一种自驱动微流控芯片的制作方法及自驱动微流控芯片与流程

1.本发明属于荧光免疫检验技术领域，特别是一种自驱动微流控芯片的制作方法及自驱动微流控芯片。


背景技术：

2.心肌三项是心血管专科临床上非常常用的三个指标，分别是肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶，这三类指标对于心肌损伤都有不同的特异性和敏感性，并且表现在心肌损伤之后的不同阶段，所以，对心肌损害的严重程度和时间判断有很重要的意义，有利于早期发现心肌损伤，及时进行治疗干预，对后期的治疗、恢复判断有很好的指导意义。肌红蛋白是心肌损伤之后最早出现变化的一个指标，有助于早期发现心肌损害。肌钙蛋白对于心肌梗死的诊断和治疗，有很大的临床指导意义。肌酸激酶同工酶在临床中应用最为广泛，可以作为心脏疾病的常规检查。
3.目前有胶体金和荧光层析两种方法的产品，均是采用双抗体夹心法检测血液样本种的待检物质，然后通过仪器检测，定量分析检测物。现有的产品基本上时采用nc膜作为载体，该载体受环境影响因素较大，若温度和湿度不符合要求，会导致nc膜对样本的检测结果造成非常显著的影响，所以在生产和储存过程中有较高的环境控制要求，同时nc膜批次间差大固定抗体的量不均一，其次，用nc膜制备的心肌三联检测试剂会因为nc膜、样品垫、结合垫这3个因素导致荧光抗体随样本流动释放的问题，进而也会对检测结果造成影响，所以会导致产品重复性cv较大。另外，由于心肌三联检是将心肌三项ckmb、ctni和myo 的3个检测项目联合在同一个检测试剂卡上，存在项目间的相互干扰，检测灵敏度不高，重复性cv较差等问题。为此，本技术人发明了一种自驱动微流控芯片，并于2020年01月17日向国家知识产权局提交了专利申请，该申请已于2020 年4月28日公布，其请公布号为cn111068801a。该自驱动微流控芯片将待检物质所对应的抗体预存在自驱动微流控芯片上，样本能分别通过识别反应和免疫反应形成双抗体夹心。其凭借单一纯净材质形成的微流道优势，通过精准微流体控制，能够保障样品检测结果的可靠性和可控性，有望代替目前临床常用的多种膜材料的免疫层析(lifcs)技术，从而为解决目前poct检测技术所面临的挑战提供新的技术思路。之后，本技术人又于2020年5月22日，向国家知识产权局提交了一种基于自驱动微流控芯片的快速免疫荧光检测方法的专利申请，该申请已于2020年8月21日公布，其请公布号为cn111562380a；该方法公开了使用该自驱动微流控芯片进行快速免疫荧光检测的全过程。
4.该自驱动微流控芯片在制作过程中，需要将标记有荧光物质的一株抗体封存在混合区内，将另一株抗体固定在芯片检测区的微柱上，以在被检样本在芯片内流动过程中，在与混合区内荧光抗体发生识别反应后，携带有荧光标志物的抗体再与检测区微柱上的抗体发生免疫反应，从而形成滞留在微柱上的双抗体夹心标识物，荧光检测仪通过对双抗体夹心标识物的荧光标记检测获得检测结果。因此，将标记有荧光物质的抗体封存在混合区，以在发生识别反应后，荧光抗体能够完全挣脱混合区的束缚，以及在微柱上固定的抗体能够
在发生免疫反应后，能够牢固地附着在微柱上，以便在荧光检测仪检测时，能够获得准确的检测结果，是该自驱动微流控芯片制作技术的关键，而抗体封存和固定后的活性也是该技术的重要组成部分。目前，现有技术中，尚无文献披露能够达到前述目的相关技术。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的就是针对现有自驱动微流控芯片的制备过程中缺少抗体预存储技术的不足，提供一种自驱动微流控芯片的制作方法，该方法通过荧光染料封存法或荧光微球封存法将荧光抗体封存在自驱动微流控芯片的混合区，通过epi固定法或乳胶微球固定法将抗体固定在自驱动微流控芯片反应区，以在被检样本在芯片内流动过程中，在与混合区内荧光抗体发生识别反应后，携带有荧光标志物的抗体再与微柱上的抗体发生免疫反应后，形成双抗体夹心标识物，从而由荧光检测仪通过对双抗体夹心标识物的荧光标记检测获得检测结果。本发明的第二目的还提供一种基于前述方法进行抗体封存和抗体固定的自驱动微流控芯片。
6.为实现第一目的，本发明采用如下技术方案。
7.一种自驱动微流控芯片的制作方法，包括抗体封存和抗体固定的步骤；其中，
8.所述抗体封存，包括荧光染料封存法或荧光微球封存法；
9.所述荧光染料封存法，包括将荧光染料通过化学反应标记在抗体上，并去除多余的荧光染料；然后，用透明的第一抗体封存液将荧光抗体稀释至所需要的浓度；最后，通过仪器定量将荧光抗体封存到自驱动微流控芯片的混合区上晾干；
10.所述荧光微球封存法，包括将抗体与荧光微球通过交联剂edc/nhs进行反应；然后，用透明的第二抗体封存液将抗体荧光微球稀释至所需要的浓度；最后，通过仪器定量将荧光抗体封存到自驱动微流控芯片的混合区上晾干；
11.所述第一抗体封存液由海藻糖、bsa、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇和透明质酸钠通过hepes缓冲液配制而成；
12.所述第二抗体封存液由海藻糖、bsa、聚乙烯吡咯烷酮和山梨醇通过hepes 缓冲液配制而成；
13.所述抗体固定，包括epi固定法或乳胶微球固定法；
14.所述epi固定法，包括先将抗体与分子量为1w-100w的聚乙烯亚胺通过交联剂bs3或dss进行反应；然后，将反应后的混合溶液通过仪器定量将抗体固定到自驱动微流控芯片检测区的微柱上晾干；
15.所述乳胶微球固定法，包括先将抗体与乳胶微球通过交联剂edc/nhs进行反应形成抗体微球结合物；将反应后的抗体微球结合物与透明质的固定液混合；最后，将混合后的溶液通过仪器定量将抗体固定到自驱动微流控芯片检测区的微柱上晾干；
16.所述固定液由羟乙基纤维素、透明质酸钠、海藻酸钠和聚乙烯醇中的任意一种通过hepes缓冲液配制而成；或者分别配制后形成的两种及以上的组合物。
17.采用前述技术方案的本发明，通过荧光染料封存法或荧光微球封存法将荧光抗体封存在自驱动微流控芯片的混合区晾干，通过epi固定法或乳胶微球固定法将抗体固定在自驱动微流控芯片反应区晾干，以在被检样本在芯片内流动过程中，在与混合区内荧光抗体发生识别反应后，携带有荧光标志物的抗体再与微柱上的抗体发生免疫反应后，形成双
抗体夹心标识物，从而由荧光检测仪通过对双抗体夹心标识物的荧光标记检测获得检测结果。其中，抗体固定和封存后的晾干是在满足10万级洁净区的环境要求条件下自然晾干；其环境温度为 25℃，湿度为50～60％的恒湿恒温条件。固定液通过羟乙基纤维素、透明质酸钠、海藻酸钠和聚乙烯醇分别通过hepes缓冲液配制形成多种不同的固定液；这些不同的固定液可单独使用，也可以按任意两种及以上的多种组合使用。
18.优选的，在所述epi固定法中，获得反应后混合溶液的过程包括，
19.s11，将聚乙烯亚胺与抗体按质量比1∶3～1∶6混匀；
20.s12，将bs3加入到聚乙烯亚胺和抗体的混合液中混匀，其中bs3与聚乙烯亚胺的质量比为1∶10～1∶2；
21.s13，在37℃条件下反应2h～3h。
22.以通过合理的配比和反应条件，获得基于芯片上微柱载体结构特性能够将抗体固定在芯片反应区的微柱上，除能够保持抗体活性，还可将抗体牢牢固定在微柱上。
23.优选的，在乳胶微球固定法中，获得与固定液混合后溶液的过程包括，
24.s21，在37℃条件下将乳胶微球用交联剂edc/nhs活化20min～40min，乳胶微球与edc/nhs的质量比为100∶1～1∶1；
25.s22，将活化后的乳胶微球加入到抗体溶液中，并在37℃条件下反应2h-3h，乳胶微球与抗体的质量比为20∶1～5∶1；
26.s23，用冷冻离心机对抗体微球反应后的溶液进行离心分离，并在去除未标记的抗体后，加入hepes缓冲液重悬抗体微球结合物；
27.s24，重复执行s23至少一次；
28.s25，再用冷冻离心机对抗体微球反应后的溶液进行离心分离，并在去除未标记的抗体后，加入所述固定液重悬抗体微球结合物。
29.以通过合理的配比和反应条件，获得活性保持时间长的抗体，以便基于芯片上微柱载体结构特性，借助固定液和乳胶微球特性，将抗体固定在芯片反应区的微柱上。其中，重悬采用超声赋能手段进行，即将超声清洗头的伸入混合液体中使抗体微球形成再次悬浮状态。
30.进一步优选的，在加入所述hepes缓冲液的重悬过程中，以重悬后的质量百分比计，按混合液中抗体微球结合物的固含量为0.5％的比例加入所述hepes缓冲液；在加入所述固定液的重悬过程中，以重悬后的质量百分比计，按混合液中抗体微球结合物的固含量为0.1％的比例加入所述固定液。以通过合理的配比最终形成满足微球抗体固定和保持抗体活性的固定混合物。
31.优选的，在由羟乙基纤维素、透明质酸钠、海藻酸钠和聚乙烯醇分别通过 hepes缓冲液配制的固定液中，按质量百分比计分别，羟乙基纤维素占0.01％～ 1.0％、透明质酸钠占0.01％～0.1％、海藻酸钠占0.01％～0.1％、聚乙烯醇占0.01％～ 1.0％，其余均为hepes缓冲液。以通过合理的配比最终形成满足微球抗体固定和保持抗体活性功能特性的多种固定液。
32.优选的，在荧光染料封存法中，获得稀释后荧光抗体混合液的过程包括，
33.s31，将荧光染料与抗体按质量比1∶1～1∶10混合后，在37℃条件下反应 20min～40min；
34.s32，通过透析或纯化的方式去除多余的荧光染料；
35.s33，用透明的第一抗体封存液稀释到0.2mg/ml的抗体浓度。
36.以通过合理的配比和反应条件，使抗体均匀染上荧光染料，并通过去除多余荧光染料，确保以荧光标标识作为测试结果的准确性，同时借助封存液保持抗体活性，利用荧光染料与封存液结合能力弱的特点，确保被检试样在混合区发生识别反应后，能够挣脱载体的束缚，随样本在芯片的微流道内流动。
37.优选的，在荧光微球封存法中，获得稀释后荧光微球混合液的过程包括，
38.s41，将荧光微球用交联剂edc/nhs在37℃条件下活化20min～40min，荧光微球与edc/nhs的质量比为100∶1～1∶1；
39.s42，将活化后的荧光微球加入到抗体溶液中，并在37℃条件下反应2h～ 3h，荧光微球与抗体的质量比为20∶1～5∶1；
40.s43，用冷冻离心机对抗体荧光微球反应后的溶液离心分离，并在去除未标记的抗体后，加入hepes缓冲液重悬抗体微球结合物；
41.s44，重复执行s43至少一次；
42.s45，再用冷冻离心机对抗体微球反应后的溶液进行离心分离，并在去除未标记的抗体微球后，加入透明的第二抗体封存液重悬抗体微球结合物。
43.以通过合理的配比和反应条件，使抗体与荧光微球充分结合，并通过去除多余荧光微球，确保检测结果的准确性；同时借助封存液保持抗体活性，利用荧光抗体微球与封存液结合能力弱的特点，确保被检试样在混合区发生识别反应后，荧光抗体微球能够挣脱载体的束缚，随样本在芯片的微流道内流动。其中，重悬采用超声赋能手段进行，即将超声清洗头的伸入混合液体中使荧光抗体微球形成再次悬浮状态。
44.进一步优选的，在加入所述hepes缓冲液的重悬过程中，以重悬后的质量百分比计，按混合液中荧光抗体微球结合物的固含量为0.5％的比例加入所述hepes 缓冲液；在加入所述第二抗体封存液的重悬过程中，以重悬后的质量百分比计，按混合液中荧光抗体微球结合物的固含量为0.2％的比例加入所述第二抗体封存液。以通过合理的配比最终形成满足荧光抗体封存和保持抗体活性的封存混合物。
45.优选的，所述第一抗体封存液，按质量百分比计，海藻糖：5％～20％，bsa： 0.1％～1.0％，聚乙烯吡咯烷酮：0.1％～1.0％，山梨醇：0.1％～5.0％，透明质酸钠：0.05％～0.1％，其余为hepes缓冲液；所述第二抗体封存液，按质量百分比计，海藻糖：5％～20％，bsa：0.1％～1.0％，聚乙烯吡咯烷酮占0.1％～1.0％，山梨醇占0.1％～5.0％，其余为hepes缓冲液。以通过合理的配比最终形成满足荧光抗体封存和保持抗体活性的封存液功能特性特性。
46.以通过合理的配比和反应条件，获得基于芯片混合区流道载体结构特性，以及封存液特性，借助封存液能够将抗体封存在芯片混合区内，除保持抗体活性外，还能在被检试样在与标记有荧光物质的抗体发生识别反应后，能够挣脱载体的束缚随样本在微流控流道内流动，以顺利进入反应区内与微柱上的抗体发生免疫反应。
47.为实现第二目的，本发明采用如下技术方案。
48.一种自驱动微流控芯片，通过实现第一目的的方法进行抗体封存和抗体固定。
49.采用前述技术方案进行抗体封存和抗体固定的自驱动微流控芯片，在用于心脏疾
病的常规检查时，被检样本在芯片内流动过程中，在与混合区内荧光抗体发生识别反应后挣脱束缚随样本流动，携带有荧光标志物的抗体再与检测区微柱上的抗体发生免疫反应后，形成双抗体夹心标识物，从而由荧光检测仪通过对双抗体夹心标识物的荧光标记检测获得检测结果。
50.本发明的有益效果是，制作方法封存和固定在芯片上的抗体具有长时间的活性，其封存的荧光抗体在发生标识反应后，能够挣脱束缚随样本流动；固定在检测区的抗体在发生免疫反应后位置不变，并能够将双抗体夹心标识物滞留在芯片的检测区微柱上。自驱动微流控芯片在用于心脏疾病的常规检查时，可通过荧光检测仪检测滞留在检测区的双抗体夹心的荧光标记信号强度获得检测结果。
附图说明
[0051][0052]
图1是应用本发明方法的自驱动微流控芯片的结构示意图。
具体实施方式
[0053]
下面结合附图对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0054]
实施例1，一种自驱动微流控芯片的制作方法，包括抗体封存和抗体固定的步骤；其中，抗体封存按荧光染料封存法进行；
[0055]
荧光染料封存法，包括将荧光染料通过化学反应标记在抗体上，并去除多余的荧光染料；然后，用透明的第一抗体封存液将荧光抗体稀释至所需要的浓度；最后，通过仪器定量将荧光抗体封存到自驱动微流控芯片的混合区3上，并在满足10万级洁净区的环境要求条件下自然晾干；所述第一抗体封存液由海藻糖、 bsa、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇和透明质酸钠通过hepes缓冲液配制而成；
[0056]
抗体固定按epi固定法进行；
[0057]
epi固定法，包括先将抗体与分子量为1w-100w的聚乙烯亚胺通过交联剂bs3 或dss进行反应；然后，将反应后的混合溶液通过仪器定量将抗体固定到自驱动微流控芯片检测区5的微柱上，并在满足10万级洁净区的环境要求条件下自然晾干；
[0058]
其中，在epi固定过程中，获得反应后混合溶液的过程包括，
[0059]
s11，将聚乙烯亚胺与抗体按质量比1∶3～1∶6混匀；
[0060]
s12，将bs3加入到聚乙烯亚胺和抗体的混合液中混匀，其中bs3与聚乙烯亚胺的质量比为1∶10～1∶2；
[0061]
s13，在37℃条件下反应2h～3h。
[0062]
其中，在荧光染料封存过程中，获得稀释后荧光抗体混合液的过程包括，
[0063]
s31，将荧光染料与抗体按质量比1∶1～1∶10混合后，在37℃条件下反应 20min～40min；
[0064]
s32，通过透析或纯化的方式去除多余的荧光染料；
[0065]
s33，用透明的第一抗体封存液稀释到0.2mg/ml的抗体浓度。
[0066]
第一抗体封存液按质量百分比计，海藻糖占5％～20％，bsa占0.1％～1.0％，聚乙
烯吡咯烷酮占0.1％～1.0％，山梨醇占0.1％～5.0％，透明质酸钠占0.05％～ 0.1％，其余为hepes缓冲液。
[0067]
为获得更好的封存效果，第一抗体封存液按质量百分比计，海藻糖：5％～10％， bsa：0.5％～1％，聚乙烯吡咯烷酮：0.5％～1.0％，山梨醇：0.5％～1.0％，透明质酸钠：0.05％～0.1％，其余为hepes缓冲液。
[0068]
实施例2，一种自驱动微流控芯片的制作方法，包括抗体封存和抗体固定的步骤；其中，抗体固定按乳胶微球固定法进行；
[0069]
乳胶微球固定法，包括先将抗体与乳胶微球通过交联剂edc/nhs进行反应形成抗体微球结合物；将反应后的抗体微球结合物与透明质的固定液混合；最后，将混合后的溶液通过仪器定量将抗体固定到自驱动微流控芯片检测区5的微柱上晾干；其中，所述固定液由羟乙基纤维素、透明质酸钠、海藻酸钠和聚乙烯醇中的任意一种通过hepes缓冲液配制而成。
[0070]
在乳胶微球固定过程中，获得与固定液混合后溶液的过程包括，
[0071]
s21，在37℃条件下将乳胶微球用交联剂edc/nhs活化20min～40min，且乳胶微球与edc/nhs的质量比为100∶1～1∶1；
[0072]
s22，将活化后的乳胶微球加入到抗体溶液中，并在37℃条件下反应2h-3h；且乳胶微球与抗体的质量比为20∶1～5∶1；
[0073]
s23，用冷冻离心机对抗体微球反应后的溶液进行离心分离，并在去除未标记的抗体后，加入hepes缓冲液重悬抗体微球结合物；
[0074]
s24，重复执行s23至少一次；
[0075]
s25，再用冷冻离心机对抗体微球反应后的溶液进行离心分离，并在去除未标记的抗体后，加入所述固定液重悬抗体微球结合物。
[0076]
在加入所述hepes缓冲液的重悬过程中，以重悬后的质量百分比计，按混合液中抗体微球结合物的固含量为0.5％的比例加入所述hepes缓冲液；在加入所述固定液的重悬过程中，以重悬后的质量百分比计，按混合液中抗体微球结合物的固含量为0.1％的比例加入所述固定液。
[0077]
其中，固定液可通过羟乙基纤维素、透明质酸钠、海藻酸钠和聚乙烯醇分别与hepes缓冲液配制形成，分别配制时按质量百分比计，羟乙基纤维素占0.01％～ 1％、透明质酸钠占0.01％～0.1％、海藻酸钠占0.01％～0.1％、聚乙烯醇占0.01％～ 1％，其余均为hepes缓冲液。
[0078]
本实施例的其余步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
[0079]
本实施例中，固定液也可由通过羟乙基纤维素、透明质酸钠、海藻酸钠和聚乙烯醇分别与hepes缓冲液配制形成后的任意两种或两种以上的液体混合在一起使用。
[0080]
为获得更好的固定效果，在分别制备的抗体固定液过程中，按质量百分比计，羟乙基纤维素占0.01％-0.05％，透明质酸钠占0.01％-0.05％，海藻酸钠占 0.01％-0.05％，聚乙烯醇占0.01％-0.05％，其余均为hepes缓冲液。
[0081]
本实施例中的固定液也可由羟乙基纤维素、透明质酸钠、海藻酸钠和聚乙烯醇中的任意两种或两种以上的组合，可按前述的固含量比例共同与构成其余含量的hepes缓冲液配制而成。
表示有衰减，“ ”有明显衰减，“ ”有严重衰减
“‑”
表示无衰减。表2为不同配比条件下用于荧光微球抗体封存的第二封存液的试验数据记录，表中，荧光抗体残留检验的是荧光抗体与样本发生识别反应后的挣脱能力，挣脱能力与残留值反相关，即挣脱能越强，残留越少，反之亦然；其中，“ ”表示有残留，“ ”表示有明显残留，“ ”表示有严重残留，
“‑”
表示无残留；抗体活性是通过在37℃环境加速老化1个月后的信号衰减程度，其中“ ”表示有衰减，“ ”有明显衰减，“ ”有严重衰减；表3为不同固定液的试验数据记录，其中，以固定后的抗体荧光信号检测值和重复性cv评价指标记录，其中cv小于15％即可，且越小越好。其中，荧光信号强度单位为cps。
[0097]
表1，不同配比固含量条件下第一封存液的试验数据记录
[0098][0099]
表1中所列百分比均为固含量的质量百分比，其余为hepes缓冲液。
[0100]
表2，不同配比固含量条件下第二封存液的试验数据记录
[0101][0102]
表2中所列百分比均为固含量的质量百分比，其余为hepes缓冲液。
[0103]
表3，固定液固定抗体后的荧光信号检测值及重复性cv值
[0104][0105]
表3中所列固定液，由透明质酸钠、羟乙基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯醇分别与hepes缓冲液配制形成，对应的百分比均为固含量的质量百分比，其余均为hepes缓冲液。
[0106]
在对第一封存液和第二封存液的封存的抗体活性评价过程中，在经历的30 天过程中进行每隔一段时间进行了相关荧光信号强度的测试，并计算了变化率；具体数据分别见表4和表5，表4为第一封存液对应组别的间断时间测试结；表 5为第二封存液对应组别的间断时间测试结果；
[0107]
表4，第一封存液对应组别的间断时间测试结果记录
[0108][0109]
表5，第二封存液对应组别的间断时间测试结果记录
[0110][0111]
在表4和表5中，信号强度的变化率为间隔30天时的信号检测值与封存当天检测之差相对于封存当天信号检测值的百分比，负数为衰减，正数为增强，理论上不会出现增强，但考虑检测误差，信号值有微小增强是可以接受的。评定标准为，信号变化率绝对值小于等于10％定义为无衰减，记为
“‑”
；大于10％，并小于等于20％为有衰减，记为“ ”；大于20％，并小于等于50％为明显衰减，记为“ ”；大于50％为严重衰减，记为“ ”。
[0112]
实施例4，一种自驱动微流控芯片，包括混合区3和检测区5，混合区3内封存有荧光抗体，检测区5通过芯片底板微流道上的微柱固定有固定抗体；其中，荧光抗体的封存和固定抗体的固定分别采用实施例1、实施例2或实施例3 所述方法进行。
[0113]
该芯片用于心肌三项联检时，包括如图1所示的芯片底板，芯片底板上依次设有加样区1、滤血区2、混合区3、限速区4和检测区5，限速区4设有时控阀门，以减缓待测样本在限速区4内的流动速度缓慢，延长待测样本在混合区3内的滞留时间，增加待测样本与混合区3内试剂的反应时间；混合区3内封存有三株荧光抗体，三株荧光抗体分别为一株ckmb抗体、一株ctni抗体和一株myo抗体，检测区内通过芯片底板微流道上的微柱依次固定有三株抗体，该固定的三株抗体分别为一株ckmb抗体、一株ctni抗体和一株myo抗体。
[0114]
使用时，被检全血、血清或血浆的血样通过吸管加注在加样区1后，依靠毛细原理试样按箭头a所指方向自动进入滤血区2过滤，之后进入混合区3与荧光抗体进行识别反应，荧光抗体与血样结合后挣脱混合区3的束缚随血样流动，随后进入检测区5，在通过与固定的抗体结合后形成双抗体夹心检测标识物。最后通过荧光仪检测标识物的信号强度获得检测结果。
[0115]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。