一种应用vismodegib使鼠类多生牙的方法与流程

1.本发明属于牙科领域，尤其涉及鼠类多生牙的研究。


背景技术：

2.本发明所述的多生牙是指多于现有牙齿数目的牙齿，研究认为多生牙形成可能是挽救了退化的牙齿或者是诱导含有成牙上皮能力的干细胞发育而成。
3.目前人类治疗牙齿缺失的办法有：可摘义齿、固定义齿或者是种植义齿等，但是这些修复义齿仍然与天然牙之间存在着明显差异，因此如果能通过牙齿再生来治疗牙齿缺失，无疑是人类的福音。牙齿再生研究者甚多，暂无结果。目前现有研究发现通过转基因手段诱发小鼠的残余连续性牙板持续高表达wnt信号通路可以诱发局部上皮进一步发育形成牙齿样的结构(popa e,buchtova m,tucker a.revitalising the rudimentary replacement dentition in the mouse.development(cambridge,england).2019；146(3).https://doi.org10.1242/dev.171363.)如图1箭头所示，为通过转基因手段诱导小鼠残余连续性牙板上皮增殖发育形成牙蕾样的结构组织，但是文章中报道其并未观察到牙齿自然萌出，说明了残余连续性牙板具有诱导成牙的潜能。
4.不同物种牙齿的再生能力不同，多牙列动物具有无限的牙齿再生能力，双牙列物种具有有限的牙齿再生能力，人类是双牙列，其牙齿具有有限的再生能力。人们将第一副牙列称为乳牙，第二副牙列称为恒牙，而第三牙列则是指多于第二牙列的牙齿。研究发现第一牙列起源于牙板上皮，而第二牙列的发育起源于连续性牙板上皮，其中连续性牙板上皮是一种位于第一牙列舌侧的牙板上皮结构。人们发现无论是牙板上皮还是连续性牙板均含有牙源性上皮的干细胞。通过对小鼠第一牙列的研究，人们发现小鼠也存在着类似的连续性牙板结构。


技术实现要素：

5.牙再生是治疗牙齿缺失的最佳办法，本发明的目的在于通过研究多生牙发育机制有望进一步实现牙再生的梦想，本发明提供一种应用vismodegib使鼠类多生牙的方法，以推进牙再生的实现。
6.本发明所采用的技术方案为一种应用vismodegib使鼠类多生牙的方法，其特征是,将鼠类雌雄于发情期合笼，次日检测雌鼠，如见雌鼠有阴栓，则定为e0.5天，并将其与雄性鼠类分开饲养，在雌性孕鼠怀孕天数至e15.0-17.0天，将vismodegib通过单次灌胃给药的方式进入孕鼠体内。
7.vismodegib是一种hh信号通路抑制剂，目前已经被fda批准由于临床治疗多种实体肿瘤的药物，对基底细胞癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌等有疗效。研究表明其可以抑制肿瘤细胞的生长，本发明创造性地将vismodegib用于鼠类多生牙研究，通过灌胃的方式给予孕鼠vismodegib，可以诱导小鼠第二牙列发育、萌出产生稳定的舌侧多生牙表型。
8.单次灌胃的方式给予孕鼠vismodegib的量为(150mg/kg-200mg/kg)。在150mg/kg
可以诱导产生50％以上的舌侧多生牙小鼠，而随着浓度增加我们发现部分小鼠在e15.5时给予200mg/kg可以诱导小鼠接近100％的舌侧多生牙。
9.所述的鼠类为小鼠。
10.所述的小鼠为野生型。
11.雌雄以1:1比例进行合笼。雌雄比例可以为3-1:1，而1:1的比例有助于提高雌鼠的受孕率。
12.在雌性孕鼠怀孕天数至e15.5进行单次灌胃的方式给予孕鼠vismodegib的量为：200mg/kg。
13.合笼的时间为动物交配时间。基于人类对动物长时间的研究，对于某些动物的交配时间已有明确的认知，将合笼的时间定为动物天然的交配时间，有利于交配的发生，增加受孕的成功率。
14.合笼的时间为18-22点。经研究认为该时间点比较符合小鼠的生理。
15.本发明创造性地将治疗肿瘤的vismodegib用于鼠类多生牙研究，通过灌胃的方式给予孕鼠vismodegib，可以诱导小鼠第二牙列发育、萌出产生稳定的舌侧多生牙表型。其单次给药减少对孕鼠刺激，灌胃给药的方式操作简单，其中在150mg/kg可以诱导产生50％以上的舌侧多生牙小鼠，而随着浓度增加我们发现部分小鼠在给予200mg/kg可以诱导100％的舌侧多生牙小鼠模型；再者，本项目诱导的小鼠可以自然生长、牙齿自行萌出至成年，尚未发现明显其他的身体畸形。通过本发明所建立小鼠多生牙的模型，周期短，经济成本低，可重复性强。
附图说明
16.图1为现有技术中通过转基因手段诱导小鼠残余连续性牙板上皮增殖发育形成牙蕾样的结构组织对照图图2为本发明e16.5-18.5小鼠vismodegib灌胃后的he切片染色对照图图3为出生后28天小鼠的micro-ct三维重建vismodegib与对照组下颌牙列图4为e9.5-10.5小鼠vismodegib灌胃后诱导第一牙列舌侧形成多生牙的he切片染色结果图5为vismodegib不同时间点诱导胎鼠上下颌舌侧多生磨牙统计图图6为不同浓度vismodegib诱导e15.5小鼠形成多生的统计图图7为应用vismodegib处理过的小鼠多生切牙与对照组的比较图
具体实施方式
17.下面结合视图对本发明进行详细的描述，以使本专业的技术人员更理解本发明。
18.如图2-6所示，本发明是一种应用vismodegib使鼠类多生牙的方法，将鼠类雌雄以3-1:1的比例于发情期合笼，最好合笼雌雄的比例为1:1，次日检测雌鼠，如见雌鼠有阴栓，则定为e0.5天(胚胎胎龄0.5天)，并将其与雄性鼠类分开饲养，在雌性孕鼠怀孕天数至e15.0-17.0天(通过直接计算胎龄而得)，将vismodegib通过单次灌胃的方式进入孕鼠体内。单次灌胃的方式给予孕鼠vismodegib的量为150mg/kg-200mg/kg。在150mg/kg可以诱导产生50％以上的舌侧多生牙小鼠，而随着浓度增加我们发现部分小鼠在给予200mg/kg可以
诱导100％的舌侧多生牙。
19.实施例，野生型(野生型是指小鼠的品种基因纯正，没有经过人为的基因编辑手段进行改变)6-8周龄的icr小鼠200只(雌鼠)，雌雄以1:1比例进行合笼，合笼的时间为18-22点。第二日早检查雌鼠，120只见有阴栓，则定为e0.5天(胚胎胎龄0.5天)进行记录，日常饲养于环境温度为(25
±
2)℃、人工调控12h昼夜循环、自由进食和饮水的条件下，对雌鼠的体重十天内大于10g、肚子周长明显增大着即判定为怀孕，从e9.5开始每天任意取9只孕鼠进行vismodegib灌胃，其中3只给予vismodegib的量为100mg/kg，3只给予所给的量为150mg/kg，另3只所给的量为200mg/kg，一直到e18.5天，共10天，分成10大组，将剩余的30只小鼠中每3只为一对照组，分入每天的试验组中作对照。其中根据小鼠牙齿发育起始时间为10.5天，结合vismodegib药物动力学在100mg/kg给药剂量的时候其半衰期会长达24h，所以我们将本发明研究定义在9.5天为起始天数，而小鼠基本上怀孕至19.0天时候出生，故我们将实验的截止时间定在17.0天。我们的研究发现在e9.5-e17.0期间实验组给予100mg/kg的vismodegib而对照组给予等量溶剂的情况下，实验组与对照组的胎鼠中均未见多生牙形成。
20.如图2所示为本发明e16.5-p1.5与对照组的he切片染色比较图，图abcdefgh分别为图abcdefgh黑色方框区域局部放大图像，通过放大图像我们可以发现在正常鼠类发育过程中的e16.5-p1.5舌侧的残余连续性牙板上皮并未进一步发育(箭头所指处)，而经过vismodegib处理过的孕鼠其胎鼠在这个时间段上的形态发生了增殖及进一步发育成牙齿样结构(箭头所指该处发生的结构变化)，发现通过给予vismodegib可以诱导小鼠第一牙列舌侧形成多生牙。
21.图3为e15.5 150mg/kg vismodegib灌胃的出生后28天小鼠的micro-ct三维重建vismodegib与对照组下颌牙列，通过图像中我们可以明显发现经过vismodegib处理的出生小鼠第一牙列舌侧明显多形成一个牙齿，且这个牙齿具有完整的牙根，是一个独立的牙齿。说明了应用vismodegib可以促进小鼠舌侧形成多余的牙齿，促进全牙再生。
22.图4为e9.5-10.5小鼠vismodegib灌胃后的he切片染色结果显示在小鼠第一牙列发育的时候其同期下颌舌侧可见一个多余的牙齿样结构，说明了应用vismodegib不仅可以通过诱导牙板上皮也可以通过诱导连续性牙板上皮促进多生牙的形成。
23.图5为不同天数的孕鼠在e9.5-e17.0期间实验组给予vismodegib(150mg/kg)，而对照组给予等量溶剂所出生胎鼠的多生磨牙发生率的统计。通过图5我们发现e9.5-e10.5与e15.0-17.0为应用vismodegib诱导胎鼠形成舌侧多生磨牙的关键时期。然而，在e9.5-e13.0期间给予vismodegib(150mg/kg)会出现腭裂等其他颌面部畸形继而导致胎鼠出生后无法自然进食而导致死亡或死胎导致牙齿无法自然萌出，在e9.5天我们发现死胎率达到75％。在e14.0期间之后给予vismodegib(150mg/kg)胎鼠正常出生并且可以正常进食，在e15.0-17.0期间给予vismodegib(150mg/kg)发现第一磨牙舌侧可以自然萌出多生牙，并且未见身体其他器官严重的畸形。故本研究发现e15.0-17.0期间为诱导小鼠第二牙列发育的关键阶段，以上发现说明了在特定的时期应用vismodegib有助于促进小鼠牙齿再生。
24.在e13.0天之前给予200mg/kg剂量的的vismodegib则会出现较高比例的死胎，无法进行多生牙形成统计。所以我们选取e15.5为测定vismodegib不同给药剂量对于小鼠舌侧多生磨牙的影响。其结果如图6所示，通过研究我们发现vismodegib在e15.5天时同其他
天数的小鼠一样在100mg/kg的药物剂量下无法诱导小鼠舌侧形成多生牙，而在150mg/kg-200mg/kg之间随着浓度的增加多生牙出现的比例逐渐增高，据此，本发明发现多生牙形成与vismodegib的药物剂量有一定相关性。
25.图7为成活子鼠长出的多生切牙，应用vismodegib处理过的小鼠切牙可见较对照组多，我们通过给予vismodegib诱导出多生切牙的模型，发现其多生的切牙同小鼠正常切牙的结构类似，并且同其正常切牙一样具有无限的生长的潜能。说明了vismodegib可能对于所有牙齿的发育均具有调控作用，可以诱发牙齿在发育过程中的牙板上皮发育成牙。
26.结论应用vismodegib可以在鼠类不同时间点诱导其舌侧形成多生牙。以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改进与等同替换，均落入本发明保护范围之内。