靶向EHD2基因的siRNA及其应用的制作方法

靶向ehd2基因的sirna及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，更具体地说，涉及靶向ehd2基因的sirna及其应用。


背景技术：

2.肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌是最主要的肺癌类型，约占总病例数的85％。近年来，通过手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗大大改善了肺癌患者的预后。但由于治疗后易发生复发、转移和耐药性，肺癌患者的5年生存率不超过20％。放射治疗作为非小细胞肺癌最重要的非手术治疗，然而疗效仍然受到多种因素的影响，如肿瘤上皮细胞-间充质转化、肿瘤的固有辐射抵抗力、肿瘤细胞的异质性、肿瘤微环境和免疫反应。因此，探索新的关键靶基因和治疗靶点，改善放疗疗效，对于治疗非小细胞肺癌来说尤为重要。
3.ehd2(eh-domian containing protein2)作为ehd家族的重要成员，是一种c端含有eh域的膜转运调控蛋白，具有信号转导、调控膜蛋白和膜受体内吞的作用。近年来的报道表明，ehd2与多种癌症相关。在肝癌中ehd2与e-cadherin存在相互作用，当受机械应力刺激或辐射时，小窝解体，形成e-cadherin囊泡入胞至溶酶体降解或循环到质膜，募集ehd2将其稳定在质膜。e-cadherin丢失是体内emt的一个关键事件，在肺癌、乳腺癌、和卵巢癌中，e-cadherin的下调导致细胞间粘附减少，是肿瘤进展的一个重要特征。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种靶向ehd2基因的sirna。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述靶向ehd2基因的sirna在用于建立肺癌生长相关模型中的应用。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种靶向ehd2基因的sirna分子，是核酸序列如下的双链rna分子：
7.正义序列：5
′‑
uccgcaaacucaacccuuudtdt-3
′
，
8.反义序列：5
′‑
aaaggguugaguuugcggadtdt-3
′
；
9.或
10.正义序列：5
′‑
ggaaggagaacaagaagaadtdt-3
′
，
11.反义序列：5
′‑
uucuucuuguucuccuuccdtdt-3
′
；
12.或
13.正义序列：5
′‑
ccaaauacgacgagaucuudtdt-3
′
，
14.反义序列：5
′‑
aagaucucgucguauuuggdtdt-3
′
。
15.所述的靶向ehd2的sirna分子在如下(a)-(d)至少一种中的应用：
16.(a)促进肺癌细胞增殖，或者制备用于促进肺癌细胞增殖的产品；
17.(b)促进肺癌细胞迁移，或者制备用于促进肺癌细胞迁移的产品；
18.(c)促进肺癌细胞侵袭，或者制备用于促进肺癌细胞侵袭的产品；
19.(d)激活肺癌细胞中emt通路，或者制备用于激活肺癌细胞中emt通路的产品。
20.所述用于促进肺癌细胞增殖的产品为增殖能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备增殖能力增强的肺癌细胞模型的物质。
21.所述用于促进肺癌细胞迁移的产品为迁移能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备迁移能力增强的肺癌细胞模型的物质。
22.所述用于促进肺癌细胞增殖的产品为增殖能力增强的肺癌细胞模型，或者是用于制备增殖能力增强的肺癌细胞模型的物质。
23.所述用于激活肺癌细胞中emt通路的产品为肺癌细胞中emt通路激活的肺癌细胞模型，或者是用于制备肺癌细胞中emt通路激活的模型的物质。
24.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
25.本发明设计特异性sirna针对ehd2进行靶向阻断，能显著降低肺癌细胞内ehd2的表达水平，显著促进细胞的增殖，迁移和emt通路激活的作用，从而促进肺癌细胞的生长。本发明提供的靶向ehd2的sirna分子可以用于建立肺癌生长相关模型，有助于阐明ehd2基因及其靶基因的作用，为深入研究其在多种生理和病理过程中的作用提供实验依据，有助于阐明ehd2转录因子在恶性肿瘤中的发展规律，为从分子水平研究肺癌的发病机制提供帮助。
附图说明
26.图1为肺癌细胞a549中ehd2及其sirna干扰后表达水平的结果图；
27.图2为cck8实验证明siehd2影响肺癌细胞增殖的结果图；
28.图3为transwell迁移实验证明siehd2影响肺癌细胞转移的结果图；
29.图4为证明siehd2对emt相关蛋白表达水平影响的结果图；
30.图5为ehd2慢病毒过表达载体的质粒图谱图；
31.图6为1v-ehd2组细胞与对照组(nc)蛋白免疫印迹实验结果图；
32.图7为1v-ehd2组细胞与对照组(nc)cck8实验结果图；
33.图8为lvehd2组细胞对照组(nc)transwell细胞迁移实验结果图；
34.图9为lvehd2组细胞对照组(nc)中emt相关蛋白表达水平的结果图。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
36.实施例1：ehd2的干扰sirna的设计
37.针对人ehd2基因(genbank id：nm_014601.4)设计三种sirna序列和对照序列，sirna及对照由和元生物公司化学合成。
38.sirna1的碱基序列为：
[0039]5′‑
uccgcaaacucaacccuuudtdt-3
′
，
[0040]5′‑
aaaggguugaguuugcggadtdt-3
′
：
[0041]
sirna2的碱基序列为：
[0042]5′‑
ggaaggagaacaagaagaadtdt-3
′
，
[0043]5′‑
uucuucuuguucuccuuccdtdt-3
′
；
[0044]
sirna3的碱基序列为：
[0045]5′‑
ccaaauacgacgagaucuudtdt-3
′
，
[0046]5′‑
aagaucucgucguauuuggdtdt-3
′
；
[0047]
sirna对照组的碱基序列为：
[0048]5′‑
uucuccgaacgucacgudtdt-3
′
[0049]5′‑
acgugacguucggagaadtdt-3
′
[0050]
实施例2：ehd2的干扰sirna的筛选和功能验证
[0051]
1、细胞培养
[0052]
本发明实验中所选用的a549非小细胞肺癌细胞系购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
[0053]
首先将水浴箱预先加热至37℃，打开超净台75％酒精擦拭后紫外线消毒30min。从-80℃超低温冰箱取出a549细胞株取出，迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并不断的摇动，使管中的液体迅速融化。融化后将冻存管放入离心机中以1000rpm/min速度离心2～5min。将冻存管放入超净台，打开并去除上清液后用完全培养基重悬，转移至25mm培养瓶，采用十字法进行晃匀，在显微镜下观察细胞的分布，从而确保细胞分布均匀，最后再将培养瓶放至37℃，含有5％co2的培养箱中过夜后，根据细胞情况确定换液时间。
[0054]
2、细胞传代
[0055]
a549非小细胞肺癌细胞系培养至1-2天，显微镜下观察细胞贴壁生长至约85％密度时倒去培养基，使用pbs(1
×
)冲洗2-3次后加入1ml的0.25％胰酶，当在显微镜下观察到贴壁的细胞约有50％飘起时，加入一定量的终止液，然后按顺时针的顺序对细胞进行吹打分散，最终把消化下来的细胞悬液放于15ml的离心管中，1000rpm/min，离心时间一股为2-5min，在弃掉上清液后加入完培并重悬细胞，以1∶2-1∶3的比例重新接种到新的培养瓶中进行继续培养。
[0056]
3、细胞转染
[0057]
种贴壁细胞：转染前24小时，使用无双抗完全培养基制备细胞悬液，充分混匀后使用细胞计数仪测得所需细胞浓度。并接种于六孔板内，保证每个孔内的细胞密度在转染时的融合度在50％左右。
[0058]
用50μl opti-mem稀释sirna(转染细胞的终浓度为50nm)，轻轻吹吸3-5次混匀。轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μl opti-mem稀释1.0μl lipofectaminetm 2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。混合转染试剂和sirna稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。将含有sirna1、sirna2、sirna3分别和sirna转染试剂的opti-mem混合后缓慢加入对应的24孔细胞板中，100μl/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。细胞板置于37℃、5％co2培养箱中培养18-48h。转染4-6h后可换新鲜培养基。
[0059]
4、蛋白质印迹实验
[0060]
为验证转染sirna后是否抑制肺癌细胞靶基因ehd2的表达，采用蛋白质印迹分析。分别培养正常的a549肺癌细胞以及3组稳转细胞组。将转染sirna的a549肺癌细胞系使用裂解缓冲液处理细胞并匀浆获得细胞裂解液。通过10％的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋
白质(室温，120-150v，120min)，取出聚丙烯酰胺凝胶进行pvdf膜电转移(4℃，300ma，90min)。取出pvdf膜，置于5％的脱脂牛奶封闭液中，室温下封闭约2h；以抗ehd2抗体(购自abcam公司)为一抗加入，室温下孵育约2h。再以兔抗(cst公司)为二抗加入，室温下孵育约2h。最后加入化学增强发光试剂显影，以gapdh为内参对照，结果如图1所示。
[0061]
由蛋白质印记实验结果可以看出，与阴性对照nc组的ehd2蛋白的表达水平相比，转染的sirna1组，sirna2组以及sirna3组的条带都减弱，这表明转染后的ehd2蛋白表达水平被抑制，且转染的sirna3组的蛋白水平抑制效果显著。
[0062]
综上发现，sirna3的对ehd2蛋白抑制水平最为显著，故以下5-7实验中的小干扰rna是指sirna3。
[0063]
5、cck-8细胞增殖实验
[0064]
为验证siehd2对肺癌细胞增殖的影响，采用cck-8细胞增殖实验：
[0065]
将进行小干扰rna转染后的a549细胞和阴性对照组细胞分别进行消化，低速离心，使用完全培养基重悬目的细胞。细胞计数仪器分批将样品细胞数调整至一致，96孔板里每孔细胞约为4
×
103，培养液每孔100μl。实验组设置3个复孔，同时设置完全培养基作为空白对照组，十字法晃匀，在显微镜下可观测细胞分布，确保细胞分布均匀，无堆积，无重叠。后将其转入37℃，含有5％co2的细胞培养箱内进行过夜培养。过夜培养时间完成后，在每孔中加入cck-8试剂，一股为10μl，再次移入37℃，含有5％co2的细胞培养箱内培养24-96h。按照酶标仪使用说明书上分别测定24、48、72、96h时450nm测定吸光度值，记录od值，根据数据绘制增殖曲线。结果如图2所示：由cck-8细胞增殖实验结果可见，与对照组(nc)相比，si-ehd2组细胞在检测的第48h，72h及96h的od值明显增高(p＜0.05)。
[0066]
6、为验证ehd2sirna对肺癌细胞迁移能力的影响，采用transwell细胞迁移实验：
[0067]
将目的细胞依次进行消化，离心，使用pbs(1
×
)重新悬浮目的细胞，再次清洗，离心后去除上层液体，最后使用基配(无血清)重悬细胞。取无血清基培细胞母液进行细胞计数，用无血清基培调整细胞密度达到目的细胞数，约3
×
105个。采用无菌24孔板，将下室放入500ml的完全培养基(含10％胎牛血清)，将小室放入相对应的24孔板中。加入细胞悬液母液，体积约为200μl，轻微摇晃，最后放入细胞培养箱内进行培养，时间为24h。到规定时间后，取出24孔板，在空白孔内滴加4％多聚甲醛约600ml，将小室进行pbs冲洗后放入进行固定20min。一股在固定结束后使用pbs进行缓慢地冲洗，适当风干后，用结晶紫染液(0.1％)进行染色，时间为30min。轻轻取出小室，再用pbs清洗2-3遍，接着用棉签擦净上层小室内还未迁移的细胞，晾干后用显微镜进行观察和拍照。对对照组(nc)及siehd2组的迁移细胞数采用prism8.0进行组间差异分析，p值小于0.05具有统计学意义o结果如图3所示：通过transwell细胞迁移实验可见，图3的左侧两组图分别为nc组与siehd2组发生迁移侵袭的实验镜下图。图3的右侧两组图分别为比较nc组与siehd2组迁移侵袭能力的柱状图。结果表明与nc组相比，siehd2组的迁移侵袭的细胞数显著增加，迁移能力显著增强(p＜0.05)。
[0068]
7、为验证siehd2对细胞上皮-间充质转化进程(epithelium-mesenchymal transition，emt)的影响，采用蛋白质印记实验方法检测emt相关分子的表达水平。
[0069]
分别培养正常的a549肺癌细胞(nc)以及siehd2组a549肺癌细胞。将转染sirna的a549肺癌细胞系使用裂解缓冲液处理细胞并匀浆获得细胞裂解液。通过10％的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白质(室温，120-150v，120min)，取出聚丙烯酰胺凝胶进行pvdf膜电
转移(4℃，300ma，90min)。取出pvdf膜，置于5％的脱脂牛奶封闭液中，室温下封闭约2h。加入一抗，室温下孵育约2h。加入二抗，室温下孵育约2h。最后加入化学增强发光试剂显影，以gapdh为内参对照。结果如4所示，与对照组(nc)相比，siehd2组中e-cadherin的蛋白表达水平显著减弱，但n-cadherin和vimentin蛋白表达水平略有增加。结果表明，敲低的siehd2可以激活emt通路。
[0070]
实例3：一种慢病毒过表达载体介导的ehd2在非小细胞肺癌细胞的行为影响
[0071]
1、ehd2诱导表达病毒载体构建和鉴定委托和元生物公司完成，载体的质粒图谱如图5所示。构建步骤如下：所使用载体均为h19127载体，其元件顺序为：gl119 pslenti-cmv-mcs-3xflag-pgk-puro-wpre，使用上下游克隆酶切位点ecori酶及xmai酶切后琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体。使用对应的引物pcr扩增获取ehd2全长基因片段，引物对应关系如下表所示：
[0072]
正义序列：5
′‑
cgcaaatgggcggtaggcgtg-3
′
，
[0073]
反义序列：5
′‑
aagaacggagccggttggcg-3
′
。
[0074]
2、蛋白质印迹实验方法
[0075]
验证过表达ehd2的稳定细胞株中ehd2表达效果。分别培养正常的h1299肺癌细胞以及过表达稳转细胞组。将过表达ehd2稳定的肺癌细胞系使用裂解缓冲液处理细胞并匀浆获得细胞裂解液。通过10％的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白质(室温，120-150v，120min)，取出聚丙烯酰胺凝胶进行pvdf膜电转移(4℃，300ma，90min)。取出pvdf膜，置于5％的脱脂牛奶封闭液中，室温下封闭约2h；以抗ehd2抗体(购自abcam公司)为一抗加入，室温下孵育约2h。再以兔抗(cst公司)为二抗加入，室温下孵育约2h。最后加入化学增强发光试剂显影，以gapdh为内参对照，结果如图6所示。由蛋白质印记实验结果可以看出，与阴性对照nc组的ehd2蛋白的表达水平相比，过表达的ehd2的条带显著增强，这表明慢病毒过表达载体介导的ehd2的蛋白表达水平显著上调。
[0076]
3、cck-8细胞增殖实验
[0077]
为验证lvehd2对肺癌细胞增殖的影响，采用cck-8细胞增殖实验：将进行慢病毒过表达载体介导的ehd2在h1299肺癌细胞系和阴性对照组细胞分别进行消化，低速离心，使用完全培养基重悬目的细胞。细胞计数仪器分批将样品细胞数调整至一致，96孔板里每孔细胞约为4
×
103，培养液每孔100μl。实验组设置3个复孔，同时设置完全培养基作为空白对照组，十字法晃匀，在显微镜下可观测细胞分布，确保细胞分布均匀，无堆积，无重叠。后将其转入37℃，含有5％co2的细胞培养箱内进行过夜培养。过夜培养时间完成后，在每孔中加入cck-8试剂，一股为10μl，再次移入37℃，含有5％co2的细胞培养箱内培养24-96h。按照酶标仪使用说明书上分别测定24、48、72、96h时450nm测定吸光度值，记录od值，根据数据绘制增殖曲线。结果如图7所示：由cck-8细胞增殖实验结果可见，与对照组(nc)相比，1v-ehd2组细胞在检测的第48h，72h及96h的od值明显降低(p＜0.05)。
[0078]
4、为验证过表达ehd2对肺癌细胞迁移能力的影响，采用transwell细胞迁移实验：将目的细胞依次进行消化，离心，使用pbs(1
×
)重新悬浮目的细胞，再次清洗，离心后去除上层液体，最后使用基配(无血清)重悬细胞。取无血清基培细胞母液进行细胞计数，用无血清基培调整细胞密度达到目的细胞数，约3
×
105个。采用无菌24孔板，将下室放入500ml的完全培养基(含10％胎牛血清)，将小室放入相对应的24孔板中。加入细胞悬液母液，体积约
为200μl，轻微摇晃，最后放入细胞培养箱内进行培养，时间为24h。到规定时间后，取出24孔板，在空白孔内滴加4％多聚甲醛约600ml，将小室进行pbs冲洗后放入进行固定20min。一股在固定结束后使用pbs进行缓慢地冲洗，适当风干后，用结晶紫染液(0.1％)进行染色，时间为30min。轻轻取出小室，再用pbs清洗2-3遍，接着用棉签擦净上层小室内还未迁移的细胞，晾干后用显微镜进行观察和拍照。对对照组(nc)及lvehd2组的迁移细胞数采用prism8.0进行组间差异分析，p值小于0.05具有统计学意义。结果如图8所示：通过transwell细胞迁移实验可见，图8的左侧两组图分别为nc组与lvehd2组发生迁移侵袭的实验镜下图。图8的右侧两组图分别为比较nc组与lvehd2组迁移侵袭能力的柱状图。结果表明与nc组相比，lvehd2组的迁移侵袭的细胞数显著降低，迁移能力显著抑制(p＜0.05)。
[0079]
5、为验证lvehd2对细胞上皮-间充质转化进程(epithelium-mesenchymal transition，emt)的影响，采用蛋白质印记实验方法检测emt相关分子的表达水平。分别培养正常的h1299肺癌细胞(nc)以及lvehd2组h1299肺癌细胞。将过表达的h1299肺癌细胞系使用裂解缓冲液处理细胞并匀浆获得细胞裂解液。通过10％的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白质(室温，120-150v，120min)，取出聚丙烯酰胺凝胶进行pvdf膜电转移(4℃，300ma，90min)。取出pvdf膜，置于5％的脱脂牛奶封闭液中，室温下封闭约2h。加入一抗，室温下孵育约2h。加入二抗，室温下孵育约2h。最后加入化学增强发光试剂显影，以gapdh为内参对照。结果如图9所示，与对照组(nc)相比，lvehd2组中e-cadherin的蛋白表达水平显著增强，但n-cadherin和vimentin蛋白表达水平略有减少。结果表明，过表达的ehd2可以抑制emt通路。