一种联合多酚与糖基化改性修饰的乳蛋白荷载虾青素乳液的制备方法与流程

1.本发明属于食品加工领域技术领域，具体涉及一种联合多酚与糖基化改性修饰的乳蛋白荷载虾青素乳液的制备方法。


背景技术：

2.随着人们生活水平的不断提高，人们对饮食品质的满足感不再简单停留在食品的风味与营养，对食品的功能性提出了更高的需求。功能食品的快速发展出现了利好趋势。利用天然活性物质广泛的生物学活性实现食品的功能化发展是当前功能食品及保健药品开发的重要途径。然而，天然活性物质往往存在稳定性差、适口性弱、溶解性不佳、生物利用度低等问题，寻找合适的策略改善天然生物活性化合物的加工适应性和生物利用度成为食品研究领域的热点。虾青素是一种脂溶性类胡萝卜素，且具有降血糖、降血脂、提高机体免疫力、抗癌等多种保健效果。但是虾青素的理化性质极不稳定，容易氧化、见光易分解，同时虾青素的生物可及性较低。
3.乳液体系是包裹、保护及靶向输送营养物质的优良载体，广泛用于亲脂性生物活性成分的包封、保护和释放，是提高虾青素稳定性和生物利用度的有效措施，然而，当前用于稳定乳液的颗粒多为无机颗粒和人工表面活性剂，普遍存在着生物相容性较差，抗聚集稳定性弱及氧化稳定性一般等问题。
4.蛋白是生物活性物质包封常用的一种壁材，因富含大量亲水和亲脂性残基，能显著降低表面张力，是作为活性物质输送载体和包埋壁材的合适原料。乳蛋白，既能为人体提供营养又可以改良食品理化性质和功能特性，常作为乳化剂和活性物质的包埋载体应用于食品乳液体系。然而，天然乳蛋白分子结构和功能特性容易受到ph、离子强度、温度和其他环境因素的影响，同时其抗氧化性能相对较弱。为了突破天然蛋白在食品加工应用上的局限性，亟需对其进行适当的加工修饰来提高食品蛋白的乳化性和稳定性。
5.目前蛋白质的改性主要通过有限酶解或借助加热、高压或低剂量辐射等物理手段来实现，或者通过添加化学试剂对蛋白质结构进行修饰，如磷酸化、酰化、硫醇化和糖基化等。然而，现有的技术往往存在成本较高，过程较复杂或者效果不明显等问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种联合多酚与糖基化改性修饰的乳蛋白荷载虾青素乳液的制备方法，该方法通过多酚接枝技术提升乳蛋白的抗氧化性能，通过糖基化修饰进一步改善乳蛋白-多酚共价产物的乳化性、抗氧化活性和生物可及性，综合二者的优越性实现乳蛋白作为载体在脂溶性功能因子高效包载中的应用，有助于拓宽乳蛋白的利用范围，改善虾青素在食品加工过程中稳定性差、生物利用度低等的问题，且该方法成本低，工艺简洁。
7.本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种联合多酚与糖基化改性修
饰的乳蛋白荷载虾青素乳液的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)乳蛋白-多酚共价物的制备
9.将乳蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液，加入抗坏血酸和过氧化氢，充分振荡后静置，加入多酚，混合均匀后继续静置，将混合溶液透析后冷冻干燥，得到乳蛋白-多酚共价物粉末；
10.(2)乳蛋白-多酚共价物的糖基化修饰
11.将乳蛋白-多酚共价物粉末溶解于水，加入葡萄糖，调节ph至5.0～9.0后充分混合，将混合溶液冻干，冻干粉于50～70℃、湿度70～90％条件下进行美拉德反应，得到乳蛋白-多酚-葡萄糖共价复合物；
12.(3)荷载虾青素乳液的制备
13.将乳蛋白-多酚-葡萄糖共价复合物溶于水，调节ph至5.0～9.0，得乳蛋白-多酚-葡萄糖共价复合物溶液，加入荷载虾青素的油相，充分混匀后进行高压均质，即得联合多酚与糖基化改性修饰的乳蛋白荷载虾青素乳液。
14.在上述联合多酚与糖基化改性修饰的乳蛋白荷载虾青素乳液的制备方法中：
15.优选的，步骤(1)中将乳蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液，加入抗坏血酸和过氧化氢，充分振荡后静置1～3h，加入多酚，混合均匀后继续静置12～36h，将混合溶液透析24～72h后冷冻干燥，得到乳蛋白-多酚共价物粉末。
16.优选的，步骤(1)中所述乳蛋白与所述多酚的质量份配比为1：0.1～2。
17.优选的，步骤(1)中所述乳蛋白为酪蛋白、乳清蛋白和乳清分离蛋白中的一种或几种；步骤(1)中所述多酚来自咖啡酸、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)和绿原酸中的一种或几种。
18.优选的，步骤(1)中所述磷酸盐缓冲液的浓度为10～50mm，ph为6.0～8.0。
19.优选的，步骤(1)所述抗坏血酸的添加量为0.1～1g/g乳蛋白。
20.优选的，步骤(1)所述过氧化氢的摩尔浓度为5mol/l，添加量为0.1～5ml/100ml乳蛋白磷酸盐缓冲溶液。
21.优选的，步骤(2)中所述乳蛋白-多酚共价物粉末与所述葡萄糖的质量份配比为1：0.1～2。
22.优选的，步骤(2)中进行美拉德反应的时间为12～48h。
23.优选的，步骤(3)中所述乳蛋白-多酚-葡萄糖共价复合物溶液中所述乳蛋白-多酚-葡萄糖共价复合物的质量百分含量为1～5％。
24.优选的，步骤(3)中所述乳蛋白-多酚-葡萄糖共价复合物溶液与所述荷载虾青素的油相的体积比为1～9：1～9。
25.优选的，步骤(3)中所述荷载虾青素的油相中虾青素的质量百分含量为0.01～0.1％。
26.优选的，步骤(3)中所述油相为大豆油、花生油、橄榄油和中链甘油三酯中一种或几种。
27.优选的，步骤(3)中高压均质时的转速为10000rpm～15000rpm，时间为2～10min，压力为10mpa～100mpa，次数为2～6次。
28.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
29.(1)本发明方法包括蛋白-多酚共价物的制备；共价产物的糖基化修饰；荷载虾青
素乳液的制备，乳液性能评价等步骤，其以乳蛋白为虾青素的载体原料，通过多酚、糖基化等技术手段对其进行改性修饰，提高载体乳化性和稳定性，以实现虾青素的高效荷载及靶向输送；
30.(2)多酚具有多种生物活性，可以减少细胞和组织中蛋白质、脂质和碳水化合物的氧化损伤，从而降低患高血糖、高胆固醇和心血管等慢性疾病的风险，此外，多酚具有显着的抗氧化和抗菌特性，对食物致病细菌有优异的抑制效果，本发明利用自由基法诱导乳蛋白和多酚(咖啡酸)共价键结合，提高蛋白质的稳定性和抗氧化能力，美拉德反应有助于提升蛋白质的乳化性活性及乳化稳定性，同时其在乳液体系中形成的较厚界面层，有利于对抗外界不利环境，保护其荷载的活性物质(虾青素)免受氧化和降解；
31.(3)本发明通过多酚接枝技术提升乳蛋白的抗氧化性能，通过糖基化修饰进一步改善乳蛋白-多酚共价产物的乳化性、抗氧化活性和生物可及性，综合二者的优越性实现乳蛋白作为载体在脂溶性功能因子高效包载中的应用，有助于拓宽乳蛋白的利用范围，改善虾青素在食品加工过程中稳定性差、生物利用度低等的问题。
附图说明
32.以下通过附图对本发明作进一步说明。
33.图1为本发明实施例1-2中联合多酚与糖基化改性修饰的乳蛋白的乳化性能；
34.图2为本发明实施例3中不同浓度的改性修饰的乳蛋白制备的荷载虾青素乳液的粒径和pdi；
35.图3为本发明实施例4中不同浓度的水油比例下虾青素乳液的粒径和pdi；
36.图4为本发明实施例5中联合多酚与糖基化改性修饰的酪蛋白荷载虾青素乳液中虾青素的贮藏稳定性；
37.图5为本发明实施例5中联合多酚和糖基化改性修饰的改性酪蛋白荷载虾青素乳液经胃肠消化后的生物可及性；
38.图6为本发明实施例6中联合多酚和糖基化改性修饰的改性酪蛋白荷载虾青素乳液在不同温度下的粒径和pdi。
具体实施方式
39.下面结合实例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
40.实施例1
41.本实施例提供的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的乳清分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：
42.(1)乳清分离蛋白-咖啡酸共价物的制备：
43.将1g乳清分离蛋白溶解在100mlpbs(10mm、ph＝7.4)中，加入0.25g抗坏血酸和1ml h2o2(5mol/l)，充分振荡后室温下静置2h后，加入0.2g咖啡酸，混合均匀后继续静置24h，然后将溶液进行48h透析并将其真空冷冻干燥，得乳清分离蛋白-咖啡酸共价物粉末。
44.(2)乳清分离蛋白-咖啡酸共价物的糖基化修饰：
45.将乳清分离蛋白-咖啡酸共价物粉末和葡萄糖以1：1的质量比溶于水，调节ph至7.4，充分混合；将混合溶液冻干，冻干后的粉末在温度60℃、湿度79％条件下进行美拉德反
应(24h)，得到乳清分离蛋白-咖啡酸-葡萄糖共价复合物。
46.实施例1的对照组为乳清分离蛋白。
47.实施例2
48.本实施例提供的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白的制备方法，具体方案如下：
49.(1)酪蛋白-咖啡酸共价物的制备：
50.将1g酪蛋白溶解在100mlpbs(10mm、ph＝7.4)中，加入0.25g抗坏血酸和1ml h2o2(5mol/l)，充分振荡后室温下静置2h后，加入0.2g咖啡酸，混合均匀后继续静置24h，然后将溶液进行48h透析并将其真空冷冻干燥。
51.(2)酪蛋白-咖啡酸共价物的糖基化修饰
52.将酪蛋白-咖啡酸共价物粉末和葡萄糖以1：1的质量比溶于水，调节ph至7.4，充分混合；将混合溶液冻干，冻干后的粉末在温度60℃、湿度79％条件下进行美拉德反应(24h)，得到酪蛋白-咖啡酸-葡萄糖共价复合物。
53.实施例2的对照组为酪蛋白。
54.实施例3
55.本实施例提供的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白及其荷载虾青素乳液的制备方法，具体方案如下：
56.(1)酪蛋白-咖啡酸共价物的制备：
57.将1g酪蛋白溶解在100mlpbs(10mm、ph＝7.4)中，加入0.25g抗坏血酸和1ml h2o2(5mol/l)，充分振荡后室温下静置2h后，加入0.2g咖啡酸，混合均匀后继续静置24h，然后将溶液进行48h透析并将其真空冷冻干燥。
58.(2)酪蛋白-咖啡酸共价物的糖基化修饰：
59.将酪蛋白-咖啡酸共价物粉末和葡萄糖以1：1的质量比溶于水，调节ph至7.4，充分混合；将混合溶液冻干，冻干后的粉末在温度60℃、湿度79％条件下进行美拉德反应(24h)，得到酪蛋白-咖啡酸-葡萄糖共价复合物。
60.(3)荷载虾青素乳液的制备
61.将酪蛋白-咖啡酸-葡萄糖共价复合物溶于水(1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％)，调节ph至7.4，充分混合，将混合溶液与荷载虾青素(0.05wt％)的油相以9：1(v/v)的比例混合，然后10000rpm均质3min后，在25mpa下均质3次得到所述联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白所荷载虾青素的乳液。
62.实施例4
63.本实施例提供的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白及其荷载虾青素乳液的制备方法，具体方案如下：
64.(1)酪蛋白-咖啡酸共价物的制备：
65.将1g酪蛋白溶解在100mlpbs(10mm、ph＝7.4)中，加入0.25g抗坏血酸和1ml h2o2(5mol/l)，室温下静置2h后，加入0.2g咖啡酸，静置24h，然后将溶液进行48h透析并将其真空冷冻干燥。
66.(2)酪蛋白-咖啡酸共价物的糖基化修饰：
67.将酪蛋白-咖啡酸共价物粉末和葡萄糖以1：1的质量比溶于水，调节ph至7.4，充分
混合；将混合溶液冻干，冻干后的粉末在温度60℃、湿度79％条件下进行美拉德反应(24h)，得到酪蛋白-咖啡酸-葡萄糖共价复合物。
68.(3)荷载虾青素乳液的制备
69.将酪蛋白-咖啡酸-葡萄糖共价复合物溶于水(3wt％)，调节ph至7.4，充分混合；将混合溶液与荷载虾青素(0.05wt％)的油相以9.5：0.5、9：1、8.5：1.5、8：2、7.5：2.5(v/v)的比例混合，然后10000rpm均质3min后，在25mpa下均质3次得到所述联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白所荷载虾青素的乳液。
70.实施例5
71.本实施例提供的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白及其荷载虾青素乳液的制备方法，具体方案如下：
72.(1)酪蛋白-咖啡酸共价物的制备：
73.将1g酪蛋白溶解在100mlpbs(10mm、ph＝7.4)中，加入0.25g抗坏血酸和1ml h2o2(5mol/l)，室温下静置2h后，加入0.2g咖啡酸，静置24h，然后将溶液进行48h透析并将其真空冷冻干燥。
74.(2)酪蛋白-咖啡酸共价物的糖基化修饰：
75.将酪蛋白-咖啡酸共价物粉末和葡萄糖以1：1的质量比溶于水，调节ph至7.4，充分混合；将混合溶液冻干，冻干后的粉末在温度60℃、湿度79％条件下进行美拉德反应(24h)，得到酪蛋白-咖啡酸-葡萄糖共价复合物。
76.(3)荷载虾青素乳液的制备：
77.将酪蛋白-咖啡酸-葡萄糖共价复合物溶于水(3wt％)，调节ph至7.4，充分混合；将混合溶液与荷载虾青素(0.05％)的油相以9：1(v/v)的比例混合，然后10000rpm均质3min后，在25mpa下均质3次得到所述联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白所荷载虾青素的乳液。
78.实施例5的对照组为不经步骤(1)～(2)改性仅按照步骤(3)制备的酪蛋白酸钠荷载虾青素的乳液。
79.实施例6
80.本实施例提供的联合绿原酸与糖基化改性修饰的酪蛋白及其荷载虾青素乳液的制备方法，具体方案如下：
81.(1)乳清分离蛋白-绿原酸共价物的制备：
82.将1g乳清分离蛋白溶解在100mlpbs(10mm、ph＝7.4)中，加入0.25g抗坏血酸和1ml h2o2(5mol/l)，室温下静置2h后，加入0.1g绿原酸，静置24h，然后将溶液进行48h透析并将其真空冷冻干燥。
83.(2)乳清分离蛋白-绿原酸共价物的糖基化修饰：
84.将酪蛋白-咖啡酸共价物粉末和葡萄糖以2：1的质量比溶于水，调节ph至7.4，充分混合；将混合溶液冻干，冻干后的粉末在温度60℃、湿度79％条件下进行美拉德反应(24h)，得到乳清分离蛋白-绿原酸-葡萄糖共价复合物。
85.(3)荷载虾青素乳液的制备：
86.将乳清分离蛋白-绿原酸-葡萄糖共价复合物溶于水(3wt％)，调节ph至7.4，充分混合；将混合溶液与荷载虾青素(0.05％)的油相以9：1(v/v)的比例混合，然后10000rpm均
质3min后，在25mpa下均质3次得到所述联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白所荷载虾青素的乳液。
87.以下分别通过抗氧化能力、乳化性能、粒径和pdi、贮藏稳定性以及生物可及性测试以说明上述实施例1-5中所得产品的各项性能。
88.一、实验方法
89.1.抗氧化能力的测定
90.dpph(％)、abts(μmol trolox/g prot)、frap(μmol trolox/g prot)的测试方法参考以下文献：xu y,han m,huang m,et al.enhanced heat stability and antioxidant activity of myofibrillar protein-dextran conjugate by the covalent adduction of polyphenols[j].food chemistry,2021(pt 1):129376。
[0091]
2.乳化性能的测定
[0092]
将6ml的样品溶液(以ph＝7.4,10mm的pbs溶解的改性蛋白冻干粉末)和2ml玉米胚芽油在高速均质器中以13,000rpm均质1分钟。立即或均质后的第10分钟，从均质乳液的底部取出50μl乳液，加入0.1％(w/v)5ml sds溶液中。涡旋混合后，在分光光度计中于500nm读取稀释乳剂的吸光度。eai和esi值通过以下公式计算：
[0093][0094][0095]
其中a0、a
10
是乳液在0min和10min的吸光值，df是稀释倍数(100)，c是初始蛋白浓度(g/ml)，是光程(0.01m)，θ是乳液中油相的比例(0.25)。
[0096]
3、粒径和pdi的测定
[0097]
采用马尔文粒径仪测定颗粒的电位和颗粒大小。所有样品用相同ph和离子强度的溶液稀释100倍，在仪器中平衡2min，采集10个连续读数，每组样品重复3次。
[0098]
4.贮藏稳定性
[0099]
将乳液储藏在20ml血清瓶中，放入25℃培养箱避光贮藏。在第0、7、14、21、28d取样测量乳液中虾青素的含量。其中虾青素含量的测量参考以下文献：shu g,khalid n,chen z,et al.formulation and characterization of astaxanthin-enriched nanoemulsions stabilized using ginseng saponins as natural emulsifiers[j].food chemistry,2018,255(jul.30):67-74。
[0100]
6.生物可及性
[0101]
生物可及性的测定方法参考以下方法：chen l,yokoyama w,liang r,et al.enzymatic degradation and bioaccessibility of protein encapsulatedβ-carotene nano-emulsions during in vitro gastro-intestinal digestion[j].food hydrocolloids,2020,100:105177。
[0102]
7.热稳定性
[0103]
乳液在不同的温度(25～85℃)下加热30min，待乳液温度恢复至室温后测定乳液的粒径和pdi。
[0104]
二、实验结果
[0105]
表1是本发明实施例1-2中的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的乳蛋白以及对照组1-2中的乳蛋白的抗氧化能力
[0106][0107][0108]
如表1所示，对照组1-2中的乳蛋白的dpph自由基清除能力较弱，实施例1-2中改性乳蛋白(即多酚和糖基化反应制备的改性乳蛋白)表现出了较高的dpph自由基清除能力，与之类似的改性乳蛋白的abts、frap总抗氧化能力同样得到了显著增强，实施例1中的改性乳清分离蛋白相对对照组1中的乳清分离蛋白的abts、frap抗氧化能力提高了约56.9倍和18.97倍，在实施例2中和对照组2中酪蛋白组中这个数值为16.62倍和16.46倍，这可能是改性乳蛋白中除了多酚提供的抗氧化能力，美拉德反应产生的中间产物及终产物也同样具有还原能力和自由基清除能力，使得整体上的抗氧化能力增强。
[0109]
图1示出了本发明实施例1-2得到的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的乳蛋白的乳化性能。
[0110]
从图1可以看出改性乳蛋白的eai和esi分别为32.44m2/g、21.95min显著高于酪蛋白酸钠(对照组)的24.13m2/g、18.12min，这说明多酚与蛋白质的共价结合可以展开蛋白质的结构，从而增加蛋白在油滴表面的吸附量，提高乳状液的稳定性，同时糖基化可以增加改性复乳蛋白的溶解度和空间位阻，蛋白质和多糖的共价吸附通过加强它们在油水界面上的吸附能力和稳定水相中被多糖粘弹性层包围的油滴，协同增强共价物的乳化特性。
[0111]
图2示出了本发明实施例3得到的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白制作成的荷载虾青素乳液的粒径和pdi。
[0112]
从图2可以看到，随着油相比例的增加，乳液的粒径程先降低后增加的趋势，而pdi的趋势与粒径稍不相同，先减少至一定程度后趋于稳定。其中水油比9：1下的乳液同时具有较低的粒径和pdi，可以认为在该条件下乳液的稳定性最好。
[0113]
图3示出了本发明实施例4得到的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白制作成的荷载虾青素乳液的粒径和pdi。
[0114]
从图3可以看到，随着改性蛋白浓度的增加，乳液的粒径和pdi先减小后趋于稳定。其中改性蛋白浓度为3wt％时的乳液同时具有较低的粒径和pdi，且考虑到成本问题，可以认为在该条件下乳液的稳定性最好。
[0115]
图4示出了本发明实施例5得到的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白制作成的荷载虾青素乳液中的虾青素的贮藏稳定性。
[0116]
从图4中可以看出经过28d的贮藏，无论是在4℃或是25℃，改性酪蛋白制得的乳液其虾青素的含量远高于相应的乳蛋白酸钠组。这表明本发明得到的改性酪蛋白更有利于长期保护虾青素，减少外在环境因素导致的虾青素的损失。
[0117]
图5示出了本发明实施例5得到的联合咖啡酸与糖基化改性修饰的酪蛋白制作成的荷载虾青素乳液经胃肠消化后的生物可及性。
[0118]
从图5可以看到，酪蛋白酸钠制得的乳液难以将虾青素递送到肠道中，无法做到活性物质在肠道中的靶向释放，而本发明得到的改性乳蛋白制得的乳液，其虾青素的生物可及性达到了26.21％，显示出了递送疏水性生物活性成分的优越性。
[0119]
从图6可以看到，本发明得到的改性乳蛋白制得的乳液，其在25～85℃条件下粒径和pdi较为稳定，具有良好的加热稳定性。
[0120]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。