包裹荧光染料的免疫脂质体及应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种包裹荧光染料的免疫脂质体及应用，尤其是用于液体食品中棒曲霉素的荧光检测技术。


背景技术：

2.棒曲霉素是一些真菌物种如aspergillus(曲霉菌),penicillium(青霉菌),byssochlamys(丝衣霉菌)等的有毒次生代谢物。代谢产生棒曲霉素的菌种包括a.clavatus,a.giganteus,a.longivesica,p.clavigerum,p.carneum,p.coprobium,p.concentricum,p.dipodomyicola,p.glandicola,p.gladioli,p.griseofulvum,p.expansum,p.marinum,p.sclerotigenum,p.paneum,and p.vulpinum。
3.棒曲霉素能污染多种食品，如水果、蔬菜、谷物和奶酪等，若通过这些食物进入身体则会引发人和动物的多种健康风险。一些毒理学研究表明棒曲霉素能入侵皮肤、肾脏、肝脏、胃肠道和神经系统，对人体的组织和器官造成损伤。在一些动物学研究中，棒曲霉素还具有急性和亚急性毒性、免疫毒性、致畸形、致突变性、致癌性等。
4.目前棒曲霉素的检测方法主要有色谱法，例如薄层色谱法、高效液相色谱法和气相色谱法。色谱法虽然对检测棒曲霉素有高灵敏性和高特异性，却需要复杂的净化步骤、大量的原材料和昂贵的仪器，不适合实际场合的现场实时检测，不符合食品工业的需求。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术不足，开发一种对棒曲霉素的快速、灵敏检测方法。本发明所提供的基于免疫脂质体的棒曲霉素荧光检测方法，是使用兔抗棒曲霉素bsa抗体研制了棒曲霉素免疫脂质体，并应用于棒曲霉素的检测。
6.本发明的技术方案概述如下：
7.a.制备荧光染料封装的脂质体；
8.b.制备抗棒曲霉-bsa igg包封的免疫脂质体；
9.c.基于免疫脂质体的荧光法检测棒曲霉素；
10.d.基于免疫脂质体的棒曲霉素荧光检测方法的特异性检验；
11.e.hplc法检测棒曲霉素。
12.步骤a中制备荧光染料封装的脂质体的步骤是：
13.将dppe和sata溶解在氯仿溶液中，超声处理形成dppe-sata。将dppe-sata、dppc,dppg和胆固醇溶解在氯仿和甲醇的混合溶液中，超声以形成脂质，加入密封剂，超声。蒸发去除有机溶剂，留下深紫色的凝胶状悬浮液。向脂质悬浮液中再加入密封剂，超声，之后重复涡流，蒸发，超声处理直到混合物变成均匀的悬浮液。将悬浮液通过膜过滤器挤出，获得均匀大小的脂质体。将粒径均匀包封srb的脂质体在hepes缓冲液中用透析膜透析过夜。
14.所述的氯仿溶液含0.7％三乙胺。
15.所述的密封剂为分散在0.02m hepes缓冲液中的srb，其中srb的浓度为100mm，密
封剂的ph为7.5。
16.所述的hepes缓冲液的浓度为0.01m，ph为7.5，包含0.2m nacl和0.01％nan3。
17.步骤b中制备免疫脂质体的步骤是：
18.为了制备igg标记的脂质体，将sulfo-kmus加入抗棒曲霉素-bsa igg溶液中振荡反应以制备带有马来酰亚胺基团的衍生化igg。将被衍生化的抗棒曲霉素-bsa igg透析。同时，将盐酸羟胺溶解在hepes溶液中，与脂质体溶液混合，以去除脂质体纳米颗粒上的乙酰硫代乙酸基团。含有巯基的脂质体溶液调节ph到7.0后再与带有马来酰亚胺基团的衍生化igg混合。混合物氮吹后在室温下培养4h，然后在4℃避光条件下培养过夜。将乙基马来酰亚胺添加到反应中，在室温下轻轻摇晃以猝灭未反应的巯基。然后，过滤混合物，在0.02m tbs溶液中透析。
19.所述的sulfo-kmus浓度为2mg/ml，溶解在dmso:甲醇(2:1,v/v)的混合溶剂中。
20.所述的被衍生化的抗棒曲霉素-bsa igg透析的条件是：避光条件下在hepes溶液中透析过夜，其中hepes溶液浓度为0.02m，溶液ph为7.0，含有0.15m nacl和0.01％nan3。
21.所述的hepes溶液浓度为0.1m，ph为7.5，含25mm edta。
22.所述的乙基马来酰亚胺浓度为100mm，溶解在0.02m tbs溶液中，tbs溶液ph为7.0。
23.所述的混合物的过滤条件为：sepharose cl-4b柱，用0.02m tbs平衡。
24.步骤c中基于免疫脂质体的荧光法检测棒曲霉素的步骤是：
25.用tbs缓冲液稀释制备的免疫脂质体原液，以备将来使用。首先，将抗棒曲霉素-bsa igg滴加到96孔微孔板上，孵育2h。然后，用磷酸盐缓冲液(pbst)洗涤96孔微孔板。将稀释后的棒曲霉素溶液加入到洗涤后的96孔微孔板中，孵育1h。将稀释后的免疫脂质体溶液加入到用pbst洗涤后的96孔微孔板，孵育1h后，用pbst洗涤滴定板三次。最后，将og溶液加入到96孔微孔板以溶解免疫脂质体释放出荧光剂srb。测量荧光强度信号。分析棒曲霉素的系列稀释液以确定检测限。
26.所述的tbs缓冲溶液浓度为0.01m，含0.04m蔗糖，对制备的免疫脂质体原液的稀释比例为1:10。
27.所述的磷酸盐缓冲液(pbst)浓度为0.01m，含0.05％tween 20。
28.所述的孵育条件均为4℃。
29.所述的荧光检测条件为：激发波长为550nm，发射波长为585nm；仪器型号为infinite m200,tecan,mannedorf,switzerland。
30.通过采用上述技术方案，在激发波长550nm，发射波长585nm的条件下测定荧光强度信号，即可以实现对棒曲霉素的快速检测。
31.本发明的有益效果如下：
32.与现有的hplc或hplc相关方法相比，这种基于免疫脂质体的荧光检测法是非常迅速的，能在3h之内检测苹果汁样品中的棒曲霉素，实现了对棒曲霉素的快速检测。此外，基于免疫脂质体的荧光检测方法简便易行，不需要复杂的前处理步骤，无需有机溶剂提取和洗涤过程，对环境友好。这种基于免疫脂质体的荧光检测方法快速、简单、方便，检测限为3.15μg/l。
附图说明
33.图1：棒曲霉素的荧光检测标准曲线，线性范围为0-150μg/l；标准曲线方程为y＝4.3102x 55.432，r2＝0.9641；
34.图2：基于免疫脂质体的对棒曲霉素、牛血清白蛋白、赭曲霉毒素a的荧光检测图谱。
具体实施方式
35.以下结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
36.实施例1：制备荧光染料封装的脂质体
37.dppe、dppc、dppg、胆固醇和srb为原料制备荧光染料封装的脂质体。简要地说，将dppe(7.2μmol)和sata(14.3μmol)溶解在1ml含0.7％三乙胺的氯仿溶液中，在氮气冲洗下超声处理1分钟形成dppe-sata。dppc(40.3μmol),dppg(4.2μmol)和胆固醇(40.9μmol)溶解在3ml氯仿和0.5ml甲醇的混合溶液中，在45℃和氮气的吹扫下，超声1min以形成脂质，然后立即向脂质混合物中加入2ml密封剂(100mm srb in 0.02m hepes buffer；ph7.5)，在45℃和氮气的吹扫下超声3min。之后，通过在45℃下蒸发去除有机溶剂，留下深紫色的凝胶状悬浮液。向脂质悬浮液中再加入2ml密封剂，进行1min的超声处理，之后重复涡流，蒸发，超声处理直到混合物变成均匀的悬浮液。通过将悬浮液依次通过0.8μm和0.4μm膜过滤器挤出，获得均匀大小的脂质体。将粒径均匀包封srb的脂质体在包含0.2m nacl和0.01％nan3(ph7.5)的0.01m hepes缓冲液中用透析膜透析过夜。
38.实施例2：制备抗棒曲霉-bsa igg包封的免疫脂质体
39.为了制备igg标记的脂质体，将溶解在dmso:甲醇(2:1,v/v)的混合溶剂中的sulfo-kmus(2mg/ml)加入到1ml的抗棒曲霉素-bsa igg溶液中，在室温下以70rpm的转速反应3h以制备带有马来酰亚胺基团的衍生化igg。被衍生化的抗棒曲霉素-bsa igg在4℃避光条件下，用透析膜在含有0.15m nacl和0.01％nan3(ph 7.0)的0.02m hepes溶液中透析过夜。同时，将30μl0.5m盐酸羟胺溶解在含有25mm edta(ph7.5)的0.1m hepes溶液中，与300μl脂质体溶液混合，以去除脂质体纳米颗粒上的乙酰硫代乙酸基团。用氮气吹扫1min后，脂质体溶液在室温下反应2h。含有巯基的脂质体溶液用0.5m hepes溶液调节ph到7.0后再与带有马来酰亚胺基团的衍生化igg混合。混合物用氮气吹扫1min并在室温下培养4h，然后在4℃避光条件下培养过夜。将溶解在0.02m tbs(ph 7.0)溶液中浓度为100mm的乙基马来酰亚胺添加到反应中，通过在室温下轻轻摇晃(70rpm)30min以猝灭未反应的巯基。然后，用0.02m tbs平衡的sepharose cl-4b柱过滤混合物。将收集的免疫脂质体溶液用透析膜在0.02m tbs溶液中透析。
40.脂质体和抗棒曲霉-bsa igg包封的免疫脂质体的特征如表1所示。
41.表1.脂质体和免疫脂质体的特征
42.[0043][0044]
所有实验重复三次，数据代表平均标准偏差。
[0045]
由表1中数据可知，脂质体粒径增大，表明用抗棒曲霉-bsa igg包被在脂质体上成功制备了免疫脂质体。假设srb的起始浓度为100mm，所开发的脂质体和免疫脂质体的内部体积均为3.03
×
10-12μl，浓度为3.03
×
10-13μmol的srb被封装在内部。如表1所示，制备的脂质体和免疫脂质体的多分散指数分别为0.19
±
0.00和0.17
±
0.01，低多分散指数表明制备的脂质体和免疫脂质体具有良好的稳定性。纳米颗粒的zeta电位反映了胶体系统的电位稳定性。当悬浮液中的颗粒具有较大的负或正zeta电位时，颗粒之间会相互排斥，使悬浮液稳定。如表1所示，脂质体和免疫脂质体都有负zeta电位，这表明悬浮液中的颗粒具有聚集在一起的阻力。此实验结果显示制备的脂质体和免疫脂质体稳定、均一。
[0046]
实施例3：基于免疫脂质体的荧光法检测棒曲霉素
[0047]
将100μl抗棒曲霉素-bsa igg(1μg/ml)滴加到96孔微孔板上，在4℃下孵育2h。用200μl含有0.05％tween 20的0.01m磷酸盐缓冲盐水(pbst)洗涤96孔微孔板。将100μl稀释后的棒曲霉素溶液加入到洗涤后的96孔微孔板中，在4℃下孵育1h。将100μl的稀释后的免疫脂质体溶液加入到用200μl的pbst洗涤后的96孔微孔板。免疫脂质体用96孔微孔板在4℃培养1h后，用200μl的pbst洗涤96孔微孔板三次。最后，将200μl的og溶液加入到96孔微孔板以溶解免疫脂质体释放出荧光剂srb。在激发波长为550nm和发射波长为585nm的条件下测量荧光强度信号。
[0048]
结果如图1所示，当棒曲霉素的浓度由0μg/l增加到150μg/l时，荧光强度急剧增加。荧光强度信号与棒曲霉素浓度有很好的线性关系，r2为0.9641，这表明发明的基于免疫脂质体的棒曲霉素荧光检测方法能给出定量分析结果。然而，当棒曲霉素的浓度高于150μg/l后，荧光强度不再增加，这表明所建立的方法可以检测但不能给出检测棒曲霉素的定量分析结果，因为当棒曲霉素浓度高于150μg/l时没有线性。
[0049]
实施例4：基于免疫脂质体的荧光检测的特异性
[0050]
将溶解在0.01m pbs中的赭曲霉毒素a溶液稀释至浓度为10μg/l、50μg/l和100μg/l。通过发明的基于免疫脂质体的荧光检测法对这些不同浓度的赭曲霉毒素a进行测定。同时，为了确认bsa对所发明的检测方法的交叉反应，苹果汁中不同浓度的bsa也通过发明的基于免疫脂质体的荧光检测法进行测定。
[0051]
用赭曲霉毒素a作为对照毒素检验基于免疫脂质体的棒曲霉素荧光检测方法的特异性。检测结果如图2所示，当赭曲霉毒素a的浓度从0μg/l增加到200μg/l时，荧光信号没有改变，这表明该方法与赭曲霉毒素a无交叉反应。另一方面，bsa是免疫原的一部分，检验了bsa与发明的基于免疫脂质体的荧光检测方法的交叉反应性。如图2所示，发明的基于免疫脂质体的荧光检测法与bsa具有交叉反应性，当bsa存在于食品样品中时，该结果可能限制开发的检测棒曲霉素的方法的应用。
[0052]
实施例5：hplc法对棒曲霉素进行测定
[0053]
采用hplc法对人工污染了10μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l和500μg/l棒曲霉素的苹果汁样品进行分析。首先，用乙酸乙酯将棒曲霉素从人工污染的苹果汁样品中提取出
来，乙酸乙酯馏分用0.5％的碳酸钠处理，并使用布氏漏斗通过无水硫酸钠。滤液真空干燥并溶解在乙酸溶液(ph 4.0)中，然后用0.22μm的注射器过滤器过滤，进行hplc分析，该分析过程在配备紫外线探测器的ultimate 3000(thermo scientific；waltham,ma,usa)中进行。将20μl样品注入c18柱(5μm孔径，4.6mm内径
×
250mm长)(waters；milford,ma,usa)并使用5％乙腈(v/v)以0.5ml/min的恒定流速进行洗脱。在276nm处检测到棒曲霉素，并通过将来自样品的信号与来自已知浓度的棒曲霉素的信号进行比较来量化。
[0054]
表2.比较基于免疫脂质体的荧光检测法和hplc检测人工污染的苹果汁中棒曲霉素的回收率。
[0055][0056]
所有实验重复三次，数据代表平均标准偏差。
[0057]
如表2所示，当棒曲霉素的加标浓度为10μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l和500μg/l时，hplc检测到的棒曲霉素浓度分别为6.19
±
0.31μg/l、35.63
±
0.62μg/l、74.38
±
6.88μg/l、151.88
±
3.12μg/l和481.88
±
1.31μg/l，回收率分别为61.88
±
0.03％、71.25
±
0.01％、74.38
±
0.07％、75.02％，和96.38
±
0.03％。在棒曲霉素的hplc分析中，提取过程中的有机溶剂将显著影响回收率。低回收率表明在提取过程中有棒曲霉素的损耗。当棒曲霉素的加标浓度为10μg/l,50μg/l和100μg/l时，基于免疫脂质体的荧光检测法的回收率分别为73.24
±
0.06％、101.73
±
1.55％和98.74
±
4.88％，表明该方法检测棒曲霉素是灵敏且可靠的。当棒曲霉素的加标浓度为200μg/l和500μg/l时，回收率为69.97
±
0.17％和32.7
±
1.31％，这与该方法在纯溶液中对棒曲霉素的检测结果是一致的，这种方法在棒曲霉素浓度为0μg/l至150μg/l的范围内具有良好的线性关系。然而，在纯溶液和人为污染的苹果汁溶液中，当棒曲霉素的浓度高于200μg/l时，该方法的线性均有所下降。