一种miRNA结合区域可变的报告基因质粒及其制备方法和应用与流程

一种mirna结合区域可变的报告基因质粒及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于mirna功能检测技术领域，具体涉及一种mirna结合区域可变的报告基因质粒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.微小核糖核酸(microrna，mirna)是一类长约22个核苷酸的小型非编码rna。作为基因表达过程中一种重要的调节因子，mirna能够调节生物体许多的生理活动。人们普遍认为，哺乳动物的mirna主要通过靶向信使核糖核酸(mrna)的3’非翻译区(3’utr)来抑制靶基因的表达。研究mirna功能与机制的过程中，通常需要报告基因(reporter gene)系统来验证mirna的结合位点。常规的方法是将待验证的靶基因的3’utr或者3’utr上可能包含有mirna的结合位点的序列连接到报告基因编码区终止密码子的下游构建成mirna靶点的报告基因质粒。将报告基因转入细胞中并操控细胞中mirna的表达，如果mirna能够与待验证的3’utr或者靶向序列结合的话，那么报告基因(如荧光素酶或者荧光蛋白)的表达就会收到mirna的影响。因此，通过检测报告基因产物的信号，我们就可以判断和验证mirna与靶向序列之间的调控关系。目前，常用的研究mirna的报告基因系统主要有由promega公司pgl3-control质粒改造而成的pgl3-cm质粒(nature genetics,2006，doi：10.1038/ng1725)，invitrogen的pmir-report以及promega公司的pmirglo报告基因载体等。
3.近年来不少研究表明，mirna除了可以结合3’utr，还能够靶向mrna的蛋白质编码序列(coding sequence,cds)，并且，在作用模式上，mirna-cds跟mirna-3’utr之间可能存在着很大不同：mirna作用于3’utr时一般会引起下游mrna水平的下调，同时会导致mrna所编码的蛋白水平降低；而当mirna作用于cds时，下游的mrna的水平一般不会降低，但是蛋白水平会出现下调。另外，细胞中参与调节两种模式的因子也不同(genome research,2013.doi:10.1101/gr.139758.112；nature structural and molecular biology,2018,doi:10.1038/s41594-018-0136-3.)。现有的常规报告基因载体基本是把待验证序列克隆在报告基因编码区终止密码子的下游(属于3’utr区域)，因此是不适合研究mirna-cds之间的调控关系的。
4.2013年，湖南师范大学周建林等人提交申请了“鉴定mirna靶点的双荧光报告基因载体及其制备方法和应用”专利(cn103266120a)。该发明将待验证的mirna结合序列连接到报告基因的最末端氨基酸密码子和终止密码子之间，使之依然存在于编码区，以此来验证编码区内的mirna靶点和检测作用于编码区的mirna的功能。
5.但是人为的在报告基因的最末端氨基酸密码子和终止密码子之间插入序列，会导致蛋白产物末端的增加多余的氨基酸序列或者改变氨基酸的组成，可能会影响报告基因编码蛋白稳定性、活性(如荧光素酶的酶活力)以及抗体亲和力。这些因素会干扰对报告基因产物活力和水平的检测。cn103266120a的方法一般只能插入很短的mirna靶向序列(一般为18-30个核苷酸)。如果插入序列太长，则表达形成的融合蛋白会在在荧光素酶蛋白的羧基
端多出很长的一段肽链，会使荧光素酶功能受到影响。而mirna与结合位点的作用依赖于背景序列，另外，mirna在编码区有时会有多个结合位点。因此我们通常需要克隆长片段的序列去与报告基因同框融合，来验证mirna-cds的调控关系，而cn103266120a的质粒载体则难以实现这样的实验目的。cn103266120a的质粒载体对待验证的编码区内的mirna靶点除了有长度限制，还可能有氨基酸序列方面的制约。比如，如果带检测的mirna的靶向序列本身编码介导蛋白质降解的序列(如带有泛素化位点的短序列)，那么这些短序列一旦跟报告基因同框表达，就会以不依赖于mirna的方式下调报告基因信号，干扰实验结果。
6.本发明针对目前用于研究mirna的报告基因系统的缺点，构建了一个mirna结合区域可变的报告基因系统，适合用于研究mirna与下游mrna编码序列上结合位点之间调控关系。该报告基因质粒对编码区上mirna靶向序列没有长度以及编码氨基酸组成的限制。另外，该报告基因质粒依然可以用于研究mirna与位于3’utr的结合位点之间的调控关系，从而更为灵活可变。


技术实现要素：

7.针对上述技术中存在的问题，本发明提出了一种mirna结合区域可变的报告基因质粒及其制备方法和应用，本发明在报告基因(如荧光素酶、荧光蛋白基因)编码序列的最末端氨基酸密码子与克隆位点之间融合了具有共翻译自主加工(co-translational self-cleavage)活性的猪捷申病毒(porcine teschovirus-1)p2a序列。p2a肽链在翻译的过程中会被自主切断，但不会影响后续序列的翻译，从而可以使一条mrna最终通过翻译过程生成各自独立的氮端(n端)和碳端(c端)的两条肽链。
8.当把带检测的编码区上mirna靶向序列同框插入到p2a后面的克隆位点后，就形成了包含报告基因-p2a-mirna靶向序列的表达组件。由于mirna靶向序列跟其它表达组件共存于同一条转录产物上，所以这个报告基因系统可以用来研究mirna的功能与机制。由于p2a序列的存在，该报告基因系统的表达产物会有两个分离的部分：氮端蛋白和碳端肽链。碳端的肽链为p2a序列中的一个脯氨酸与mirna靶向序列编码蛋白的融合产物。氮端蛋白是报告基因蛋白与p2a序列切割后剩余的19个氨基酸的融合产物。p2a序列n端的19个氨基酸很短，并不会影响报告基因蛋白活性和稳定性。实验最终的检测指标是报告基因产物(氮端蛋白)的活力或者丰度。而无论mirna靶向区域的长度或者序列如何改变，只会影响碳端肽链的序列，而真正被检测的部分氮端蛋白产物(报告基因)的序列都是不变的。因此，该报告基因质粒对编码区上mirna靶向序列没有长度以及编码氨基酸组成的限制。另外，该质粒依然可以用于研究mirna与位于3’utr的结合位点之间的调控关系(只需在p2a序列的与待克隆的序列之间引入终止密码子即可)，与以往的报告基因系统相比更为灵活。
9.需要说明的是，mirbs为mirna binding sites，即mirna结合位点。
10.本发明提供的一种mirna结合区域可变的报告基因质粒，包含报告基因和多克隆位点，所述报告基因编码序列的最末端氨基酸密码子与克隆位点之间融合了p2a序列，所述p2a序列的下游克隆有mirna结合区域。
11.所述报告基因为海肾荧光素酶或者绿色荧光蛋白。
12.所述多克隆位点包括nhei、kpni、sacii、noti和asci 5个酶切位点。
13.本发明还提供了一种mirna结合区域可变的报告基因质粒的制备方法，其步骤包
括：(1)改造pcdna3.3-topo的质粒骨架得到npcdna3.3-topo载体，记为ntopo质粒；(2)将pcr扩增报告基因的产物克隆到ntopo质粒，构建成ntopo-flag报告基因质粒；(3)在报告基因下游插入p2a序列；(4)将mirna结合区域克隆到p2a的下游，得到最终的报告基因质粒。
14.上述mirna结合区域可变的报告基因质粒的制备方法，具体包括以下步骤：
15.(1)通过pcr的方法反向扩增pcdna3.3-topo的质粒骨架，并通过在上下游引物的5’端添加酶切位点的方式引入了nhei、kpni、sacii、noti和asci的识别序列，通过酶切后自连的方式获得了npcdna3.3-topo质粒载体，记为ntopo，在获得的ntopo质粒中就有了了nhei、kpni、sacii、noti和asci酶切位点，为后续的克隆提供了方便，另外pcr的过程中在asci位点下游还添加了3个各自不同框的终止密码子；
16.(2)用nhei和kpni双酶切ntopo质粒得到两端带有粘性末端的线性化的载体；
17.(3)以promega公司的pmirglo质粒为模板，pcr扩增海肾荧光素酶(renil la luciferase，rluc)或者绿色荧光蛋白(mwasabi)编码序列，正向和反向引物分别带有nhei和kpni位点，正向引物的5’端还添加了编码flag标签的序列，pcr产物酶切纯化后，克隆到ntopo载体的nhei和kpni位点之间，获得了ntopo-flagrluc或者ntopo-flagmwasabi质粒；
18.(4)用kpni和sacii双酶切ntopo-flagrluc或者ntopo-flagmwasabi质粒得到两端带有粘性末端的线性化的载体；
19.(5)合成p2a编码序列的寡核苷酸及其互补链，
20.正向序列为：
[0021][0022]
反向序列为：
[0023][0024]
将上述合成的两条寡核苷酸链等摩尔混合，95度加热5分钟，75度放置5分钟，然后25度放置10分钟，完成退火，获得的双链寡核苷酸两端分别带有kpni和sacii的粘性末端；
[0025]
(6)将退火产物克隆到到步骤(4)获得的线性化的ntopo-flagrluc或者ntopo-flagmwasabi质粒的kpni和sacii之间，获得ntopo-flagrlu-p2a或者ntopo-flagmwasabi-p2a-cds质粒，分别记为prlucrep2a-cds质粒和pwsbrep2a-cds质粒。
[0026]
进一步的，prlucrep2a-cds质粒和pwsbrep2a-cds质粒中的sacii、noti和asci位点可用于克隆位于编码区的mirna靶向区域。
[0027]
本发明还保护mirna结合区域可变的报告基因质粒在鉴定或检测mirna与位于编码区的结合位点的应用。
[0028]
进一步的，在鉴定或检测mirna与位于编码区的结合位点之间的调控关系，可pcr扩增待检测序列，在正向和方向引物的5’端分别添加对应的酶切位点，sacii和noti，sacii和asci，或者noti和asci，通过酶切、连接、转化的常规分子克隆方法获得prlucrep2a-cdsmirbs(mirbs为mirna binding sites，即mirna结合位点)和pwsbrep2a-cdsmirbs报告基因质粒，在pwsbrep2a-cds报告基因质粒sacii和noti之间克隆了mir-378的结合位点，验证了报告基因的表达可以被mir-378所抑制。
[0029]
进一步的，在鉴定或检测mirna与位于3’utr的结合位点之间的调控关系，在p2a序
列的末端和sacii位点之间引入终止密码子，具体方法如下，先合成带有终止密码子的p2a编码序列的寡核苷酸及其互补链，
[0030]
正向序列为:
[0031][0032]
反向序列为：
[0033][0034]
将上述合成的两条寡核苷酸链等摩尔混合，95度加热5分钟，75度放置5分钟，然后室温继续退火10分钟。获得的双链寡核苷酸两端分别带有kpni和sacii的粘性末端。将退火产物克隆到ntopo-flagrluc或者ntopo-flagmwasabi质粒的kpni和sacii之间，获得ntopo-flagrlu-p2a-utr或者ntopo-flagmwasabi-p2a-utr质粒，分别记为prlucrep2a-utr和pwsbrep2a-utr质粒；在pwsbrep2a-utr报告基因质粒sacii和noti之间克隆了mir-378的结合位点(pwsbrep2a-utrmirbs)，验证了报告基因的表达可以被mir-378所抑制。
[0035]
与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：
[0036]
1.)在报告基因编码序列与mirna结合位点之间同框融合了p2a序列，使之对所研究的编码区上的mirna靶向序列的长度以及编码氨基酸的组成没有限制。
[0037]
2.)另外，在p2a的末端与待克隆的序列5’端之间加上与报告基因同框的终止密码子，使该质粒依然可以用于研究mirna与位于3’utr的结合位点之间的调控关系。因此，该质粒与以往的报告基因系统相比更为灵活。
附图说明
[0038]
图1为构建prlucrep2a-cdsmirbs和pwsbrep2a-cdsmirbs报告基因质粒的流程图；
[0039]
图2为prlucrep2a-cdsmirbs和pwsbrep2a-cdsmirbs报告基因质粒用于研究mirna与位于编码区的结合位点之间的调控关系图；
[0040]
图3为prlucrep2a和pwsbrep2a报告基因质粒的mirna结合区域灵活可变图；
[0041]
图4为pwsbrep2a-cdsmirbs报告基因质粒的检测报告基因的效果图；
[0042]
图5为pwsbrep2a-utrmirbs报告基因质粒的检测报告基因的效果图。
具体实施方式
[0043]
下面通过具体实施方式例对本发明进行详细描述。本发明的范围并不受限于该具体实施方式。
[0044]
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明所保护的范围。
[0045]
本发明的缩写及英文含义如下表1所示：
[0046]
表1缩写及英文含义
[0047]
缩写及英文含义
flagmwasabi质粒的kpni和sacii之间，获得ntopo-flagrlu-p2a或者ntopo-flagmwasabi-p2a-cds质粒，得到prlucrep2a-cds质粒和pwsbrep2a-cds质粒。
[0061]
图2为本发明prlucrep2a-cdsmirbs和pwsbrep2a-cdsmirbs报告基因质粒用于研究mirna与位于编码区的结合位点之间的调控关系。将含有mirna结合位点的编码区序列的报告基因载体通过转染的方式导入hela细胞。报告基因将会在细胞中被表达。由于p2a序列的存在，该报告基因系统的表达产物会有两个分离的部分：氮端蛋白和碳端肽链。碳端的肽链为p2a序列中的一个脯氨酸与mirna靶向序列编码蛋白的融合产物。氮端蛋白是报告基因蛋白与p2a序列切割后剩余的19个氨基酸的融合产物。p2a序列n端的19个氨基酸很短，并不会影响报告基因蛋白活性和稳定性。实验最终的检测指标是报告基因产物(氮端蛋白)，在转染24-72小时后，可以通过荧光显微镜或酶标仪读取报告基因信号。而无论mirna靶向区域的长度或者序列如何改变，只会影响碳端肽链的序列，而真正被检测的部分氮端蛋白产物(报告基因)的序列都是不变的。因此，该报告基因质粒对编码区上mirna靶向序列没有长度以及编码氨基酸组成的限制。
[0062]
图3为本发明prlucrep2a和pwsbrep2a报告基因质粒的mirna结合区域灵活可变。当p2a序列的末端和mirna结合位点之间没有终止密码子时(prlucrep2a-cdsmirbs和pwsbrep2a-cdsmirbs)，mirna靶向区域则属于编码序列(虚线框)，当p2a序列的末端和mirna结合区域之间引入了终止密码子时(prlucrep2a-utrmirbs和pwsbrep2a-utrmirbs)，mirna靶向区域则属于3’非翻译区(实线框)。因此，该质粒与以往的报告基因系统相比更为灵活，既可以用于研究mirna与位于编码区的结合位点之间的调控关系，也可以研究mirna与位于3’utr的结合位点之间的调控关系。将含有mirna结合位点的3’utr序列的报告基因载体通过转染的方式导入hela细胞。报告基因将会在细胞中被表达。在转染24-72小时后，可以通过荧光显微镜或酶标仪读取报告基因信号。
[0063]
图4为本发明在pwsbrep2a-cds质粒sacii和noti之间克隆了mir-378的结合位点，获得了pwsbrep2a-cdsmirbs报告基因质粒。将该报告基因质粒转入hela细胞，并在不同的时间点通过检查荧光蛋白的荧光强度，来验证mirna-378对报告基因表达的影响(control为mirna-378的对照)。转染后24小时，已经可以观察到pwsbrep2a-cdsmirbs可以被mir-378所抑制(列与列之间做对比，行表示不同的时间点)，而转染后48小时，抑制作用更为明显。这一实验结果显示，我们发明的新的报告基因系统是有效可行的。
[0064]
图5为本发明在pwsbrep2a-utr质粒sacii和noti之间克隆了mir-378的结合位点，获得了pwsbrep2a-utrmirbs报告基因质粒。将该报告基因质粒并行转入hela细胞，并在不同的时间点通过检查荧光蛋白的荧光强度，来验证mirna-378对报告基因表达的影响(control为mirna-378的对照)。转染后24小时(24h)，已经可以观察到pwsbrep2a-utrmirbs可以被mir-378所抑制(列与列之间做对比，行表示不同的时间点)，而转染后48小时(48h)，抑制作用更为明显。这一实验结果显示，我们发明的新的报告基因系统是有效可行的。
[0065]
上面仅对本发明的较佳实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化，各种变化均应包含在本发明的保护范围之内。
[0066]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围
之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。