一种核苷类抗病毒药物凝胶及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种核苷类抗病毒药物凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.临床针对病毒性角膜炎是采取局部滴加抗病毒药物进行治疗，制剂包括滴眼液、眼膏及眼用凝胶。由于眼部的生理结构特征，滴眼液的生物利用度极低，仅有约1％-3％的药物会发挥活性，药效维持时间短、给药频繁，易诱发耐药性及累积毒性等。乳膏剂及凝胶剂由于可增加在局部的滞留率在眼科剂型中受到广泛关注。然而，乳膏剂由于其透明度和折光率较差，易造成视野模糊，使用场景受限，给患者带来不便。当前的临床眼用凝胶制剂多是采用的凝胶基质包裹抗病毒药物制成，凝胶基质包括卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、透明质酸钠或甲基纤维素中的一种或几种，其中卡波姆系列为当前临床眼用凝胶剂型的最主要凝胶基质。虽然凝胶剂型的透明度和折光率优于膏剂，该类凝胶基质仍然存在以下问题：1)药物是通过物理包裹作用装载于凝胶中，无法控制其释放速率；2)性状类似于半固体，不易在眼表铺展，在眨眼过程中易被眼睑剪切至睫毛、外眼睑处，且不具有形变恢复能力，较高的粘性及半固体特性使其停留在睫毛及外眼睑处，从而流失率较高；且高粘度会对眼睛造成刺激，刺激泪液分泌，增加凝胶损失。3)卡波姆类凝胶基质对盐离子敏感，在泪液环境下凝胶骨架崩塌，


技术实现要素：

3.为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种核苷类抗病毒药物凝胶及其制备方法。本发明提供的核苷类抗病毒药物凝胶生物利用度高、可在眼表高效滞留且可延缓药物释放。
4.本发明提供了一种核苷类抗病毒药物凝胶，所述药物凝胶由以下成分组成：脱氧鸟嘌呤核苷或其衍生物、核苷类抗病毒药物、碱金属离子、ph调节剂、水。
5.所述脱氧鸟嘌呤核苷衍生物的结构式如下式(1)所示：
[0006][0007]
其中，x，y为氢键供体或受体基团，分别选自-oh、-ch2oh、-ch2ch2oh、i中的一种；
[0008]
所述脱氧鸟嘌呤核苷或其衍生物的终摩尔浓度为30mm～85mm或终质量浓度为0.8％～2.3％；优选地，所述终摩尔浓度为50-60mm，对应于终质量浓度为1.4％～1.68％。
[0009]
所述核苷类抗病毒药物包括更昔洛韦、阿昔洛韦、喷昔洛韦或与该三种药物具有
同种治疗活性的衍生物；
[0010]
所述核苷类抗病毒药物的质量浓度为0.01～0.5％；对于更昔洛韦，所述质量浓度优选为0.15％；对于阿昔洛韦，所述质量浓度优选为0.1％。
[0011]
所述碱金属离子包括钾离子、钠离子；所述碱金属离子通过包含该碱金属离子的盐类提供；优选地，为钾离子，来源于氯化钾，其终摩尔浓度为脱氧鸟嘌呤核苷或其衍生物终摩尔浓度的两倍。
[0012]
所述碱金属离子与脱氧鸟嘌呤核苷或其衍生物的终摩尔浓度之比为1～2.5，优选地，为2；其中，对于钾离子，终质量分数为0.1％～0.85％；对于钠离子，终质量分数为0.065％～0.5％
[0013]
所述ph调节剂包括氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液等，在使用时需和体系中的碱金属离子保持一致。
[0014]
所述ph调节剂用于调节溶液的ph值，根据溶液的量及酸碱性适量添加，直至溶液的ph呈中性；优选地，调节ph至7.4。
[0015]
所述水为注射用水。
[0016]
本发明还提供了一种上述核苷类抗病毒药物凝胶的制备方法，所述方法包括：取上述一定浓度的脱氧鸟嘌呤核苷或其衍生物、核苷类抗病毒药物、提供碱金属离子的碱金属盐类，及注射用水，加热溶解后加ph调节剂调节ph至7.4，高压灭菌，冷却至室温成胶。
[0017]
所述加热的温度为80-90℃；
[0018]
所述高压灭菌在正常高压灭菌条件下(115℃，30分钟)进行。
[0019]
本发明还提供了一种通过上述制备方法制备获得的核苷类抗病毒药物凝胶。
[0020]
所述药物凝胶低频(即剪切速率小于1.01/s)下呈黏性流体特征，损耗角为0.3～0.95；优选地，损耗角为0.4-0.9，具有较好的流动性；在剪切力下呈黏弹性体特征，具有形变恢复性能。
[0021]
所述药物凝胶可用于眼部及皮肤、粘膜类组织感染治疗。
[0022]
本发明还提供了所述药物凝胶在制备治疗眼部及皮肤、粘膜类组织感染的药物中的应用。
[0023]
本发明所述药物凝胶可抵御眨眼剪切，在眼科凝胶制剂中具有良好的应用前景。
[0024]
在一个具体实施方案中，取配方量的脱氧鸟嘌呤核苷、核苷类抗病毒药物、适量钾离子或钠离子，及注射用水，加热溶解(温度范围80-90℃)，加ph调节剂调节ph至7.4；热压灭菌(115℃，15分钟)，分装，冷却至室温成胶。
[0025]
与现有技术相比，本发明所述核苷类抗病毒药物凝胶的优异效果在于：
[0026]
1)药物并非通过物理包裹装载于凝胶中，而是通过非共价作用组装成凝胶骨架，药物释放速率更加可控；
[0027]
2)低频下呈现为黏性流体特征，具有良好的流动性，可均匀的铺展于眼球表面；
[0028]
3)当存在眨眼剪切时表现为黏弹体，当剪切力撤除，变形即可恢复，不会从结膜囊内被剪切出至眼睑或睫毛上，具有较高的滞留效率。
[0029]
4)本发明所述核苷类抗病毒药物凝胶制备方法操作简单，适合于规模化生产。
附图说明
[0030]
图1为本发明实施例1不同钾离子浓度比例的更昔洛韦凝胶(图中的数值为钾离子和2
’‑
脱氧鸟苷的摩尔比)；
[0031]
图2为本发明实施例2不同配方比例的更昔洛韦凝胶(图中的数值单位为mm)；
[0032]
图3为本发明实施例2不同配方比例的更昔洛韦凝胶的稳定性(图中的数值单位为mm)；
[0033]
图4为本发明实施例3不同配方比例的阿昔洛韦凝胶(图中的数值单位为mm)；
[0034]
图5为本发明实施例3不同配方比例阿昔洛韦凝胶的稳定性(图中的数值单位为mm)；
[0035]
图6为本发明实施例4不同药物浓度的更昔洛韦凝胶及阿昔洛韦凝胶；
[0036]
图7为本发明实施例5新型更昔洛韦凝胶及临床更昔洛韦凝胶的流体曲线；
[0037]
图8为本发明实施例6新型更昔洛韦凝胶及临床更昔洛韦凝胶的角频率扫描曲线；
[0038]
图9为本发明实施例7新型更昔洛韦凝胶及临床更昔洛韦凝胶的应变扫描曲线；
[0039]
图10为本发明实施例7新型更昔洛韦凝胶及临床更昔洛韦凝胶的损耗角正切值；
[0040]
图11为本发明实施例8中更昔洛韦凝胶与临床参比更昔洛韦凝胶在义眼模型表面的行为；
[0041]
图12为本发明实施例9中更昔洛韦凝胶与临床参比更昔洛韦凝胶对泪液的抵抗性能；
[0042]
图13为本发明实施例10中更昔洛韦凝胶与临床参比更昔洛韦凝胶的释放曲线；
[0043]
图14为本发明实施例11中更昔洛韦凝胶与临床参比更昔洛韦凝胶在小鼠结膜及角膜中的浓度；
[0044]
图15为本发明实施例12中经更昔洛韦凝胶与临床参比更昔洛韦凝胶处理后的病毒性角膜炎小鼠的死亡曲线；
[0045]
图16为本发明实施例12中经更昔洛韦凝胶与临床参比更昔洛韦凝胶处理后的病毒性角膜炎小鼠的角膜混浊度评分；n.s.说明临床参比凝胶的治疗效果与pbs无显著性差异，*说明实施例11中的更昔洛韦凝胶与临床参比凝胶、pbs的治疗效果具有显著性差异。
[0046]
图17为本发明实施例12中经更昔洛韦凝胶与临床参比更昔洛韦凝胶处理后的病毒性角膜炎小鼠的角膜病变面积比例。n.s.说明临床参比凝胶的治疗效果与pbs无显著性差异，***说明实施例12中的更昔洛韦凝胶与临床参比凝胶、pbs的治疗效果差异性极其显著。
具体实施方式
[0047]
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
[0048]
实施例1
[0049]
一种更昔洛韦凝胶，其配方为：
[0050]
14.26毫克2
’‑
脱氧鸟苷，1.5毫克更昔洛韦，0.35毫升水，0.5毫升kcl母液，其中kcl母液的浓度分别为25mm、50mm、75mm、100mm、150mm、200mm、250mm、300mm、400mm，另加入
0.15毫升水，混合均匀，90℃加热3分钟至澄清溶液，冷却至室温，得到钾离子与2
’‑
脱氧鸟苷的摩尔比分别为0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4的凝胶，所得凝胶如图1所示。钾离子的摩尔比值在1-2.5之间具有稳定、透明度良好的凝胶。
[0051]
实施例2
[0052]
分别按照如下配方配制更昔洛韦凝胶：
[0053]2’‑
脱氧鸟苷分别为2.85mg、5.7mg、8.56mg、11.41mg、14.26mg、17.11mg、19.96mg、22.82mg、25.67mg，钾离子分别固定为2
’‑
脱氧鸟苷摩尔浓度的两倍，分别配制2
’‑
脱氧鸟苷浓度为10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm，更昔洛韦含量固定为1.5毫克，配制1ml混合体系，振荡1分钟，加热至90℃，溶解成透明溶液后冷却至室温，所得凝胶如图2所示，静置三个月后如图3所示。综合配制初期及三个月后的凝胶状态可得，辅料dg浓度在40-80mm之间时，可获得较为透明，可视度、稳定性良好的新型更昔洛韦凝胶。
[0054]
实施例3
[0055]
分别按照如下配方配制阿昔洛韦凝胶：
[0056]2’‑
脱氧鸟苷分别为2.85mg、5.7mg、8.56mg、11.41mg、14.26mg、17.11mg、19.96mg、22.82mg、25.67mg，28.52mg，离子分别固定为2
’‑
脱氧鸟苷摩尔浓度的两倍，分别配制2
’‑
脱氧鸟苷浓度为10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm，阿昔洛韦含量固定为1.0毫克，配制1ml混合体系，振荡1分钟，加热至90℃，溶解成透明溶液后冷却至室温，所得凝胶如图4所示，静置三个月如图5所示：
[0057]
综合配制初期及三个月后的凝胶状态可得，辅料dg浓度在40-70mm之间时可获得较为透明，可视度、稳定性良好的新型阿昔洛韦凝胶。
[0058]
实施例4
[0059]
分别配制药物质量浓度为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％的新型更昔洛韦凝胶以及质量浓度为0.4％、0.5％、0.6％、0.7％的阿昔洛韦凝胶。如图6所示，当药物浓度超过0.4％时更昔洛韦凝胶析出，而药物浓度超过0.5％时，阿昔洛韦凝胶析出，可得出对于此凝胶来说，药物质量浓度在0.5％以内可维持良好的可视性。
[0060]
但此浓度仅针对单独使用dg辅料时的药物浓度，必要时可通过添加其他常用眼科药物辅料来提高药物的浓度，同时保持良好的可视性。
[0061]
实施例5
[0062]
分别配制1ml辅料dg浓度为40mm、60mm、80mm的新型更昔洛韦凝胶(分别命名为新型更昔洛韦凝胶1-3)，取临床参比制剂(含有相同药物浓度的临床更昔洛韦凝胶，湖北科益)，测试各自流变学性能。
[0063]
样品量1ml，间隙400μm，将剪切速率设置为0.01-1000s-1
之间，对其进行流动模式的扫描，检测其复黏度及剪切应力，得到更昔洛韦凝胶的流体学类型曲线，如图7所示。图中展示新型更昔洛韦凝胶在低频区具有一个类似于牛顿流体的平台区域，凝胶的粘度不随剪切速率而变化，且无屈服应力，说明该类凝胶在低频下具有良好的流延及铺展性能。而临床参比凝胶的具有明显的屈服应力，在此实验中为5.8pa，在低应力下为刚性体，不具有流动性，展示出宾汉流体特性。
[0064]
实施例6
[0065]
取本发明实施例5所得的三种配方新型更昔洛韦凝胶样品以及临床更昔洛韦凝胶
各1ml，间隙400μm，将应变率固定为0.1％，角频率设置为0.1-100rad/s之间，进行角频率扫描，所得结果如图8所示。三种不同配方的更昔洛韦凝胶都展示出典型的粘弹性流体特性，低频率下呈现出粘性流体行为，与其流动扫描曲线吻合，说明在低频下具有良好的流延及铺展性能，高频率下呈现出弹性体行为，因此在高频剪切力撤除后仍可恢复弹性形变，此流体学性能使其适用于眼部生理结构，可铺展于眼表，同时可抵抗眨眼剪切。而临床凝胶更昔洛韦凝胶储能模量显著高于损耗模量，表现出典型的半固体特性，因此不具有自动流延、铺展性能，无法在眼表均匀铺展，且其无黏弹性流体特征。
[0066]
实施例7
[0067]
取本发明实施例5所得的三种新型更昔洛韦凝胶配方1ml，间隙400μm，将角频率固定为1hz，应变率设置为0.01-500％之间，进行应变扫描，所得结果如图9所示。三种不同配方的新型更昔洛韦凝胶都具有良好的抵抗应变的能力，辅料dg含量为40mm、60mm及80mm时，分别可抵抗220％、250％、535％的应变，而临床更昔洛韦凝胶仅可抵抗25％的应变。
[0068]
同时，新型更昔洛韦凝胶的损耗角正切值在0.95-0.4之间，显著高于临床更昔洛韦凝胶的损耗角正切值(低于0.1)，说明具有更强的流动性能，如图10所示。
[0069]
实施例8
[0070]
抵抗剪切力性能的义眼模型评价:
[0071]
分别取150毫克辅料dg浓度为50mm的本发明实施例5中所制得的更昔洛韦凝胶及临床更昔洛韦参比凝胶，滴加在义眼模型上，观察其铺展情况。如图11a所示，本发明中的更昔洛韦凝胶可均匀铺展于义眼模型表面，而临床更昔洛韦凝胶无任何铺展行为，表现出类固体属性。此外，模拟眨眼剪切给予凝胶一定剪切力，如图11b所示，更昔洛韦凝胶在剪切力撤销后可恢复变形至原位，而临床更昔洛韦凝胶在剪切力撤销后无法恢复变形，因此在剪切力的作用下出现损失。
[0072]
本发明实施例5中所制得的三种配方的更昔洛韦凝胶粘度分别为3.1pa.s，36.8pa.s，132.5pa.s，临床参比凝胶的粘度约为578.8pa.s。因此，本发明中并非采用增加粘度而提高滞留率，而是利用凝胶独特的黏弹性流变学行为所带来的效果。
[0073]
实施例9
[0074]
对泪液的抵抗性能：
[0075]
分别取100毫克实施例5中所制得的dg浓度为60mm的更昔洛韦凝胶及参比制剂(含有相同药物浓度的临床更昔洛韦凝胶，湖北科益)，置于小皿中，滴加1毫升人工泪液，浸泡1分钟，移除液体，称量重量。如图12所示，临床更昔洛韦凝胶表现出显著的降解损失，而本发明中所提出的更昔洛韦凝胶并未出现明显的损耗。
[0076]
实施例10
[0077]
体外释放性能评估：
[0078]
17.1毫克2
’‑
脱氧鸟苷，0.5毫升氯化钾溶液(200mm)，1.5毫克更昔洛韦，0.5毫升水，配制得到浓度为60mm 2
’‑
脱氧鸟苷的更昔洛韦凝胶(0.15％更昔洛韦含量)。
[0079]
分别取150毫克上述更昔洛韦凝胶以及参比制剂(含有相同药物浓度的临床更昔洛韦凝胶，湖北科益)至小管中，外部添加300微升人工泪液，在37℃下释放，于1、3、6、9小时分别取样50微升，并同时补充新鲜的同体积人工泪液。采用高效液相色谱法检测所释放出的更昔洛韦，计算累积释放量，所得更昔洛韦的释放曲线如图13所示，新型更昔洛韦凝胶在
9小时内只释放了60％左右的药物，而临床更昔洛韦凝胶的药物在6小时内则完全释放。
[0080]
实施例11balb/c鼠单次给予更昔洛韦凝胶后眼表组织中的药物含量测定
[0081]
实验动物：balb/c鼠，8只，体重18-20g，6-8周龄，来源于sipur-bikai实验动物公司，上海。
[0082]
受试材料：本发明实施例1中所制得的新型更昔洛韦凝胶2和临床参比制剂(含有相同药物浓度的临床更昔洛韦凝胶，湖北科益)。
[0083]
实验方法：将balb/c鼠分成2组，每组4只，分别在每组兔子的左眼滴加本发明实施例1所制得更昔洛韦凝胶及参比制剂5微升，后分别在2h、4h、8h、24h将小鼠处死，取下角膜及结膜，采用高效液相色谱分析其中的更昔洛韦含量。
[0084]
实验结果：如图14所示，本发明实施例1中的更昔洛韦凝胶具有更高的药物滞留率，在24h后可分别在角膜组织及结膜组织中检测到的更昔洛韦浓度为13.81ug/ml及5.91ug/ml，而临床更昔洛韦凝胶在24h后仅检测到3.31ug/ml及2.54ug/ml。
[0085]
实施例12单纯疱疹病毒性角膜炎治疗效果评估
[0086]
实验动物：balb/c鼠，15只，体重18-20g，6-8周龄，来源于sipur-bikai实验动物公司，上海。
[0087]
受试材料：本发明实施例1中所制得的新型更昔洛韦凝胶2、参比制剂(含有相同药物浓度的临床更昔洛韦凝胶，湖北科益)、pbs。
[0088]
实验方法：将balb/c鼠分成3组，每组5只，分别进行单纯疱疹病毒(hsv-1)感染，诱导形成单纯病毒性角膜炎(hsk)。后进行治疗，按照5微升每只眼睛分别滴加本发明实施例1中所制得的更昔洛韦凝胶、参比制剂(含有相同药物浓度的临床更昔洛韦凝胶，湖北科益)、pbs。隔天滴加一次，累计滴加5次。期间观察小鼠存活情况，统计生存曲线；同时观察角膜感染情况，进行评分，并通过显微镜拍照，统计角膜混浊面积。
[0089]
实验结果：如图15所示，小鼠感染单纯疱疹病毒后会存在较高的死亡率，经临床参比凝胶处理后的小鼠存活率低于40％，相比于hsk病理对照组并无任何改善，而经本发明中所提出的更昔洛韦凝胶处理后，小鼠的存活率达到70％以上，得到了显著提升。
[0090]
如图16所示，经临床参比凝胶处理后的小鼠角膜浑浊度与病理对照组并无显著性差异，评分值在3分以上，而经本发明中所提出的更昔洛韦凝胶处理后，角膜混浊度评分平均值在1.5分左右，角膜混浊现象明显改善。
[0091]
如图17所示，经临床参比凝胶处理后的小鼠角膜病变面积在35％左右，与病理对照组相当，而经本发明中所提出的更昔洛韦凝胶处理后，小鼠角膜病变面积仅有12％左右，得到了显著的改善。
[0092]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。