间甲酚在治疗冠状病毒感染性疾病药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及间甲酚在治疗病毒感染性疾病药物中的应用。


背景技术：

2.间甲酚(c7h8o)又名间甲基苯酚，是合成农药的重要精细化工中间体，主要应用于合成杀虫剂杀螟松、速杀威、倍硫磷以及拟除虫菊酯类农药中间体间苯氧基苯甲醛等。近年以来，我国农药产品生产与发展前景广阔，对间甲酚的市场需求量保持平均8％～10％的速度增加。此外，间甲酚也是制造树脂、增塑剂、药物和香料等的重要原料。随着石油化工的发展，有机合成产品的种类不断增多，市场对间甲酚的需求量也日益增大，间甲酚纯度也逐渐提高。间甲酚是也是一种常用的防腐剂。间甲酚可通过使蛋白质凝固、变性和溶解脂肪达到抑制微生物生长的作用。目前没有关于间甲酚可治疗病毒感染性疾病的报道。
3.冠状病毒在自然界中广泛存在，1937年首次从家禽体内分离，最早在人体内发现是在1965年。冠状病毒共分为4个属(α、β、γ、δ)。目前已鉴定出了7种可以感染人类的冠状病毒，其中4种冠状病毒(hcov-nl63、hcov-229e、hcov-oc43和hcov-hku1)，在人群中较为常见，致病性较低，一般引起轻度呼吸道疾病，类似于普通感冒，另外3种冠状病毒(sars-cov、sars-cov-2和mers-cov)的致病性、传染性都较高，给人类健康造成了极大的威胁。
4.全球范围内的上呼吸道感染中，10％～30％由人类冠状病毒引起，在近20年间，冠状病毒新变种不断出现，致病力变强的同时呈现出从局地暴发向全球扩散的特点，给全球健康带来极大威胁。在没有疫苗可用的情况下，抗病毒药物研究对于病毒防控至关重要。但目前还没有治疗冠状病毒感染的特效药物被批准上市，因此迫切需要一种预防和治疗人冠状病毒药物的出现。


技术实现要素：

5.针对上述临床需要，我们对大量酚类化合物进行了药效筛选，本发明提供了间甲酚在制备治疗或预防冠状病毒感染疾病药物中的应用。目前，关于上述应用，尤其是间甲酚在治疗人冠状病毒hcov-229e感染疾病中的应用，尚未见任何报道。
6.本发明的目的在于，提供间甲酚用于制备预防或治疗冠状病毒感染性疾病药物中的应用。
7.其中，所述间甲酚的分子式为c7h8o，分子量为108.14。
8.优选的，所述冠状病毒感染性疾病为人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病。
9.优选的，所述人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病包括肺炎、肾炎和肝炎。
10.优选的，所述预防或治疗冠状病毒感染性疾病的药物是指含有间甲酚的药物制剂。
11.其中，
12.所述药物制剂是由间甲酚和适当药物辅料制备成的液体制剂或固体制剂。
13.所述制剂可以是吸入制剂、注射剂、口服制剂或鼻喷剂。
14.更优选的，所述吸入制剂中，间甲酚的质量百分含量为0.02％-0.64％，进一步优选为0.16％-0.64％。
15.其中，所述吸入制剂是指雾化吸入溶液，处方组成为间甲酚、氯化钠和注射用水。
16.优选的，所述间甲酚的用量为0.02g-0.64g，氯化钠的用量为8.0g-10.0g，注射用水用量加至溶液体积为1000ml。
17.其具体制备方法为：
18.称取处方量的间甲酚和氯化钠，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经微孔滤膜滤过，按无菌生产工艺制备，即得。
19.本发明的有益效果：本发明技术方案通过在感染人冠状病毒hcov-229e的小鼠试验中验证间甲酚的新用途，该技术方案具有新颖性，并进行了间甲酚在治疗由hcov-229e病毒感染引起的肺炎的疗效试验，试验结果显示，间甲酚对感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺指数及抑制率中表现出了良好的药效。本发明方案还通过实施例显示了间甲酚的抗病毒药物应用实例。
具体实施方式
20.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
21.试验例1
22.采用人冠状病毒hcov-229e感染小鼠肺炎模型，从肺指数和抑制率2个方面评价不同酚类化合物对人冠状病毒hcov-229e小鼠肺炎模型的治疗作用。
23.一、实验材料
24.1.1细胞株为小鼠单核巨噬细胞raw264.7，购自北京北纳创联生物技术研究院，本实验室传代，液氮保存备用。
25.1.2病毒株为人冠状病毒hcov-229e，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，本实验室传代，-80℃冰箱保存备用。
26.1.3受试药物间苯三酚浓度为0.3％，戊基间甲酚浓度为0.3％，间甲酚浓度为0.3％。
27.1.4实验试剂见表1。
28.表1：
29.试剂名称批号生产厂家试剂用途乙醚20150417国药集团化学试剂有限公司小鼠麻醉
30.1.5实验仪器见表2。
31.表2：
[0032][0033]
二、实验方法
[0034]
2.1药物配制
[0035]
受试药物的配制：参照实施例1-3，分别按照以上浓度雾化吸入，每次10min，每日1次，连续4天给药。
[0036]
2.2病毒传代
[0037]
取已长成单层raw264.7细胞的25cm2培养瓶，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，加入细胞维持液5ml，再加入hcov-229e病毒液200μl，置37℃5％co2培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，直至80％细胞出现明显病变(cpe)后，将细胞培养瓶置于-80℃低温冰箱冻存，病毒液反复冻融3次后，用于病毒滴度测定。
[0038]
2.3病毒滴度测定
[0039]
取已长成单层raw264.7细胞的96孔板，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞3遍后，按10倍倍比(10-1～10-8)稀释接种不同滴度的hcov-229e病毒液，共8个稀释度，100μl/孔，每个稀释度做4个复孔，同时设正常细胞对照。96孔板置37℃5％co2培养箱中培养72h～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，并记录各孔的细胞病变情况。按reed-muench法计算50％细胞病变浓度(tcid50)。
[0040]
2.4人冠状病毒肺炎小鼠模型构建及给药
[0041]
icr小鼠40只，按体重随机分为：正常对照组、模型对照组、间苯三酚组、戊基间甲酚组、间甲酚组。每组8只，雌雄各半。除正常对照组外，其他各组小鼠乙醚轻度麻醉后，用100tcid50 hcov-229e滴鼻感染，50μl/只。感染当天，各给药组雾化吸入，每次10min，每日1次，连续4天。末次给药后一天称量体重后，解剖取肺并称量肺重，计算肺指数和肺指数抑制率。
[0042]
2.5小鼠肺指数及抑制率计算
[0043]
小鼠称量体重后解剖取肺组织并称量肺重，计算小鼠肺指数及抑制率，具体计算公式如下：
[0044]
肺指数＝肺湿重(g)
×
100/体重(g)
[0045][0046]
2.6统计分析
[0047]
数据采用(mean
±
sd)表示，组间差异采用t检验，p《0.05为差异具有统计学意义。
[0048]
三、实验结果
[0049]
表3受试药物对人冠状病毒肺炎小鼠模型的影响(肺指数及抑制率)
[0050][0051][0052]
由表3结果可知，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肺指数显著增加(p《0.01)；与模型对照组比较，间甲酚组小鼠肺指数显著降低(p《0.01)，相对于间苯三酚组和戊基间甲酚组，间甲酚组具有良好的治疗效果。
[0053]
试验例2
[0054]
采用人冠状病毒hcov-229e感染小鼠肺炎模型，从肺指数和抑制率2个方面评价间甲酚对人冠状病毒hcov-229e小鼠肺炎模型的治疗作用。
[0055]
一、实验材料
[0056]
1.1细胞株为小鼠单核巨噬细胞raw264.7，购自北京北纳创联生物技术研究院，本实验室传代，液氮保存备用。
[0057]
1.2病毒株为人冠状病毒hcov-229e，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，本实验室传代，-80℃冰箱保存备用。
[0058]
1.3受试药物为间甲酚，分子量为108.14。
[0059]
1.4实验试剂见表4。
[0060]
表4实验用试剂
[0061]
试剂名称批号生产厂家试剂用途乙醚20150417国药集团化学试剂有限公司小鼠麻醉
[0062]
1.5实验仪器见表5。
[0063]
表5实验用仪器
[0064][0065]
二、实验方法
[0066]
2.1药物配制
[0067]
受试药物的配制：根据实施例4-10制备间甲酚1组(0.01％)、间甲酚2组(0.02％)、间甲酚3组(0.08％)、间甲酚4组(0.16％)、间甲酚5组(0.32％)、间甲酚6组(0.64％)、间甲酚7组(1.28％)，直接雾化吸入给药，每次10min，每日1次，连续4天。
[0068]
2.2病毒传代
[0069]
取已长成单层raw264.7细胞的25cm2培养瓶，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，加入细胞维持液5ml，再加入hcov-229e病毒液200μl，置37℃5％co2培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，直至80％细胞出现明显病变(cpe)后，将细胞培养瓶置于-80℃低温冰箱冻存，病毒液反复冻融3次后，用于病毒滴度测定。
[0070]
2.3病毒滴度测定
[0071]
取已长成单层raw264.7细胞的96孔板，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞3遍后，按10倍倍比(10-1～10-8)稀释接种不同滴度的hcov-229e病毒液，共8个稀释度，100μl/孔，每个稀释度做4个复孔，同时设正常细胞对照。96孔板置37℃5％co2培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，并记录各孔的细胞病变情况。按reed-muench法计算50％细胞病变浓度(tcid50)。
[0072]
2.4人冠状病毒肺炎小鼠模型构建及给药
[0073]
icr小鼠72只，按体重随机分为：正常对照组、模型对照组、间甲酚给药7个剂量组。每组8只，雌雄各半。除正常对照组外，其他各组小鼠乙醚轻度麻醉后，用100tcid50 hcov-229e滴鼻感染，50μl/只。感染当天，各给药组雾化吸入，每次10min，每日1次，连续4天。末次给药后一天称量体重后，解剖取肺并称量肺重，计算肺指数和肺指数抑制率。
[0074]
2.5小鼠肺指数及抑制率计算
[0075]
小鼠称量体重后解剖取肺组织并称量肺重，计算小鼠肺指数及抑制率，具体计算公式如下：
[0076]
肺指数＝肺湿重(g)
×
100/体重(g)
[0077][0078]
2.6统计分析
[0079]
数据采用(mean
±
sd)表示，组间差异采用t检验，p《0.05为差异具有统计学意义。
[0080]
三、实验结果
[0081]
表6受试药物对人冠状病毒肺炎小鼠模型的影响(肺指数及抑制率)
[0082][0083]
注：与正常对照组比较
##
p《0.01；与模型对照组比较*p《0.05，**p《0.01。
[0084]
由表6结果可知，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肺指数显著增加(p《0.01)；与模型对照组比较，间甲酚2组、3组、4组、5组、6组小鼠肺指数显著降低(p《0.05，p《0.01)，以上组别的肺指数抑制率分别为60.73％、67.86％、101.55％、99.45％、99.32％。1组
(0.01％)抑制人冠状病毒229e造成的小鼠肺炎的作用不明显，7组(1.28％)抑制人冠状病毒229e造成的小鼠肺炎的作用也不明显。
[0085]
实施例1间苯三酚雾化吸入制剂
[0086]
间苯三酚2g
[0087]
氯化钠9.0g
[0088]
注射用水加至
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000ml
[0089]
制备工艺：
[0090]
步骤1：称取间苯三酚2g，氯化钠9.0g，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0091]
步骤2：灌封于棕色安瓿瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
[0092]
实施例2戊基间甲酚雾化吸入制剂
[0093]
戊基间甲酚2g
[0094]
氯化钠9.0g
[0095]
注射用水加至
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000ml
[0096]
制备工艺：
[0097]
步骤1：称取戊基间甲酚2g，氯化钠9.0g，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0098]
步骤2：灌封于棕色安瓿瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
[0099]
实施例3间甲酚雾化吸入制剂
[0100]
间甲酚2g
[0101]
氯化钠9.0g
[0102]
注射用水加至
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000ml
[0103]
制备工艺：
[0104]
步骤1：称取间甲酚2g，氯化钠9.0g，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0105]
步骤2：灌封于棕色安瓿瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
[0106]
实施例4间甲酚雾化吸入制剂
[0107]
间甲酚0.1g
[0108]
氯化钠9.0g
[0109]
注射用水加至
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000ml
[0110]
制备工艺：
[0111]
步骤1：称取间甲酚0.1g，氯化钠9.0g，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0112]
步骤2：在无菌环境下灌封于棕色安瓿瓶中，即得。
[0113]
实施例5间甲酚雾化吸入制剂
[0114]
间甲酚0.2g
[0115]
氯化钠9.0g
[0116]
注射用水加至
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000ml
[0117]
制备工艺：
[0118]
步骤1：称取间甲酚0.2g，氯化钠9.0g，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0119]
步骤2：在无菌环境下灌封于棕色安瓿瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
[0120]
实施例6间甲酚雾化吸入制剂
[0121]
间甲酚0.8g
[0122]
氯化钠9.0g
[0123]
注射用水加至
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000ml
[0124]
制备工艺：
[0125]
步骤1：称取间甲酚0.8g，氯化钠9.0g，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0126]
步骤2：在无菌环境下灌封于棕色安瓿瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
[0127]
实施例7间甲酚雾化吸入制剂
[0128]
间甲酚1.6g
[0129]
氯化钠9.0g
[0130]
注射用水加至
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000ml
[0131]
制备工艺：
[0132]
步骤1：称取间甲酚1.6g，氯化钠9.0g，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0133]
步骤2：在无菌环境下灌封于棕色安瓿瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
[0134]
实施例8间甲酚雾化吸入制剂
[0135]
间甲酚3.2g
[0136]
氯化钠9.0g
[0137]
注射用水加至
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000ml
[0138]
制备工艺：
[0139]
步骤1：称取间甲酚3.2g，氯化钠9.0g，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0140]
步骤2：在无菌环境下灌封于棕色安瓿瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
[0141]
实施例9间甲酚雾化吸入制剂
[0142]
间甲酚6.4g
[0143]
氯化钠9.0g
[0144]
注射用水加至
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000ml
[0145]
制备工艺：
[0146]
步骤1：称取间甲酚6.4g，氯化钠9.0g，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0147]
步骤2：在无菌环境下灌封于棕色安瓿瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30min，即得。
[0148]
实施例10间甲酚雾化吸入制剂
[0149]
间甲酚12.8g
[0150]
氯化钠9.0g
[0151]
注射用水加至
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1000ml
[0152]
制备工艺：
[0153]
步骤1：称取间甲酚12.8g，氯化钠9.0g，20℃～35℃下加入注射用水1000ml，稀释、搅拌均匀，经0.22μm微孔滤膜滤过；
[0154]
步骤2：在无菌环境下灌封于棕色安瓿瓶中，115℃高压蒸汽灭菌30min，即得。