MSI2-Numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法与流程

技术特征：
1.msi2-numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，其特征在于，包括如下步骤：(一)肿瘤组织切除阶段检测：步骤1，肿瘤组织预处理：将肿瘤组织用depc水冲洗，置于冻存管中-80℃冻存待测；取30～50mg肿瘤组织置1.5ml离心管中，加入1.5ml trizol充分匀浆，室温静置10min；每管加入300μl氯仿，剧烈混匀30sec，静置20min，4℃，10000rpm离心15min；轻轻吸取上层液体400μl至另一新离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，4℃10000rpm离心15min；弃上清，加入2ml 75％酒精洗涤沉淀物，4℃10000rpm离心15min；弃掉上清，室温下晾干10min，每管加入10μl无rna酶水，在65℃溶解10～15min；步骤2，测定肿瘤组织musashi2：将肿瘤组织进行预处理后，置于pcr反应体系，在pcr反应体系中加入荧光染料sypro和热启动htaq酶，所述的荧光染料sypro能特异性地结合musashi2而发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步；所述的pcr反应体系还包括pcr缓冲液、荧光标记cy5、datp溶液、dgtp溶液、dctp溶液、pcr保护剂、钙离子和无菌双蒸水；所述pcr反应体系还包括8μmol/l正向引物，核苷酸序列为：aggttgagccatgcagtcat；所述pcr反应体系还包括8μmol/l反向引物，核苷酸序列为：aggttgagccatgcagtagc；所述pcr反应体系中musashi2模板量为：以20μl反应体系计，质粒5～10ng，钙离子浓度为3～8mmol/l；定量pcr反应条件为：90℃4min，95℃15s，50℃35s，40个循环。步骤3，测定肿瘤组织numb：将肿瘤组织进行预处理后，置于pcr反应体系，在pcr反应体系中加入荧光染料ruby和热启动htaq酶，所述的荧光染料ruby能特异性地结合numb而发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步；所述的pcr反应体系还包括pcr缓冲液、荧光标记cy3、dutp溶液、dgtp溶液、dctp溶液、pcr保护剂、钙离子和无菌双蒸水；所述pcr反应体系还包括10μmol/l正向引物，核苷酸序列为：ggcacccagcacaatgaaga；所述pcr反应体系还包括10μmol/l反向引物，核苷酸序列为：actcctgcttgctgatccac；所述pcr反应体系中numb模板量为：以20μl反应体系计，质粒6～12ng，钙离子浓度为3～8mmol/l；定量pcr反应条件为：94℃3min，94℃20s，50℃30s，40个循环。步骤4，测定血液代谢分子：测定患者血液中分子量为100～3000道尔顿的代谢分子的数量，计算信噪比高于最佳阈值的分子数与所检测代谢分子数的比值：血液与纳米硅进行混合，将混合后的血液在质谱的靶板上制样，用质谱仪获得数据(精度为0.001-0.1道尔顿)，获得的数据为100道尔顿以上的代谢分子的相对数量值m，然后选择100～3000道尔顿，且信噪比大于2.10的所有代谢分子的数量值n；步骤5，综合判定：根据肿瘤组织中的musashi2含量高于正常值的程度，以及肿瘤组织中的numb含量低于
正常值的程度，并结合血浆中所有检出的分子量为100～3000道尔顿，且信噪比大于2.10的代谢分子的数量之间的比例高于正常值的程度，判定肿瘤恶化程度；(二)预后阶段检测：步骤1，测定血液musashi2：将术后患者的血液预处理后，置于pcr反应体系，在pcr反应体系中加入荧光染料sypro和热启动htaq酶，所述的荧光染料sypro能特异性地结合musashi2而发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步；所述的pcr反应体系还包括pcr缓冲液、荧光标记cy5、datp溶液、dgtp溶液、dctp溶液、pcr保护剂、钙离子和无菌双蒸水；所述pcr反应体系还包括9μmol/l正向引物，核苷酸序列为：aggttgagccatgcagtcat；所述pcr反应体系还包括9μmol/l反向引物，核苷酸序列为：aggttgagccatgcagtagc；所述pcr反应体系中musashi2模板量为：以20μl反应体系计，质粒5～10ng，钙离子浓度为6～8mmol/l；定量pcr反应条件为：90℃4min，95℃15s，50℃35s，40个循环。步骤2，测定血液numb：将术后患者的血液预处理后，置于pcr反应体系，在pcr反应体系中加入荧光染料ruby和热启动htaq酶，所述的荧光染料ruby能特异性地结合numb而发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与pcr产物的增加完全同步；所述的pcr反应体系还包括pcr缓冲液、荧光标记cy3、dutp溶液、dgtp溶液、dctp溶液、pcr保护剂、钙离子和无菌双蒸水；所述pcr反应体系还包括12μmol/l正向引物，核苷酸序列为：ggcacccagcacaatgaaga；所述pcr反应体系还包括12μmol/l反向引物，核苷酸序列为：actcctgcttgctgatccac；所述pcr反应体系中numb模板量为：以20μl反应体系计，质粒6～12ng，钙离子浓度为5～10mmol/l；定量pcr反应条件为：94℃3min，94℃20s，50℃30s，40个循环。步骤3，测定血液代谢分子：测定患者血液中分子量为100～3000道尔顿的代谢分子的数量，计算信噪比高于最佳阈值的分子数与所检测代谢分子数的比值：血液与纳米硅进行混合，将混合后的血液在质谱的靶板上制样，用质谱仪获得数据(精度为0.001-0.1道尔顿)，获得的数据为100道尔顿以上的代谢分子的相对数量值m，然后选择100～3000道尔顿，且信噪比大于2.10的所有代谢分子的数量值n；步骤4，预后判定：预后阶段进行多次血液检测，每一次检测结果与上一次检测结果进行对比；测定术后患者的血液中musashi2含量高于上一次测定的血液中musashi2含量，且测定术后患者的血液中numb的含量低于上一次测定的血液中numb含量，以及且测定术后患者的血液中所有检出的分子量为100～3000道尔顿，且信噪比大于2.10的代谢分子的数量之间的比例高于上一次测定值，则表明该患者的病情有所发展或者进一步恶化；反之则表明该患者的病情好转。2.根据权利要求1所述的msi2-numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，其特征在
于，(一)肿瘤组织切除阶段检测，步骤2中，所述的荧光染料sypro的工作浓度为0.3
×
～1
×
，所述热启动htaq酶的工作浓度为0.03～0.1u/μl；所述的datp溶液的工作浓度为50～80μmol/l；所述dgtp溶液的工作浓度为50～90μmol/l；所述dctp溶液的工作浓度为60～80μmol/l；所述荧光标记cy5的工作浓度为0.2
×
～0.8
×
。3.根据权利要求1所述的msi2-numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，其特征在于，(一)肿瘤组织切除阶段检测，步骤3中，所述的荧光染料ruby的工作浓度为0.5
×
～1
×
，所述热启动htaq酶的工作浓度为0.04～0.1u/μl；所述的dutp溶液的工作浓度为60～80μmol/l；所述dgtp溶液的工作浓度为40～70μmol/l；所述dctp溶液的工作浓度为50～70μmol/l；所述荧光标记cy3的工作浓度为0.4
×
～0.7
×
。4.根据权利要求1所述的msi2-numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，其特征在于，(二)预后阶段检测，步骤1中，所述的荧光染料sypro的工作浓度为0.35
×
～1
×
，所述热启动htaq酶的工作浓度为0.04～0.1u/μl；所述的datp溶液的工作浓度为90～95μmol/l；所述dgtp溶液的工作浓度为100～120μmol/l；所述dctp溶液的工作浓度为100～120μmol/l；所述荧光标记cy5的工作浓度为0.6
×
～0.8
×
。5.根据权利要求1所述的msi2-numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，其特征在于，(二)预后阶段检测，步骤2中，所述的荧光染料ruby的工作浓度为0.8
×
～1
×
，所述热启动htaq酶的工作浓度为0.06～0.1u/μl；所述的dutp溶液的工作浓度为100～120μmol/l；所述dgtp溶液的工作浓度为80～100μmol/l；所述dctp溶液的工作浓度为80～100μmol/l；所述荧光标记cy3的工作浓度为0.5
×
～0.8
×
。6.根据权利要求1所述的msi2-numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，其特征在于，所述的pcr保护剂为明胶、tween20或二硫苏糖醇。7.根据权利要求1所述的msi2-numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，其特征在于，所述血液与纳米硅混合质量比例为1:0.6。8.根据权利要求1所述的msi2-numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，其特征在于，所述信噪比高于最佳阈值的分子数和所选取检测代谢分子数的比值计算采用下组的公式为：得分比值＝信噪比高于最佳阈值的分子数/所检测代谢分子数，即得分比值＝n/m。

技术总结
MSI2-Numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，所属检测技术领域，方法包括肿瘤组织切术阶段检测和血液预后阶段检测。肿瘤组织切术阶段检测包括肿瘤组织细胞预处理、测定肿瘤组织Musashi2、测定肿瘤组织Numb、测定血液代谢分子及判定；血液预后阶段检测包括测定血液Musashi2、测定血液Numb、测定血液代谢分子及预后；本发明提供MSI2-Numb结合代谢分子测定胰腺癌进展的方法，能够通过测定Musashi2和Numb在胰腺癌组织中表达结合血液检测来进行胰腺癌病情进展筛查，能够客观评估肿瘤临床进展、耐药性及不良预后，有助于拟定最佳治疗方案，检测精度比现有检测方法提高20％。检测精度比现有检测方法提高20％。


技术研发人员：盛伟伟 董明 周建平 唐景彤
受保护的技术使用者：中国医科大学附属第一医院
技术研发日：2021.10.26
技术公布日：2022/2/24