一种香柏洗液及其制备方法以及在动物真菌性皮肤病中的应用与流程

1.本发明属于中医药技术领域，特别涉及一种香柏洗液及其制备方法以及在动物真菌性皮肤病中的应用。


背景技术：

2.皮肤病是一类严重危害宠物健康的疾病，种类很多，其病因也复杂多样常见。皮肤病种类有细菌性皮肤病、真菌性皮肤病、寄生虫性皮肤病、过敏性皮肤、激素紊乱性皮肤病、营养缺乏性皮肤病、脂溢性皮炎等。其中常见的宠物真菌性皮肤病，又称癣病，主要由犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌等真菌引起，侵入皮肤表皮、毛发或趾甲从而引起皮肤的一系列器质性病变，是犬、猫临床最常见的传染性皮肤疾病之一。其临床特征是掉屑、脓包、红的斑点、掉毛及丘疹等，继发感染可能出现疡、糜烂。真菌性皮肤病治愈率低，病程较长，易反复，并可通过动物传染给人，对动物和人类的健康造成严重影响。
3.目前临床上主要是使用西药来治疗本类疾病，包括水杨酸、灰黄霉素、两性霉素、克霉唑、伊曲康唑等。由于多种因素导致皮肤真菌病发病率增多，变异菌株也随之增多，加之临床上抗真菌药物的过度不规范使用，致使病原真菌对较多抗真菌药都普遍产生抗性，严重影响了原有西药的药物效果，同时西药因为难以避免的毒副作用，某些疾病需要长期使用时，也让广大患者或宿主望而却步，严重影响着它们的使用范围。
4.中兽医理论认为，虽然皮肤病发生在动物的体表，但是与内在脏腑、气血有密切关系。风、湿、热、虫、毒乘机侵入是皮肤病得以发生的常见原因。从中兽医学基础的辨证论治观念出发，犬真菌性皮肤病的病机为水湿内蕴，郁而化热，水湿热邪相搏，湿甚于热，外蒸肌表，浸淫皮肤而成。中医治则主要以清热燥湿、杀虫止痒为主。
5.我国古代文献中记载大量治癣方，如《外科启玄》中的“鹅掌风方”，《外科正宗》中的“枯矾散”，《洞天奥旨》的“菊粉散”、“熊脂膏方”等，现已发现300余种中药具有抗真菌活性，从中草药中寻找抗真菌新药已成为近年来非常重要的研究方向。中药对于真菌病的防治，具有天然性、毒副作用小、不易产生抗药性等优势。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种香柏洗液。
7.本发明的另一目的在于提供所述香柏洗液的制备方法。
8.本发明的再一目的在于提供所述香柏洗液在制备防治动物真菌性皮肤病的产品中的应用。
9.本发明的目的通过下述技术方案实现：
10.一种香柏洗液，所述的香柏洗液的活性成分由以下重量份的原料制成：黄柏30～65份、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，明矾2.5g。
11.所述的香柏洗液的活性成分更优选为由以下重量份的原料制成：黄柏30份、黄藤
10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，明矾2.5g。
12.所述的香柏洗液的生药含量(药液浓度)为0.1～0.6g/ml；优选为0.2～0.6g/ml；进一步优选为0.2～0.4g/ml；更进一步优选为0.4g/ml。
13.所述的香柏洗液的制备方法，包括如下步骤：将黄柏、黄藤、苦参、苍术、丁香和花椒混合粉碎后，用质量百分比50％的乙醇溶液润湿后密闭30分钟以上，再装入渗漉装置中，加入质量百分比50％的乙醇溶液浸泡后进行渗漉提取，再加入明矾，最后用质量百分比20％的乙醇溶液调整其浓度为0.1～0.6生药/ml，得到所述的香柏洗液。
14.所述的渗漉的速度为6ml/(min
·
kg)。
15.所述的渗漉提取的乙醇溶液的用量为按每克(g)所述抗马拉色菌中药组合物配比5～10ml乙醇溶液计算；优选为按每克(g)所述抗马拉色菌中药组合物配比5ml乙醇溶液计算。
16.所述的渗漉提取的次数优选为两次以上。
17.所述的香柏洗液的生药含量(药液浓度)优选为0.2～0.6g/ml；进一步优选为0.2～0.4g/ml；更进一步优选为0.4g/ml。
18.所述的香柏洗液在制备防治动物真菌性皮肤病的产品中的应用。
19.所述的真菌为犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌中的至少一种。
20.所述的犬小孢子菌优选为犬小孢子菌(microsporum canis)atcc 8137。
21.所述的石膏样小孢子菌优选为石膏样小孢子菌(microsporum gypseum)atcc 14683。
22.所述的须癣毛癣菌优选为须癣毛癣菌(trichophyton mentagrophytes)atcc 32457。
23.所述的产品包括外用药物等。
24.本发明在“清热燥湿、杀虫止痒”治则基础上，结合抗小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌等抑菌试验，筛选药味，遣方用药，由黄柏、黄藤、苦参、苍术、丁香、花椒、明矾组成，适用于湿热蕴阻下焦型孢子菌和毛廯菌皮肤病，症见掉屑、脓包、红斑点、掉毛及丘疹等。中医认为风、湿、热、虫、毒乘机侵入是皮肤病得以发生的常见原因，上述香柏洗液的组方符合中医药理论，以黄柏、黄藤、苦参、苍术、丁香、花椒配伍运用，方中黄柏大寒，能清热燥湿、解毒疗疮，为本方君药；黄藤加强清热解毒之功，苦参增杀虫止痒之效，苍术提高燥湿健脾之能，明矾又能收湿止痒、解毒杀虫，共同提高君药疗效；花椒温中止痛、杀虫止痒，丁香芳香辟秽，又可补肾助阳，取其温热之性制约其它药物的苦寒之性，以免耗伤脾肾之阳。
25.在对宠物皮肤真菌感染深刻认识基础上，以饮片性味归经及功能的传统中医认识，结合药材对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的抑菌效能考察，形成中药组方。在组方中，我们重用对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的抑菌能力强的黄柏(亦符合中医清热燥湿之功能)，并对其在复方中的占比进行了优化，形成了既符合中医药理论、又有抑菌药效支持的香柏洗液。对香柏洗液的浓度，进行了优化，取得了优越的疗效。
26.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
27.(1)目前，对于黄柏、黄藤、苦参、苍术、丁香、花椒组方的抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的中药外用制剂尚无文献及专利报道，本发明在中医药理论和临床实践支持下，经过反复实验所得到的上述组方的香柏洗液抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和
须癣毛癣菌的效果优于现有上市的纯中药复方制剂，适合于长期及预防性应用等特点，具有良好的临床应用前景。
28.(2)本发明通过对比黄柏、黄藤、苦参、丁香、明矾、花椒、苍术等多味中药体外抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的效果，筛选出最优中药组合物，然后再通过体外实验，优化处方中君药(黄柏)的占比，确定最优的君药比例，得出香柏洗液处方比例并根据体外实验结果确定了最佳香柏洗液的浓度。
29.(3)本发明所述香柏洗液具有抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的效果，可以用于治疗宠物皮肤感染，疗效显著，安全稳定可靠。
30.(4)本发明所香柏洗液，组方中药源广，副作用少，耐药性小，成本低廉，抑菌效果显著，可在治疗宠物皮肤感染的外用药物中的临床实践应用。
具体实施方式
31.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
32.实施例1抗小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的单味药的筛选
33.1.1试验材料(仪器、试剂、药材与试验用菌)
34.仪器：旋转蒸发仪(elela sb
‑
1000)；套式恒温器(tc
‑
15，海宁市新华医疗器械厂)；数控超声波清洗器(kq5200da，昆山市超声设备有限公司)；单人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；高压蒸汽灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)；恒温培养箱(池本理化业株式会社)；空气浴振荡器(哈尔滨市东联电子科技开发有限公司)；血细胞计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)。
35.试剂：沙氏液体培养基(sda)(青岛高科园海博生物技术，批号：20120822)；沙氏葡萄糖琼脂培养基(青岛高科园海博生物技术，批号：20120924)；其他试剂均为分析纯。
36.药材：本实验中所用三白草药材产地为广西，北大青叶购于广州致信药业，其它药材均购于和翔制药有限公司。
37.试验用菌：犬小孢子菌(microsporum canis，atcc 8137)(犬小孢子菌，平台编号：bio
‑
72693，拉丁属名：microsporum canis bodin；https://www.biobw.org/atcc/bio
‑
72693.html)、石膏样小孢子菌(microsporum gypseum，atcc 14683)和须癣毛癣菌(trichophyton mentagrophytes，atcc 32457)，购自中国微生物菌种保藏中心。
38.1.2实验方法
39.1.2.1中药储备液的制备
40.中药饮片(具体药材见表1)碎成粗粉，称取10g，用10倍量(质量体积比，g/ml)50％(w/w)的乙醇溶液回流提取2次，每次1h，滤过，减压回收乙醇，浓缩至生药量为1g/ml，作为中药储备液。
41.1.2.2菌液的制备
42.先按照sda葡萄糖琼脂培养基的配方配制培养基，再制作sda琼脂平板，在其中心接种犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌，28℃活化培养1周，活化2次，使菌落覆盖
sda琼脂平板。用血细胞计数板，将菌液浓度调整为5～6
×
104个/ml，备用。
43.1.2.3平板接种
44.用无菌医用棉签蘸取200μl菌液于sda琼脂平板，均匀涂抹。
45.1.2.4贴药敏纸
46.无菌操作法，分别将10μl药液(中药储备液)滴加到纸片(直径为6.0mm)上，略干后用无菌镊子将纸片放于接种菌后的sda琼脂平板的表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。本试验每块平板贴药敏纸片3～5个，不挪动位置，15min后反转过来，放入培养箱内于37℃、5％(v/v)co2条件下培养14～16h，观察并记录结果。
47.1.2.5判定标准
48.根据药敏纸片周围抑菌圈的大小判定其抗菌程度，判定标准：不敏感(小于或等于6mm，
‑
)，低度敏感(小于或等于7mm， )，中度敏感(大于7mm， )，高敏感(大于或等于15mm， )。
49.1.3实验结果
50.不同中药储备液的体外抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的药效结果如表1所示。
51.表1 不同中药储备液的体外抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的药效
52.[0053][0054]
由以上结果可知，黄柏对导致犬猫皮肤感染的常见真菌小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌有较强的抑菌效果，黄藤、苦参、丁香、明矾、花椒的抑菌药效亦佳。
[0055]
根据“清热燥湿、杀虫止痒”中医治则基础上，结合抗小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌等抑菌试验，确定香柏洗液由黄柏量待定、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g组成。
[0056]
实施例2不同君药浓度的药液对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的抗菌敏感性试验
[0057]
2.1试验材料
[0058]
本实施例所用到的实验材料同实施例1。
[0059]
2.2实验方法(纸片扩散法)
[0060]
2.2.1不同君药占比的中药组合物(0.4g/ml)的制备
[0061]
66％君药占比的中药组合物(0.4g/ml)的制备：称取黄柏67g(主药)、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉(过1号筛，2000
±
70μm，10目；下同)，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量(质量体积比，g/ml；下同)的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至1倍量(1g生药/ml)；初漉液与续漉浓缩液合并，加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度(0.4g生药/ml)，滤过，即得。
[0062]
56％君药占比的中药组合物(0.4g/ml)的制备：称取黄柏45g(主药)、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至1倍量(1g生药/ml)；初漉液与续漉浓缩液合并，加入明矾2.5g，以
20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度，滤过，即得。
[0063]
46％君药占比的中药组合物(0.4g/ml)的制备：称取黄柏30g(主药)、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至1倍量(1g生药/ml)；初漉液与续漉浓缩液合并，加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度，滤过，即得。
[0064]
36％君药占比的中药组合物(0.4g/ml)的制备：称取黄柏20g(主药)黄藤10g、苦参10g、百部7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至1倍量(1g生药/ml)；初漉液与续漉浓缩液合并，加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度，滤过，即得。
[0065]
26％君药占比的中药组合物(0.4g/ml)的制备：称取黄柏12g(主药)、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至1倍量(1g生药/ml)；初漉液与续漉浓缩液合并，加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度，滤过，即得。
[0066]
16％君药占比的中药组合物(0.4g/ml)的制备：称取黄柏6.5g(主药)、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至1倍量(1g生药/ml)；初漉液与续漉浓缩液合并，加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度，滤过，即得。
[0067]
2.2.2菌液的制备
[0068]
先按照sda葡萄糖琼脂培养基的配方配制培养基，再制作sda琼脂平板，在其中心接种犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌，28℃活化培养1周，活化2次，使菌落覆盖sda琼脂平板。用血细胞计数板，将菌液浓度调整为5～6
×
104个/ml，备用。
[0069]
2.2.3平板接种
[0070]
用无菌医用棉签蘸取200μl菌液于sda琼脂平板，均匀涂抹。
[0071]
2.2.4贴药敏纸
[0072]
无菌操作法，分别将10μl药液(不同君药占比的中药组合物)滴加到纸片(直径为6.0mm)上，略干后用无菌镊子将纸片放于接种菌后的sda琼脂平板的表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。本试验每块平板贴药敏纸片3～5个，不挪动位置，15min后反转过来，放入培养箱内于37℃、5％(v/v)co2条件下培养14～16h，观察并记录结果。
[0073]
2.2.5判定标准
[0074]
根据药敏纸片周围抑菌圈的大小判定其抗菌程度，判定标准：不敏感(小于或等于6mm，
‑
)，低度敏感(小于或等于7mm， )，中度敏感(大于7mm， )，高敏感(大于或等于15mm，
)。
[0075]
2.3实验结果
[0076]
不同君药占比的中药组合物的体外抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的药效实验结果如见表2所示。
[0077]
表2 不同君药占比的中药组合物体外抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌药效
[0078][0079]
本发明的抗病原微生物的中药组合物对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌的抑制效果较好，依次增大君药黄柏的占比(66％、56％、46％、36％、26％、16％)对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌表现出逐步增强的抑制效果。当君药占比达到46％以上后，抑菌增加不显著，选用46％君药占比的药液效果理想。
[0080]
确定香柏洗液组方：黄柏30g、黄藤10g、苦参10、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g、明矾2.5g。
[0081]
洗液的浓度对抑菌药效亦有显著影响，因此继续考察不同制剂浓度对小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的抑菌效果，确定适宜的制剂浓度。
[0082]
实施例3不同浓度香柏洗液的抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌药敏试验
[0083]
3.1试验材料
[0084]
市售外用治疗宠物真菌性皮肤病药物：狼毒菌一净中药乳膏(广州万兴药业有限公司)；复方土槿皮酊(广州白云山敬修堂药业股份有限公司)；复方伊曲康唑软膏(霉菌净)(天津市保灵动物保健品有限公司)；盐酸特比萘芬喷剂(天津市保灵动物保健品有限公司)；
[0085]
其他实验材料同实施例1。
[0086]
3.2实验方法(纸片扩散法)
[0087]
3.2.1不同浓度的香柏洗液(0.1～0.6g/ml)的制备
[0088]
46％君药占比的香柏洗液(0.6g/ml)的制备：称取黄柏30g、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量(质量体积比，g/ml；下同)的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至稠膏；加入初漉液，再加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度(0.6g生药/ml)，滤过，即得。
[0089]
46％君药占比的香柏洗液(0.5g/ml)的制备：称取黄柏30g、黄藤10g、苦参10g、苍
术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至稠膏；加入初漉液，再加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度(0.5g生药/ml)，滤过，即得。
[0090]
46％君药占比的香柏洗液(0.4g/ml)的制备：称取黄柏30g、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至稠膏；加入初漉液，再加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度(0.4g生药/ml)，滤过，即得。
[0091]
46％君药占比的香柏洗液(0.2g/ml)的制备：称取黄柏30g、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至稠膏；加入初漉液，再加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度(0.2g生药/ml)，滤过，即得。
[0092]
46％君药占比的香柏洗液(0.1g/ml)的制备：称取黄柏30g、黄藤10g、苦参10g、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至稠膏；加入初漉液，再加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度(0.1g生药/ml)，滤过，即得。
[0093]
3.2.2菌液的制备
[0094]
先按照sda葡萄糖琼脂培养基的配方配制培养基，再制作sda琼脂平板，在其中心接种犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌，28℃活化培养1周，活化2次，使菌落覆盖sda琼脂平板。用血细胞计数板，将菌液浓度调整为5～6
×
104个/ml，备用。
[0095]
3.2.3平板接种
[0096]
用无菌医用棉签蘸取200μl菌液于sda琼脂平板，均匀涂抹。
[0097]
3.2.4贴药敏纸
[0098]
无菌操作法，分别将10μl药液(香柏洗液)滴加到纸片(直径为6.0mm)上，略干后用无菌镊子将纸片放于接种菌后的sda琼脂平板的基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。本试验每块平板贴药敏纸片3～5个，不挪动位置，15min后反转过来，放入培养箱内于37℃、5％(v/v)co2条件下培养14～16h，观察并记录结果。
[0099]
3.2.5判定标准
[0100]
根据药敏纸片周围抑菌圈的大小判定其抗菌程度，判定标准：不敏感(小于或等于6mm，
‑
)，低度敏感(小于或等于7mm， )，中度敏感(大于7mm， )，高敏感(大于或等于15mm， )。
[0101]
3.3实验结果
[0102]
不同浓度的香柏洗液体以及部分市售外用治疗宠物真菌性皮肤病药物的外抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的药效结果如表3和表4所示。
[0103]
表3 不同浓度的香柏洗液体外抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌药效
[0104][0105][0106]
表4 市售外用治疗宠物真菌性皮肤病药物的体外抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌药效
[0107][0108]
由表3结果可知，确定君药占比46％后，配制其处方不同浓度的的香柏洗液，发现伴随洗液浓度的提高，可提高对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌的抗菌效果，当药液达到0.4g(生药)/ml以上后，抑菌增加不显著，最佳浓度范围确定为0.4g(生药)/ml，考虑成本，以0.4g(生药)/ml适宜。
[0109]
表4的结果显示，上述市售外用治疗宠物皮肤感染药物中，中药制剂狼毒菌一净中药乳膏和复方土槿皮酊对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌有中、低程度抑制作用。西药制剂复方伊曲康唑软膏、盐酸特比萘芬喷剂具有强的抑菌作用。本发明有优于上市中药制剂狼毒菌一净中药乳膏和复方土槿皮酊的抗犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌效果。
[0110]
实施例4香柏洗液对犬真菌性皮肤病的实验性临床试验研究
[0111]
4.1处方组成
[0112]
本实施例所述香柏洗液的处方原料组成及配比同实施例3。
[0113]
4.2实验材料
[0114]
本实施例所用到的试验材料同实施例1。
[0115]
4.3实验动物
[0116]
中华田园犬，体重3～7kg，年龄2～3岁，购于成都爱宝园犬业有限公司，试验前半
年内没有使用抗真菌药。所有动物均单笼喂养，饲料为常规狗粮。
[0117]
4.4.实验方法
[0118]
4.4.1供试液的配制
[0119]
46％君药占比的香柏洗液(0.4g/ml)的制备：称取黄柏30g(主药)、黄藤10g、苦参10、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至1倍量(1g生药/ml)；初漉液与续漉浓缩液合并，加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度，滤过，即得。
[0120]
46％君药占比的香柏洗液(0.2g/ml)的制备：称取黄柏30g(主药)、黄藤10g、苦参10、苍术7.5g、丁香2.5g、花椒2.5g，粉碎成中粉，以少量50％(w/w)的乙醇溶液润湿，密闭30分钟，装入渗漉装置，用少量50％(w/w)的乙醇溶液浸泡24小时，用药材质量5倍量的50％(w/w)的乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为6ml/(min
·
kg)。收集初漉液1倍量(1g生药/ml)，续漉液浓缩至1倍量(1g生药/ml)；初漉液与续漉浓缩液合并，加入明矾2.5g，以20％(w/w)的乙醇溶液调整至规定浓度，滤过，即得。
[0121]
4.4.2培养基的配制
[0122]
沙氏葡萄糖琼脂培养基(sda)，主要组成成分为葡萄糖，蛋白腺，琼脂，加蒸馏水。制备方法是：琼脂加蒸馏水后加热溶解，再边混匀边加入其它成分，待冷却后分装到试管中，加棉塞并包扎标记，于高压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌20min。
[0123]
皮肤癣菌鉴别琼脂培养基(dtm)(购自上海远慕生物科技有限公司)，主要组成成分为葡萄糖，蛋白胨，琼脂，蒸馏水，酚红，盐酸，再加青霉素和链霉素。将培养基的各成分称量后加入纯水并定容，115℃灭菌10min备用。冷却到40℃左右时，超净工作台中把青霉素和链霉素加入培养基。
[0124]
4.4.3菌种的活化
[0125]
在超净工作台中，把保存的犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的菌丝用接种环挑取适量接种于sda表面，在27℃培养箱中培养7～14d，转接三次确保其纯度和活性。
[0126]
4.4.4菌悬液的制备
[0127]
分别挑选出三株菌的适量菌落后溶于无菌生理盐水中，用移液枪吹打菌落分散成菌悬液，rmpi
‑
1640培养液调节浓度，血细胞计数板计数。因为各地环境条件和动物自身抵抗力的差异，参考他人真菌性皮肤病模型建立的浓度范围，每株菌进行造模。其中犬小孢子菌用1
×
107cfu/ml；石膏样孢子菌用1
×
106cfu/ml；须癣毛癣菌用1
×
107cfu/ml。
[0128]
4.4.5建立犬皮肤真菌感染模型
[0129]
用记号笔在受试动物背部左右两侧各选5cm
×
5cm的正方形区域，剃毛刀刮毛，再用锋利的刀片垂直轻刮该区域使点状出血。75％酒精消毒后，把以上每株菌的菌悬液100μl分别接种至每只犬背部的区域。接种后，每天仔细观察真菌的感染症状，筛选各个菌感染动物的最佳造模浓度和造模时间。
[0130]
4.4.6动物模型建立的判断
[0131]
皮肤真菌感染，具有显著的症状，该疾病模型建立成功的判定依据主要通过临床
症状观察和真菌学检查结果，真菌学检查依靠显微镜镜检和真菌培养。
[0132]
4.4.7临床症状观察
[0133]
真菌感染后，局部皮肤出现红斑、脱屑、病灶周围毛发断裂、表面颜色呈白色，严重时会发生糜烂和结痂。动物有不同程度的瘙痒，有时能观察到明显“蹭墙”行为。wood灯预热20min，在暗处照射感染部位，部分小孢子菌因产生大量色氨酸在紫外光的照射下，显苹果绿的荧光，但值得注意的是，一些药物或护发素同样在紫外灯的照射下显荧光。
[0134]
4.4.8真菌学评价
[0135]
(1)显微镜观察检测
[0136]
手术刀片刮取感染病灶处断毛发和鳞屑等皮损，置于载玻片上，滴加10％(w/v)koh溶液透明软化，盖上盖玻片，在显微镜下检查，若造模阳性便能看见游动的孢子和菌丝。
[0137]
(2)真菌培养检测
[0138]
收集皮损，无菌接种于培养基(sda和dtm)上进行培养。每天观察菌落生长变化情况，确定了菌落形态及变化规律后，挑取少量菌丝，用乳酸酚棉蓝涂片染色，显微镜观察孢子及菌丝的形态，与标准目的菌株进行对比。每种皮肤癣菌菌落、孢子、菌丝等各不相同。参照依据如下：
[0139]
犬小孢子菌：在sda培养基上27℃培养，7d左右菌落直径达1cm以上，菌落扁平，中心表面有少量气生菌丝，表面有白色或淡黄色微细粉末覆盖，周围的气生菌丝呈白色羊毛状。随着菌落的扩大生长，表面会出现少数同心圆形的环状沟纹，无或有条放射状沟纹。在dtm培养基上培养，能使培养基变红。菌丝用乳酸酚棉蓝涂片染色，显微镜下可见梭形厚壁的多隔大分生孢子，近透明，呈纺锤形，表面粗糙，有麻点或细刺。小分生孢子呈棍棒形，沿菌丝体侧壁产生。
[0140]
石膏样小孢子菌：在sda培养基上生长迅速，室温下3～5d即可见菌落。通常菌落中心稍隆起，有一小环，周围平坦，表面覆盖气生菌丝呈白色绒毛状，能产色素，培养基反面呈红褐色至橘黄色。在dtm培养基上培养，能使培养基变红。菌丝用乳酸酚棉蓝涂片染色后，显微镜下可见梭形，壁薄的大分生孢子，4～6个分隔，呈纺锤形，两端稍细，壁薄。
[0141]
须癣毛癣菌：在sda培养基上比犬小孢子菌生长更快，27℃培养3～5d，即可见菌落生长，菌落中央为白色粉末状或颗粒状，边缘黄色且有少量放射状菌丝，反面为棕黄色或浅黄色。能使dtm培养基变红。菌丝用乳酸酚棉蓝涂片染色后，在显微镜下可见大量簇生的小分生孢子和螺旋菌丝。大分生孢子极少，为纺锤形，侧顶生或顶生，壁薄，有5～10个分隔。
[0142]
4.4.9病例纳入标准的建立
[0143]
制定了犬皮肤真菌感染症状的评分标准，对确诊为皮肤癣菌感染的病例，随机抽查10只，主要针对皮损局部出现红斑、脱屑、糜烂、结痂的程度进行评估，发现以轻、中度症状犬数量最多(均达到85％以上)，整体出现正态分布。以此为依据，制定本试验的病例纳入标准(表5)。
[0144]
表5 犬真菌性皮肤病评分标准
[0145][0146]
4.4.10试验动物分组及给药
[0147]
从人工感染造模的确诊病例中，依据病例纳入标准，犬小孢子菌、石膏样孢子菌和须癣毛癣菌模型分别取40只(共120只)，随机分为4组，每组10只(经统计各组试验犬临床症状得分差异不显著)，分别为模型对照组、香柏洗液低、高剂量组(浓度为0.2g/ml、0.4g/ml)、阳性对照组(复方土槿皮酊)，同时设置空白对照组(10只)，共130只。在感染10d后，用生理盐水和肥皂将患处皮肤洗净后用纱布将水吸干，再涂抹相应药物(每1
×
1cm2大小感染的部位用药1ml)。香柏洗液低、高剂量组组每天涂抹2次，连用7d；阳性对照组涂抹复方土槿皮酊，每天2次，连用7d；空白对照组和模型对照组不给药。
[0148]
4.4.11临床症状评分观察
[0149]
在给药前(0d)，给药后(7d)，检查每只犬皮肤感染部位皮肤破损、红斑、毛发缺损和瘙痒等程度，观察用药前后犬临床症状的变化情况。根据表5的评分标准，从炎症变化、鳞屑和毛发缺损三个方面对每只犬进行评分。
[0150]
4.4.12皮肤致病菌分离转阴率观察
[0151]
在给药7d后，把实验犬背部的每个正方形感染部位分为四个象限(每只犬总共分为8个区域)，从每个象限中挑取毛发，结痂和鳞屑等组织，取少量置于载玻片，滴加10％(w/v)koh溶液进行软化，盖上盖玻片，置于显微镜下观察，观察是否有游动孢子和菌丝。另取少量皮屑组织在超净工作台中无菌接入到含抗生素的sda培养基中进行培养，培养7d后，观察菌落的形状和颜色，与标准菌菌落进行对比。挑取菌丝染色后，观察分生孢子和菌丝形态进行鉴定。若显微镜镜检和真菌培养均为阴性，表示真菌学治愈，其中之一为阳性，表示真菌学未治愈。真菌分离转阴是指真菌镜检和培养均为阴性。
[0152]
4.4.13药物对真菌病临床疗效观察
[0153]
给药结束后，将动物的临床药效试验结果分为“治愈、显效、有效、无效”四个等级。
[0154]
①
治愈：皮肤真菌分离转阴率≥95％，同时炎性分泌物消失，红疹，皮屑、浓症和瘙痒症状消失。
[0155]
②
显效：皮肤真菌分离转阴率≥80％，同时炎性分泌物明显消失，红疹，皮屑、浓症和瘙痒症状明显消失。
[0156]
③
有效：皮肤真菌分离转阴率≥60％，同时炎性分泌物有所减少，红疹，皮屑、浓症等有所减少，瘙痒症状有所减轻。
[0157]
④
无效：皮肤真菌分离转阴率<60％，同时炎性分泌物依然存在，红疹，皮屑、浓症等未见减少。
[0158]
总有效率＝治愈率 显效率 有效率。
[0159]
4.5数据分析
[0160]
所有数据使用spss 20.0软件进行分析，治愈率和有效率等用卡方检验。
[0161]
4.6实验结果
[0162]
4.6.1临床症状评分结果
[0163]
表6 临床症状评分结果(mean
±
sd，n＝10)
[0164][0165]
注：“*”表示与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
[0166]
表7 各实验组皮肤真菌分离转阴率(n＝10)
[0167]
组别犬小孢子菌/％石膏样小孢子菌/％须癣毛癣菌/％模型对照组2.53.43.0低剂量组(0.2g/ml)60.461.670.9高剂量组(0.4g/ml)85.488.692.5阳性对照组55.660.364.7
[0168]
观察发现高剂量组(0.4g/ml)犬红斑和鳞屑减少，3只犬红斑和鳞屑消失，有2只毛发缺损完全恢复，其余动物毛发缺损均减少。低剂量组(0.2g/ml)犬炎症均减轻，鳞屑减少，有新毛发生长。阳性对照组犬感染处红斑和丘疱疹轻微减少，有中等程度或大量鳞屑，毛发缺损恢复不明显。模型对照组犬感染处，炎症加重，鳞屑、结痂和丘疱疹较多，毛发缺损严重。
[0169]
犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌感染犬评分结果如表6所示，在感染10d即给药0d时，各造模组得分无显著性差异(p>0.05)，各个组的动物造模处可见红斑和丘疱疹，中等及大量鳞屑，毛发缺损严重。治疗7天后，与模型组相比，给药组的临床得分明显减少(p<0.05，p<0.01)其中，40％香柏洗液的药效最为明显。
[0170]
在给药7d后，犬的致病真菌分离转阴率用显微镜镜检和真菌培养方法判断，结果如表7所示。在给药7d后，所有给药组的犬致病菌分离转阴率明显高于模型组，表明香柏洗液对三种真菌均有良好的杀灭作用。在三类真菌感染模型中，香柏洗液的治疗效果均呈剂量依赖性，给药浓度越高，真菌转阴率越高。其中，高剂量组(0.4g/ml)在给药结束后，分离转阴率均达到或高于85％。
[0171]
4.6.2临床疗效判断
[0172]
表8 香柏洗液对犬小孢子菌临床疗效须给药7d的临床疗效观察(n＝10)
[0173][0174]
表9 香柏洗液对石膏样小孢子菌临床疗效须给药7d的临床疗效观察(n＝10)
[0175][0176]
表10 香柏洗液对须癣毛癣菌临床疗效须给药7d的临床疗效观察(n＝10)
[0177][0178][0179]
给药7d后，真菌学检查结果如表8、表9和表10所示。模型对照组无效率均为100％，低剂量组(0.2g/ml)总有效率为30％～60％，高剂量组(0.4g/ml)总有效率为100％，其中对须癣毛癣菌的有效率最高；阳性对照组总有效率为40％～60％，说明香柏洗液有优于复方土槿皮酊的疗效趋势。
[0180]
实施例5抗孢子菌和毛廯菌香柏洗液治疗犬真菌性皮肤病的临床疗效
[0181]
5.1一般资料
[0182]
将临床上确诊为真菌性皮肤病的90只病犬，为多种宠物犬(包括边牧、泰迪、斗牛等)(年龄1岁～5岁)，剃毛后作为试验动物，将患病犬分成三组，每组30只(安慰剂组用的是蒸馏水)，病犬表现剧痒，胸背部、四肢大面积脱毛，体表散布红斑、丘疹，皮肤潮红、充血，脱毛区和周围毛根被覆油性厚痂，随着病程延长，患部黑色素沉着，镜检患部皮屑和毛根可见大量竹叶状真菌孢子，毛根周围由大量真菌孢子包裹呈管套状。毛癣菌感染病犬体表出现拇指盖大小脱毛区，似梅花鹿体表斑纹。如遇螨虫混合感染可检出寄生性螨虫。
[0183]
其他试验材料实施例4。
[0184]
5.2治疗方法
[0185]
根据实验性临床试验结果，0.4g/ml香柏洗液组在病犬的患处涂抹香柏洗液，阳性对照组在病犬的患处涂抹复方伊曲康唑软膏(霉菌净)。用药前，用生理盐水和肥皂将患处皮肤洗净，后用纱布将水吸干试验开始后两组不再使用其他药物。用棉签将香柏洗液(每1
×
1cm2大小感染的部位用药1ml)或复方伊曲康唑软膏均匀涂抹于患处，每日3次，7天为1个
疗程。
[0186]
5.3不良反应观察
[0187]
在整个给药期间，仔细观察并记录每只犬的精神状况、食欲、体温和呼吸变化，若其中之一有异常即属于不良反应。治疗前和试验结束时分别对患犬进行肝肾功能检测。如果有犬死亡，要对死亡的犬进行剖检，并对脏器及感染处皮肤做he切片染色观察。
[0188]
5.4临床症状评分观察
[0189]
在给药前，给药7d后，检查每只犬皮肤感染部位皮肤破损、红斑、毛发缺损和瘙痒等程度，观察用药前后犬临床症状的变化情况。根据表11的评分标准，从炎症变化、鳞屑和毛发缺损三个方面对每只犬进行评分。
[0190]
表11 犬真菌性皮肤病评分标准
[0191][0192][0193]
4.6临床疗效评价
[0194]
在给药7d后，取每只动物感染处的八个不同部位皮屑或毛发进行致病菌的分离鉴定。鉴定方法同第三章。参考《兽药研究指导原则汇编》，临床药效试验结果分为“治愈、有效、无效”三个等级。
[0195]
①
治愈：皮肤真菌分离转阴率≥80％，同时炎性分泌物消失，红疹，皮屑、浓症和瘙痒症状消失。
[0196]
②
有效：皮肤真菌分离转阴率≥60％，同时炎性分泌物有所减少，红疹，皮屑、浓症等有所减少，瘙痒症状有所减轻。
[0197]
④
无效：皮肤真菌分离转阴率<60％，同时炎性分泌物依然存在，红疹，皮屑、浓症等未见减少。
[0198]
总有效率＝治愈率 有效率。
[0199]
4.7治疗结果
[0200]
两种不同药剂在使用过程中均未见不良反应，随着药物使用时间的延长，病犬表现越来越安静，痒感减轻；两种药物相比，香柏洗液在改善体表异味上有明显的优势，使用一次后病犬的体表异味会明显减轻；在试验后期，两种不同药剂对应的病犬基本恢复至正常，潮红的皮肤渐变为粉红色，患部开始有新毛长出。
[0201]
患犬感染部位评分结果如表12所示，在给药前，两个组的感染症状得分差异不显著。在给药7d后，症状恢复明显，两个组得分相比给药之前，均显著性减少(p<0.01)。治疗组各病犬炎症均减轻，鳞屑都显著减少，有新毛发生长。
[0202]
表12 香柏洗液临床得分(mean
±
sd，n＝30)
[0203]
分组给药0天给药7天
安慰剂组16.34
±
1.7817.54
±
2.69香柏洗液组7.65
±
2.345.03
±
2.57**阳性对照组7.22
±
1.354.94
±
1.73**
[0204]
表中：*与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
[0205]
临床疗效评价结果见表13，伊曲康唑对犬真菌性皮肤病总有效率达86.7％(26/30)，治愈率为83.3％(25/30)，香柏洗液对真菌性皮肤病总有效率达90.0％(84/93)，治愈率为80.0％(51/93)，两者就总有效率和治愈率而言，差异不显著。
[0206]
伊曲康唑组在试验结束时，有少数出现了不适反应(呕吐、食欲下降)占3.3％(1/30)，而香柏洗液组没有出现不适症状，表明伊曲康唑对试验动物有一定的不良反应，而香柏洗液不良反应小。香柏洗液在用药3天后，犬真菌性皮肤病症状大多有缓解。结果表明，本发明的治疗宠物真菌性的香柏洗液对治疗犬真菌性皮肤病具有显著的临床疗效。
[0207]
表13 香柏洗液对治疗宠物真菌性皮肤病的效果(n＝30)
[0208]
组别治愈数有效数无效数总有效率安慰剂组00300％伊曲康唑组251486.70％香柏洗液组243390.00％
[0209]
注：总有效率＝(显效例数 有效例数)/总例数
×
l00％。
[0210]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。