一种肝癌模型及其构建方法与应用与流程

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1.本发明涉及生物模型技术领域，特别是涉及一种肝癌肿瘤模型的构建方法及应用。


背景技术：

2.2020年，原发性肝癌是全球第六大最常被诊断出的癌症，也是癌症死亡的第三大原因，约有90.6万例新病例和83万例死亡。在大多数地区，男性的发病率和死亡率都是女性的2到3倍。肝癌在全球发病率方面排名第五，在男性死亡率方面排名第二。但主要在过渡国家观察到发病最高的癌症，如东亚(蒙古的发病率远远超过任何其他国家)、东南亚(如泰国、柬埔寨、越南)、和北非和西非。肝癌是蒙古、泰国、柬埔寨、埃及、危地马拉以及另外18个国家的主要癌症死亡原因。原发性肝癌包括肝细胞癌(hcc)(占75％-85％)和肝内胆管癌(10％-15％)以及其他罕见类型。hcc的主要危险因素是慢性感染乙型肝炎病毒(hbv)或丙型肝炎病毒(hcv)、食用黄曲霉毒素污染的食物、大量饮酒、体重超重、2型糖尿病和吸烟。大多数患者发现时已有转移，转移性肝癌治疗难度大，预后极差，迫切需要我们对其进一步的研究。
3.动物模型是一个成熟的工具，用于了解疾病的发病机制，确定治疗目标和筛选有效的药物。由于复杂的病因和肿瘤的异质性，开发类似于人类疾病环境的hcc动物模型是一个挑战。目前可用的动物模型可分为如下：(a)化学诱导模型、(b)转基因小鼠(gem)模型和(c)移植模型。
4.转基因小鼠(gem)模型成本高昂，需要大量人力物力，周期长，较少使用。目前最常用的肿瘤细胞种植法采用的是通过皮下、鼠尾静脉、腹腔等途径注射悬浮肿瘤细胞，形成异位肝癌模型，但这个模型有其最根本的缺点：不能完全模拟体内肿瘤生长微环境，其肿瘤生长与人体内生长方式有巨大差别，例如，研究最多的皮下移植瘤模型易形成包膜、不易转移、易中央坏死，需要我们对其加以改进，构建一个更好的原位模型，最大限度的贴合肝癌在人体内的肿瘤生长微环境，模拟人体内肿瘤的生物学特性，对其进行更进一步研究。
5.化学诱导模型是比较常用的模型。人类不可避免地暴露在有毒的化合物中，有几种公认的化学诱导物质可以诱导肝损伤，因此在hcc模型中被用作启动子，如二乙基亚硝胺(den)，四氯化碳(ccl4)，硫代乙酰胺(taa)，5-苯-5-乙巴比妥(pb)。这些化学物质主要导致肝细胞死亡、脂肪变性或胆汁淤积，随后是炎症和纤维化。临床中我们发现高同型半胱氨酸血症的表现形式多样，比如脂肪肝，肝纤维化等，肝纤维化进一步发展为肝硬化、肝癌。而目前尚未有高同型半胱氨酸血症发展为肝癌的模型来模拟这一发病机制。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明将提供一种高蛋氨酸联合二乙基亚硝胺(den)和四氯化碳(ccl4)构建的肝癌肿瘤模型，该模型能更好的模拟高同型半胱氨酸血症的发病机制，且这种肝癌模型的建立，较目前常用的den ccl4致癌模型(20周以上建模时间)，造模时
间明显缩短，成功率更高。
7.所述肝癌肿瘤模型的构建方法如下：采用蛋氨酸质量百分含量为2％的高蛋氨酸饲料喂养小鼠，直到造模成功；从第1周起每周灌胃2次ccl4，直到造模成功；从第1周起腹腔注射den，每周注射1次，连续注射4周；
8.进一步地，造模用小鼠为6-8周龄的雄性c57bl/6j小鼠；
9.进一步地，所述ccl4采用玉米油稀释成15％浓度(v:v)，灌胃剂量为每次5ml/kg；
10.进一步地，腹腔注射的den浓度为10μg/ml，每次注射剂量为100mg/kg；
11.进一步地，造模期间小鼠自由饮水自由食用饲料，并定期更换灭菌饲料和灭菌水；
12.更进一步地，造模期间将小鼠放置于清洁evc鼠笼，每3天更换一次灭菌垫料、饲料及灭菌水；
13.进一步地，造模时间为8周；
14.进一步地，造模8周后，处死小鼠，取肝脏进行小鼠肝癌的病理组化判定，通过he染色和马松染色观察肝脏的组织结构和转移、侵袭情况，肉眼观可见造模组肝脏表面凸起的肿块，he染色可见造模组有瘤巨细胞和病理性核分裂，马松染色看到造模组明显纤维化。
15.本发明还提供采用上述方法构建的肝癌肿瘤模型，及其应用，特别是在制备肝脏疾病相关药物中的应用，以及在肝脏相关疾病的治疗、检测和/或预后中的应用。
16.有益效果：
17.1、本发明首次采用高蛋氨酸联合二乙基亚硝胺(den)和四氯化碳(ccl4)构建肝癌肿瘤模型，该模型可以广泛应用于基础和临床研究，
①
有利于监测高同型半胱氨酸血症发展为肝癌的生物学行为；
②
有利于监测此病因导致肝癌的放化疗及生物靶向治疗敏感性，提供最佳治疗方案的选择；
③
将该肝癌非人动物模型用于筛选预防或治疗高同型半胱氨酸血症导致肝癌的药物的研究。
18.2、本发明操作简单，且周期短(8周)，成功率高(成瘤率93％)，死亡率低。因此，这一研究平台的建立，有其他模型不可替代的必要性，也必将受到越来越多的科技工作者的重视，并具有广阔的研究前景。
附图说明：
19.图1为造模流程图。
20.图2小鼠马松染色图；a:正常组；b：第5周2％高蛋氨酸 den ccl4组。
21.图3小鼠马松染色图；a:正常组；c：第8周2％高蛋氨酸 den ccl4组。
22.图4小鼠马松染色图；a:正常组；d：第20周den ccl4组。
23.图5小鼠he染色图；a:正常组；b：第5周2％高蛋氨酸 den ccl4组。
24.图6小鼠he染色图；a:正常组；c：第8周2％高蛋氨酸 den ccl4组。
25.图7小鼠he染色图；a:正常组；d：第20周den ccl4组。
26.图2-图7中的染色图为光学显微镜40
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放大。
具体实施方式：
27.为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不
用于限定本发明。
28.本发明提供的造模方法流程如如图1所示，以下将结合具体实施例对本发明做进一步的解释说明。
29.本发明使用的部分材料和方法如下，本发明涉及材料均可通过市售获得：
30.ccl4(玉米油稀释成15％浓度)，玉米油，den(生理盐水稀释至浓度为10μg/ml)，含2％高蛋氨酸饲料，正常饲料，4％福尔马林。其中，含2％高蛋氨酸饲料，正常饲料(ain93g标准饲料)均购自南通特洛菲饲料科技有限公司。
31.6-8周龄的雄性c57bl/6j小鼠(购自北京维通达生物技术有限公司)，重14-16g，随机分组，1组30只。
32.实施例1一种肝癌肿瘤模型的构建方法
33.步骤s1：建立原位异种鼠肝癌模型，具体为：
34.步骤s1a：选取120只6-8周龄的雄性c57bl/6j小鼠；
35.步骤s1b：设置对照组，2％高蛋氨酸 den ccl4实验组，den ccl4实验组：
36.对照组：30只小鼠。正常饲料喂养，不做处理。
37.2％高蛋氨酸 den ccl4实验组：60只小鼠(分为两组，每组30只)。用含2％高蛋氨酸饲料喂养和自由饮水。将小鼠放置于清洁evc鼠笼，加入灭菌饲料，更换灭菌水；将evc鼠笼送至动物房。每3天更换一次灭菌垫料、饲料及灭菌水，观察小鼠活力及生长状态；
38.从第1周起每周灌胃2次ccl4(用玉米油稀释成15％浓度)，剂量为每次5ml/kg，直到造模成功；
39.从第1周起腹腔注射den(10μg/ml)，每周注射1次，每次100mg/kg，连续注射4周。
40.den ccl4实验组：30只小鼠。与2％高蛋氨酸 den ccl4实验组相比，将2％高蛋氨酸饲料替换为不含蛋氨酸的正常饲料，其余实验设置均相同。
41.步骤s2：通过he染色观察肿瘤的组织结构和转移、侵袭情况。具体为：
42.步骤s2a：分别于5、8周后处死一组2％高蛋氨酸 den ccl4小鼠，于20周后处死den ccl4实验组及正常组，打开腹腔和胸腔，观察肝脏肿瘤组织的大体形态、生长浸润情况以及远处转移情况，并将肝脏固定在4％福尔马林中。
43.步骤s2b：经过福尔马林固定的肝脏组织包埋于石蜡中，4个μm切片切取，苏木精-伊红(he)染色，收集肝脏组织标本均进行常规病理组织学检测，并应用马松染色评估肝脏纤维化的情况。结果如下：
44.第5周2％高蛋氨酸 den ccl4实验组马松染色，结果如图2所示，轻度纤维化；
45.第5周2％高蛋氨酸 den ccl4实验组he染色，结果如图5所示，未见异形性细胞。
46.第8周2％高蛋氨酸 den ccl4实验组马松染色，结果如图3所示，显示实验组可见明显纤维化；
47.第8周2％高蛋氨酸 den ccl4实验组he染色，结果如图6所示，显示实验组核质比例加大，细胞核呈多行性，染色深，核仁增多且不规则，分裂像增多，肿瘤散发，约2-3mm大小；
48.外观可见肝脏上都有灰白色的肿瘤组织，表面呈结节状，质地较硬，独立或弥漫分布在肝表面和肝边缘处，部分结节可融合成较大的结节；
49.且经过解剖其他部位器官未观察到肿瘤转移情况。
50.第20周den ccl4实验组马松染色，结果如图4所示，轻度纤维化；
51.第20周den ccl4实验组he染色，结果如图7所示，未见异形性细胞；
52.外观可见肝脏整体外观表面光滑，颜色红润，质地稍硬。
53.第20周正常组马松染色，结果如各图a所示，未见纤维化；
54.第20周正常组he染色，结果如各图a所示，未见异型性细胞；
55.外观肝脏整体外观表面光滑，颜色红润，质地柔软。
56.步骤s3：计算成瘤率，结果如表1所示，采用本实施例方法，2％高蛋氨酸 den ccl4实验组的30只实验小鼠中，在8周造模结束时，死亡3只，其余存活的27只中有25只成瘤，死亡率10％，成瘤率93％。
57.表1
[0058][0059][0060]
综合马松染色、he染色结果，以及成瘤率数据，可以确定2％高蛋氨酸 den ccl4实验组肝癌肿瘤造模成功。
[0061]
采用上述方法经过多次重复试验，2％高蛋氨酸 den ccl4实验组均能在8周造模成功，图2-7为多次重复试验的马松染色图及he染色图。结果显示，本发明造模方法较为稳定，造模成瘤率和存活率都能保持在90％以上。
[0062]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。