的orientbio公司购买6周龄的雌性icr小鼠，驯化1周后，喂食含有60％的脂肪的高脂饮食直至实验结束之前。实验是从各个体的体重比起初始体重增加约20％的第15天开始的。实验组共分为如下7个组。
74.组1：正常饲料饮食(nfd：normal food diet)
75.组2：高脂肪饲料饮食(hfd：high fat diet)
76.组3：hfd 二氢卟吩e6复合物(2.5mg/kg)
77.组4：hfd 低发光二极管(low led)(3j/cm2)
78.组5：hfd 高发光二极管(high led)(5j/cm2)
79.组6：hfd 二氢卟吩e6复合物(2.5mg/kg) 低发光二极管(3j/cm2)
80.组7：hfd 二氢卟吩e6复合物(2.5mg/kg) 高发光二极管(5j/cm2)
81.通过腹腔注射来应用二氢卟吩e6复合物，注射3小时后，照射发光二极管。以2天的间隔实施上述实验。
82.9)统计处理
83.将数据输入美国spss inc.公司的统计处理程序(社会科学统计包(statistical package for social science))。输入能够代表各独立实验结果的3个数据来求得各组的平均值和标准差。通过单因素方差分析来计算统计的显著性，并使用图基事后检验法(tukey's post hoc)来检验。当p＜0.05时可以考虑为具有统计学显著性。
84.10)用于测量比格犬脂肪量的电子计算机断层扫描拍摄
85.从韩国orientbio公司的井邑中心购买12只11月龄的雌性比格犬，在设定为温度23
±
3℃、相对湿度55
±
15％、换气次数10次/小时～20次/小时、照明时间12小时(上午8点开灯～下午8点关灯)及光照强度150lux～300lux的(株)knotus公司的第一动物饲育区的1号室实施。饲料是从韩国biopia公司购入(株)cargill公司生产的实验动物用狗饲料，以每次约300g的量供摄取，使用自动供水装置使实验动物自由摄取水。试验组共分为4个组。
86.组1：高脂肪饲料(hfd)
87.组2：高脂肪饲料 给药二氢卟吩e6复合物
88.组3：高脂肪饲料 给药二氢卟吩e6复合物 发光二极管照射
89.组4：高脂肪饲料 给药二氢卟吩e6复合物 发光二极管照射
90.利用输注仪器静脉注射2.5mg/kg的二氢卟吩e6复合物30分钟，使用7.34mw/cm2强度的光二极管激光照射。
91.以每周3次的方式给药二氢卟吩e6复合物并发光二极管激光照射15分钟(组3；6.6j/cm2)、30分钟(组4；13.2j/cm2)直至第16天，然后每周给药5次，并照射发光二极管激光10分钟(组3；4.4j/cm2)、15分钟(组4；6.6j/cm2)。电子计算机断层扫描拍摄是在给药试验物质之前(第0天(day 0))进行，并在解剖检查日(第35天(day 35))利用5mg/kg的法国virbac
公司的zoletil50及2.5mg/kg的德国bayer ag公司的rompun麻醉后，利用日本toshiba corporation公司的alexion拍摄电子计算机断层扫描图像。
92.结果
93.1)利用由二氢卟吩e6或二氢卟吩e6衍生物组成的复合物的3t3-l1细胞的存活功效
94.使用稀释为4μm～11μm浓度的二氢卟吩e6复合物处理3t3-l1细胞后，进行mtt分析。这些细胞在经过11μm的由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗处理48小时后显出约88％的存活率。在使用11μm以下浓度的二氢卟吩e6复合物处理的组中，未显出显著的细胞毒性。
95.2)在使用mdi培养液诱导的3t3-l1细胞分化中脂质的合成与以由二氢卟吩e6或二氢卟吩e6衍生物组成的复合物介导的光动力治疗的关系
96.以图3所示的过程进行3次由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗。然后通过使用油红o染色确认分化的3t3-l1细胞中的由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗处理是否影响脂肪细胞分化的结果显示，在对照组中，在诱导分化之前观察到小且细长的形态，而未观察到脂肪颗粒，但在通过mdi培养液诱导分化时，观察到细胞呈圆形，还观察到脂肪颗粒。但在由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗处理的组中，可以确认随着浓度的升高，通过mdi培养液诱导的分化被抑制。并且可以确认，无论是否有二氢卟吩e6复合物，只要不照射发光二极管，3t3-l1细胞与对照组相似地分化。可以确认与以5μm～7.5μm浓度的由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗处理组减少20％左右的脂肪相比，在10μm的浓度下，抑制了约60％脂肪的积聚。
97.并且，参照图5，使用尼罗红染色3t3-l1的脂质过载的结果，可以确认在由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗处理的组中，中性脂肪的合成根据二氢卟吩e6复合物的浓度减少。
98.3)与脂肪和脂质的生成相关的蛋白质和信使核糖核酸的表达与以由二氢卟吩e6或二氢卟吩e6衍生物组成的复合物介导的光动力治疗的关系
99.为了从分子生物学的观点确认由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗的效果，利用分化的3t3-l1细胞通过蛋白印迹法确认作为与脂肪生成相关的因子的pparγ和c/ebpα的表达量。参照图6，可知当使用10μm的二氢卟吩e6复合物处理后照射发光二极管时，pparγ-1、pparγ-2以及c/ebpα的表达量减少了。并且可以在由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗处理的组中确认调解脂肪的吸收和生物合成的srebp-1的表达量也减少了。可以确认磷酸化的ampk显著增加了。
100.为了确认由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗是否影响与脂肪和脂质的生成相关的信使核糖核酸，实施了实时聚合酶链式反应。参照图7，可以确认在10μm的二氢卟吩e6复合物浓度下，lpl信使核糖核酸的表达量显著减少了。而且，可以确认c/ebpα、fas的信使核糖核酸的表达量也减少了。但是，由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗未影响未分化的3t3-l1细胞。
101.4)诱导肥胖的小鼠的白色脂肪组织和棕色脂肪组织的重量变化与以由二氢卟吩e6或二氢卟吩e6衍生物组成的复合物介导的光动力治疗的关系
102.为了观察肥胖小鼠白色脂肪及棕色脂肪的重量变化，摘除附睾白色脂肪组织和肩
胛骨棕色脂肪组织，比较其大小并测量重量。当用肉眼观察如图9a所示的摘除的脂肪组织时，确认到与正常饲料饮食组(nfd：normal food diet)相比，高脂肪饮食组(hfd：high fat diet)的白色脂肪更肥大，重量的差异也非常大。
103.在使用二氢卟吩e6复合物处理并使用低发光二极管和高发光二极管照射的组中，与未处理并照射的组相比，可以确认白色脂肪显著变小，重量也减少了(减少约50％)。另一方面，在只处理二氢卟吩e6复合物的组中可以确认白色脂肪的大小或重量几乎没有变化。但从肩胛骨棕色脂肪组织在所有组中都未显出显著变化来看，认为由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗对棕色脂肪的重量并没有很大的影响。
104.5)以由二氢卟吩e6或二氢卟吩e6衍生物组成的复合物介导的光动力治疗对诱导肥胖的比格犬的抗肥胖效果
105.利用比格犬来从体内(in vivo)的观点进行由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗的脂肪减少效果实验。在实验开始之前进行电子计算机断层扫描拍摄，在实验的最后一天进行电子计算机断层扫描拍摄来测量脂肪量的结果，确认到与未处理组相比，组4的总脂肪减少量及内脏脂肪减少量的水平显著的高。因此，由二氢卟吩e6复合物介导的光动力治疗示出对比格犬的肥胖治疗效果，但可以确认当只单独处理二氢卟吩e6复合物后不照射发光二极管激光时，改善肥胖的效果微乎其微，并且可以确认，随着照射发光二极管激光的时间的增加，肥胖的改善效果也随之增大。
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