嵌合受体及其使用方法与流程

嵌合受体及其使用方法
1.相关申请的交叉参考
2.本技术要求2019年4月30日提交的美国临时申请号62/841，128、2019年5月29日提交的美国临时申请号62/854,151和2019年8月28日提交的美国临时申请号62/893,106的权益；诸案各自以引用的方式整体并入本文。
3.序列表
4.本技术含有已经通过efs-web提交并且以引用的方式整体并入本文的序列表。所述ascii副本是在20xx年xx月xx日创建，命名为xxxxxus_sequencelisting.txt，并且大小是x，xxx，xxx字节。
5.发明背景
6.用于重定向诸如t细胞等免疫应答细胞的特异性和功能的基于嵌合抗原受体(car)的过继性细胞疗法已经在患有淋巴恶性肿瘤的患者中显示出了功效(pule等，nat.med.(14)：1264-1270(2008)；maude等，n engl jmed.(371)：1507-17(2014)；brentjens等，sci transl med.(5)：177ra38(2013))。已经证明car t细胞在化疗已经引起了抗药性和肿瘤进展的患有表达cd19的恶性肿瘤的患者中诱导了完全缓解。cd19 car疗法的成功为治疗诸如急性髓性白血病(aml)等其他血液系统恶性肿瘤提供了信心。急性髓性白血病是成人中最常见的急性白血病。aml是骨髓系血细胞癌症，并且以异常细胞快速生长从而积累在骨髓和血液中并干扰正常血细胞为特征。有时，aml可能波及脑、皮肤或齿龈。针对aml的标准化疗治疗在过去40年间无实质性变化(pulte等，2008)，而且总体存活率仍然非常低。
7.开发针对aml的car疗法的一个挑战是缺乏合适的靶标。能够鉴定适当的car靶标对有效地靶向并治疗肿瘤而不破坏表达相同靶抗原的正常细胞非常重要。因此，仍然需要靶向aml细胞而不靶向正常细胞或组织的基于car-t细胞的aml疗法。
发明概要
8.在一方面，本文提供了分离的免疫应答细胞，所述分离的免疫应答细胞包含：(a)第一嵌合受体，其包含结合至第一抗原的细胞外抗原结合域，和(b)第二嵌合受体，其包含结合至第二抗原的细胞外抗原结合域，其中各个抗原选自flt3、cd33、clec12a、ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70，并且其中所述第一抗原与所述第二抗原不同。
9.在一些实施方案中，所述第一抗原是flt3并且所述第一嵌合受体的细胞外抗原结合域包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no：3的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no：4的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no：1的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no：2的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(c)包含seq id no：5的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no：6的氨基酸序列或与其至少90％
同一的序列的vl；(d)包含seq id no：7的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no：8的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(e)包含seq id no：9的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:10的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(f)包含seq id no:11的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:12的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(g)包含seq id no:13的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:14的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(h)包含seq id no:15的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:16的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
10.在一些实施方案中，所述第二抗原是cd33并且所述第二嵌合受体的细胞外抗原结合域包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl，以及(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；或所述第二抗原是clec12a并且包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl，(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl，以及(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
11.在一些实施方案中，所述第一抗原是clec12a并且所述第一嵌合受体的细胞外抗原结合域包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl，任选地其中所述第二抗原是cd33并且所述第二嵌合受体的细胞外抗原结合域包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
12.在一些实施方案中，所述第一嵌合受体结合至所述第一抗原能够激活所述免疫应答细胞和/或所述第二嵌合受体结合至所述第二抗原能够刺激所述免疫应答细胞；和/或所述免疫应答细胞表现出对针对所述第一抗原与所述第二抗原都呈阳性的靶细胞的细胞溶解活性与对仅针对所述第一抗原或所述第二抗原呈阳性的靶细胞的细胞溶解活性相比程度更大；和/或所述第一嵌合受体结合至所述第一抗原的结合亲和力低于所述第二嵌合受体对所述第二抗原的结合亲和力；和/或所述第一嵌合受体以低结合亲合力结合至所述第一抗原。
13.在一些实施方案中，所述第一嵌合受体是第一car且所述第二嵌合受体是第二car，并且各个car包含：cd3ζ链细胞内信号传导域，任选地其中各个car另外包含一个或多
个额外细胞内信号传导域，并且所述一个或多个额外细胞内信号传导域选自cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域、myd88细胞内信号传导域和2b4细胞内信号传导域；和/或跨膜域，并且所述跨膜域选自cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域；和/或间隔区，所述间隔区在所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64的氨基酸序列。
14.在一些实施方案中，所述细胞另外包含抑制性嵌合受体，所述抑制性嵌合受体包含抗原结合域，任选地其中所述抑制性嵌合受体抑制所述细胞的一种或多种活性。
15.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合表达在非肿瘤细胞上的抗原，任选地其中所述表达在非肿瘤细胞上的抗原来源于选自以下的组织：脑、神经元组织、内分泌、骨、骨髓、免疫系统、内皮组织、肌肉、肺、肝脏、胆囊、胰腺、胃肠道、肾脏、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、软组织和皮肤。
16.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合选自以下的抗原：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar2、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136和tmem200a。
17.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含抗原结合域，所述抗原结合域包含单链可变片段(scfv)，并且所述scfv来源于抗emcn抗体。
18.在一些实施方案中，所述第一嵌合受体的抗原结合域、所述第二嵌合受体的抗原结合域和/或所述抑制性嵌合受体的抗原结合域包含一个或多个单链可变片段(scfv)，其中所述一个或多个scfv中的每一个包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)，任选地其中所述vh和所述vl由肽接头隔开，并且任选地其中所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。
19.在一些实施方案中，所述一个或多个scfv中的每一个包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
20.在一些实施方案中，所述一个或多个scfv中的每一个结合至相同抗原上的不同表位。
21.在一些实施方案中，所述一个或多个scfv中的每一个由肽接头隔开，任选地其中所述肽接头包含ggggsggggsggggs(seq id no:27)或eaaakeaaakeaaakeaaak(seq id no:74)的氨基酸序列。
22.在一些实施方案中，所述细胞是t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调控t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞(esc)、esc衍生细胞、多能干细胞和诱导型多能干细胞(ipsc)以及ipsc衍生细胞，任选地其中所述免疫应答细胞是同种异体的。
23.在另一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含有效量的如本文的任何实施方案所述的分离的免疫应答细胞和药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂或其组合。
24.在另一方面，本文提供了在受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效剂量的如本文的任何实施方案所述的分离的免疫应答细胞中的任一种或如本文的任何实施方案所述的药物组合物。
25.在另一方面，本文提供了在受试者中治疗或预防骨髓病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文的任何实施方案所述的分离的免疫应答细胞或如本文的任何实施方案所述的药物组合物，任选地其中所述骨髓病症是骨髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、慢性髓单核细胞性白血病、急性髓性白血病(aml)、急性成髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和真性红细胞增多症。
26.在另一方面，本文提供了用于治疗和/或预防骨髓病症的药盒，所述药盒包括如本文的任何实施方案所述的分离的免疫应答细胞或如本文的任何实施方案所述的药物组合物，任选地其中所述药盒另外包括使用所述细胞治疗和/或预防受试者的骨髓病症的书面说明书。
27.在一方面，本文提供了嵌合受体，所述嵌合受体包含细胞外抗原结合域，所述细胞外抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9和spns3。
28.在一些实施方案中，所述抗原是ms4a3。在一些实施方案中在一些实施方案中，所述抗原是vstm1。在一些实施方案中，其中所述抗原是lat2。在一些实施方案中，所述抗原是mlc1。在一些实施方案中，所述抗原是cd131。在一些实施方案中，所述抗原是gapt。在一些实施方案中，所述抗原是pram1。在一些实施方案中，所述抗原是slc22a16。在一些实施方案中，所述抗原是slc17a9。在一些实施方案中，所述抗原是spns3。
29.在一些实施方案中，所述嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，所述嵌合受体是car。
30.在一些实施方案中，所述car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域和myd88细胞内信号传导域。
31.在一些实施方案中，所述car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域。
32.在一些实施方案中，所述car包含间隔区，所述间隔区在所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
33.在一些实施方案中，所述抗原结合域包含抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、
f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述scfv包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述vh和所述vl由肽接头隔开。在一些实施方案中，所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scfv包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
34.在另一方面，本文提供了分离的细胞，所述分离的细胞包含如所述实施方案中任一个所述的嵌合受体。
35.在一些实施方案中，所述嵌合受体被重组表达。在一些实施方案中，所述嵌合受体由载体或来自细胞基因组的所选基因座表达。
36.在一些实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调控t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞(esc)、esc衍生细胞、多能干细胞和诱导型多能干细胞(ipsc)以及ipsc衍生细胞。
37.在一些实施方案中，所述细胞是自体的。在一些实施方案中，所述细胞是同种异体的。
38.在另一方面，本文提供了分离的细胞，所述分离的细胞包含(a)第一嵌合受体，其包含结合至第一抗原的细胞外抗原结合域，和(b)第二嵌合受体，其包含结合至第二抗原的细胞外抗原结合域，其中各个抗原选自由表1中列出的抗原组成的组或所述第一抗原和所述第二抗原选自由表3中列出的抗原配对组成的组，并且其中所述第一抗原与所述第二抗原不同。
39.在另一方面，本文提供了分离的细胞，所述分离的细胞包含(a)第一嵌合受体，其包含结合至第一抗原的细胞外抗原结合域，和
40.(b)第二嵌合受体，其包含结合至第二抗原的细胞外抗原结合域，其中各个抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70，并且其中所述第一抗原与所述第二抗原不同。
41.在一些实施方案中，所述第一抗原是ms4a3并且所述第二抗原选自由以下组成的组：vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
42.在一些实施方案中，所述第一抗原是vstm1并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
43.在一些实施方案中，所述第一抗原是lat2并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
44.在一些实施方案中，所述第一抗原是mlc1并且所述第二抗原选自由以下组成的
组：ms4a3、vstm1、lat2、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
45.在一些实施方案中，所述第一抗原是cd131并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
46.在一些实施方案中，所述第一抗原是gapt并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
47.在一些实施方案中，所述第一抗原是pram1并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
48.在一些实施方案中，所述第一抗原是slc22a16并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
49.在一些实施方案中，所述第一抗原是slc17a9并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
50.在一些实施方案中，所述第一抗原是spns3并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
51.在一些实施方案中，所述第一抗原是flt3。在一些实施方案中，所述结合至第一抗原的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:1的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:2的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no:3的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:4的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(c)包含seq id no:5的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:6的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(d)包含seq id no:7的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:8的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(e)包含seq id no:9的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:10的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(f)包含seq id no:11的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:12的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(g)包含seq id no:13的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含
no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合至第二抗原的抗原结合域含有包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合至第二抗原的抗原结合域含有包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合至第二抗原的抗原结合域含有包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。
52.在一些实施方案中，所述第一抗原是clecl12a。在一些实施方案中，所述结合至第一抗原的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在一些实施方案中，所述结合至第一抗原的抗原结合域含有包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合至第一抗原的抗原结合域含有包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合至第一抗原的抗原结合域含有包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述第二抗原是cd33。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合至第二抗原的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合至第二抗原的抗原结合域含有包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合至第二抗原的抗原结合域含有包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。
53.在一些实施方案中，所述细胞是免疫应答细胞。在一些实施方案中，所述第一嵌合
受体结合至所述第一抗原能够激活所述免疫应答细胞。在一些实施方案中，所述第二嵌合受体结合至所述第二抗原能够刺激所述免疫应答细胞。
54.在一些实施方案中，所述第一嵌合受体结合至所述第一抗原和所述第二嵌合受体结合至所述第二抗原是激活所述免疫应答细胞所需要的。
55.在一些实施方案中，所述免疫应答细胞表现出对针对所述第一抗原与所述第二抗原都呈阳性的细胞的细胞溶解活性与对单独针对所述第一抗原呈阳性的细胞的细胞溶解活性相比程度更大。
56.在一些实施方案中，所述第一嵌合受体结合至所述第一抗原或所述第二嵌合受体结合至所述第二抗原能够激活所述免疫应答细胞。
57.在一些实施方案中，所述第一嵌合受体以低结合亲和力结合至所述第一抗原。在一些实施方案中，所述第一嵌合受体结合至所述第一抗原的结合亲和力低于所述第二嵌合受体结合至所述第二抗原的结合亲和力。在一些实施方案中，所述第一嵌合受体以低结合亲合力结合至所述第一抗原。
58.在一些实施方案中，所述第一嵌合受体和/或所述第二嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，所述第一嵌合受体和/或所述第二嵌合受体是car。在一些实施方案中，所述第一嵌合受体是第一car并且所述第二嵌合受体是第二car。
59.在一些实施方案中，所述car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域和myd88细胞内信号传导域。
60.在一些实施方案中，所述第一car的一个或多个细胞内信号传导域与所述第二car的一个或多个细胞内信号传导域不同。
61.在一些实施方案中，所述第一car和所述第二car各自包含cd3ζ链细胞内信号传导域。
62.在一些实施方案中，所述第一car和所述第二car各自另外包含选自由以下组成的组的额外细胞内信号传导域：cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域和myd88细胞内信号传导域。
63.在一些实施方案中，所述第一car的额外细胞内信号传导域与所述第二car的额外细胞内信号传导域不同。
64.在一些实施方案中，各个car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域。
65.在一些实施方案中，所述第一car的跨膜域与所述第二car的跨膜域不同。
66.在一些实施方案中，各个car包含间隔区，所述间隔区介于所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
67.在一些实施方案中，所述第一嵌合受体和/或所述第二嵌合受体的抗原结合域包含抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述scfv包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述vh和所述vl由肽接头隔开。在一些实施方案中，所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scfv包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
68.在一些实施方案中，所述第一嵌合受体被重组表达。
69.在一些实施方案中，所述第一嵌合受体由载体或来自细胞基因组的所选基因座表达。
70.在一些实施方案中，所述第二嵌合受体被重组表达。
71.在一些实施方案中，所述第二嵌合受体由载体或来自细胞基因组的所选基因座表达。
72.在一些实施方案中，所述细胞另外包含抑制性嵌合受体，所述抑制性嵌合受体包含抗原结合域。
73.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体抑制所述细胞的一种或多种活性。
74.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合不在肿瘤细胞上表达的抗原。
75.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合在非肿瘤细胞上表达的抗原。
76.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合在非肿瘤细胞上表达的抗原，所述在非肿瘤细胞上表达的抗原来源于选自由以下组成的组的组织：脑、神经元组织、内分泌、骨、骨髓、免疫系统、肌肉、肺、肝脏、胆囊、胰腺、胃肠道、肾脏、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、软组织和皮肤。
77.在一些实施方案中，所述肿瘤细胞是急性髓性白血病(aml)细胞。
78.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含酶抑制域。
79.在一些实施方案中，所述酶抑制域当在免疫受体近端时抑制免疫受体激活。
80.在一些实施方案中，所述酶抑制域包含酶催化域。
81.在一些实施方案中，所述酶催化域来源于选自由以下组成的组的酶：csk、shp-1、pten、cd45、cd148、ptp-meg1、ptp-pest、c-cbl、cbl-b、ptpn22、lar、ptph1、ship-1和rasgap。
82.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体另外包含一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域。
83.在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域选自由以下组成的组：pd-1、ctla4、tigit、lair1、grb-2、dok-1、dok-2、slap、lag3、havr、btla、gitr和pd-l1。
84.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合选自由以下组成的组的抗原：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls和ffar2。
85.在一些实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调控t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞(esc)、esc衍生细胞、多能干细胞和诱导型多能干细胞(ipsc)以及ipsc衍生细胞。
86.在一些实施方案中，所述细胞是自体的。
87.在一些实施方案中，所述细胞是同种异体的。
88.在另一方面，本文提供了嵌合受体，所述嵌合受体包含两个或更多个抗原结合域，其中各个抗原结合域结合至选自由表1中列出的抗原组成的组的抗原，或所述两个或更多个抗原结合域结合至选自由表3中列出的抗原配对组成的组的抗原配对，其中各个抗原结合域结合至不同的抗原。
89.在另一方面，本文提供了嵌合受体，所述嵌合受体包含两个或更多个抗原结合域，其中各个抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70，其中各个抗原结合域结合至不同的抗原。
90.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合ms4a3，而第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
91.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合vstm1，而第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
92.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合lat2，而第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
93.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合mlc1，而第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
94.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合cd131，而第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
95.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合gapt，而第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
96.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合pram1，而第二抗原结合域结合至选自由
以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
97.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合slc22a16，而第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
98.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合slc17a9，而第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
99.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合spns3，而第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
100.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合flt3。在一些实施方案中，结合flt3的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:1的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:2的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no:3的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:4的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(c)包含seq id no:5的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:6的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(d)包含seq id no:7的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:8的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(e)包含seq id no:9的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:10的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(f)包含seq id no:11的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:12的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(g)包含seq id no:13的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:14的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(h)包含seq id no:15的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:16的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在一些实施方案中，所述结合flt3的抗原结合域含有包含seq id no:1的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:2的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合flt3的抗原结合域含有包含seq id no:3的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:4的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合flt3的抗原结合域含有包含seq id no:5的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:6的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合flt3的抗原结合域含有包含seq id no:7的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:8的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合flt3的
抗原结合域含有包含seq id no:9的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:10的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合flt3的抗原结合域含有包含seq id no:11的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:12的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合flt3的抗原结合域含有包含seq id no:13的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:14的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合flt3的抗原结合域含有包含seq id no:15的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:16的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，第二抗原结合域结合cd33。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合cd33的第二抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合cd33的第二抗原结合域含有包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合cd33的第二抗原结合域含有包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，第二抗原结合域结合clec12a。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合clecl12a的第二抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合clecl12a的第二抗原结合域含有包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合clecl12a的第二抗原结合域含有包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合clecl12a的第二抗原结合域含有包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。
101.在一些实施方案中，一个抗原结合域结合clec12a。在一些实施方案中，所述结合
clec12a的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在一些实施方案中，所述结合clec12a的抗原结合域含有包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合clec12a的抗原结合域含有包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述结合clec12a的抗原结合域含有包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，第二抗原结合域结合cd33。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合cd33的第二抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合cd33的第二抗原结合域含有包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。在可以与前述实施方案中的任一个组合的一些实施方案中，所述结合cd33的第二抗原结合域含有包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的重链可变域(vh)和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的轻链可变域(vl)。
102.在一些实施方案中，所述嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。
103.在一些实施方案中，所述嵌合受体是car。
104.在一些实施方案中，所述car是双特异性car。
105.在一些实施方案中，所述car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3-ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域和myd88细胞内信号传导域。
106.在一些实施方案中，所述car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域。
107.在一些实施方案中，所述car包含间隔区，所述间隔区在所述抗原结合域与所述跨
膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
108.在一些实施方案中，各个抗原结合域包含抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述scfv包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述vh和所述vl由肽接头隔开。在一些实施方案中，所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scfv包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
109.在另一方面，本文提供了分离的细胞，其包含如所述实施方案中任一个所述的嵌合受体。
110.在一些实施方案中，所述细胞另外包含额外嵌合受体，所述额外嵌合受体包含抗原结合域。
111.在一些实施方案中，所述额外嵌合受体结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
112.在一些实施方案中，所述两个嵌合受体中的每一个结合至不同的抗原。
113.在一些实施方案中，所述细胞是免疫应答细胞。
114.在一些实施方案中，所述嵌合受体结合至所述两个抗原中的任一个都能够激活所述免疫应答细胞。
115.在一些实施方案中，所述额外嵌合受体结合至其同源抗原能够刺激所述免疫应答细胞。
116.在一些实施方案中，所述嵌合受体结合至所述两个抗原中的任一个和所述额外嵌合受体结合至其同源抗原是激活所述免疫应答细胞所需要的。
117.在一些实施方案中，所述免疫应答细胞表现出对针对所述嵌合受体结合的所述两个抗原中的任一个都呈阳性而且针对所述额外嵌合受体结合的抗原呈阳性的细胞的细胞溶解活性与对仅针对单个抗原呈阳性的细胞的细胞溶解活性相比程度更大。
118.在一些实施方案中，所述额外嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。
119.在一些实施方案中，所述额外嵌合受体是car。
120.在一些实施方案中，所述嵌合受体是第一car并且所述额外嵌合受体是第二car。
121.在一些实施方案中，所述第二car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域和myd88细胞内信号传导域。
122.在一些实施方案中，所述第一car的一个或多个细胞内信号传导域与所述第二car的一个或多个细胞内信号传导域不同。
123.在一些实施方案中，所述第一car和所述第二car各自包含cd3ζ链细胞内信号传导
域。
124.在一些实施方案中，所述第一car和所述第二car各自另外包含选自由以下组成的组的额外细胞内信号传导域：cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域和myd88细胞内信号传导域。
125.在一些实施方案中，所述第一car的额外细胞内信号传导域与所述第二car的额外细胞内信号传导域不同。
126.在一些实施方案中，所述第二car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域。
127.在一些实施方案中，所述第一car的跨膜域与所述第二car的跨膜域不同。
128.在一些实施方案中，所述第二car包含间隔区，所述间隔区在所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
129.在一些实施方案中，所述细胞另外包含抑制性嵌合受体，所述抑制性嵌合受体包含抗原结合域。
130.在一些实施方案中，所述额外嵌合受体是包含抗原结合域的抑制性嵌合受体。
131.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体抑制所述细胞的一种或多种活性。
132.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合不在肿瘤细胞上表达的抗原。
133.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合在非肿瘤细胞上表达的抗原。
134.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合在非肿瘤细胞上表达的抗原，所述在非肿瘤细胞上表达的抗原来源于选自由以下组成的组的组织：脑、神经元组织、内分泌、骨、骨髓、免疫系统、肌肉、肺、肝脏、胆囊、胰腺、胃肠道、肾脏、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、软组织和皮肤。
135.在一些实施方案中，所述肿瘤细胞是急性髓性白血病(aml)细胞。
136.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含酶抑制域。
137.在一些实施方案中，所述酶抑制域当在免疫受体近端时抑制免疫受体激活。
138.在一些实施方案中，其中所述酶抑制域包含酶催化域。
139.在一些实施方案中，所述酶催化域来源于选自由以下组成的组的酶：csk、shp-1、pten、cd45、cd148、ptp-meg1、ptp-pest、c-cbl、cbl-b、ptpn22、lar、ptph1、ship-1和rasgap。
140.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体另外包含一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域。
141.在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域选自由以下组成的组：pd-1、ctla4、tigit、lair1、grb-2、dok-1、dok-2、slap、lag3、havr、btla、gitr和pd-l1。
142.在一些实施方案中，其中所述抑制性嵌合受体结合选自由以下组成的组的抗原：
emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls和ffar2。
143.在一些实施方案中，所述额外嵌合受体和/或抑制性嵌合受体的抗原结合域包含抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述scfv包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述vh和所述vl由肽接头隔开。在一些实施方案中，所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scfv包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
144.在一些实施方案中，各个嵌合受体被重组表达。
145.在一些实施方案中，各个嵌合受体由载体或来自细胞基因组的所选基因座表达。
146.在一些实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调控t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞(esc)、esc衍生细胞、多能干细胞和诱导型多能干细胞(ipsc)以及ipsc衍生细胞。
147.在一些实施方案中，所述细胞是自体的。
148.在一些实施方案中，所述细胞是同种异体的。
149.在另一方面，本文提供了嵌合抑制性受体，其包含细胞外抗原结合域，所述细胞外抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls和ffar2。
150.在一些实施方案中，所述抗原是emcn。
151.在一些实施方案中，所述抗原是jam2。
152.在一些实施方案中，所述抗原是ms4a15。
153.在一些实施方案中，所述抗原是c4bpa。
154.在一些实施方案中，所述抗原是trpm1。
155.在一些实施方案中，所述抗原是sctr。
156.在一些实施方案中，所述抗原是slc2a2。
157.在一些实施方案中，所述抗原是kcnq2。
158.在一些实施方案中，所述抗原是perp。
159.在一些实施方案中，当表达在细胞上时，所述抑制性嵌合受体抑制所述细胞的一种或多种活性。
160.在一些实施方案中，所述抗原不表达在肿瘤细胞上。
161.在一些实施方案中，所述抗原表达在非肿瘤细胞上。
162.在一些实施方案中，所述抗原表达在来源于选自由以下组成的组的组织的非肿瘤细胞上：脑、神经元组织、内分泌、骨、骨髓、免疫系统、肌肉、肺、肝脏、胆囊、胰腺、胃肠道、肾脏、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、软组织和皮肤。
163.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含酶抑制域。
164.在一些实施方案中，所述酶抑制域当在免疫受体近端时抑制免疫受体激活。
165.在一些实施方案中，所述酶抑制域包含酶催化域。
166.在一些实施方案中，所述酶催化域来源于选自由以下组成的组的酶：csk、shp-1、pten、cd45、cd148、ptp-meg1、ptp-pest、c-cbl、cbl-b、ptpn22、lar、ptph1、ship-1和
rasgap。
167.在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体另外包含一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域。
168.在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域选自由以下组成的组：pd-1、ctla4、tigit、lair1、grb-2、dok-1、dok-2、slap、lag3、havr、btla、gitr和pd-l1。
169.在一些实施方案中，所述抗原结合域包含抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述scfv包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述vh和所述vl由肽接头隔开。在一些实施方案中，所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scfv包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
170.在另一方面，本文提供了分离的细胞，其包含如所述实施方案中任一个所述的嵌合抑制性受体。
171.在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体被重组表达。
172.在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体由载体或来自细胞基因组的所选基因座表达。
173.在一些实施方案中，所述细胞另外包含嵌合受体，所述嵌合受体包含细胞外抗原结合域，所述细胞外抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
174.在另一方面，本文提供了分离的细胞，其包含(a)嵌合抑制性受体，其包含细胞外抗原结合域，所述细胞外抗原结合域结合至第一抗原，其中所述第一抗原选自由以下组成的组：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls和ffar2，以及(b)嵌合受体，其包含一个或多个细胞外抗原结合域，其中各个抗原结合域结合至选自由表1中列出的抗原组成的组的抗原。
175.在另一方面，本文提供了分离的细胞，其包含(a)嵌合抑制性受体，其包含细胞外抗原结合域，所述细胞外抗原结合域结合至第一抗原，其中所述第一抗原选自由以下组成的组：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls和ffar2，以及(b)嵌合受体，其包含一个或多个细胞外抗原结合域，其中各个抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
176.在一些实施方案中，所述嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。
177.在一些实施方案中，所述嵌合受体是car。
178.在一些实施方案中，所述car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、
cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域和myd88细胞内信号传导域。
179.在一些实施方案中，所述car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域。
180.在一些实施方案中，所述car包含间隔区，所述间隔区在所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
181.在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体和/或所述嵌合受体的抗原结合域包含抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述scfv包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。在一些实施方案中，所述vh和所述vl由肽接头隔开。在一些实施方案中，所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scfv包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
182.在一些实施方案中，所述细胞是免疫应答细胞。
183.在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合至所述第一抗原能够抑制所述免疫应答细胞。
184.在一些实施方案中，所述嵌合受体结合至所述第二抗原能够激活所述免疫应答细胞。
185.在一些实施方案中，所述嵌合受体以低结合亲和力结合至所述第二抗原。
186.在一些实施方案中，所述嵌合受体结合至所述第二抗原的结合亲和力低于所述嵌合抑制性受体结合至所述第一抗原的结合亲和力。
187.在一些实施方案中，所述嵌合受体以低结合亲合力结合至所述第一抗原。
188.在一些实施方案中，所述嵌合受体被重组表达。
189.在一些实施方案中，所述嵌合受体由载体或来自细胞基因组的所选基因座表达。
190.在一些实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调控t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞(esc)、esc衍生细胞、多能干细胞和诱导型多能干细胞(ipsc)以及ipsc衍生细胞。
191.在一些实施方案中，所述细胞是自体的。
192.在一些实施方案中，所述细胞是同种异体的。
193.在另一方面，本文提供了分离的核酸，其编码如所述实施方案中任一个所述的嵌合受体。
194.在另一方面，本文提供了分离的核酸，其编码如所述实施方案中任一个所述的嵌合受体。
195.在另一方面，本文提供了分离的核酸，其编码如所述实施方案中任一个所述的嵌合抑制性受体。
196.在另一方面，本文提供了载体，所述载体包含如权利要求175所述的核酸。
197.在一些实施方案中，所述载体另外包含如诸实施方案所述的核酸。
198.在另一方面，本文提供了载体，所述载体包含如诸实施方案所述的核酸。
199.在另一方面，本文提供了基因修饰的细胞，所述基因修饰的细胞包含如诸实施方案所述的核酸。
200.在一些实施方案中，所述细胞另外包含如诸实施方案所述的核酸。
201.在另一方面，本文提供了基因修饰的细胞，所述基因修饰的细胞包含如诸实施方案所述的核酸。
202.在另一方面，本文提供了基因工程改造的细胞，所述基因工程改造的细胞包含如诸实施方案中任一个所述的载体。
203.在另一方面，本文提供了减小受试者的肿瘤负担的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如诸实施方案中任一个所述的分离的细胞。
204.在一些实施方案中，所述方法使肿瘤细胞数目减少。
205.在一些实施方案中，所述方法使肿瘤大小减小。
206.在一些实施方案中，所述方法消除了所述受试者的肿瘤。
207.在另一方面，本文提供了在受试者中治疗或预防骨髓病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如诸实施方案中任一个所述的分离的细胞。
208.在一些实施方案中，所述骨髓病症是骨髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、慢性髓单核细胞性白血病、急性髓性白血病(aml)、急性成髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和真性红细胞增多症。
209.在一些实施方案中，所述骨髓病症是急性髓性白血病(aml)。
210.在一些实施方案中，所述方法减小或消除了所述受试者的肿瘤负担。
211.在另一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含有效量的如诸实施方案中任一个所述的分离的细胞和药学上可接受的赋形剂。
212.在一些实施方案中，所述药物组合物用于治疗和/或预防骨髓病症。
213.在另一方面，本文提供了用于治疗和/或预防骨髓病症的药盒，所述药盒包括如诸实施方案中任一个所述的分离的细胞。
214.在一些实施方案中，所述药盒另外包括使用所述细胞在受试者治疗和/或预防骨髓病症的书面说明书。
215.在另一方面，本文提供了用于治疗和/或预防骨髓病症的药盒，所述药盒包括如诸实施方案中任一个所述的分离的核酸。
216.在一些实施方案中，所述药盒另外包括使用所述核酸产生一种或多种抗原特异性细胞以用于在受试者中治疗和/或预防骨髓病症的书面说明书。
217.在另一方面，本文提供了用于治疗和/或预防骨髓病症的药盒，所述药盒包括如诸实施方案中任一个所述的载体。
218.在一些实施方案中，所述药盒另外包括使用所述载体产生一种或多种抗原特异性细胞以用于在受试者中治疗和/或预防骨髓病症的书面说明书。
219.在另一方面，本文提供了治疗和/或预防骨髓病症的方法，所述方法包括施用有效量的至少一种结合至抗原的抗体，其中所述抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9和spns3。
220.在一些实施方案中，所述骨髓病症选自由以下组成的组：骨髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、慢性髓单核细胞性白血病、或急性髓性白血病(aml)、急性成髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和真性红细胞增多症。
221.在一些实施方案中，所述骨髓病症是急性髓性白血病(aml)。
222.在一些实施方案中，所述方法减小或消除了所述受试者的肿瘤负担。
223.附图简述
224.本专利或申请文件含有至少一幅彩色绘图。在请求并支付必要的费用后，事务所将提供含彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
225.结合以下发明描述和附图，将会更充分地理解本发明的那些和其他特征、方面和优点。
226.图1提供了指定组织或细胞类型中的flt3表达的微阵列和rna-seq数据。
227.图2提供了指定组织或细胞类型中的ms4a3表达的微阵列和rna-seq数据。
228.图3提供了指定组织或细胞类型中的cd33表达的微阵列和rna-seq数据。
229.图4提供了指定组织或细胞类型中的clec12a表达的微阵列和rna-seq数据。
230.图5提供了指定组织或细胞类型中的cd312/adgre2表达的微阵列和rna-seq数据。
231.图6提供了指定组织或细胞类型中的slc22a16表达的微阵列和rna-seq数据。
232.图7提供了指定组织或细胞类型中的cd123/ilr3ra表达的微阵列和rna-seq数据。
233.图8提供了指定组织或细胞类型中的lat2表达的微阵列和rna-seq数据。
234.图9提供了指定组织或细胞类型中的piezo1/fam38a表达的微阵列和rna-seq数据。
235.图10提供了指定组织或细胞类型中的cd38表达的微阵列和rna-seq数据。
236.图11提供了指定组织或细胞类型中的emb表达的微阵列和rna-seq数据。
237.图12提供了指定组织或细胞类型中的cd131/csf2rb表达的微阵列和rna-seq数据。
238.图13提供了指定组织或细胞类型中的p2ry8表达的微阵列和rna-seq数据。
239.图14提供了指定组织或细胞类型中的lilra2/cd85h表达的微阵列和rna-seq数据。
240.图15提供了指定组织或细胞类型中的slc17a9表达的微阵列和rna-seq数据。
241.图16提供了指定组织或细胞类型中的myadm表达的微阵列和rna-seq数据。
242.图17提供了指定组织或细胞类型中的cd300lf表达的微阵列和rna-seq数据。
243.图18提供了指定组织或细胞类型中的cd244/slamf4表达的微阵列和rna-seq数据。
244.图19提供了指定组织或细胞类型中的plaur表达的微阵列和rna-seq数据。
245.图20提供了指定组织或细胞类型中的cd93表达的微阵列和rna-seq数据。
246.图21提供了指定组织或细胞类型中的spns3表达的微阵列和rna-seq数据。
247.图22提供了指定组织或细胞类型中的gapt表达的微阵列和rna-seq数据。
248.图23提供了指定组织或细胞类型中的rasgrp4表达的微阵列和rna-seq数据。
249.图24提供了指定组织或细胞类型中的cd117/c-kit表达的微阵列和rna-seq数据。
γ和il-2产生。图41c示出了flt3 car t细胞在与eol-1细胞一起孵育之后诱导tnf-α、ifn-γ和il-2产生。
267.图42a示出示出了aml细胞系molm-13、mv4-1和thp-1中的cd33蛋白表达(x轴)的流式细胞术直方图。图42b示出了cd33 car t细胞杀伤moml-13、mv-11和thp-1人白血病细胞。图42c示出了molm-13 aml细胞在两种cd33car t细胞情况下的剂量依赖性cd33 car t细胞杀伤。
268.图43a示出了cd33 car t细胞在与molm-13细胞一起孵育之后诱导tnf-α、ifn-γ和il-2产生。图43b示出了cd33car t细胞在与mv4-11细胞一起孵育之后诱导tnf-α、ifn-γ和il-2产生。图43c示出了cd33 car t细胞诱导thp-1细胞中的tnf-α、ifn-γ和il-2产生。
269.图44示出了u937、thp-1、hl-60、mv-14、molm-14、molm-13、nalm6、raji、k562和sem细胞系中的clec12a表达的流式细胞术图。
270.图45a示出了四个aml细胞系中的clec12a蛋白表达的流式细胞术直方图。图45b示出了证明clec12a car t细胞杀伤人aml细胞(e∶t比1∶1)的体外共培养细胞毒性测定，其中杀伤活性百分比在y轴上。图45c示出了clec12a car t细胞当与人急性髓性白血病(aml)细胞系一起共培养时具有强效细胞因子分泌(il-2)，如通过luminex测定所检测。car第1号＝sb01261，clec12a(357)car t细胞；car第2号＝sb01262，clec12a(378)car t细胞；car第3号＝sb01263，clec12a(161)car t细胞。
271.图46a示出了针对molm-13(低clec12a表达)的clec12a car t细胞细胞毒性活性和细胞因子产生。图46b示出了针对mv4-11(低clec12a表达)的clec12a car t细胞细胞毒性活性和细胞因子产生。图46c示出了针对molm-14(高clec12a表达)的clec12a car t细胞细胞毒性活性和细胞因子产生。图46d示出了针对u937的clec12a car t细胞细胞毒性活性和细胞因子产生。图46e示出了针对thp-1的clec12a car t细胞细胞毒性活性和细胞因子产生。图46f示出了针对hl-60的clec12a car t细胞细胞毒性活性和细胞因子产生。各个clec12a car具有cd8铰链和跨膜域以及4-1bb和cd3ζ共刺激域。flt3(nc7)car具有4-1bb共刺激域。cd33(hu195)car具有cd28共刺激域。
272.图47提供了合成的clec12a car的示意图。
273.图48a示出了指定clec12a car在t细胞中的转导。图48b示出了指定clec12a car在t细胞中的平均荧光强度(mfi)。
274.图49示出了指定clec12a car t细胞对hl-60、molm14、mv4-11和molm-13细胞的细胞毒性，如在与所述car t细胞一起孵育之后的细胞系杀伤百分比所表明。
275.图50示出了指定clec12a car t细胞在与hl-60、molm14、mv4-11、molm-13和k562细胞一起孵育之后的il-2产生。
276.图51示出了指定clec 12a car t细胞在与hl-60、molm14、mv4-11、molm-13和k562细胞一起孵育之后的ifn-γ产生。
277.图52示出了指定clec12a car t细胞在与hl-60、molm14、mv4-11、molm-13和k562细胞一起孵育之后的tnf-α产生。
278.图53a示出了用cd33 car t细胞处理的未携带肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图53b示出了用flt3 car t细胞处理的未携带肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图53c示出了用对照物未工程改造的t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。终点标准是
达到第14天并且将小鼠处死。图53d示出了用对照物未工程改造的t细胞处理的未携带肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图53e示出了第5天用flt3 car t细胞处理一次的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图53f示出了第8天用flt3 car t细胞处理一次的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。终点标准是达到第14天并且将小鼠处死。图53g示出了在第5天和第12天用flt3 car t细胞处理两次的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图53h示出了第5天用cd33 car t细胞处理一次的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图53i示出了第8天用cd33 car t细胞处理一次的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。终点标准是达到第14天并且将小鼠处死。图53j示出了在第5天和第12天用cd33 car t细胞处理两次的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图53k提供了各个处理组中的体内fluc生物发光图像。
279.图54a示出了用flt3 car t细胞和cd33 car t细胞单独或组合进行的t细胞剂量递增测定的体内图像结果。图54b示出了用未工程改造的t细胞处理的未携带肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54c示出了用未工程改造的t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54d示出了用9
×
106个flt3 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54e示出了用18
×
106个flt3 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54f示出了用0.625
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54g示出了用1.25
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54h示出了用2.5
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54i示出了用5
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54j示出了用10
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54k示出了用4.5
×
106个flt3 car t细胞和2.5
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54l示出了用9
×
106个flt3 car t细胞和5
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54m示出了用18
×
106个flt3 car t细胞和10
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。
280.图55a示出了体内肿瘤molm-14细胞在用指定car处理后第7天的相对生物发光变化倍数。图55b示出了体内肿瘤molm-14细胞在用指定car处理后第11天的相对生物发光变化倍数。图55c示出了体内肿瘤molm-14细胞在用指定car处理后的生物发光。
281.图56a提供了具有替代铰链序列的指定car的示意图。图56b示出了指定car在与molm-13细胞一起孵育之后的细胞毒性和il-2产生。图56c示出了指定car在与molm-14细胞一起孵育之后的细胞毒性和il-2产生。图56d示出了指定car在与mv4-11细胞一起孵育之后的细胞毒性和il-2产生。图56e示出了指定car在与sem细胞一起孵育之后的细胞毒性和il-2产生。
282.图57a示出了呈相对于未转导的car t细胞正规化形式的指定car t细胞在与molm-13细胞一起孵育后所致的杀伤百分比。图57b示出了指定car在与molm-13细胞一起孵育之后的il-2产生。图57c示出了指定car t细胞在与molm-13细胞一起孵育之后的ifn-γ产生。图57d示出了指定car t细胞在与molm-13细胞一起孵育之后的tnf-α产生。
283.图58a示出了molm-13模型中用指定car t细胞处理后的体内存活时间。图58b示出了体内肿瘤molm-13细胞在用指定car处理后的生物发光。
284.图59a示出了两种双顺反子flt3和cd33 car在t细胞sb01266和sb01659中的表达。图59b示出了指定car在与molm-13细胞一起孵育之后的细胞毒性和il-2产生。图59c示出了指定car在与mv4-11细胞一起孵育之后的细胞毒性和il-2产生。图59d示出了指定car在与sem细胞一起孵育之后的细胞毒性和il-2产生。
285.图60a示出了未工程改造的k562细胞中的flt3和cd33染色。图60b示出了经过工程改造以表达flt3的k562细胞中的flt3和cd33染色。图60c示出了经过工程改造以表达cd33的k562细胞中的flt3和cd33染色。
286.图61示出了单价flt3 car t细胞、单价cd33 car t细胞以及双顺反子flt3和cd33 car t细胞与表达flt3的k562细胞(上图)、表达cd33的细胞(中图)或表达flt3的细胞与表达cd33的细胞的1∶1混合物(下图)一起孵育时的细胞毒性、il-2产生、ifn-γ产生和tnf-α产生。
287.图62示出了单价flt3 car t细胞、单价cd33 car t细胞以及双顺反子flt3和cd33 car t细胞与molm-13细胞(上图)、mv4-11细胞(中图)或sem细胞(下图)一起孵育时的细胞毒性、il-2产生、ifn-γ产生和tnf-α产生。
288.图63a示出了环flt3二价car的示意图。图63b示出了串联flt3二价car的示意图。图63c示出了单价flt3 car t细胞、环二价flt3 car t细胞和串联flt3 car t细胞与mv4-11细胞(上)或sem细胞(下)一起孵育之后的细胞毒性。
289.图64a示出了指定car构建体与molm-13细胞一起孵育之后的细胞毒性以及il-2、ifn-γ和tnf-α分泌。图64b示出了指定car构建体与mv4-11细胞一起孵育之后的细胞毒性以及il-2、ifn-γ和tnf-α分泌。图64c示出了指定car构建体与表达cd33的k562细胞一起孵育之后的细胞毒性以及il-2、ifn-γ和tnf-α分泌。
290.图65a示出了指定细胞类型上的emcn表达。图65b示出了hsc和lsc上的emcn表达。图65c示出了来自多个供体的hsc和lsc上的emcn表达的汇总。
291.图66a示出了sem细胞的flt3、cd33和flt3/cd33 car nk细胞杀伤。图66b示出了flt3 car nk细胞与sem细胞一起孵育之后的ifn-γ分泌。图66c示出了flt3 car nk细胞与sem细胞一起孵育之后的tnf-α分泌。图66d示出了pl-21细胞的flt3、cd33和flt3/cd33 car nk细胞杀伤。
292.发明详述
293.除非另外指明，否则将采用本领域技术人员能力范围内的分子生物学、化学、生物化学、病毒学和免疫学常规方法来实践本发明。文献中已充分阐明了此类技术。参见例如hepatitis cviruses：genomes and molecular biology(s.l.tan编，taylor&francis，2006)；fundamental virology，第3版，第i卷和第ii卷(b.n.fields和d.m.knipe编)；handbook of experimental immunology，第i卷至第iv卷(d.m.weir和c.c.blackwell编，blackwell scientific publications)；a.l.lehninger，biochemistry(worth publishers，inc.，现行版)；sambrook等，molecular cloning：a laboratory manual(第3版，2001)；methods in enzymology(s.colowick和n.kaplan编，academic press，inc.)。
294.定义
295.除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、标记和其他科学术语都意在具有本领域技术人员通常所理解的含义。在一些情况下，本文出于清楚性和/或快速参考的目的
而定义了具有通常理解的含义的术语，而且本文包括此类定义未必应当被理解为表示与本领域通常所理解的有差异。本领域技术人员一般使用常规方法就能充分理解并且通常采用本文描述或参考的技术和程序，举例来说，诸如sambrook等，molecular cloning：a laboratory manual第4版(2012)cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，ny中描述的广泛使用的分子克隆方法。适当时，除非另外指明，否则涉及使用市售试剂盒和试剂的程序一般根据制造商限定的方案和条件来进行。
296.如本文所用，除非上下文另外明确指明，否则单数形式“一”和“该”包括复数个参考物。除非另外明确指明，否则术语“包括”、“诸如”等等意在传达包括但不限于。
297.如本文所用，除非另外明确指明，否则术语“包含”还明确包括实施方案“由叙述的要素组成”和“基本上由叙述的要素组成”。
298.术语“约”表示并涵盖指定值和在该值上下的范围。在某些实施方案中，术语“约”表示指定值
±
10％、
±
5％或
±
1％。在某些实施方案中，适用时，术语“约”表示指定值
±
该值的一倍标准偏差。
299.如本文所用，术语“激活免疫应答细胞”是指在细胞中诱导信号转导或蛋白质表达变化，从而引发免疫应答。举例来说，当cd3链响应于配体结合和基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(itam)而丛聚时，产生了信号转导级联。在某些实施方案中，当内源tcr或外源car结合抗原时，发生了免疫突触形成，其包括许多分子丛聚在已结合的受体附近(例如cd4或cd8、cd3γ/δ/ε/ζ等)。膜结合信号传导分子的这种丛聚允许cd3链内含有的itam基序磷酸化。这种磷酸化又引发了t细胞激活途径，最终激活了转录因子，诸如nf-κb和ap-1。这些转录因子诱导t细胞的整体基因表达以增加il-2产生，从而进行主调控t细胞蛋白的增殖和表达，以便引发t细胞介导的免疫应答。
300.如本文所用，术语“刺激免疫应答细胞”是指引起稳固又持续的免疫应答的信号。在各个实施方案中，这发生在免疫细胞(例如t细胞)激活后或通过包括但不限于cd28、cd137(4-1bb)、ox40、cd40和icos等受体附带介导。不受特定理论束缚，接受多个刺激信号对于建立长期稳固t细胞介导的免疫应答非常重要。在没有接受这些刺激信号的情况下，t细胞很快被抑制而且对抗原无响应。尽管这些共刺激信号的作用不同而且仍然被部分理解，但它们一般会增加基因表达以产生对稳定响应于抗原的长寿命增殖性抗凋亡t细胞，从而实现完全又持续的根除。
301.如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或替代地“car”是指包含至少细胞外抗原结合域、跨膜域和包含来源于如下文定义的刺激分子的功能性信号传导域的胞质信号传导域(本文也称为“细胞内信号传导域”)的重组多肽构建体。在一些实施方案中，car多肽构建体中的结构域在相同多肽链中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，car多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如在不同的多肽链中，例如，如本文描述的rcar中所提供。在一方面，刺激分子是与t细胞受体复合物缔合的ζ链。在一方面，所述胞质信号传导域包含一级信号传导域(例如cd3-ζ的一级信号传导域)。在一方面，胞质信号传导域另外包含一个或多个来源于至少一个如下文定义的共刺激分子的功能性信号传导域。在一方面，所述共刺激分子选自4-1bb(亦即，cd 137)、cd27、icos和/或cd28。在一方面，所述car包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合域、跨膜域和细胞内细胞内信号传导域，所述细胞内信号传导域包含来源于刺激分子的功能性信号传导域。在一方面，所述car包含嵌合融
lazikani等,(1997)jmb 273,927-948(“chothia”编号方案)描述的那些方案，或其组合。根据kabat编号方案，在一些实施方案中，重链可变域(vh)中的cdr氨基酸残基被编号为31-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)；而轻链可变域(vl)中的cdr氨基酸残基被编号为24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)。根据chothia编号方案，在一些实施方案中，vh中的cdr氨基酸残基被编号为26-32(hcdr1)、52-56(hcdr2)和95-102(hcdr3)；而vl中的cdr氨基酸残基被编号为26-32(lcdr1)、50-52(lcdr2)和91-96(lcdr3)。在一些实施方案中，在组合的kabat和chothia编号方案中，cdr对应于作为kabat cdr、chothia cdr或二者的一部分的氨基酸残基。举例来说，在一些实施方案中，cdr对应于vh(例如哺乳动物vh，例如人vh)中的氨基酸残基26-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)；以及vl(例如哺乳动物vl，例如人vl)中的氨基酸残基24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)。
307.本发明的嵌合受体中包含抗体或其抗体片段的部分可以呈多种形式存在，其中抗原结合域表达为连续多肽链的一部分，包括例如scfv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(诸如sdab(vl或vh))、骆驼vhh结构域、人源化抗体、双特异性抗体、抗体缀合物(harlow等,1999,using antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,ny；harlow等,1989,antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor,new york；houston等,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883；bird等,1988,science 242:423-426)。在一方面，本发明的嵌合受体的抗原结合域包含抗体片段。在另一方面，所述嵌合受体含有包含scfv的抗体片段。
308.如本文所用，术语“抗体重链”是指以天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中的较大者，而且它通常决定抗体所属的类别。
309.如本文所用，术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中的较小者。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同型。
310.如本文所用，术语“重组抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，举例来说，诸如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应当被视为意指通过合成编码抗体的dna分子并且所述dna分子表达抗体蛋白质或规定抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中所述dna或氨基酸序列是使用本领域可利用而且众所周知的重组dna或氨基酸序列技术来获得。
311.如本文所用，术语“抗原”或“ag”是指激起免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或具体免疫胜任细胞激活或二者。本领域技术人员应当理解，任何巨分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。
312.如本文所用，术语“抗肿瘤作用”或“抗肿瘤活性”是指可以通过各种手段体现的生物学作用，包括但不限于例如肿瘤体积减小、肿瘤细胞数目减少、转移数目减少、预期寿命增加、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活率降低或与癌症疾患相关的各种生理学症状改善。“抗肿瘤作用”还可以由本发明的肽、聚核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来体现。
313.如本文所用，术语“自体”是指来源于相同个体的任何材料，它稍后将被重新引入所述个体中。
314.如本文所用，术语“同种异体”是指来源于与引入所述材料的个体的相同物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座的基因不同一时，称两个或更多个个体为彼此同种异体的。在一些实施方案中，来自相同物种的个体的同种异体材料在基因上不同的程度
可能足以发生抗原相互作用。
315.如本文所用，术语“亲和力”是指结合强度的度量。不受理论束缚，亲和力视抗体结合位点与抗原决定子之间的立体化学拟合的紧密度、它们之间的接触面积的大小以及带电和疏水性基团的分布而定。亲和力还包括术语“亲合力”，它是指形成可逆复合物之后抗原-抗体键的强度。计算抗体对抗原的亲和力的方法在本领域是已知的，包括使用结合实验来计算亲和力。功能测定(例如流式细胞术测定)中的抗体活性也体现抗体亲和力。可以使用功能测定(例如流式细胞术测定)对抗体和亲和力进行表型表征和比较。
316.如本文所用，术语“免疫抑制活性”是指在细胞(诸如激活的免疫应答细胞)中诱导信号转导或蛋白质表达变化，由此引起免疫应答降低。已知通过它们的结合而抑制或降低了免疫应答的多肽的非限制性实例包括cd47、pd-1、ctla-4及其相应配体，包括sirpa、pd-l1、pd-l2、b7-1和b7-2。此类多肽可以存在于肿瘤微环境中而且可以抑制对肿瘤细胞的免疫应答。在各个实施方案中，抑制、阻断或以其他方式拮抗免疫抑制性多肽和/或其配体的相互作用可以增强免疫应答细胞的免疫应答。
317.如本文所用，术语“酶抑制域”是指抑制细胞内信号转导级联，例如天然t细胞激活级联的蛋白质结构域。在一些实施方案中，本发明的嵌合抑制性受体的酶抑制结构域包含细胞外域、跨膜域和/或细胞内域的至少一部分。在一些实施方案中，所述酶抑制域包含酶的至少一部分。在一些实施方案中，所述酶选自csk、shp-1、pten、cd45、cd148、ptp-meg1、ptp-pest、c-cbl、cbl-b、ptpn22、lar、ptph1、ship-1和rasgap(参见例如stanford等,regulation of tcr signaling by tyrosine phosphatases:from immune homeostasis to autoimmunity,immunology,2012年9月；137(1):1-19)。在一些实施方案中，所述酶部分包含酶结构域、酶片段或其突变体。在一些实施方案中，所述酶部分是酶催化域。在一些实施方案中，选择酶结构域、酶片段或其突变体以使功效最大化并且使基础抑制最小化。
318.如本文所用，术语“免疫刺激活性”是指在细胞(诸如激活的免疫应答细胞)中诱导信号转导或蛋白质表达变化，从而引起免疫应答增加。免疫刺激活性可以包括促炎性活性。已知通过其结合来刺激或增加免疫应答的多肽的非限制性实例包括cd28、ox-40、4-1bb及其相应配体，包括b7-1、b7-2、ox-40l和4-1bbl。此类多肽可以存在于肿瘤微环境中而且可以激活对肿瘤细胞的免疫应答。在各个实施方案中，促进、刺激或以其他方式激动促炎性多肽和/或其配体的相互作用可以增强免疫应答细胞的免疫应答。
319.本发明的分离的核酸分子包括编码本发明的多肽的任何核酸分子或其片段。此类核酸分子无需与内源核酸序列100％同源或同一，但典型地将表现出基本同一性。与内源序列具有“基本同一性”或“基本同源性”的核酸典型地能够与双链核酸分子的至少一个链杂交。如本文所用，“杂交”是指在各种严格条件下配对以在互补聚核苷酸序列(例如本文所述的基因)或其部分之间形成双链分子。举例来说，严格盐浓度可以低于约750mm nacl和75mm柠檬酸三钠、低于约500mm nacl和50mm柠檬酸三钠、或低于约250mm nacl和25mm柠檬酸三钠。低严格度杂交可以在不存在有机溶剂(例如甲酰胺)的情况下获得，而高严格度杂交可以在存在至少约35％甲酰胺或至少约50％甲酰胺的情况下获得。严格温度条件一般将包括至少约30℃、至少约37℃或至少约42℃的温度。改变其他参数，诸如杂交时间、清洁剂(例如十二烷基硫酸钠(sds))的浓度以及包括或不包括载体dna，对本领域技术人员是众所周知的。通过根据需要组合这些不同的条件可以实现各种水平的严格度。
[0320]“基本上同一”或“基本上同源”意指多肽或核酸分子表现出与参考氨基酸序列(例如本文所述的氨基酸序列中的任一种)或核酸序列(例如本文所述的核酸序列中的任一种)至少约50％同源或同一。优选地，此类序列在氨基酸层面或核酸上与用于比较的序列至少约60％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％同源或同一。序列同一性典型地使用序列分析软件(例如威斯康辛大学生物技术中心(1710university avenue,madison,wis.53705)genetics computer group的序列分析软件包、blast、bestfit、gap或pileup/prettybox程序)进行测量。此类软件通过指定各种取代、缺失和/或其他修饰的同源性程度来匹配同一或类似的序列。保守取代典型地包括以下各组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰氨酸、谷酰氨酸；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，其中概率评分在e-3与e-100之间表明密切相关的序列。
[0321]
如本文所用，术语“编码”是指用于在生物过程中充当合成其他聚合物和大分子的模板而且具有确定的核苷酸序列(例如rrna、trna和mrna)或确定的氨基酸序列的聚核苷酸，诸如基因、cdna或mrna中具体核苷酸序列的固有性质，以及由此产生的生物学性质。因此，如果对应于所述基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因、cdna或rna编码蛋白质。核苷酸序列与mrna序列同一而且通常提供在序列表中的编码链和用作基因或cdna的转录模板的非编码链可以称为编码蛋白质或者所述基因或cdna的其他产物。除非另外规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是简并型式而且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列还可以包括内含子，其程度是编码蛋白质的核苷酸序列可以在某种型式中含有内含子。
[0322]
如本文所用，术语“配体”是指结合至受体的分子。具体来说，配体结合另一个细胞上的受体，从而允许细胞-细胞识别和/或相互作用。
[0323]
术语“有效量”和“治疗有效量”在本文可互换使用，并且是指如本文所述的对实现特定生物学结果有效的化合物、制剂、材料或组合物的量。在一些实施方案中，“有效量”或“治疗有效量”是足以停滞、改善或抑制目标疾病或病症(例如髓病症)继续增殖、生长或转移的量。
[0324]
如本文所用，术语“免疫应答细胞”是指在免疫应答(例如免疫效应子应答)中发挥功能的细胞或祖细胞或其子代。免疫效应细胞的实例包括但不限于α/βt细胞、γ/δt细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、肥大细胞和骨髓衍生吞噬细胞。
[0325]
如本文所用，术语“免疫效应子应答”或“免疫效应子功能”是指例如增强或促进靶细胞的免疫攻击的免疫应答细胞功能或应答。举例来说，免疫效应子功能或应答可以指t细胞或nk细胞的促进杀伤靶细胞或者抑制其生长或增殖的性质。在t细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。
[0326]
如本文所用，术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基的氨基酸组成而且用于将可变重链和可变轻链区域连接在一起的肽接头。在一个实施方案中，柔性多肽接头是gly/ser接头而且包含氨基酸序列(gly-gly-gly-ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。举例来说，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5且n＝6、n＝7、n＝8、n＝9且n＝10。在一些实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(gly4ser)4或(gly4ser)3。在其他实施方案中，接头包括多个(gly2ser)、(glyser)或(gly3ser)重复单元。
本发明的范围内还包括例如wo2012/138475中所述的接头。
[0327]
如本文所用，术语“特异性结合”是指识别并结合目标生物分子(例如多肽)但基本上不识别并结合样品(例如生物样品，它在天然情况下包括本发明的多肽)中的其他分子的多肽或其片段。在某些实施方案中，“特异性结合”是指例如抗体以使得可以用同一或类似表位、抗原或抗原决定子的第二制剂替代或竞争结合的方式结合至表位或抗原或抗原决定子。
[0328]
如本文所用，术语“治疗”是指通过施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂，诸如本发明的car)来减轻或改善增殖性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善增殖性疾病的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨症状)。在一些实施方案中，术语“治疗”是指改善患者未必能辨别的增殖性病症的至少一个可测量物理参数，诸如肿瘤生长。在其他实施方案中，术语“治疗”是指以物理方式(通过例如稳定可辨症状)、以生理方式(通过例如稳定物理参数)或二者抑制增殖性病症的进展。在一些实施方案中，术语“治疗”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
[0329]
如本文所用，术语“受试者”意在包括可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物、人)。
[0330]
本发明的其他方面描述于以下部分中并且在所要求的发明范围内。
[0331]
其他诠释惯例
[0332]
本文叙述的范围应当理解为对所述范围内的所有值(包括所述终点在内)的简化。举例来说，范围1至50应当理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的任何数值、数值组合或子范围。
[0333]
除非另外指明，否则提到具有一个或多个立体中心的化合物意指其每一种立体异构体和立体异构体的所有组合。
[0334]
骨髓抗原
[0335]
本发明的某些方面涉及嵌合受体和经过基因修饰以表达一个或多个结合至目标抗原的嵌合受体的细胞，诸如免疫应答细胞，以及使用此类受体和细胞治疗和/或预防骨髓恶性肿瘤(诸如aml)和需要抗原特异性免疫应答的其他病变的方法。恶性细胞已经发展出一系列机制来保护其自身免于免疫识别和消除。本发明在肿瘤微环境内提供免疫原性以用于治疗此类恶性细胞。
[0336]
本发明的某些方面涉及可用于治疗骨髓恶性肿瘤的特异性结合骨髓细胞上表达的一种或多种抗原的嵌合受体，以及经过基因修饰以表达此类嵌合受体的免疫应答细胞。骨髓恶性肿瘤是由造血干细胞或祖细胞功能障碍引起的克隆性疾病，由破坏关键过程(诸如细胞增殖和分化)的基因和表观基因变化引起。骨髓恶性肿瘤可以是慢性或急性的。慢性疾病包括骨髓增生性肿瘤(mpn)、骨髓发育不良综合征(mds)和慢性髓单核细胞性白血病(cmml)。急性疾病包括急性髓性白血病(aml)。
[0337]
aml以异常白细胞快速生长，积累在骨髓中并破坏正常血细胞的产生为特征。aml的症状包括疲劳、呼吸短促、易感染性增高以及容易瘀青和出血。大多数aml病例是原发性的，但一些病例可能继发于慢性疾病。基于白血病所起源的细胞类型和细胞成熟程度，aml有八种不同的亚型。aml亚型包括未分化成髓细胞(m0)、最低程度成熟成髓细胞(m1)、完全
成熟成髓细胞(m2)、前髓细胞(m3)、髓单核细胞(m4)、单核细胞(m5)、红白血病(m6)和巨核细胞(m7)。
[0338]
在某些实施方案中，本发明涉及aml抗原和适用于嵌合受体(例如嵌合tcr或car)中以便在治疗aml时增高功效并降低脱肿瘤毒性的aml抗原组合。
[0339]
表1提供了适用于本文提供的方法和组合物中所述的嵌合受体中的aml抗原。
[0340]
[0341]
[0342]
[0343]
[0344]
[0345]
[0346][0347]
在一些实施方案中，所述aml抗原是flt3抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是ms4a3抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd33抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是clec12a抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd312/adgre2抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是slc22a16抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd123/ilr3ra抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是lat2抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是piezo1/fam38a抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd38抗原。在一些实施方案中，所述aml抗
原是emb抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd131/csf2rb抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是p2ry8抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是lilra2/cd85h抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是slc17a9抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是myadm抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd300lf抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd244/slamf4抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是plaur抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd93抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是spns3抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是gapt抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是rasgrp4抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd117/c-kit抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd123/ilr3ra抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是slc34a2抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是vstm1抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是mlc1抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是pram1抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是hck抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是icam3抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是lrrc37a2抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是itgam抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是itgb2抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是lilra1抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是prtn3抗原。在一些实施方案中，aml抗原是card9抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是siglec5抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是sell抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是mlkl抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是inpp5d抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是apbb1ip抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是itga4抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是c3ar1抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是itga5抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是fmnl1抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是il1rap抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是ccr1/cd191抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是lilrb2抗原。在一些实施方案中，所述aml抗原是cd70抗原。
[0348]
嵌合受体
[0349]
本发明的某些方面涉及嵌合受体和编码此类结合至目标抗原的嵌合受体的核酸。
[0350]
抗体和抗原结合片段
[0351]
在一些实施方案中，嵌合受体包含表a1或表a2中列出的氨基酸序列中的一个或多个。表a1提供了抗体重链或轻链的可变域。对于各个可变重链或可变轻链，使用kabat方法确定cdr，在表a1中加下划线并示于表a2中。在一些实施方案中，编码本发明的嵌合受体中的任一个的核酸包含表b中列出的核酸序列中的一个或多个。
[0352]
[0353]
[0354]
[0355]
[0356][0357]
[0358]
[0359]
[0360]
[0361]
[0362]
[0363]
[0364]
[0365]
[0366][0367]
[0368]
id no:111中所示的cdr-h1序列、如seq id no:112中所示的cdr-h2序列和如seq id no:113中所示的cdr-h3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:114中所示的cdr-l1序列、如seq id no:115中所示的cdr-l2序列和如seq id no:116中所示的cdr-l3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:117中所示的cdr-h1序列、如seq id no:118中所示的cdr-h2序列和如seq id no:119中所示的cdr-h3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:120中所示的cdr-l1序列、如seq id no:121中所示的cdr-l2序列和如seq id no:122中所示的cdr-l3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:123中所示的cdr-h1序列、如seq id no:124中所示的cdr-h2序列和如seq id no:125中所示的cdr-h3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:126中所示的cdr-l1序列、如seq id no:127中所示的cdr-l2序列和如seq id no:128中所示的cdr-l3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:129中所示的cdr-h1序列、如seq id no:130中所示的cdr-h2序列和如seq id no:131中所示的cdr-h3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:132中所示的cdr-l1序列、如seq id no:133中所示的cdr-l2序列和如seq id no:134中所示的cdr-l3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:135中所示的cdr-h1序列、如seq id no:136中所示的cdr-h2序列和如seq id no:137中所示的cdr-h3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:138中所示的cdr-l1序列、如seq id no:139中所示的cdr-l2序列和如seq id no:140中所示的cdr-l3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:141中所示的cdr-h1序列、如seq id no:142中所示的cdr-h2序列和如seq id no:143中所示的cdr-h3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:144中所示的cdr-l1序列、如seq id no:145中所示的cdr-l2序列和如seq id no:146中所示的cdr-l3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:147中所示的cdr-h1序列、如seq id no:148中所示的cdr-h2序列和如seq id no:149中所示的cdr-h3序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域包含如seq id no:150中所示的cdr-l1序列、如seq id no:151中所示的cdr-l2序列和如seq id no:152中所示的cdr-l3序列。
[0373]
合适的本发明抗体包括足够强地且特异性地结合至骨髓(例如aml)抗原的任何抗体，无论天然或合成、全长或其片段、单克隆或多克隆。在一些实施方案中，所述抗体的kd可以是至多约至多10-6
m、至多约10-7
m、至多约10-8
m、至多约10-9
m、至多约10-10
m、至多约10-11
m或至多约10-12
m。
[0374]
在一些实施方案中，可以使用的抗体及其衍生物包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、灵长类化(cdr移植)抗体、镶嵌抗体、单链抗体、噬菌体产生的抗体(例如来自噬菌体呈现文库)和抗体的功能结合片段。举例来说，能够结合至骨髓(例如aml)抗原或其部分的抗体片段包括但不限于fv、fab、fab'和f(ab')2片段。所述片段可以通过酶促切割或通过重组技术产生。举例来说但不具限制性，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割分别可以产生fab或f(ab')2片段。具有必要底物特异性的其他蛋白酶也可以用于产生fab或f(ab')2片段。还可以使用已经在天然终止位点上游引入一个或多个终止密码子的抗体基因来产生呈各种截短形式的抗体。举例来说，可以设计编码f(ab')2重链部分的嵌合基因以包括编码重链的ch结构域和铰链区的dna序列。
[0375]
产生靶向特异性抗原的抗体的方法在本领域中一般是已知的。合成的和工程改造
的抗体描述于例如us4816567、ep0125023bl、us4816397、ep0120694bl、wo 86/01533、ep0194276bl、us5225539、ep0239400bl、ep0451216bl、ep0519596al和us4946778中。
[0376]
在一些实施方案中，市售抗体可用于结合至骨髓(例如aml)抗原。本领域技术人员使用常规测序技术容易获取市售抗体的cdr。此外，本领域技术人员能够基于此类市售抗体的cdr来构建编码scfv和嵌合受体(例如car和tcr)的核酸。
[0377]
在一些实施方案中，嵌合受体包含特异性结合flt3的抗原结合域。在一些实施方案中，所述flt3特异性抗原结合域来源于抗flt3抗体，诸如美国专利号8,071,099中所述的d4-3、nc7或eb10抗体。在一些实施方案中，所述flt3特异性抗原结合域来源于抗flt3抗体，诸如美国专利号9,023,996中所述的4g8或bv10抗体。在一些实施方案中，所述flt3特异性抗原结合域来源于抗flt3抗体，诸如2017年2月9日公开的美国专利公布号2017/0037149中所述的fl_16或fl_39抗体。在一些实施方案中，所述flt3特异性抗原结合域来源于抗flt3抗体，诸如2018年6月28日公开的国际专利公布中wo 2018/119279所述的ml0006抗体。所述抗原结合域可以是包含轻链可变域(vl)和重链可变域(vh)的scfv。在一些实施方案中，所述嵌合受体可以具有多特异性抗原结合域。举例来说，所述嵌合受体可以对flt'3和一种或多种其他抗原(诸如cd33和/或clec12a)具特异性。
[0378]
在一些实施方案中，嵌合受体包含特异性结合cd33的抗原结合域。在一些实施方案中，所述cd33特异性抗原结合域来源于抗cd33抗体，诸如2018年1月4日公开的美国专利公布号2018/0002397中所述的林妥珠单抗。在一些实施方案中，所述cd33特异性抗原结合域来源于抗cd33抗体，诸如美国专利号5,739,116中所述的吉妥珠单抗。所述抗原结合域可以是包含轻链可变域(vl)和重链可变域(vh)的scfv。在一些实施方案中，所述嵌合受体可以具有多特异性抗原结合域。举例来说，所述嵌合受体可以对cd33和一种或多种其他抗原(诸如flt3和/或clec12a)具特异性。
[0379]
在一些实施方案中，嵌合受体包含特异性结合clec12a的抗原结合域。在一些实施方案中，所述clec12a特异性抗原结合域来源于抗clec12a抗体，诸如美国专利号7,741,443中所述的sc02-357、sc02-378或sc02-161抗体。所述抗原结合域可以是包含轻链可变域(vl)和重链可变域(vh)的scfv。在一些实施方案中，所述嵌合受体可以具有多特异性抗原结合域。举例来说，所述嵌合受体可以对clec12a和一种或多种其他抗原(诸如flt3和/或cd33)具特异性。
[0380]
t细胞受体(tcr)
[0381]
本发明的某些方面涉及特异性结合至骨髓细胞(诸如aml细胞)上表达的抗原的嵌合受体。在一些实施方案中，所述嵌合受体是嵌合t细胞受体(tcr)。本发明的tcr是二硫键连接的异二聚蛋白，它们含有表达为与不变cd3链分子的复合物的一部分的两个可变链。tcr发现于t细胞表面上，而且负责识别呈与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的肽形式的抗原。在某些实施方案中，本发明的tcr包含由tra编码的α链和由trb编码的β链。在某些实施方案中，tcr包含γ链和δ链(分别由trg和trd编码)。
[0382]
tcr的各个链由两个细胞外域构成：可变(v)区和恒定(c)区。恒定区在细胞膜近端，之后是跨膜区和短胞质尾部。可变区结合至肽/mhc复合物。各个可变区具有三个互补性决定区(cdr)。
[0383]
在某些实施方案中，tcr可以与三个二聚信号传导模组cd3δ/ε、cd3γ/ε和cd247ζ/
ζ或cd247ζ/η形成受体复合物。当tcr复合物与其抗原和mhc接合(肽/mhc)时，表达tcr复合物的t细胞被激活。
[0384]
在一些实施方案中，本发明的tcr是重组tcr。在某些实施方案中，所述tcr是非天然存在的tcr。在某些实施方案中，所述tcr与天然存在的tcr相差至少一个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述tcr与天然存在的tcr相差至少2个氨基酸残基、至少3个氨基酸残基、至少4个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基、至少13个氨基酸残基、至少14个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基酸残基、至少70个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基或更多个氨基酸残基。在某些实施方案中，所述tcr相对于天然存在的tcr被至少一个氨基酸残基修饰。在某些实施方案中，所述tcr相对于天然存在的tcr被至少2个氨基酸残基、至少3个氨基酸残基、至少4个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基、至少6个氨基酸残基、至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基、至少13个氨基酸残基、至少14个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少30个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基酸残基、至少70个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基或更多个氨基酸残基修饰。
[0385]
嵌合tcr
[0386]
在一些实施方案中，本发明的tcr包含一个或多个抗原结合域，所述一个或多个抗原结合域可以移植至tcr链，例如tcrα链或tcrβ链的一个或多个恒定域，以产生特异性结合至本发明的靶抗原(例如aml抗原)的嵌合tcr。不希望受理论束缚，认为在抗原结合后，嵌合tcr可以通过tcr复合物进行信号传导。举例来说，抗体或抗体片段(例如scfv)可以移植至tcr链(诸如tcrα链和/或tcrβ链)的恒定域，例如细胞外恒定域、跨膜域和细胞质域的至少一部分。作为另一个实例，抗体或抗体片段的cdr可以移植至tcrα链和/或β链中，以产生特异性结合至本发明的抗原(例如aml抗原)的嵌合tcr。此类嵌合tcr可以通过本领域已知的方法来产生(例如willemsen ra等,gene therapy 2000；7:1369-1377；zhang t等,cancer gene ther 200411:487-496；以及aggen等,gene ther.2012年4月；19(4):365-74)。
[0387]
嵌合抗原受体(car)
[0388]
本发明的某些方面涉及特异性结合至骨髓细胞(诸如aml细胞)上表达的抗原的嵌合受体。在一些实施方案中，所述嵌合受体是嵌合抗原受体(car)。
[0389]
在一些实施方案中，car是将目标特异性移植至或赋予免疫效应细胞上的工程改造的受体。在某些实施方案中，car可用于将抗体的特异性移植至诸如t细胞等免疫应答细胞上。在一些实施方案中，本发明的car包含与跨膜结构域融合、与一个或多个细胞内信号传导域融合的细胞外抗原结合域(例如scfv)。
[0390]
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体结合至其同源配体足以诱导免疫应答细胞激活。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体结合至其同源配体足以诱导免疫应答细胞刺激。在一些实施方案中，免疫应答细胞激活杀伤靶细胞。在一些实施方案中，免疫应答细胞
激活引起免疫应答细胞的细胞因子或趋化因子表达和/或分泌。在一些实施方案中，免疫应答细胞刺激引起免疫应答细胞的细胞因子或趋化因子表达和/或分泌。在一些实施方案中，免疫应答细胞刺激诱导免疫应答细胞分化。在一些实施方案中，免疫应答细胞刺激诱导免疫应答细胞增殖。
[0391]
本发明的car可以是第一代、第二代或第三代car。“第一代”car包含单个细胞内信号传导域，一般来源于t细胞受体链。“第一代”car一般具有来自cd3-ζ(cd3ζ)链的细胞内信号传导域，它是来自内源tcr的信号的主要传送者。“第一代”car可以提供从头抗原识别，并通过单个融合分子中的cd3ζ链信号传导域激活cd4

和cd8
t细胞，与hla介导的抗原呈递无关。“第二代”car将来自多种共刺激分子之一(例如cd28、4-1bb、icos、ox40)的第二细胞内信号传导域添加至car的胞质尾部，以便向t细胞提供额外的信号。“第二代”car提供共刺激(例如cd28或4-1bb)和激活(cd3ζ)。临床前研究已经表明“第二代”car可以改善免疫应答细胞(诸如t细胞)的抗肿瘤活性。“第三代”car具有多个细胞内共刺激信号传导域(例如cd28和4-1bb)和细胞内激活信号传导域(cd3ζ)。
[0392]
在一些实施方案中，本发明的car的细胞外抗原结合域结合至骨髓细胞(诸如aml细胞)上表达的一个或多个抗原，解离常数(kd)是约2
×
10-7
m或更小、约1
×
10-7
m或更小、约9
×
10-8
m或更小、约1
×
10-8
m或更小、约9
×
10-9
m或更小、约5
×
10-9
m或更小、约4
×
10-9
m或更小、约3
×
10-9
m或更小、约2
×
10-9
m或更小、或者约1
×
10-9
m或更小。在一些实施方案中，所述kd在约2
×
10-7
m至约1
×
10-9
m的范围内。
[0393]
本发明的car的细胞外抗原结合域的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、facs分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定(western blot assay)来测定。这些测定法中的每一种一般通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体或scfv)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。举例来说，scfv可以经过放射性标记并且用于ria测定中。可以通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器等手段或通过自动放射摄影术来检测放射性同位素。在某些实施方案中，car的细胞外抗原结合域经过萦光标记物标记。萦光标记物的非限制性实例包括绿色萦光蛋白(gfp)、蓝色萦光蛋白(例如ebfp、ebfp2、azurite和mkalamal)、青色萦光蛋白(例如ecfp、cerulean和cypet)和黄色萦光蛋白(例如yfp、citrine、venus和ypet)。
[0394]
在一些实施方案中，本发明的car包含结合至骨髓(例如aml)细胞上表达的一个或多个抗原的细胞外抗原结合域、跨膜域和一个或多个细胞内信号传导域。在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合域包含scfv。在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合域包含可能交联的fab片段。在某些实施方案中，所述细胞外结合域是f(ab)2片段。
[0395]
细胞外抗原结合域
[0396]
在一些实施方案中，本发明的car的细胞外抗原结合域特异性结合至诸如aml细胞等骨髓细胞上表达的一个或多个抗原。在某些实施方案中，所述细胞外抗原结合域结合至aml细胞上表达的一个或多个抗原(aml抗原)。在一些实施方案中，所述一个或多个aml抗原是人多肽。
[0397]
本发明的抗原结合域可以包括任何结合至抗原的结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、缀合抗体、人抗体、人源化抗体及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体(sdab)，诸如骆驼来源的纳米抗体的重链可变域(vh)、轻链可变
域(vl)和可变域(vhh)，以及本领域已知的发挥抗原结合域功能的替代支架，诸如重组纤维连接蛋白结构域、t细胞受体(tcr)、具有增高亲和力的重组tcr或其片段，例如单链tcr，等等。在一些情况下，抗原结合域来源于最终将使用car的相同物种是有益的。举例来说，为了在人类中使用，car的抗原结合域包含抗体或抗体片段的抗原结合域的人源或人源化残基可能是有益的。
[0398]
在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合域包含抗体。在某些实施方案中，所述抗体是人抗体。在某些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合域包含抗体的抗原结合片段。
[0399]
在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合域包含f(ab)片段。在某些实施方案中，所述细胞外抗原结合域包含f(ab')片段。
[0400]
在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合域包含scfv。在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合域包含两个单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述两个scfv各自结合至相同抗原上的不同表位。在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合域包含第一scfv和第二scfv。在一些实施方案中，所述第一scfv和所述第二scfv结合相同抗原上的不同表位。在某些实施方案中，所述scfv是人scfv。在某些实施方案中，所述scfv是人源化scfv。在某些实施方案中，所述scfv是嵌合scfv。在某些实施方案中，所述scfv包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。在某些实施方案中，所述vh和所述vl由肽接头隔开。在某些实施方案中，所述肽接头包含seq id no:27或seq id no:74的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述肽接头包含seq id no:218或219的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述肽接头由包含seq id no:54、220、221或222的序列的核酸编码。在某些实施方案中，所述scfv包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
[0401]
在一些实施方案中，所述一个或多个scfv各自包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。当有两个或更多个scfv连接在一起时，各个scfv可利用连接肽连接至下一个scfv。在一些实施方案中，所述一个或多个scfv各自由肽接头隔开。在一些实施方案中，所述肽接头包含ggggsggggsggggs(seq id no:27)或eaaakeaaakeaaakeaaak(seq id no:74)的氨基酸序列。
[0402]
在一些实施方案中，所述细胞包含第一嵌合受体和第二嵌合受体。所述第一嵌合受体的抗原结合域和所述第二嵌合受体的抗原结合域可以是本文所述或本领域已知的适当抗原结合域。举例来说，所述第一或第二抗原结合域可以是一个或多个抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。在一些实施方案中，所述第一嵌合受体和/或所述第二嵌合受体的抗原结合域包含两个单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，所述两个scfv各自结合至相同抗原上的不同表位。
[0403]
在一些实施方案中，所述细胞外抗原结合域包含单结构域抗体(sdab)。在某些实施方案中，所述sdab是人源化sdab。在某些实施方案中，所述sdab是嵌合sdab。
[0404]
在一些实施方案中，本发明的car可以包含两个或更多个抗原结合域、三个或更多个抗原结合域、四个或更多个抗原结合域、五个或更多个抗原结合域、六个或更多个抗原结合域、七个或更多个抗原结合域、八个或更多个抗原结合域、九个或更多个抗原结合域、或者十个或更多个抗原结合域。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合域各自结合相同抗原。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合域各自结合相同抗原的不同表
位。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合域各自结合不同的抗原。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原结合域提供具有诸如or逻辑闸控等逻辑闸控的car。
[0405]
在一些实施方案中，所述car包含两个抗原结合域。在一些实施方案中，所述两个抗原结合域通过柔性接头彼此连接。在一些实施方案中，所述两个抗原结合域各自可以独立地选自抗体、抗体的抗原结合片段、scfv、sdab、重组纤维连接蛋白结构域、t细胞受体(tcr)、具有增高亲和力的重组tcr和单链tcr。在一些实施方案中，所述包含两个抗原结合域的car是双特异性car或串联car(tancar)。
[0406]
在某些实施方案中，所述双特异性car或tancar含有包含双特异性抗体或抗体片段(例如scfv)的抗原结合域。在一些实施方案中，在双特异性抗体分子的各个抗体或抗体片段(例如scfv)内，vh可以在vl上游或下游。在一些实施方案中，所述上游抗体或抗体片段(例如scfv)被排列为它的vh(vh1)在它的vl(vl1)上游，而所述下游抗体或抗体片段(例如scfv)被排列为它的vl(vl2)在它的vh(vh2)上游，使得所述总体双特异性抗体分子具有排列vh
1-vl
1-vl
2-vh2。在其他实施方案中，所述上游抗体或抗体片段(例如scfv)被排列为它的vl(vl1)在它的vh(vh1)上游，而所述下游抗体或抗体片段(例如scfv)被排列为它的vh(vh2)在它的vl(vl2)上游，使得所述总体双特异性抗体分子具有排列vl
1-vh
1-vh
2-vl2。在一些实施方案中，接头被布置在两个抗体或抗体片段(例如scfv)之间，例如在构建体被排列为vh
1-vl
1-vl
2-vh2时处于vl1与vl2之间，或在构建体被排列为vl
1-vh
1-vh
2-vl2时处于vh1与vh2之间。所述接头可以是如本文所述的接头，例如(gly
4-ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6。一般来说，在两个scfv之间的接头的长度应足以避免所述两个scfv的结构域之间出现错配。在一些实施方案中，接头被布置在第一scfv的vl与vh之间。在一些实施方案中，接头被布置在第二scfv的vl与vh之间。在具有多个接头的构建体中，所述接头中的任两个或更多个可以相同或不同。因此，在一些实施方案中，双特异性car或tancar包含vl、vh，而且可以另外包含呈如本文所述的排列的一个或多个接头。
[0407]
在一些实施方案中，嵌合受体包含二价car。在一些实施方案中，所述二价car是flt3二价car。在一些实施方案中，所述二价flt3 car包含nc7 scfv和d4-3 scfv。在一些实施方案中，所述二价car是cd33二价car。在一些实施方案中，所述二价car是clec12a二价car。
[0408]
在一些实施方案中，所述嵌合受体包含二价嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述二价嵌合受体包含flt3 car和cd33 car。在一些实施方案中，所述二价嵌合受体包含flt3 car和clec12a car。在一些实施方案中，所述二价嵌合受体包含clec12a car和cd33 car。在一些实施方案中，所述二价嵌合受体包含emcn car。在一些实施方案中，所述二价嵌合受体包含具有靶向表1中提供的任何抗原的抗原结合域的car。在一些实施方案中，所述二价嵌合受体包含具有靶向表2中提供的任何抗原的抗原结合域的car。在一些实施方案中，所述二价嵌合受体包含具有靶向表3中提供的任何抗原配对的两个或更多个抗原结合域的car。在一些实施方案中，所述二价嵌合抗原受体包含具有两个或更多个如本文所述的抗原结合域的任何组合的car。
[0409]
在一些实施方案中，嵌合受体包含双顺反子嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含flt3 car和cd33 car。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含flt3 car和clec12a car。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体
包含clec12a car和cd33 car。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含emcn car。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含具有靶向表1中提供的任何抗原的抗原结合域的car。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含具有靶向表2中所提供的任何抗原的抗原结合域的car。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含具有靶向表3中所提供的任何抗原配对的两个或更多个抗原结合域的car。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含具有两个或更多个如本文所述的抗原结合域的任何组合的car。
[0410]
跨膜域
[0411]
在一些实施方案中，本发明的car的跨膜域包含跨越细胞膜的至少一部分的疏水性α螺旋。已经证明了不同的跨膜域可以产生不同的受体稳定性。在抗原识别之后，受体发生丛聚并且信号传输至细胞。在一些实施方案中，本发明的car的跨膜域可以包含cd8多肽、cd28多肽、cd3-ζ多肽、cd4多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、ctla-4多肽、pd-1多肽、lag-3多肽、2b4多肽、btla多肽、lir-1(lilrb1)多肽的跨膜域，或者可以是合成肽，或其任何组合。
[0412]
在一些实施方案中，所述跨膜域来源于cd8多肽。可以使用任何合适的cd8多肽。示例性cd8多肽包括但不限于ncbi参考号np_001139345和aaa92533.1。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于cd28多肽。可以使用任何合适的cd28多肽。示例性cd28多肽包括但不限于ncbi参考号np_006130.1和np_031668.3。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于cd3-ζ多肽。可以使用任何合适的cd3-ζ多肽。示例性cd3-ζ多肽包括但不限于ncbi参考号np_932170.1和np_001106862.1。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于cd4多肽。可以使用任何合适的cd4多肽。示例性cd4多肽包括但不限于ncbi参考号np_000607.1和np_038516.1。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于4-1bb多肽。可以使用任何合适的4-1bb多肽。示例性4-1bb多肽包括但不限于ncbi参考号np_001552.2和np_001070977.1。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于ox40多肽。可以使用任何合适的ox40多肽。示例性ox40多肽包括但不限于ncbi参考号np_003318.1和np_035789.1。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于icos多肽。可以使用任何合适的icos多肽。示例性icos多肽包括但不限于ncbi参考号np_036224和np_059508。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于ctla-4多肽。可以使用任何合适的ctla-4多肽。示例性ctla-4多肽包括但不限于ncbi参考号np_005205.2和np_033973.2。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于pd-1多肽。可以使用任何合适的pd-1多肽。示例性pd-1多肽包括但不限于ncbi参考号np_005009和np_032824。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于lag-3多肽。可以使用任何合适的lag-3多肽。示例性lag-3多肽包括但不限于ncbi参考号np_002277.4和np_032505.1。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于2b4多肽。可以使用任何合适的2b4多肽。示例性2b4多肽包括但不限于ncbi参考号np_057466.1和np_061199.2。在一些实施方案中，所述跨膜域来源于btla多肽。可以使用任何合适的btla多肽。示例性btla多肽包括但不限于ncbi参考号np_861445.4和np_001032808.2。可以使用任何合适的lir-1(lilrb1)多肽。示例性lir-1(lilrb1)多肽包括但不限于ncbi参考号np_001075106.2和np_001075107.2。
[0413]
在一些实施方案中，所述跨膜域含有包含与ncbi参考号np_001139345、aaa92533.1、np_006130.1、np_031668.3、np_932170.1、np_001106862.1、np_000607.1、np_
038516.1、np_001552.2、np_001070977.1、np_003318.1、np_035789.1、np_036224、np_059508、np_005205.2、np_033973.2、np_005009、np_032824、np_002277.4、np_032505.1、np_057466.1、np_061199.2、np_861445.4或np_001032808.2的序列或其片段至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，可以使用诸如blast或fasta等标准软件来确定同源性。在一些实施方案中，所述多肽可以包含一个保守氨基酸取代、至多两个保守氨基酸取代或至多三个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述多肽可以具有作为ncbi参考号np_001139345、aaa92533.1、np_006130.1、np_031668.3、np_932170.1、np_001106862.1、np_000607.1、np_038516.1、np_001552.2、np_001070977.1、np_003318.1、np_035789.1、np_036224、np_059508、np_005205.2、np_033973.2、np_005009、np_032824、np_002277.4、np_032505.1、np_057466.1、np_061199.2、np_861445.4或np_001032808.2中至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230或至少240个氨基酸长度的连续部分的氨基酸序列。
[0414]
跨膜域可能来源的合适多肽的其他实例包括但不限于t细胞受体cd27、cd3ε、cd45、cd5、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、kirds2、cd2、cd27、lfa-1(cd11a、cd18)、gitr、cd40、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、pag/cbp、nkg2d和ng2c的α、β或ζ链的跨膜区。
[0415]
在一些实施方案中，所述跨膜域包含seq id no:209中所示的序列。在一些实施方案中，所述跨膜域包含seq id no:210中所示的序列。在一些实施方案中，所述跨膜域包含seq id no:211中所示的序列。
[0416]
间隔区
[0417]
在一些实施方案中，本发明的car还可以包含连接所述细胞外抗原结合域与所述跨膜域的间隔区。所述间隔区的柔性可能足以允许所述抗原结合域定向在不同的方向上以促进抗原识别。在一些实施方案中，所述间隔区可以是来自人蛋白质的铰链。举例来说，所述铰链可能是人ig(免疫球蛋白)铰链，包括但不限于igg4铰链、igg2铰链、cd8a铰链或igd铰链。在一些实施方案中，所述间隔区可以包含igg4铰链、igg2铰链、igd铰链、cd28铰链、kir2ds2铰链、lngfr铰链或pdgfr-β细胞外接头。在一些实施方案中，所述间隔区局部化在所述抗原结合域与所述跨膜域之间。在一些实施方案中，间隔区可以包含表c中列出的氨基酸序列中的任一个，或者与表c中列出的氨基酸序列中的任一个至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码本发明的间隔区中的任一个的核酸可以包含表d中列出的核酸序列中的任一个，或者与表d中列出的核酸序列中的任一个至少90％、至少91％、至
少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的核酸序列。
[0418][0419]
[0420]
[0421]
[0422][0423]
在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:55中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:56中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:57中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:58中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:59中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:60中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:61中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:62中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:63中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:64中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:206中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:207中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔区包含seq id no:208中所示的序列。
[0424]
在一些实施方案中，本发明的car可以另外包括短寡肽或多肽接头，其长度在2个氨基酸残基与10个氨基酸残基之间，而且可以在所述car的跨膜域与胞质区之间形成键联。合适接头的非限制性实例是甘氨酸-丝氨酸二连体。在一些实施方案中，所述接头包含ggckjsggckjs的氨基酸序列。
[0425]
细胞内信号传导域
[0426]
在一些实施方案中，本发明的car包含一个或多个胞质域或区。所述car的胞质域或区可以包括细胞内信号传导域。细胞内信号传导域典型地负责激活经工程改造以表达本发明的car的免疫细胞(例如t细胞或nk细胞)的一种或多种效应功能。举例来说，t细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，诸如细胞因子分泌。因此，在一些实施方案中，术语“细胞内信号传导域”是指转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能的蛋白质部分。尽管可以采用整个细胞内信号传导域，但在许多情况下不必使用整个链。在使用细胞内信号传导域的截短部分的实施方案中，可以使用此类截短部分替代相应的完整链，只要所述截短部分转导效应功能信号即可。
[0427]
可用于本发明的car中的合适细胞内信号传导域的实例包括但不限于t细胞受体(tcr)和协同作用以在抗原受体接合后引发信号转导的辅助受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有所述相同功能能力的任何重组序列。
[0428]
不希望受理论束缚，认为由tcr产生的信号单独不足以完全激活t细胞，因此完全激活还需要二级和/或共刺激信号。因此，t细胞激活可能由两个不同类别的胞质信号传导序列，即，通过tcr引发抗原依赖性一级激活的那些胞质信号传导序列(一级细胞内信号传导域)以及以非抗原依赖性方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些胞质信号传导序列
(二级胞质域，例如共刺激域)来介导。
[0429]
在一些实施方案中，一级信号传导域以刺激方式抑或以抑制方式调控tcr复合物的一级激活。以刺激方式起作用的一级细胞内信号传导域可以含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的信号传导基序。可用于本发明的car中的合适含itam的一级细胞内信号传导域的实例包括但不限于cd3-ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd278(也称为“icos”)、fcεri、dap10、dap12和cd66d的那些。
[0430]
在一些实施方案中，本发明的car包含细胞内信号传导域，例如cd3-ζ的一级信号传导域。本发明的cd3-ζ多肽可以具有与ncbi参考号np_932170或np_001106864.2的序列或其片段至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述cd3-ζ多肽可以包含一个保守氨基酸取代、至多两个保守氨基酸取代或至多三个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述多肽可以具有作为ncbi参考号np_932170或np_001106864.2中至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、或至少160、至少170、或至少180个氨基酸长度的连续部分的氨基酸序列。
[0431]
在其他实施方案中，一级信号传导域包含修饰的itam结构域，例如与天然itam结构域相比具有改变(例如增高或降低)的活性的突变itam结构域。在一个实施方案中，一级信号传导域包含含有修饰的itam的一级细胞内信号传导域，例如含有优化和/或截短itam的一级细胞内信号传导域。在一个实施方案中，一级信号传导域包含一、二、三、四或更多个itam基序。
[0432]
在一些实施方案中，本发明的car的细胞内信号传导域本身可以包含cd3-ζ信号传导域或者它可以与可用于本发明的car的情况下的任何其他所希望的细胞内信号传导域组合。举例来说，car的细胞内信号传导域可以包含cd3-ζ链部分和共刺激信号传导域。所述共刺激信号传导域可能是指包含共刺激分子的细胞内域的car部分。本发明的共刺激分子是可能为淋巴细胞对抗原作出有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。合适的共刺激分子的实例包括但不限于cd97、cd2、icos、cd27、cd154、cd8、ox40、4-1bb、cd28、zap40、cd30、gitr、hvem、dap10、dap12、myd88、2b4、cd40、pd-1、淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)、cd7、light、nkg2c、b7-h3和特异性结合cd83的配体、i类mhc分子、tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(slam蛋白)、激活nk细胞受体、btla、toll配体受体、cds、icam-1、(cd11a/cd18)、baffr、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vlal、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、nkg2d、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a等等。
[0433]
在一些实施方案中，本发明的car的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按无规或规定顺序彼此连接。在一些实施方案中，例如长度在2个氨基酸与10个氨基酸之间(例如2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨
基酸或10个氨基酸)的短寡肽或多肽接头可以在细胞内信号传导序列之间形成键联。在一个实施方案中，可以使用甘氨酸-丝氨酸二连体作为合适的接头。在一个实施方案中，可以使用单个氨基酸(例如丙氨酸或甘氨酸)作为合适的接头。
[0434]
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导域包含两个或更多个共刺激信号传导域，例如两个共刺激信号传导域、三个共刺激信号传导域、四个共刺激信号传导域、五个共刺激信号传导域、六个共刺激信号传导域、七个共刺激信号传导域、八个共刺激信号传导域、九个共刺激信号传导域、10个共刺激信号传导域或更多共刺激信号传导域。在一个实施方案中，所述细胞内信号传导域包含两个共刺激信号传导域。在一些实施方案中，所述两个或更多个共刺激信号传导域由本发明的接头隔开。在一个实施方案中，所述接头是甘氨酸残基。在另一实施方案中，所述接头是丙氨酸残基。
[0435]
在一些实施方案中，本发明的细胞表达包括结合本发明的靶抗原的抗原结合域、本发明的跨膜域、一级信号传导域和一个或多个共刺激信号传导域的car。
[0436]
在一些实施方案中，car包含如seq id no:153中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:155中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:157中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:159中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:161中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:163中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:165中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:167中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:169中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:171中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:173中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:175中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:177中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:179中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:181中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:183中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:185中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:187中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:189中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:191中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:19中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列3。在一些实施方案中，car包含如seq id no:195中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:197中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:199中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:201中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的
序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:203中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:205中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:212中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:214中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:216中所示的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列。
[0437]
在一些实施方案中，car包含如seq id no:154中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:156中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:158中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:160中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:162中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:164中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:166中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:168中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:170中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:172中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:174中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:176中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:178中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:180中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:182中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:184中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:186中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:188中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:190中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:192中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:194中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:196中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:198中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:200中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:202中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:204中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:213中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:215中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。在一些实施方案中，car包含如seq id no:217中所示的核苷酸序列或与其至少90％同一的序列。
[0438]
自然杀伤细胞受体(nkr)car
[0439]
在一些实施方案中，本发明的car包含自然杀伤细胞受体(nkr)的一种或多种组分，从而形成nkr-car。nkr组分可以是来自任何合适的自然杀伤细胞受体的跨膜域、铰链域或胞质域，包括但不限于杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)，诸如kir2dl1、kir2dl2/l3、kir2dl4、kir2dl5a、kir2dl5b、kir2ds1、kir2ds2、kir2ds3、kir2ds4、dir2ds5、kir3dl1/s1、kir3dl2、kir3dl3、kir2dp1和kirs dpi；自然细胞毒性受体(ncr)，诸如nkp30、nkp44、nkp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞激活分子(slam)家族，诸如cd48、cd229、2b4、cd84、ntb-a、cracc、blame和cd2f-10；fc受体(fcr)，诸如cd16和cd64；以及ly49受体，诸如ly49a和ly49c。在一些实施方案中，nkr-car可以与接合分子或细胞内信号传导域(诸如dap12)相互作用。包含nkr组分的car的示例性构象和序列描述于2014年9月18日公开的国际专利公布wo2014/145252中。
[0440]
嵌合抑制性受体
[0441]
本发明的某些方面涉及嵌合抑制性受体。嵌合抑制性受体可用作例如用于控制细胞活性(诸如免疫细胞活性)的not逻辑闸。在一些实施方案中，本发明的嵌合抑制性受体特异性结合至正常细胞上而非肿瘤细胞上表达的一个或多个抗原。
[0442]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体包含抗原结合域、本发明的跨膜域(例如，与本发明的嵌合受体联合使用的任何合适的跨膜域)和细胞内域。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体可以抑制细胞(诸如免疫应答细胞)的一种或多种活性。
[0443]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体可以包含酶抑制域。当所述嵌合抑制性受体位于细胞膜中的受体(诸如免疫受体)近端时，同源抗原结合至所述抗原结合域将激活所述酶抑制域以抑制所述受体的激活。如本文所用，术语“酶抑制域”是指抑制细胞内信号转导级联，例如天然t细胞激活级联的蛋白质结构域。因此，所公开的嵌合抑制性受体可以被工程改造以含有适当的抗原结合域，从而将减少例如存在同源抗原时的免疫应答。本发明的嵌合抑制性受体的用途包括但不限于减少免疫应答、控制t细胞激活和控制car-t应答。
[0444]
在一些实施方案中，本发明的嵌合抑制性受体的酶抑制结构域包含细胞外域、跨膜域和/或细胞内域的至少一部分。在一些实施方案中，所述酶抑制域包含酶的至少一部分。在一些实施方案中，所述酶选自csk、shp-1、pten、cd45、cd148、ptp-meg1、ptp-pest、c-cbl、cbl-b、ptpn22、lar、ptph1、ship-1和rasgap(参见例如stanford等,regulation of tcr signaling by tyrosine phosphatases:from immune homeostasis to autoimmunity,immunology,2012年9月；137(1):1-19)。在一些实施方案中，所述酶部分包含酶结构域、酶片段或其突变体。在一些实施方案中，所述酶部分是酶催化域。在一些实施方案中，选择酶结构域、酶片段或其突变体以使功效最大化并且使基础抑制最小化。
[0445]
在一些实施方案中，所述酶抑制域包含一个或多个调节基础抑制的修饰。修饰的实例包括但不限于截短突变、氨基酸取代、引入供翻译后修饰(其实例对本领域技术人员是已知的)的位置和添加新官能基。在一些实施方案中，选择酶结构域、酶片段或其突变体以使功效最大化并且使基础抑制最小化。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰减少基础抑制。在其他实施方案中，所述一个或多个修饰增加基础抑制。
[0446]
在一些实施方案中，所述酶抑制域在将本发明的嵌合抑制性受体募集至免疫受体近端后抑制例如免疫受体激活。在一些实施方案中，所述免疫受体是天然存在的免疫受体。
在一些实施方案中，所述免疫受体是天然存在的抗原受体。在一些实施方案中，所述免疫受体选自t细胞受体、模式识别受体(prr)、nod样受体(nlr)、toll样受体(tlr)、杀伤激活受体(kar)、杀伤抑制性受体(kir)、补体受体、fc受体、b细胞受体和细胞因子受体。在一些实施方案中，所述免疫受体是t细胞受体。在一些实施方案中，所述免疫受体是嵌合免疫受体。在一些实施方案中，所述嵌合免疫受体是嵌合tcr或car。
[0447]
在一些实施方案中，本发明的嵌合抑制性受体还可以包含一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域。在一些实施方案中，所述细胞内抑制性辅助信号传导域包含抑制域。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域包含一种或多种含itim的蛋白质或其片段。itim是在许多抑制免疫受体的胞质尾部中发现的保守氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种含itim的蛋白质或其片段选自pd-1、ctla4、tigit和lair1。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域包含一种或多种非itim支架蛋白质或其片段。在一些实施方案中，所述一种或多种非itim支架蛋白质或其片段选自grb-2、dok-1、dok-2、slap、lag3、havr、btla、gitr和pd-l1。合适的细胞内抑制性辅助信号传导域的其他实例包括但不限于pd-l1、τim3、vista、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、i类mhc、ii类mhc、gal9、腺苷酸和tgfβ。
[0448]
在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合在非肿瘤细胞上表达的抗原。用于嵌合抑制性受体中的示例性抗原描述于表2中。
[0449]
[0450]
[0451]
[0452][0453]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合emcn抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合jam2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合ms4a15抗原。
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合c4bpa抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合trpm1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合sctr抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合slc2a2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合kcnq2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合perp抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合wls抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合ffar2抗原。
[0454]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体是包含两个或更多个抗原结合域，使得所述嵌合抑制性受体可以结合两个或更多个抗原的多特异性受体。替代地，可以编辑细胞以表达两个或更多个结合至不同抗原的嵌合抑制性受体。
[0455]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合ptprb抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合nckap1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合mpzl2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合plscr4抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem47抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合adgrl4抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合met抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合bace2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合atp8b1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合lifr抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合art4抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合calcrl抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cntnap3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合pcdh9抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合il18r1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合slc8a3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cdh26抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem163抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合abca13抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cachd1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cyyr1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合abcb1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合adgrg6抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合atp9a抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合caln1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合caln1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cdcp1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合il12rb2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合slc16a14抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem136抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem200a抗原。
[0456]
免疫应答细胞
[0457]
本发明的某些方面涉及经基因工程改造以包含一种或多种本发明的嵌合受体或者一种或多种编码该嵌合受体的核酸的细胞，诸如免疫应答细胞，以及使用此类细胞治疗骨髓恶性肿瘤(例如aml)的方法。
[0458]
在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是初代细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是细胞系。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是骨髓细胞、血细胞、皮肤细胞、骨细胞、肌细胞、神经元细胞、脂肪细胞、肝脏细胞或心脏细胞。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。示例性干细胞包括但不限于胚胎干细胞(esc)、诱导多能干细胞(ipsc)、成熟干细胞和组织特异性干细胞，诸如造血干细
胞(血液干细胞)、间质干细胞(msc)、神经干细胞、上皮干细胞或皮肤干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是由本发明的干细胞衍生或分化的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞。本发明的免疫细胞可以由本发明的干细胞(例如由esc或ipsc)分离或分化。示例性免疫细胞包括但不限于t细胞(例如辅助t细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞、调控t细胞、自体杀伤t细胞、αβt细胞和γδt细胞)、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、树突状细胞、骨髓细胞、巨噬细胞和单核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是神经元细胞。本发明的神经元细胞可以由本发明的干细胞(例如由esc或ipsc)分离或分化。示例性神经元细胞包括但不限于神经祖细胞、神经元(例如感觉神经元、运动神经元、胆碱激导性神经元、gaba激导性神经元、谷氨酸激导性神经元、多巴胺激导性神经元或血清素激导性神经元)、星形细胞、寡树突神经胶细胞和小胶质细胞。
[0459]
在一些实施方案中，所述细胞是免疫应答细胞。本发明的免疫应答细胞可以由本发明的干细胞(例如由esc或ipsc)分离或分化。本发明的示例性免疫应答细胞包括但不限于淋巴谱系细胞。淋巴谱系(包含b细胞、t细胞和自然杀伤(nk)细胞)提供抗体产生、细胞免疫系统调控、血液中外来物质检测、宿主外来细胞检测等等。淋巴谱系的免疫应答细胞的实例包括但不限于t细胞、自然杀伤(nk)细胞、胚胎干细胞、多能干细胞和诱导多能干细胞(例如淋巴样细胞所来源或分化的那些干细胞)。t细胞可以是在胸腺中成熟而且主要负责细胞介导的免疫力的淋巴细胞。t细胞涉及适应性免疫系统。在一些实施方案中，本发明的t细胞可以是任何类型的t细胞，包括但不限于t辅助细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞(包括中枢记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞(或干样记忆t细胞)和两种效应记忆t细胞：例如t
em
细胞和t
emra
细胞、调控t细胞(也称为抑制t细胞)、自然杀伤t细胞、粘膜相关不变t细胞和γδt细胞。细胞毒性t细胞(ctl或杀伤t细胞)是能够诱导受感染体细胞或肿瘤细胞死亡的t淋巴细胞子集。患者自身的t细胞可以通过引入一个或多个嵌合受体，诸如嵌合tcr或car进行基因修饰以靶向特定抗原。
[0460]
自然杀伤(nk)细胞可以是作为细胞介导免疫力的一部分而且在固有免疫应答期间起作用的淋巴细胞。nk细胞不需要先前激活以对靶细胞执行其细胞毒性作用。
[0461]
在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞是t细胞。本发明的t细胞可以是自体的、同种异体的或者体外来源于工程改造祖细胞或干细胞。
[0462]
在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞是缺乏tcr-αβ的通用t细胞。在本领域中，开发了通用t细胞的方法描述于例如valton等,molecular therapy(2015)；23 9,1507-1518，以及torikai等,blood 2012 119:5697-5705中。
[0463]
在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞是包含一个或多个本发明的嵌合受体的分离免疫应答细胞。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞包含一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个、或者十个或更多个本发明的嵌合受体。
[0464]
在一些实施方案中，免疫应答细胞是t细胞。在一些实施方案中，免疫应答细胞是自然杀伤(nk)细胞。
[0465]
表达多个嵌合受体的细胞
[0466]
在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含两个或更多个本发明的嵌合受体。在一些实施方案中，所述细胞包含两个或更多个嵌合受体，其中所述两个或更
多个嵌合受体之一是嵌合抑制性受体。在一些实施方案中，所述细胞包含三个或更多个嵌合受体，其中所述三个或更多个嵌合受体之一是嵌合抑制性受体。在一些实施方案中，所述细胞包含四个或更多个嵌合受体，其中所述四个或更多个嵌合受体之一是嵌合抑制性受体。在一些实施方案中，所述细胞包含五个或更多个嵌合受体，其中所述五个或更多个嵌合受体之一是嵌合抑制性受体。
[0467]
在一些实施方案中，所述两个或更多个嵌合受体各自包含例如结合至相同抗原或不同抗原的不同抗原结合域。在一些实施方案中，所述两个或更多个嵌合受体结合的各个抗原表达于相同骨髓细胞类型(例如相同aml细胞类型)上。在一个实施方案中，所述细胞包含靶向第一抗原而且包括具有共刺激信号传导域而非一级信号传导域的细胞内信号传导域的第一嵌合受体，以及靶向第二不同抗原而且包括具有一级信号传导域而非共刺激信号传导域的细胞内信号传导域的第二嵌合受体。不希望受理论束缚，认为共刺激信号传导域(例如4-1bb、cd28或ox-40)置于第一嵌合受体上以及一级信号传导域(例如cd3-ζ链)置于第二嵌合受体上可以将嵌合受体活性限制于表达所述两个靶标的细胞。因此，在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包括：(a)第一嵌合受体，其包含结合第一抗原的抗原结合域、跨膜域和共刺激信号传导域；以及(b)第二嵌合受体，其包含结合第二抗原的抗原结合域、跨膜域和一级信号传导域。在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包括：(a)第一嵌合受体，其包含结合第一抗原的抗原结合域、跨膜域和一级信号传导域；以及(b)第二嵌合受体，其包含结合第二抗原的抗原结合域、跨膜域和共刺激信号传导域。在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包括：(a)第一嵌合受体，其包含结合第一抗原的抗原结合域、跨膜域、一级信号传导域和共刺激域；以及(b)第二嵌合受体，其包含结合第二抗原的抗原结合域、跨膜域、一级信号传导域和共刺激域。在第一嵌合受体与第二嵌合受体二者各自包含共刺激信号传导域的实施方案中，第一嵌合受体的共刺激信号传导域和第二嵌合受体的共刺激信号传导域可能来源于相同的蛋白质，诸如来自4-1bb、cd28或ox40。替代地，第一嵌合受体的共刺激信号传导域可能来源于与第二嵌合受体的共刺激信号传导域不同的蛋白质。
[0468]
在本发明的细胞(例如免疫应答细胞)表达两个或更多个不同嵌合受体的实施方案中，可以设计所述不同的嵌合受体中的每一个的抗原结合域，使得所述抗原结合域彼此不发生相互作用。举例来说，表达第一嵌合受体和第二嵌合受体的本发明细胞(例如免疫应答细胞)可以含有包含不与第二嵌合受体的抗原结合域形成缔合的抗原结合域的第一嵌合受体。举例来说，第一嵌合受体的抗原结合域可以包含抗体片段，诸如scfv，而第二嵌合受体的抗原结合域可以包含vhh。
[0469]
不希望受理论束缚，认为在具有复数个各自包含抗原结合域的嵌合膜包埋受体的细胞中，各个受体的抗原结合域之间的相互作用可能不合需要，这是因为此类相互作用可能抑制所述抗原结合域中的一个或多个结合其同源抗原的能力。因此，在本发明的细胞(例如免疫应答细胞)表达两个或更多个嵌合受体的实施方案中，所述嵌合受体包含使此类抑制性相互作用最小化的抗原结合域。在一个实施方案中，一个嵌合受体的抗原结合域包含scfv，而第二嵌合受体的抗原结合域包含单个vh结构域，例如骆驼、鲨鱼或七鳃鳗单个vh结构域，或者来源于人或小鼠序列的单个vh结构域。
[0470]
在一些实施方案中，当存在于细胞表面上时，第一嵌合受体的抗原结合域与其同
源抗原的结合基本上不会因存在第二嵌合受体而降低。在一些实施方案中，第一嵌合受体的抗原结合域与其同源抗原在存在第二嵌合受体时的结合是第一嵌合受体的抗原结合域与其同源抗原在不存在第二嵌合受体时的结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，当存在于细胞表面上时，第一嵌合受体和第二嵌合受体的抗原结合域彼此缔合程度低于二者都是scfv抗原结合域时。在一些实施方案中，第一嵌合受体和第二嵌合受体的抗原结合域彼此缔合程度比二者都是scfv抗原结合域时低85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0471]
在本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含两个或更多个结合至不同抗原的本发明不同嵌合受体的实施方案中，所述两个或更多个嵌合受体向细胞提供逻辑闸控，诸如or逻辑闸控、and逻辑闸控、not逻辑闸控或此类逻辑闸控的任何组合。因此，在某些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含两个或更多个嵌合受体，而且第一嵌合受体与第一抗原结合能够激活所述细胞。在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含两个或更多个嵌合受体，而且第二嵌合受体与第二抗原结合能够刺激所述细胞。在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含两个或更多个嵌合受体，而且第一嵌合受体与第一抗原结合和第二嵌合受体与第二抗原结合是激活所述细胞所需要的。在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含两个或更多个嵌合受体，而且第一嵌合受体与第一抗原结合和第二嵌合受体与第二抗原结合是刺激所述细胞所需要的。在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含两个或更多个嵌合受体，而且所述细胞表现出对针对所述第一抗原和所述第二抗原都呈阳性的细胞的细胞溶解活性与对仅针对所述第一抗原或仅针对所述第二抗原呈阳性的细胞的细胞溶解活性相比程度更大。在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含两个或更多个嵌合受体，而且第一嵌合受体与第一抗原结合或第二嵌合受体与第二抗原结合能够激活所述免疫应答细胞。
[0472]
在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含裂解嵌合受体系统，诸如裂解car系统。示例性裂解嵌合受体系统描述于wo2014/055442和wo2014/055657中。在一些实施方案中，裂解嵌合受体系统包含表达具有第一抗原结合域和共刺激域(例如4-1bb)的第一嵌合受体以及具有第二抗原结合域和细胞内信号传导域(例如cd3-ζ)的第二嵌合受体的细胞。在此类实施方案中，当所述细胞遇到所述第一抗原时，激活所述共刺激域，而且所述细胞增殖。另外，当所述细胞遇到所述第二抗原时，激活所述细胞内信号传导域而且诱导细胞杀伤活性。因此，在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)仅在存在所述两个抗原时完全激活。
[0473]
在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)表现出对针对所述第一抗原和所述第二抗原二者都呈阳性的细胞的细胞溶解活性与对单独针对所述第一抗原呈阳性的细胞的细胞溶解活性相比程度更大。在某些实施方案中，所述第一嵌合受体以低结合亲和力或低结合亲合力结合至第一抗原。在某些实施方案中，所述第一嵌合受体结合至所述第一抗原的低可及性表位处。在某些实施方案中，第一嵌合受体结合至第一抗原的结合亲和力低于第二嵌合受体结合至第二抗原的结合亲和力。在一些实施方案中，第一嵌合受体结合至第一抗原的结合亲和力与第二嵌合受体结合至第二抗原的结合亲和力相比低至少5倍。在一些实施方案中，第一嵌合受体结合至第一抗原的结合亲和力与第二嵌合受体结合至第二抗原的结合亲和力相比低至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90
倍、100倍、200倍、5000倍、1000倍、5000倍、或10000倍。
[0474]
在一些实施方案中，配对选择应当有利于肿瘤中的两个靶抗原的冗余表达，以便将抗原逃避风险降至最小。因此，在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含(i)结合至第一抗原的第一嵌合受体和(ii)结合至第二抗原的第二嵌合受体，其中所述两个嵌合受体结合至其靶抗原的组合产生了治疗作用。在诸多实施方案中，仅结合至一个靶抗原不实现治疗作用。
[0475]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合flt3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合ms4a3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd33抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合clec12a抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd312/adgre2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合slc22a16抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd123/ilr3ra抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合lat2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合piezo1/fam38a抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd38抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合emb抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd131/csf2rb抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合p2ry8抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合lilra2/cd85h抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合slc17a9抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合myadm抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd300lf抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd244/slamf4抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合plaur抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd93抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合spns3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合gapt抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合rasgrp4抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd117/c-kit抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd123/ilr3ra抗原。
[0476]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合vstm1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合mlc1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合pram1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合hck抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合icam3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合lrrc37a2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合itgam抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合itgb2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合lilra1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合prtn3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合card9抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合siglec5抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合sell抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合mlkl抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合inpp5d抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合apbb1ip抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合itga4抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合c3ar1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合itga5抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合fmnl1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合il1rap抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合ccr1/cd191抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合lilrb2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd70抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受体是包含两个或更多个抗原结合域，使得所述嵌合受体可以结合两个或更多个抗原的多特异性受体。
[0477]
在一些实施方案中，免疫应答细胞可以包含一个或多个靶向肿瘤的嵌合受体和一个或多个靶向不表达于肿瘤上的抗原的抑制性嵌合受体。靶向肿瘤的嵌合受体与抑制性嵌
合受体组合在相同免疫应答细胞中可用于降低中靶脱肿瘤毒性。举例来说，如果健康细胞表达靶向肿瘤的嵌合受体识别的抗原与抑制性嵌合受体识别的抗原，则表达所述肿瘤抗原的免疫应答细胞可以结合至健康细胞。在此类情况下，抑制性嵌合抗原还将结合处于健康细胞上的其同源配体，而且抑制性嵌合受体的抑制功能将减少、降低、预防或抑制免疫应答细胞通过靶向肿瘤的嵌合受体激活。
[0478]
在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合emcn(内皮粘蛋白)抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合jam2抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合ms4a15抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合slc34a2抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合slc2a2抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合trpm1抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合sctr抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合kcnq2抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合perp抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合wls抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合ffar2抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合ptprb抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合nckap1抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合mpzl2抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合plscr4抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合tmem47抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合adgrl4抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合met抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合bace2抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合atp8b1抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合lifr抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合art4抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合calcrl抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合cntnap3抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合pcdh9抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合il18r1抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合slc8a3抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合cdh26抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合slc8a3抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合tmem163抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合abca13抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合cachd1抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合cyyr1抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合abcb1抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合adgrg6抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合atp9a抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合caln1抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合cdcp1抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合il12rb2抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合slc16a14抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合tmem136抗原。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体结合tmem200a抗原。
[0479]
替代地，细胞表达两个或更多个结合至不同抗原的嵌合受体。示例性抗原配对示于表3中。
[0480][0481]
[0482][0483]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga4和slc17a9。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga4和lrrc37a2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga4和emb。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga4和mlkl。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga4和myadm。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga4和adgre2。
[0484]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga5和itgam。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga5和lrrc37a2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga5和prtn3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga5和mlc1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga5和itgb2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga5和lat2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga5和ms4a3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itga5和piezo1。
[0485]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itgam和piezo1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itgam和lrrc37a2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itgam和prtn3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itgam和mlc1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itgam和lat2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itgam和ms4a3。
[0486]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是csf2rb和slc17a9。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是csf2rb和lrrc37a2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是csf2rb和emb。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是csf2rb和mlkl。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是csf2rb和adgre2。
[0487]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是slc17a9和cmtm7。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是slc17a9和lrrc37a2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是slc17a9和cd244。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是slc17a9和emb。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是slc17a9和mlkl。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是slc17a9和myadm。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是slc17a9和flt3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是slc17a9和adgre2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是slc17a9和lilra2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是slc17a9和lilra1。
[0488]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cyba和lrrc37a2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cyba和prtn3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cyba和mlc1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cyba和lat2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cyba和ms4a3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cyba和icam3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cyba和piezo1。
[0489]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cmtm7和lrrc37a2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cmtm7和emb。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cmtm7和mlkl。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cmtm7和myadm。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cmtm7和adgre2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cmtm7和lilra2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cmtm7和lilra1。
[0490]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和cd244。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和prtn3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和emb。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和card9。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和mlc1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和itgb2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和lat2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和siglec5。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和cd300lf。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和mlkl。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和inpp5d。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和myadm。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和ms4a3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和hck。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和apbb1ip。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和icam3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和cd33。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和piezo1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和flt3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和adgre2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和fmnl1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和clec12a。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和lilra2。在一些实施方案中，所述
两个或更多个抗原是lrrc37a2和lilra1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和cd93。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lrrc37a2和c3ar1。
[0491]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cd244和emb。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cd244和mlkl。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cd244和adgre2。
[0492]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是prtn3和siglec5。
[0493]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是emb和mlkl。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是emb和myadm。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是emb和flt3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是emb和adgre2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是emb和lilra2。
[0494]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和mlc1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和lat2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和siglec5。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和cd300lf。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和inpp5d。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和ms4a3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和hck。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和icam3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和cd38。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和cd33。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和piezo1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和fmnl1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和clec12a。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是card9和cd93。
[0495]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是mlc1和siglec5。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是mlc1和ms4a3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是mlc1和piezo1。
[0496]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itgb2和piezo1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是itgb2和ms4a3。
[0497]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lat2和ms4a3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lat2和siglec5。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是lat2和piezo1。
[0498]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cd300lf和piezo1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cd300lf和ms4a3。
[0499]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是mlkl和myadm。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是mlkl和flt3。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是mlkl和adgre2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是mlkl和lilra2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是mlkl和lilra1。
[0500]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是inpp5d和piezo1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是inpp5d和ms4a3。
[0501]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是myadm和flt3。
[0502]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是ms4a3和piezo1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是hck和piezo1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是
icam3和piezo1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cd38和piezo1。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cd93和cd38。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是cd33和piezo1。
[0503]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是apbb1ip和c3ar1。
[0504]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是flt3和adgre2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是adgre2和lilra2。在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是adgre2和lilra1。
[0505]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是piezo1和p2ry8。
[0506]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是flt3和cd33。在一些实施方案中，细胞表达两个或更多个本发明的嵌合受体，其中一个嵌合受体结合flt3并且第二嵌合受体结合cd33。在一些实施方案中，嵌合受体是包含两个或更多个抗原结合域，使得一个抗原结合域结合flt3并且第二抗原结合域结合cd33的多特异性受体。在一些实施方案中，结合flt3的嵌合抗原受体和/或抗原结合域包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:1的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:2的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no:3的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:4的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(c)包含seq id no:5的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:6的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(d)包含seq id no:7的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:8的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(e)包含seq id no:9的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:10的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(f)包含seq id no:11的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:12的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(g)包含seq id no:13的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:14的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(h)包含seq id no:15的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:16的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在一些实施方案中，结合cd33的嵌合抗原受体和/或抗原结合域包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0507]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是flt3和clec12a。在一些实施方案中，细胞表达两个或更多个本发明的嵌合受体，其中一个嵌合受体结合flt3并且第二嵌合受体结合clec12a。在一些实施方案中，嵌合受体是包含两个或更多个抗原结合域，使得一个抗原结合域结合flt3并且第二抗原结合域结合clec12a的多特异性受体。在一些实施方案中，嵌合受体是包含两个或更多个抗原结合域，使得一个抗原结合域结合flt3并且第二抗原结合域结合cd33的多特异性受体。在一些实施方案中，结合flt3的嵌合抗原受体和/或抗原结合域包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:1的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:2的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no:3的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh
和包含seq.id no:4的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(c)包含seq id no:5的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:6的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(d)包含seq id no:7的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:8的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(e)包含seq id no:9的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:10的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(f)包含seq id no:11的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:12的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(g)包含seq id no:13的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:14的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(h)包含seq id no:15的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:16的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在一些实施方案中，结合clec12a的嵌合抗原受体和/或抗原结合域包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0508]
在一些实施方案中，所述两个或更多个抗原是clec12a和cd33。在一些实施方案中，细胞表达两个或更多个本发明的嵌合受体，其中一个嵌合受体结合clec12a并且第二嵌合受体结合cd33。在一些实施方案中，嵌合受体是包含两个或更多个抗原结合域，使得一个抗原结合域结合clec12a并且第二抗原结合域结合cd33的多特异性受体。在一些实施方案中，结合clec12a的嵌合抗原受体和/或抗原结合域包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。在一些实施方案中，结合cd33的嵌合抗原受体和/或抗原结合域包含选自以下的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0509]
在一些实施方案中，所述免疫应答细胞包含双顺反子嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含flt3 car和cd33 car。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含flt3 car和clec12a car。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含clec12a car和cd33car。在一些实施方案中，所述双顺反子嵌合抗原受体包含表3中所提供的任一抗原配对。
[0510]
嵌合抑制性受体
[0511]
在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)包含一个或多个本发明的嵌合抑制性受体。在一些实施方案中，所述一个或多个嵌合抑制性受体各自包含抗原结合
域，所述抗原结合域结合正常细胞上而非诸如aml细胞的肿瘤细胞上表达的抗原。在一些实施方案中，所述一个或多个嵌合抑制性受体结合表达于非肿瘤细胞上的抗原，所述表达于非肿瘤细胞上的抗原来源于选自由以下组成的组的组织：脑、神经元组织、内分泌、骨、骨髓、免疫系统、内皮组织、肌肉、肺、肝脏、胆囊、胰腺、胃肠道、肾脏、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、软组织和皮肤。
[0512]
在一些实施方案中，可以使用嵌合抑制性受体与本发明细胞(例如免疫应答细胞)上表达的一个或多个嵌合受体(例如嵌合tcr或car)作为not逻辑闸，以控制、调节或以其他方式抑制所述一个或多个嵌合受体的一种或多种活性。在一些实施方案中，本发明的嵌合受体可以抑制本发明细胞(例如免疫应答细胞)的一种或多种活性。在一些实施方案中，将嵌合抑制性受体与一个或多个本发明的嵌合受体组合以组合or逻辑闸与not逻辑闸和/或and逻辑闸与not逻辑闸。
[0513]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合选自以下的一个或多个抗原：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar2、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136和tmem200a。
[0514]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合flt3抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0515]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合ms4a3抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0516]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd33抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0517]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合clec12a抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0518]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合adgre2抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、
il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0519]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合slc22a16抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0520]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd123/il3ra抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0521]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合mlc1抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0522]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合spns3抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0523]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合gapt抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0524]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合lat2抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0525]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合piezo1抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0526]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd38抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、
mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0527]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合emb抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0528]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd131/csf2rb抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0529]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合lilra2/cd85h抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0530]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合slc17a9抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0531]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合myadm抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0532]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd300lf抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0533]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd244抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0534]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd93抗原。在一些实施方案中，所述嵌合受
体结合cd117/ckit抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0535]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd117/c-kit抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0536]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cmtm7抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0537]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cyba抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0538]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合hck抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0539]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合icam3抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0540]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合lrrc37a3抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0541]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合itgam抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、
cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0542]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合itgb2抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0543]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合lilra1抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0544]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合prtn3抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0545]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合card9抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0546]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合siglec5抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0547]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合sell抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0548]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合mlkl抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0549]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合inpp5d抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、
il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0550]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合apbb1ip抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0551]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合itga4抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0552]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合c3ar1抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0553]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合itga5抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0554]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合fmnl1抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0555]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合vstm1抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0556]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合pram1抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0557]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合il1rap抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、
mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0558]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合ccr1/cd191抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0559]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合lilrb2抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0560]
在一些实施方案中，所述嵌合受体结合cd70抗原并且所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原。
[0561]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合emcn抗原并且所述嵌合受体结合flt3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合emcn抗原并且所述嵌合受体结合mlc1抗原。
[0562]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合jam2抗原并且所述嵌合受体结合flt3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合jam2抗原并且所述嵌合受体结合mlc1抗原。
[0563]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合ms4a15抗原并且所述嵌合受体结合clec12a抗原。
[0564]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合slc34a2抗原并且所述嵌合受体结合clec12a抗原。
[0565]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合c4bpa抗原并且所述嵌合受体结合cd33抗原。
[0566]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合trpm1抗原并且所述嵌合受体结合cd33抗原。
[0567]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合sctr抗原并且所述嵌合受体结合slc22a16抗原。
[0568]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合slc2a2抗原并且所述嵌合受体结合il1rap抗原。
[0569]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合kcnq2抗原并且所述嵌合受体结合piezo1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合kcnq2抗原并且所述嵌合受体结合il1rap抗原。
[0570]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合perp抗原并且所述嵌合受体结合cd123抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合perp抗原并且所述嵌合受体结合il3ra抗原。
[0571]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合wls抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合ffar2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合nckap1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合mpzl2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合plscr4抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem47抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合adgrl4抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合met抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合bace2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合atp8b1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合lifr抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合art4抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合calcrl抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cntnap3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合pcdh9抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合il18r1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合slc8a3抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cdh26抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem163抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合abca13抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cachd1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cyyr1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合adgrg6抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合atp9a抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合caln1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cdcp1抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合il12rb2抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合slc16a14抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem136抗原。在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem200a抗原。
[0572]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar2、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136或tmem200a抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0573]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合emcn抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0574]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合jam2抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0575]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合ms4a15抗原并且所述嵌合受体结合
ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0576]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合c4bpa抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0577]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合trpm1抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0578]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合sctr抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0579]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合slc2a2抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0580]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合kcnq2抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0581]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合perp抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0582]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合wls抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0583]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合ffar2抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0584]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合ptprb抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0585]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合nckap1抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0586]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合mpzl2抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0587]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合plscr4抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0588]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem47抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0589]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合adgrl4抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0590]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合met抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0591]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合bace2抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0592]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合atp8b1抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0593]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合lifr抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0594]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合art4抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、
myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0595]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合calcrl抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0596]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cntnap3抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0597]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合pcdh9抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0598]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合il18r1抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0599]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合slc8a3抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0600]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cdh26抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0601]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem163抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0602]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合abca13抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0603]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cachd1抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0604]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cyyr1抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、
clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0605]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合abcb1抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0606]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合adgrg6抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0607]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合atp9a抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0608]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合caln1抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0609]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合cdcp1抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0610]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合il12rb2抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0611]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合slc16a14抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0612]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem136抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0613]
在一些实施方案中，所述嵌合抑制性受体结合tmem200a抗原并且所述嵌合受体结合ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf或cd70抗原。
[0614]
在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含来源于抗emcn抗体的抗原结合域。
所述emcn抗体可以是已知的任何合适的emcn抗体，包括但不限于emcn抗体cbfye-0213、v.7.c7.1、l4b1、l5f12、l10b5、l3f12、l6h3、l9h8和l10f12，如samulowitz j等,am.j.path.,2002年4月30日,160(5):1669-1681中所述，该参考文献以引入的方式并入本文。emcn抗体一般可获自市面。举例来说，cbfye-0213是大鼠抗人emcn igg并且可获自creative biolabs(目录号cbmab-e0461-fy)，而v.7.c7.1是与人和小鼠emcn交叉反应的大鼠抗emcn igg2a并且可获自abcam(目录号ab106100)。
[0615]
在一些实施方案中，所述emcn抗原结合域是选自以下的抗体：cbfye-0213、v.7.c7.1、l6h10、l4b1、l5f12、l10b5、l3f12、l6h3、l9h8、l10f12、18hclc或v.7.c7。
[0616]
结合至caln1、il12rb2、cdh26、il18r1、slc8a3、abcb1、atp9a、cdcp1、emcn、jam2、pcdh9、tmem200a、adgrl4、art4、bace2、calcrl、lifr、met、mpzl2、ptprb和wls的抗体一般是已知的并且可购自各个供应商。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含来源于抗caln1抗体2g5、2g2或3h3的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗il12rb2抗体2h6、s16020b、305719、9h1、11d102或rea333的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗cdh26抗体6c10或ch-19的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗il18r1抗体70625.111、h44、rea947、rea1095、b-e43、44g6或5的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗slc8a3抗体c2c12的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗abcb1抗体c219、4e3.16、c494、jsb-1、rea495、uic2、sn06-42、oti1a7、oti5b3、oti2g6、oti6h2或oti2c7的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含抗atp9a抗体3g2的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗cdcp1抗体cub1、rea194、oti2b2、oti2c1、oti2b8、oti4g5、oti5b3、cstem26、309116或309121的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗jam2抗体988905、988901、988934、epr2489(2)、cbl560、c47b10-2a9s、c47b10-2b11s、c47b10-2b8s、500a、j1、cbfyc-2851、mm0425-4l28-igg1、14l655、156623、156624、1c2、1g4、4l28、cblxj-018、2h5或fqs3590(3)的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗pcdh9抗体7g3a2或7g3f7的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗tmem200a抗体4-b3、cbyjt-3509或cbyjt-3510的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗adgrl4抗体cl4164的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗art4抗体8c11a12的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗bace2抗体391017的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗calcrl抗体998820的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗lifr抗体8e5e4d3、32953的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗mpzl2抗体g9p3-1或oti2c7的抗原结合域。在一些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗ptprb抗体2-a2的抗原结合域。在所述些实施方案中，所述抑制性嵌合受体包含选自抗wls抗体yj5的抗原结合域。
[0617]
共刺激配体
[0618]
在一些实施方案中，本发明的细胞(例如免疫应答细胞)可以另外包括一个或多个重组或外源共刺激配体。举例来说，所述细胞可以用一个或多个共刺激配体进一步转导，使得所述细胞共表达或经诱导以共表达一个或多个本发明的嵌合受体和一个或多个共刺激
9激活并导致细胞凋亡的诱导型半胱氨酸蛋白酶-9(icaspase-9)。在一些实施方案中，icaspase-9含有包含化学二聚诱导子(cid)的结合域，其在cid存在下介导二聚，由此导致表达嵌合受体的细胞的诱导性选择性耗竭。
[0623]
替代地，在一些实施方案中，本发明的嵌合受体可以通过利用钝化或以其他方式抑制性嵌合受体活性的小分子或抗体来调控。举例来说，抗体可以通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)来耗竭表达嵌合受体的细胞。在一些实施方案中，本发明的表达嵌合受体的细胞可以进一步表达被能够通过adcc或补体诱导的细胞死亡来诱导细胞死亡的分子识别的抗原。举例来说，本发明的表达嵌合受体的细胞可以另外表达能够通过抗体或抗体片段靶向的受体。可以通过抗体或抗体片段靶向的合适受体的实例包括但不限于epcam、vegfr、整合素(例如ανβ3、α4、αi3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、tnf受体超家族成员(例如trail-r1和trail-r2)、pdgf受体、干扰素受体、叶酸受体、gpnmb、icam-1、hla-dr、cea、ca-125、muc1、tag-72、il-6受体、5t4、gd2、gd3、cd2、cd3、cd4、cd5、cd11、cd11a/lfa-1、cd15、cd18/itgb2、cd19、cd20、cd22、cd23/ige受体、cd25、cd28、cd30、cd33、cd38、cd40、cd41、cd44、cd51、cd52、cd62l、cd74、cd80、cd125、cd147/basigin、cd152/ctla-4、cd154/cd40l、cd195/ccr5、cd319/slamf7和egfr，以及其截短型式。
[0624]
在一些实施方案中，本发明的表达嵌合受体的细胞还可以表达缺乏信号传导能力但保留被能够诱导adcc的分子识别的表位的截短表皮生长因子受体(egfr)(例如wo2011/056894)。
[0625]
在一些实施方案中，本发明的表达嵌合受体的细胞另外包括高度表达紧密标记物/自杀基因，其将来自cd32与cd20抗原的靶表位组合在表达嵌合受体的细胞中，由此结合抗cd20抗体(例如利妥昔单抗(rituximab))，从而导致adcc选择性耗竭所述表达嵌合受体的细胞。耗竭本发明的表达嵌合受体的细胞的其他方法可以包括但不限于施用单克隆抗cd52抗体，所述单克隆抗cd52抗体选择性地结合并靶向表达嵌合受体的细胞以通过诱导adcc进行破坏。在一些实施方案中，可以使用诸如抗特应性抗体等嵌合受体配体选择性地靶向所述表达嵌合受体的细胞。在一些实施方案中，所述抗特应性抗体可以引起效应细胞活性，诸如adcc或adc活性。在一些实施方案中，所述嵌合受体配体可以另外偶联至诸如毒素等诱导细胞杀伤的剂。在一些实施方案中，本发明的表达嵌合受体的细胞可以另外表达由本发明的细胞耗竭剂识别的靶蛋白。在一些实施方案中，所述靶蛋白是cd20并且所述细胞耗竭剂是抗cd20抗体。在此类实施方案中，一旦需要减少或消除表达嵌合受体的细胞，便施用细胞耗竭剂。在一些实施方案中，细胞耗竭剂是抗cd52抗体。
[0626]
在一些实施方案中，受调控的嵌合受体包含一组多肽，其中本发明的嵌合受体的组分分配在独立的多肽或成员上。举例来说，该组多肽可以包括二聚开关，所述二聚开关在存在二聚分子时可以使多肽彼此偶联以形成功能嵌合受体。
[0627]
编码嵌合受体的核酸构建体
[0628]
本发明的某些方面涉及编码本发明的一个或多个嵌合受体的核酸(例如分离的核酸)。在一些实施方案中，所述核酸是rna构建体，诸如信使rna(mrna)转录物或修饰的rna。在一些实施方案中，所述核酸是dna构建体。
[0629]
在一些实施方案中，本发明的核酸编码嵌合受体，所述嵌合受体包含一个或多个抗原结合域(其中各个结构域结合至靶抗原(例如aml抗原))、跨膜结构域和一个或多个细
胞内信号传导域。在一些实施方案中，所述核酸编码嵌合受体，所述嵌合受体包含抗原结合域、跨膜域、一级信号传导域(例如cd3-ζ结构域)和一个或多个共刺激信号传导域。在一些实施方案中，所述核酸另外包含编码间隔区的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合域通过所述间隔区连接至所述跨膜域。在一些实施方案中，所述间隔区包含选自表d中列出的核酸序列中的任一个的核酸序列。在一些实施方案中，所述核酸另外包含编码前导序列的核苷酸序列。
[0630]
本发明的核酸可以使用本领域已知的任何合适的重组方法获得，包括但不限于通过筛检来自表达目标基因的细胞的文库、通过从已知包括所述基因的载体获得目标基因、或通过使用标准技术直接从含有所述基因的细胞和组织分离目标基因。替代地，所述目标基因可以合成产生。
[0631]
在一些实施方案中，本发明的核酸包含在载体内。在一些实施方案中，本发明的核酸通过转位子、crispr/cas9系统、talen或锌指核酸酶表达于细胞中。
[0632]
在一些实施方案中，编码本发明的嵌合受体的核酸的表达可以通过将所述核酸可操作地连接至启动子并且将构建体并入表达载体中来实现。合适的载体可以在真核细胞中复制并整合。典型克隆载体含有可用于调控所希望的核酸的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
[0633]
在一些实施方案中，本发明的表达构建体还可以使用标准基因递送方案(例如us5399346、us5580859和us5589466)用于核酸免疫和基因疗法。在一些实施方案中，本发明的载体是基因疗法载体。
[0634]
本发明的核酸可以克隆至许多类型的载体中。举例来说，所述核酸可以克隆至载体中，包括但不限于质粒、噬菌体质粒、噬菌体衍生物、动物病毒或粘粒。在一些实施方案中，所述载体可以是表达载体、复制载体、探针产生载体或测序载体。
[0635]
在一些实施方案中，所述质粒载体包含转位子/转位酶系统，以便将本发明的核酸并入宿主细胞基因组中。使用转位子和转位酶质粒系统在免疫细胞中表达蛋白质的方法一般描述于chicaybam l,hum gene ther.2019年4月；30(4):511-522.doi:10.1089/hum.2018.218；以及p,cytotherapy.2018年4月；20(4):507-520.doi:10.1016/j.jcyt.2017.10.001中，各个参考文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，所述转位子系统是睡美人转位子/转位酶或piggybac转位子/转位酶。
[0636]
在一些实施方案中，本发明的表达载体可以呈病毒载体形式提供至细胞。合适的病毒载体系统在本领域中是众所周知的。举例来说，病毒载体可以来源于反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。在一些实施方案中，本发明的载体是慢病毒载体。慢病毒载体适合长期基因转移，因为此类载体允许转基因长期稳定整合及其在子细胞中繁殖。慢病毒载体还优于来源于致癌反转录病毒的载体(例如鼠类白血病病毒)，因为慢病毒载体可以转导非增殖细胞。在一些实施方案中，本发明的载体是腺病毒载体(a5/35)。在一些实施方案中，本发明的载体含有在至少一种生物体中具功能性的复制起点、启动子序列、适宜的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择标记物(例如，wo01/96584；wo01/29058；和us6326193)。已经开发了许多基于病毒的系统以用于基因转移至哺乳动物细胞中。可以使用本领域已知的技术将所选基因插入载体中并包封在反转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至哺乳动物细胞。许多反转录病毒系统是本领域中已知的。
[0637]
在一些实施方案中，本发明的载体包括额外的启动子元件，诸如调控转录起始频率的增强子。增强子典型地位于起始位点上游30-110bp的区域中，但已经证明许多启动子还含有处于起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔可以是柔性的，因此启动子功能在元件相对于彼此逆转或移动时得以保留。举例来说，在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以增至50bp，然后活性开始下降。取决于启动子，个别元件可以协同或独立地发挥功能以激活转录。示例性启动子可以包括但不限于sffv基因启动子、efs基因启动子、cmv ie基因启动子、efla启动子、泛素c启动子和磷酸甘油激酶(pgk)启动子。
[0638]
在一些实施方案中，能够在哺乳动物细胞(诸如本发明的免疫应答细胞)中表达本发明的核酸的启动子是ef1a启动子。天然ef1a启动子驱动负责将氨酰基trna酶促递送至核糖体的延长因子-1复合物的α亚单位的表达。ef1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒中，而且已经被证明在驱动克隆至慢病毒载体中的核酸的嵌合受体表达方面是有效的。
[0639]
在一些实施方案中，能够在哺乳动物细胞(诸如本发明的免疫应答细胞)中表达本发明的核酸的启动子是组成性启动子。举例来说，合适的组成性启动子是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子。cmv启动子是能够驱动可操作地连接至所述启动子的任何聚核苷酸序列的高水平表达的强组成性启动子。其他合适的组成性启动子包括但不限于泛素c(ubic)启动子、猿猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(mmtv)启动子、人免疫缺乏病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒即时早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延长因子1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。
[0640]
在一些实施方案中，能够在哺乳动物细胞(诸如本发明的免疫应答细胞)中表达本发明的核酸的启动子是诱导性启动子。使用诱导性启动子可以在所述启动子可操作地连接至核酸时提供能够诱导或抑制本发明核酸的表达的分子开关。诱导性启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素调控启动子。
[0641]
在一些实施方案中，本发明的载体可以另外包含促进分泌的信号序列、聚腺苷酸化信号和转录终止子、允许附加型复制的元件和/或允许选择的元件。
[0642]
在一些实施方案中，本发明的载体可以另外包含选择标记基因和/或报告基因以促进从用所述载体转导的细胞群体鉴定和选择表达嵌合受体的细胞。在一些实施方案中，选择标记物可以由从载体分离并用于共转染程序的核酸编码。选择标记物或报告基因可以侧接有适当的调控序列以允许在宿主细胞中表达。选择标记物的实例包括但不限于抗生素抗性基因，诸如neo等等。
[0643]
在一些实施方案中，报告基因可以用于鉴定转导的细胞和评估调控序列的功能性。如本文所公开，报告基因是受体生物体或组织中不存在或不表达并且编码表达会引起容易检测的性质(诸如酶活性)的多肽的基因。可以在核酸已引入受体细胞中之后在合适的时间测定报告基因的表达。报告基因的实例包括但不限于编码萦光素酶的基因、编码β-半乳糖苷酶的基因、编码氯霉素乙酰基转移酶的基因、编码分泌碱性磷酸酶的基因和编码绿色萦光蛋白的基因。合适的表达系统在本领域中是众所周知的而且可以使用已知技术制备或获自市面。在一些实施方案中，具有显示最高水平的报告基因表达的最小5'侧接区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以连接至报告基因，并用于评估诸剂调节启动子驱动的转录的能力。
[0644]
在一些实施方案中，包含编码本发明的嵌合受体的核酸序列的载体另外包含编码增加所述嵌合受体的活性的多肽的第二核酸。
[0645]
在表达嵌合受体的细胞包含两个或更多个嵌合受体的实施方案中，单个核酸可以在单个调节控制元件(例如启动子)下或在所述核酸中包含的各个编码嵌合受体的核苷酸序列的单独调节控制元件下编码所述两个或更多个嵌合受体。在表达嵌合受体的细胞包含两个或更多个嵌合受体的一些实施方案中，各个嵌合受体可以由单独的核酸编码。在一些实施方案中，各个单独核酸包含其自身的控制元件(例如启动子)。在一些实施方案中，单个核酸编码两个或更多个嵌合受体，并且编码嵌合受体的核苷酸序列在相同阅读框中且表达为单个多肽链。在此类实施方案中，所述两个或更多个嵌合受体可以由一个或多个诸如自动切割位点等肽切割位点或细胞内蛋白酶底物隔开。合适的肽切割位点可以包括但不限于t2a肽切割位点、p2a肽切割位点、e2a肽切割位和f2a肽切割位点。在一些实施方案中，所述两个或更多个嵌合受体包含t2a肽切割位点。在一些实施方案中，所述两个或更多个嵌合受体包含e2a肽切割位点。在一些实施方案中，所述两个或更多个嵌合受体包含t2a和e2a肽切割位点。
[0646]
将基因引入细胞中并表达的方法在本领域中是众所周知的。举例来说，在一些实施方案中，可以通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移至宿主细胞中。用于将核酸引入宿主细胞中的物理手段的实例包括但不限于磷酸钙沉淀、脂质转染、颗粒轰击、显微注射和电穿孔。用于将核酸引入宿主细胞中的化学手段的实例包括但不限于胶体分散系统、巨分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、微团、混合微团和脂质体。用于将核酸引入宿主细胞中的生物学手段的实例包括但不限于使用dna和rna载体。
[0647]
在一些实施方案中，脂质体可以用作非病毒递送系统以在体外、离体或体内将本发明的核酸或载体引入宿主细胞中。在一些实施方案中，所述核酸可以与脂质缔合，例如通过包封在脂质体内部的水溶液中、散布在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和核酸缔合的连接分子连接至脂质体、包裹在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、呈悬浮液形式包含在脂质中、包含微团或与微团复合、或者以其他方式与脂质缔合。如本文所公开，脂质缔合的核酸或载体组合物不限于溶液中的任何特定结构。在一些实施方案中，此类组合物可以存在于双层结构中、呈微团形式或具有“塌陷”结构。此类组合物还可以散布在溶液中，从而形成尺寸或形状不均匀的聚集体。如本文所公开，脂质是可能天然存在或合成的脂肪物质。在一些实施方案中，脂质可以包括天然存在于细胞质中的脂肪滴或含有长链脂族烃及其衍生物，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类别。合适的脂质可以获自商业来源，并且包括但不限于二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“dmpc”)、磷酸二鲸蜡酯(“dcp”)、胆固醇和二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“dmpg”)。脂质在三氯甲烷或三氯甲烷/甲醇中的储备溶液可以储存在约-20℃下。使用三氯甲烷作为溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。如本文所用，“脂质体”可以涵盖通过产生包封脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质媒介物。在一些实施方案中，脂质体可以表征为具有存在磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。在一些实施方案中，多层脂质体可以具有通过水性介质隔开的多个脂质层。在磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成多层脂质体。在一些实施方案中，脂质组分可以在形成封闭结构之前进行自我重排而且可以将水和溶解的溶质截留在
脂质双层之间。在一些实施方案中，所述脂质可以呈递微胞结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。
[0648]
在一些实施方案中，将本发明的核酸或载体引入哺乳动物宿主细胞，诸如本发明的免疫应答细胞中。在一些实施方案中，可以通过本领域已知的任何合适的测定来证实本发明的核酸或载体存在于宿主细胞中，包括但不限于核酸印迹测定、rna印迹测定、rt-pcr、pcr、elisa测定和蛋白质印迹测定。
[0649]
在一些实施方案中，将本发明的核酸或载体稳定转导至本发明的免疫应答细胞中。在一些实施方案中，表现出核酸或载体的稳定表达的细胞在转导之后表达所编码的嵌合受体至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少12个月。
[0650]
在本发明的嵌合受体瞬时表达于细胞中的实施方案中，将本发明的编码嵌合受体的核酸或载体转染至本发明的免疫应答细胞中。在一些实施方案中，所述免疫应答细胞在转染之后表达嵌合受体约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天。
[0651]
在一些实施方案中，所述核酸构建体编码双顺反子嵌合抗原受体。在一些实施方案中，编码的双顺反子嵌合抗原受体包含flt3 car和cd33 car。在一些实施方案中，编码的双顺反子嵌合抗原受体包含flt3 car和clec12a car。在一些实施方案中，编码的双顺反子嵌合抗原受体包含clec12a car和cd33 car。在一些实施方案中，编码的双顺反子嵌合抗原受体包含emcn car。在一些实施方案中，编码的双顺反子嵌合抗原受体包含具有靶向表1中提供的任何抗原的抗原结合域的car。在一些实施方案中，编码的双顺反子嵌合抗原受体包含具有靶向表2中提供的任何抗原的抗原结合域的car。在一些实施方案中，编码的双顺反子嵌合抗原受体包含具有靶向表3中提供的任何抗原配对的两个或更多个抗原结合域的car。
[0652]
在一些实施方案中，所述核酸构建体编码二价嵌合抗原受体。在一些实施方案中，编码的二价嵌合抗原受体包含flt3 car和cd33 car。在一些实施方案中，编码的二价嵌合抗原受体包含flt3 car和clec12a car。在一些实施方案中，编码的二价嵌合抗原受体包含clec12a car和cd33 car。在一些实施方案中，编码的二价嵌合抗原受体包含emcn car。在一些实施方案中，编码的二价嵌合抗原受体包含具有靶向表1中提供的任何抗原的抗原结合域的car。在一些实施方案中，编码的二价嵌合抗原受体包含具有靶向表2中提供的任何抗原的抗原结合域的car。在一些实施方案中，编码的二价嵌合抗原受体包含具有靶向表3中提供的任何抗原配对的两个或更多个抗原结合域的car。
[0653]
药物组合物和施用
[0654]
本发明的某些方面涉及包含本发明的一个或多个嵌合受体或表达所述一个或多个嵌合受体的本发明的免疫应答细胞的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，包含嵌合受体或表达此类嵌合受体的基因修饰的免疫应答细胞的组合物可以全身或直接提供至受试者以用于治疗增殖性病症，诸如骨髓病症。在某些实施方案中，所述组合物直接注射至相关器官(例如受病症影响的器官)中。替代地，所述组合物可以例如通过施用循环系统(例如肿瘤脉管系统)而间接地提供至相关器官。可以在施用所述组合物之前、期间或之后提供扩增剂和分化剂，以增加体外或体内t细胞、nk细胞或ctl细胞产生。
[0655]
包含本发明的基因修饰的细胞的组合物可以在任何生理学上可接受的媒介物中施用，例如经血管内，但它们还可以引入骨或基因修饰的细胞可以找到合适的再生和分化部位的其他适宜部位(例如胸腺)。在一些实施方案中，可以施用至少1
×
105个细胞，最后达到1
×
10
10
或更多个细胞。包含本发明的基因修饰的细胞的组合物可以包含纯化的细胞群体。用于确定细胞群体中经过基因修饰的细胞的百分比的方法在本领域中是众所周知的，而且包括但不限于萦光激活细胞淘选(facs)。在一些实施方案中，细胞群体中经过基因修饰的细胞的纯度可以是细胞群体中约50％、约55％、约60％或约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或更多的细胞。本领域技术人员可以容易地调节剂量(例如，纯度降低可能需要增加剂量)。可以通过注射、导管等等引入细胞。在一些实施方案中，还可以包括诸多因子，例如il-2、il-3、il-6、il-11、il-7、il-12、il-15、il-21、g-csf、mcsf、gm-csf、γ-干扰素和红细胞生成素。
[0656]
在某些实施方案中，所述组合物是药物组合物，其包含基因修饰的细胞，诸如免疫应答细胞或其祖细胞，以及药学上可接受的载体。施用可以是自体的或异源的。举例来说，可以从一名受试者获得免疫应答细胞或祖细胞，并施用至同一受试者或不同的相容性受试者。在一些实施方案中，本发明的免疫应答细胞或其子代可能来源于外周血细胞(例如体内、离体或体外来源)，而且可以通过局部注射来施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或非经肠施用。当施用本发明的治疗组合物(例如，含有本发明的基因修饰的细胞的药物组合物)时，一般将它配制为单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
[0657]
制剂
[0658]
本发明的某些方面涉及包含本发明的嵌合受体或表达此类嵌合受体的基因修饰的细胞(例如，本发明的免疫应答细胞)的组合物的制剂。在一些实施方案中，本发明的包含基因修饰的细胞的组合物可以呈无菌液体制剂形式提供，包括但不限于等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液和粘性组合物，其可以缓冲至所选ph。液体制剂典型地比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物可能更便于施用，尤其通过注射。在一些实施方案中，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长接触时间段。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、聚醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适合混合物。
[0659]
在一些实施方案中，可以通过将本发明的基因修饰的细胞与需要时存在的不同量的任何其他成分一起并入足量的适当溶剂中来制备无菌注射溶液。此类组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂，诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等等混合。在一些实施方案中，还可以将组合物冻干。取决于所希望的施用和制备途径，组合物可以含有辅助物质，诸如润湿剂、分散剂、ph缓冲剂和抗微生物剂。
[0660]
在一些实施方案中，本发明的组合物可以另外包括能增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂。此类添加剂的实例包括但不限于抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。在一些实施方案中，可以通过包括多种抗细菌剂和抗真菌剂中的任一种来防止微生物污染，包括但不限于对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等等。可以通过使用合适的延迟吸收剂，诸如单硬脂酸铝和明胶，来延长本发明的可注射医药制剂的吸收。
[0661]
在一些实施方案中，本发明的组合物可以是等渗的，即，具有与血液和泪液相同的渗透压。在一些实施方案中，可以使用例如氯化钠、右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他
无机或有机溶质来实现所希望的等渗性。
[0662]
在一些实施方案中，本发明的制剂的组分被选择为化学上惰性而且不影响本发明的基因修饰的细胞的生存力或功效。
[0663]
关于本发明的基因修饰的细胞的治疗用途的一个考虑是实现最佳功效所需的细胞数量。在一些实施方案中，欲施用的细胞数量将针对所治疗的受试者而变化。在某些实施方案中，施用至有需要的受试者的基因修饰的细胞的数量可以在1
×
104个细胞至1
×
10
10
个细胞的范围内。在一些实施方案中，将被视为有效剂量的确切细胞数量可以基于各个受试者独有的因素，包括他们的体型、年龄、性别、体重和特定受试者的疾患。本领域技术人员可以基于本发明和本领域的知识容易地确定剂量。
[0664]
治疗方法
[0665]
本发明的某些方面涉及使用本发明的嵌合受体和表达此类嵌合受体的基因修饰的细胞(例如免疫应答细胞)来治疗有需要的受试者的方法。在一些实施方案中，本发明的方法可以用于治疗受试者的癌症，诸如骨髓病症。在一些实施方案中，所述骨髓病症是骨髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、慢性髓单核细胞性白血病、急性髓性白血病(aml)、急性成髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病或真性红细胞增多症。在一些实施方案中，所述骨髓病症是aml。本发明的其他方面涉及本发明的嵌合受体和表达此类嵌合受体的基因修饰的细胞(例如免疫应答细胞)在治疗受试者(诸如免疫受损人受试者)的病原体感染或其他感染性疾病的方法中的用途。在一些实施方案中，本发明的方法可以包括以对实现所希望的效果(包括但不限于减轻现有疾患、预防疾患、治疗现有疾患、控制现有疾患、或者预防疾病复发)有效的量施用本发明的基因修饰的细胞。在一些实施方案中，有效量可以在本发明的基因修饰的细胞(例如免疫应答细胞)的一次或一系列施用中提供。在一些实施方案中，有效量可以呈药团形式或通过连续灌注提供。
[0666]
如本文所公开，“有效量”或“治疗有效量”是足以在治疗后实现有益或所希望的临床结果的量。有效量可能以一个或多个剂量施用至受试者。就治疗来说，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减缓疾病进展或以其他方式减轻疾病的病理学后果的量。有效量一般由医师逐例确定而且在本领域技术人员的能力范围内。在确定实现有效量的适当剂量时典型地考虑若干因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的疾患、疾患的严重程度以及所施用的免疫应答细胞的形式和有效浓度。
[0667]
对于使用抗原特异性细胞(例如免疫应答细胞，诸如t细胞)的过继性免疫疗法，典型地输注在约1
×
106至1
×
10
10
个细胞范围内的细胞剂量(例如约1
×
109个细胞)。在细胞施用至受试者然后分化后，诱导特异性针对特定抗原的免疫应答细胞。在一些实施方案中，免疫应答细胞的诱导可以包括但不限于诸如通过缺失或无反应性使抗原特异性细胞钝化。钝化尤其可用于确定或重建耐受性，诸如在自体免疫病症中。可以通过本领域已知的任何方法来施用基因修饰的细胞，包括但不限于经静脉内、皮下、结节内、肿瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接施用至胸腺。
[0668]
治疗性治疗
[0669]
在一些实施方案中，本发明的方法增加了有需要的受试者的免疫应答。在一些实施方案中，本发明的方法包括用于治疗和/或预防受试者的骨髓病症的方法。在一些实施方
案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，适用于疗法的人受试者可以包括能通过临床标准区分的两个治疗组。具有“晚期疾病”或“高肿瘤负担”的受试者是携带临床上可测量的肿瘤的受试者。临床上可测量的肿瘤是可以基于肿瘤块检测的肿瘤(例如，基于白血病细胞的百分比、通过触诊、cat扫描、声波图、乳房x光检查或x射线；自身阳性生物化学或组织病理学标记物不足以鉴定这个群体)。在一些实施方案中，本发明的药物组合物被施用至这些受试者以引发抗肿瘤应答，目标是减轻其疾患。在一些实施方案中，肿瘤块减小是由于施用药物组合物而发生，但任何临床改善都将构成益处。在一些实施方案中，临床改善包括降低肿瘤风险或进展率或减轻其病理学后果。在一些实施方案中，第二组合适的人受试者是“佐剂组”受试者。这些个体是有骨髓病症史但已经对另一种治疗模式有应答的受试者。先前疗法可以包括但不限于手术切除、放疗和/或传统化疗。因此，这些个体不存在临床上可测量的肿瘤。然而，他们疑似在原始肿瘤部位附近或因转移而有疾病进展风险。在一些实施方案中，这组可以进一步细分为高风险个体和低风险个体。可以基于初始治疗前后观测到的特征进行细分。这些特征在临床领域中是已知的，而且被针对各种不同的骨髓病症适当地定义。高风险子群的典型特征是肿瘤侵袭邻近组织或显示累及淋巴结的那些子群。
[0670]
在如本文所述的增加免疫应答的任何和所有方面，特征或功能方面的任何增高或降低或改变是相较于没有与如本文所述的免疫应答细胞接触的细胞。
[0671]
增加免疫应答可以是增强免疫应答或诱导免疫应答。举例来说，增加免疫应答涵盖开始或引发免疫应答，或者增加或放大进行中或现有免疫应答。在一些实施方案中，所述治疗诱导了免疫应答。在一些实施方案中，诱导的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，诱导的免疫应答是固有免疫应答。在一些实施方案中，所述治疗增强了免疫应答。在一些实施方案中，增强的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，增强的免疫应答是固有免疫应答。在一些实施方案中，所述治疗增加了免疫应答。在一些实施方案中，增加的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，增加的免疫应答是固有免疫应答。
[0672]
在一些实施方案中，另一组受试者是具有骨髓病症遗传倾向性但尚无骨髓病症临床征象证据的那些受试者。举例来说，经测试对与aml相关的基因突变呈阳性但仍处于生育年龄的妇女可以受益于在治疗时预防性地接受一种或多种本发明的细胞(例如免疫应答细胞)来预防aml发生，直至其适合进行预防性手术。在一些实施方案中，受试者可能患有晚期形式的疾病，在所述情况下，治疗目标可以包括减轻或逆转疾病进展和/或改善副作用。在一些实施方案中，受试者可能具有疾患史，已经进行过治疗，在所述情况下，治疗目标典型地可以包括降低或延迟复发风险。
[0673]
组合疗法
[0674]
在一些实施方案中，表达本发明的一种或多种嵌合受体的本发明的基因修饰的细胞(例如免疫应答细胞)可以与其他已知的剂和疗法组合使用。在一些实施方案中，本发明的组合疗法包含可以与一种或多种其他治疗剂组合施用的本发明的基因修饰的细胞。在一些实施方案中，基因修饰的细胞和一种或多种其他治疗剂可以同时、在相同或单独的组合物中或者顺序施用。对于顺序施用，首先可以施用基因修饰的细胞，其次可以施用一种或多种其他剂，或者可以逆转施用顺序。在一些实施方案中，基因修饰的细胞被进一步修饰以表达一种或多种其他治疗剂。
[0675]
在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞可以与手术、化疗、放射、免疫抑制
剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲喋呤、霉酚酸酯和fk506)、抗体或其他免疫消除剂(例如campath或抗cd3抗体)、细胞毒素、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、fk506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸、类固醇、fr901228、细胞因子、照射和肽疫苗组合用于治疗方案中。
[0676]
在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞可以与淋巴细胞耗竭剂组合使用。在免疫疗法之前，合适的淋巴细胞耗竭剂减少或降低了淋巴细胞，例如b细胞淋巴细胞和/或t细胞淋巴细胞。合适的淋巴细胞耗竭剂的实例包括但不限于氟达拉滨、环磷酰胺、皮质类固醇、阿仑单抗(alemtuzumab)、总体照射(tbi)及其任何组合。
[0677]
在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞可以与化学治疗剂组合使用。合适的化学治疗剂包括但不限于蒽环类(例如阿霉素(doxorubicin))、长春花生物碱(例如长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine))、烷基化剂(例如环磷酰胺、达卡巴嗪(decarbazine)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺、替莫唑胺(temozolomide))、免疫细胞抗体(例如阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗(tositumomab))、抗代谢物(例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，诸如氟达拉滨)、mtor抑制剂、tnfr糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素(aclacinomycin)a、胶霉毒素或硼替佐米(bortezomib))、诸如沙利度胺(thalidomide)或沙利度胺衍生物(例如来那度胺(lenalidomide))等免疫调节剂。
[0678]
适用于组合疗法中的一般化学治疗剂的实例包括但不限于阿那曲唑(anastrozole)比卡米特(bicalutamide)硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)白消安(busulfan)白消安注射液卡培他滨(capecitabine)n4-戊氧基羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡铂(carboplatin)卡莫司汀(carmustine)氮芥苯丁酸(chlorambucil)顺铂(cisplatin)克拉屈滨(cladribine)环磷酰胺(或)、胞嘧啶(cytosine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪更生霉素(dactinomycin)(放线菌素d、cosmegan)、盐酸道诺霉素柠檬酸道诺霉素脂质体注射液地塞米松(dexamethasone)、欧洲紫杉醇(docetaxel)盐酸阿霉素依托泊苷(etoposide)磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺(flutamide)替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(gemcitabine)(二氟去氧胞苷)、羟基脲伊达比星(idarubicin)异环磷酰胺伊立替康(irinotecan)l-天冬酰胺酶甲酰四氢叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤氨甲喋呤米托蒽醌麦罗塔
(mylotarg)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)菲尼克斯(phoenix)(钇90/mx-dtpa)、喷司他丁(pentostatin)、具有卡莫司汀植入物的聚苯丙生(polifeprosan)20柠檬酸它莫西芬(tamoxifen citrate)替尼泊苷(teniposide)6-硫鸟嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)注射用盐酸拓扑替康长春花碱长春新碱和长春瑞滨
[0679]
合适的烷基化剂的实例包括但不限于氮芥类、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶氮芥(aminouracil
ꢀꢀ
uracil nitrogen )、氮芥环磷酰胺(环磷酰胺(rev immune
tm
)、异环磷酰胺美法仑氮芥苯丁酸哌泊溴烷哌泊溴烷三乙烯蜜胺三乙烯硫代磷酰胺、替莫唑胺噻替派白消安卡莫司汀洛莫司汀(lomustine)链脲霉素和达卡巴嗪其他示例性烷基化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(也称为放线菌素d，)；美法仑(也称为l-pam、l-沙可来新(sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥，)；阿曲他明(altretamme)(也称为六甲三聚氰胺(hmm)，)；卡莫司汀(bicnu)；苯达莫司汀(bendamustine)白消安(和)；卡铂洛莫司汀(也称为ccnu，)；顺铂(也称为cddp，和-aq)；氮芥苯丁酸环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称为dtic、dic和咪唑甲酰胺，)；阿曲他明(也称为六甲三聚氰胺(hmm)，)；异环磷酰胺泼尼莫司汀(prednumustine)；丙卡巴肼(procarbazine)氮芥(也称为氮芥子、氮芥(mustine)和二氯甲基二乙胺盐酸盐，)；链脲霉素噻替派(也称为硫代磷酰胺、tespa和tspa，)；环磷酰胺)；环磷酰胺和盐酸苯达莫司汀
[0680]
合适的mtor抑制剂的实例包括但不限于替西罗莫司(temsirolimus)、利达福莫司(ridaforolimus)(迪弗莫司(deferolimus))、ap23573、mk8669、依维莫司(everolimus)(或radool)、雷帕霉素(ay22989、)和xl765。
[0681]
合适的免疫调节剂的实例包括但不限于阿夫妥珠单抗(afutuzumab)、培非格司亭(pegfilgrastim)来那度胺(cc-5013，)、沙利度胺阿替米德(actimid)(cc4047)和irx-2。
[0682]
合适的蒽环类的实例包括但不限于阿霉素(和)；博来霉素道诺霉素(盐酸道诺霉素、道诺菌素(daunomyem)和盐酸红比霉素(rubidomycin hydrochloride)，)；道诺霉素脂质体(柠檬酸道诺霉素脂质体，)；米托蒽醌(dhad，)；表柔比星(epirubicin)(ellence
tm
)；伊达比星(idamycin )；丝裂霉素(mitomycin)c格尔德霉素(geldanamycin)；除莠霉素(herbimycin)；雷维霉素(ravidomycin)；和脱乙酰雷维霉素。
[0683]
合适的长春花生物碱的实例包括但不限于酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛)；长春花碱(也称为硫酸长春花碱、长春花碱(vincaleukoblastine)和vlb，和)；和长春瑞滨
[0684]
合适的蛋白体抑制剂的实例包括但不限于硼替佐米(bortezomib)卡非佐米(carfilzomib)；马利佐米(marizomib)(npi-0052)；柠檬酸伊沙佐米(ixazomib citrate)(mln-9708)；地兰佐米(delanzomib)(cep-18770)；和onx-0912。
[0685]
在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞与cd20抑制剂，例如抗cd20抗体或其片段组合施用。示例性抗cd20抗体包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、tru-015(trubion pharmaceuticals)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)和prol31921。
[0686]
在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞可以与溶瘤病毒组合施用。在一些实施方案中，溶瘤病毒能够选择性地在癌细胞中复制并触发其死亡或减缓其生长。在一些情况下，溶瘤病毒对非癌细胞不具影响或具有最低限度的影响。合适的溶瘤病毒包括但不限于溶瘤腺病毒、溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤反转录病毒、溶瘤细小病毒、溶瘤牛痘病毒、溶瘤辛比斯病毒、溶瘤流感病毒、或溶瘤rna病毒(例如溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤新城疫病毒(ndv)、溶瘤麻疹病毒或溶瘤水泡性口膜炎病毒(vsv))。在一些实施方案中，溶瘤病毒是重组溶瘤病毒。
[0687]
在一些实施方案中，将本发明的基因修饰的细胞与蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如shp-i抑制剂或shp-2抑制剂)组合施用至受试者。在一个实施方案中，本发明的基因修饰的细胞可以与激酶抑制剂组合使用。合适的激酶抑制剂的实例包括但不限于cdk4抑制剂、cdk4/6抑制剂、btk抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)抑制剂、mtor抑制剂、mnk抑制剂和间变性淋巴瘤激酶(alk)抑制剂。
[0688]
在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞与骨髓源性抑制细胞(mdsc)调节剂组合施用至受试者。mdsc积聚在许多实体瘤的周围和肿瘤部位。这些细胞抑制了t细胞应答，从而阻碍了表达嵌合受体的细胞疗法的功效。不受理论束缚，认为施用mdsc调节剂增强
了本发明的基因修饰的细胞的功效。合适的mdsc调节剂的实例包括但不限于mcs110和blz945。
[0689]
在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞与抑制或降低免疫抑制浆细胞活性的剂组合施用至受试者。已经证明免疫抑制性浆细胞阻碍了t细胞依赖性免疫原性化疗，诸如奥沙利铂(oxaliplatin)(shalapour等,nature 2015,521:94-101)。在一个实施方案中，免疫抑制浆细胞可以表达iga、白介素(il)-10和pd-l1中的一或多种。
[0690]
在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞与白介素15(il-15)多肽、白介素15受体α(il-15ra)多肽或il-15多肽与il-15ra多肽的组合组合施用至受试者。在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞被进一步修饰以表达白介素15(il-15)多肽、白介素15受体α(il-15ra)多肽或il-15多肽与il-15ra多肽的组合。
[0691]
在一些实施方案中，对患有骨髓病症(例如aml)的受试者施用本发明的基因修饰的细胞与例如细胞毒性剂或化学治疗剂等剂、生物疗法(例如抗体，例如单克隆抗体，或细胞疗法)或抑制剂(例如激酶抑制剂)的组合。在一些实施方案中，对受试者施用本发明的基因修饰的细胞与细胞毒性剂，例如cpx-351(celator pharmaceuticals)、阿糖胞苷、道诺霉素(daunorubicin)、伏沙罗辛(vosaroxin)(sunesis pharmaceuticals)、萨帕他滨(sapacitabine)(cyclacel pharmaceuticals)、伊达比星或米托蒽醌(mitoxantrone)的组合。cpx-351是包含5∶1摩尔比的阿糖胞苷和道诺霉素的脂质体制剂。在一些实施方案中，对受试者施用本文所述的表达嵌合受体的细胞与低甲基化剂，例如dna甲基转移酶抑制剂，例如氮杂胞苷或地西他滨(decitabine)的组合。在一些实施方案中，对受试者施用本发明的基因修饰的细胞与生物疗法，例如抗体或细胞疗法，例如225ac-林妥珠单抗(actimab-a；actinium pharmaceuticals)、iph2102(innate pharma/bristol myers squibb)、sgn-cd33a(seattle genetics)或吉妥珠单抗奥佐米星(mylotarg；pfizer)的组合。在一些实施方案中，对受试者施用本发明的基因修饰的细胞与flt3抑制剂，例如索拉非尼(sorafenib)(bayer)、米哚妥林(midostaurin)(novartis)、奎扎替尼(quizartinib)(daiichi sankyo)、克莱拉尼(crenolanib)(arog pharmaceuticals)、plx3397(daiichi sankyo)、akn-028(akinion pharmaceuticals)或asp2215(astelias)的组合。在一些实施方案中，对受试者施用本发明的基因修饰的细胞与异柠檬酸脱氢酶(idh)抑制剂，例如ag-221(celgene/agios)或ag-120(agios/celgene)的组合。在一些实施方案中，对受试者施用本发明的基因修饰的细胞与细胞周期调节剂，例如polo样激酶1(plk1)抑制剂，例如伏拉塞替(volasertib)(boehringer ingelheim)或细胞周期素依赖性激酶9(cdk9)抑制剂，例如阿伏西地(alvocidib)(tolero pharmaceuticals/sanofi aventis)的组合。在一些实施方案中，对受试者施用本发明的基因修饰的细胞与b细胞受体信号传导网络抑制剂，例如b细胞淋巴瘤2(bcl-2)抑制剂，例如维奈托克(venetoclax)(abbvie/roche)或巴顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂，例如依鲁替尼(ibrutinib)(pharmacyclics/johnson&johnson janssen pharmaceutical)的组合。在一些实施方案中，对受试者施用本发明的基因修饰的细胞与m1氨基肽酶抑制剂；组蛋白脱乙酰基酶(hdac)抑制剂，例如普拉司他(pracinostat)(mei pharma)；多激酶抑制剂，例如(rigosertib)(onconova therapeutics/baxter/symbio)；或肽cxcr4反激动剂，例如bl-8040(biolinerx)的组合。
[0692]
在一些实施方案中，可以对受试者施用能增强本发明的基因修饰的细胞的活性或
合适度的剂。举例来说，所述剂可以抑制调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子。在一些实施方案中，调节或调控t细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施方案中，抑制性分子，诸如程序性死亡1(pd-1)可以降低基因修饰的细胞建立免疫效应应答的能力。合适的抑制性分子的实例包括但不限于pd-1、pd-l1、ctla4、tim3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd 160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、i类mhc、ii类mhc、gal9、腺苷和tgfβ。抑制调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子，例如通过在dna、rna或蛋白质层级上进行抑制，可以优化本发明的基因修饰的细胞的效能。在一些实施方案中，例如抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsrna，例如sirna或shrna、成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)、转录激活蛋白样效应子核酸酶(talen)或锌指内切核酸酶(zfn)等剂可以用于抑制基因修饰的细胞中的抑制性分子表达。在一个实施方案中，所述抑制剂是shrna。在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞可以经过进一步修饰以表达抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsrna，例如sirna或shrna、成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)、转录激活蛋白样效应子核酸酶(talen)或锌指内切核酸酶(zfn)可以用于抑制基因修饰的细胞中的抑制性分子表达。
[0693]
在一个实施方案中，调节或调控，例如抑制t细胞功能的剂在本发明的基因修饰的细胞内受到抑制。在此类实施方案中，将抑制调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子的表达的dsrna分子连接至编码本发明的嵌合受体的组分(例如所有组分)的核酸。在一个实施方案中，将编码抑制调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子的表达的dsrna分子的核酸分子可操作地连接至启动子，例如hi或u6来源的启动子，从而表达，例如在基因修饰的细胞内表达抑制能调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子的表达的dsrna分子。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子的表达的dsrna分子的核酸分子存在于包含编码嵌合受体的组分(例如所有组分)的核酸分子的相同载体，例如慢病毒载体上。在此类实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子的表达的dsrna分子的核酸分子位于编码嵌合受体的组分(例如所有组分)的核酸5'或3'的载体，例如慢病毒载体上。编码抑制调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子的表达的dsrna分子的核酸分子可以在与编码嵌合受体的组分(例如所有组分)的核酸相同或不同的方向上转录。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子的表达的dsrna分子的核酸分子存在于除包含编码嵌合受体的组分(例如所有组分)的核酸分子载体以外的载体上。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子的表达的dsrna分子的核酸分子在基因修饰的细胞内瞬时表达。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)t细胞功能的分子的表达的dsrna分子的核酸分子稳定整合至本发明的基因修饰的细胞的基因组中。
[0694]
在一个实施方案中，调节或调控(例如抑制)t细胞功能的剂可以是结合至抑制性分子的抗体或抗体片段。举例来说，所述剂可以是结合至pd-1、pd-l1、pd-l2或ctla4的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述剂是结合至tim3的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述剂是结合至lag3的抗体或抗体片段。
[0695]
在一些实施方案中，增强基因修饰的细胞的活性的剂是ceacam抑制剂(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5抑制剂)。在一个实施方案中，所述ceacam抑制剂是抗
ceacam抗体分子。在一个实施方案中，所述增强本发明的基因修饰的细胞的活性的剂是mir-17-92。在一些实施方案中，所述增强本发明的基因修饰的细胞的活性的剂是cd40l。在一些实施方案中，所述增强本发明的基因修饰的细胞的活性的剂是gm-csf。在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞被进一步修饰以表达结合至本发明的抑制性分子的抗体或抗体片段。
[0696]
在一个实施方案中，所述增强本发明的基因修饰的细胞的活性的剂是细胞因子。细胞因子具有与免疫应答性细胞扩增、分化、存活和恒定性有关的重要功能。可以施用至接受本发明的基因修饰的细胞的受试者的细胞因子包括但不限于il-2、il-4、il-7、il-9、ill-12、l-15、il-18和il-21或其组合。可以每天一次或每天不止一次，例如每天两次、每天三次或每天四次施用细胞因子。可以施用细胞因子不止一天，例如施用细胞因子2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周。举例来说，每天一次施用细胞因子，持续7天。在一些实施方案中，本发明的基因修饰的细胞被进一步修饰以表达一种或多种细胞因子，诸如il-2、il-4、il-7、il-9、il-12、l-15、il-18和il-21。
[0697]
在一些实施方案中，细胞因子可以与基因修饰的细胞同时或并行施用，例如在同一天施用。细胞因子可以与基因修饰的细胞制备在相同药物组合物中，或这可以制备在单独的药物组合物中。替代地，可以在施用基因修饰的细胞后不久，例如在施用基因修饰的细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用细胞因子。在以不止一天的给药方案施用细胞因子的一些实施方案中，细胞因子给药方案的第一天可以与施用基因修饰的细胞在同一天，或细胞因子给药方案的第一天可以是施用基因修饰的细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一个实施方案中，在第一天，将基因修饰的细胞施用至受试者，并且在第二天，每天一次施用细胞因子，持续接下来的7天。在一些实施方案中，在施用基因修饰的细胞后一段时间施用细胞因子，例如在施用基因修饰的细胞后至少2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或1年或更久。在一个实施方案中，在评估受试者对基因修饰的细胞的应答后施用细胞因子。
[0698]
药盒
[0699]
本发明的某些方面涉及用于治疗和/或预防骨髓病症(例如aml)的药盒。在某些实施方案中，所述药盒包括治疗或预防组合物，其包含有效量的一种或多种本发明的嵌合受体、本发明的分离的核酸、本发明的载体和/或本发明的细胞(例如免疫应答细胞)。在一些实施方案中，所述药盒包括无菌容器。在一些实施方案中，此类容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管子、袋子、囊袋、泡罩包装或本领域已知的其他合适的容器形式。容器可以由塑胶、玻璃、层压纸、金属箔或其他合适的容纳药物的材料制成。
[0700]
在一些实施方案中，提供了治疗或预防组合物连同用于向患有骨髓病症或有罹患骨髓病症(例如aml)风险的受试者施用治疗或预防组合物的说明书。在一些实施方案中，说明书可以包括关于使用所述组合物治疗和/或预防病症的信息。在一些实施方案中，说明书包括但不限于治疗或预防组合物的描述、剂量时间表、用于治疗或预防所述病症或其症状的施用时间表、预防措施、警告、适应症、反适应症、过度剂量信息、不良反应、动物药理学、临床研究和/或参考文献。在一些实施方案中，说明书可以直接印刷在容器(当存在时)上，或者作为施加至容器的标签，或者作为在容器中或与容器一起提供的单独纸张、小册子、卡片或文件夹。
[0701]
额外的实施方案
[0702]
以下诸段提供了额外的列举实施方案。
[0703]
1.一种嵌合受体，其包含细胞外抗原结合域，所述细胞外抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9和spns3。
[0704]
2.如第1段所述的嵌合受体，其中所述抗原是ms4a3。
[0705]
3.如第1段所述的嵌合受体，其中所述抗原是vstm1。
[0706]
4.如第1段所述的嵌合受体，其中所述抗原是lat2。
[0707]
5.如第1段所述的嵌合受体，其中所述抗原是mlc1。
[0708]
6.如第1段所述的嵌合受体，其中所述抗原是cd131。
[0709]
7.如第1段所述的嵌合受体，其中所述抗原是gapt。
[0710]
8.如第1段所述的嵌合受体，其中所述抗原是pram1。
[0711]
9.如第1段所述的嵌合受体，其中所述抗原是slc22a16。
[0712]
10.如第1段所述的嵌合受体，其中所述抗原是slc17a9。
[0713]
11.如第1段所述的嵌合受体，其中所述抗原是spns3。
[0714]
12.如第1段至第11段中任一段所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。
[0715]
13.如第12段所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体是car。
[0716]
14.如第13段所述的嵌合受体，其中所述car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域和myd88细胞内信号传导域。
[0717]
15.如第13段或第14段所述的嵌合受体，其中所述car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域。
[0718]
16.如第13段至第15段中任一段所述的嵌合受体，其中所述car包含间隔区，所述间隔区在所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
[0719]
17.如第1段至第16段中任一段所述的嵌合受体，其中所述抗原结合域包含一个或多个抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。
[0720]
18.如第1段至第16段中任一段所述的嵌合受体，其中所述抗原结合域包含一个或多个单链可变片段(scfv)。
[0721]
19.如第18段所述的嵌合受体，其中所述一个或多个scfv各自包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。
[0722]
20.如第19段所述的嵌合受体，其中所述vh和所述vl由肽接头隔开。
[0723]
21.如第20段所述的嵌合受体，其中所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。
[0724]
22.如第19段至第21段中任一段所述的嵌合受体，其中所述一个或多个scfv各自包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
[0725]
23.如第1段至第22段中任一段所述的嵌合受体，其中所述抗原结合域包含两个单链可变片段(scfv)。
[0726]
24.如第23段所述的嵌合受体，其中所述两个scfv各自结合至相同抗原上的不同表位。
[0727]
25.如第18段至第24段中任一段所述的嵌合受体，其中所述一个或多个scfv各自由肽接头隔开。
[0728]
26.如第25段所述的嵌合受体，其中所述肽接头包含ggggsggggsggggs(seq id no:27)或eaaakeaaakeaaakeaaak(seq id no:74)的氨基酸序列。
[0729]
27.一种分离的细胞，其包含如第1段至第26段中任一段所述的嵌合受体。
[0730]
28.如第27段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体被重组表达。
[0731]
29.如第27段或第28段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体由载体或来自所述细胞的基因组的所选基因座表达。
[0732]
30.如第27段至第29段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调控t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞(esc)、esc衍生细胞、多能干细胞和诱导型多能干细胞(ipsc)以及ipsc衍生细胞。
[0733]
31.如第27段至第30段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是自体的。
[0734]
32.如第27段至第30段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是同种异体的。
[0735]
33.一种分离的细胞，其包含：
[0736]
(a)第一嵌合受体，其包含结合至第一抗原的细胞外抗原结合域，和
[0737]
(b)第二嵌合受体，其包含结合至第二抗原的细胞外抗原结合域，
[0738]
其中各个抗原选自由表1中列出的抗原组成的组或所述第一抗原和所述第二抗原选自由表3中列出的抗原配对组成的组，并且
[0739]
其中所述第一抗原与所述第二抗原不同。
[0740]
34.一种分离的细胞，其包含：
[0741]
(a)第一嵌合受体，其包含结合至第一抗原的细胞外抗原结合域，和
[0742]
(b)第二嵌合受体，其包含结合至第二抗原的细胞外抗原结合域，
[0743]
其中各个抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70，并且
[0744]
其中所述第一抗原与所述第二抗原不同。
[0745]
35.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是ms4a3并且所述第二抗原选自由以下组成的组：vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0746]
36.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是vstm1并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0747]
37.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是lat2并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0748]
38.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是mlc1并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0749]
39.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是cd131并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0750]
40.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是gapt并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0751]
41.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是pram1并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0752]
42.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是slc22a16并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0753]
43.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是slc17a9并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0754]
44.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是spns3并且所述第二抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0755]
45.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是flt3。
[0756]
46.如第45段所述的分离的细胞，其中所述结合至所述第一抗原的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0757]
(a)包含seq id no:1的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:2的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0758]
(b)包含seq id no:3的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:4的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0759]
(c)包含seq id no:5的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:6的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0760]
(d)包含seq id no:7的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:8的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0761]
(e)包含seq id no:9的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:10的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0762]
(f)包含seq id no:11的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:12的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0763]
(g)包含seq id no:13的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:14的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0764]
(h)包含seq id no:15的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:16的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0765]
47.如第45段或第46段所述的分离的细胞，其中所述第二抗原是cd33。
[0766]
48.如第47段所述的分离的细胞，其中所述结合至所述第二抗原的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0767]
(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0768]
(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0769]
49.如第45段或第46段所述的分离的细胞，其中所述第二抗原是clec12a。
[0770]
50.如第49段所述的分离的细胞，其中所述结合至所述第二抗原的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0771]
(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0772]
(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0773]
(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0774]
51.如第33段或第34段所述的分离的细胞，其中所述第一抗原是clec12a。
[0775]
52.如第51段所述的分离的细胞，其中所述结合至所述第一抗原的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0776]
(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0777]
(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0778]
(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0779]
53.如第51段或第52段所述的分离的细胞，其中所述第二抗原是cd33。
[0780]
54.如第53段所述的分离的细胞，其中所述结合至所述第二抗原的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0781]
(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0782]
(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0783]
55.如第33段至第54段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是免疫应答细胞。
[0784]
56.如第55段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体结合至所述第一抗原能够激活所述免疫应答细胞。
[0785]
57.如第55段所述的分离的细胞，其中所述第二嵌合受体结合至所述第二抗原能够刺激所述免疫应答细胞。
[0786]
58.如第55段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体结合至所述第一抗原和所述第二嵌合受体结合至所述第二抗原为激活所述免疫应答细胞所需要的。
[0787]
59.如第55段所述的分离的细胞，其中所述免疫应答细胞表现出对针对所述第一抗原与所述第二抗原都呈阳性的靶细胞的细胞溶解活性与对仅针对所述第一抗原或所述第二抗原呈阳性的靶细胞的细胞溶解活性相比程度更大。
[0788]
60.如第55段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体结合至所述第一抗原或所述第二嵌合受体结合至所述第二抗原能够激活所述免疫应答细胞。
[0789]
61.如第33段至第60段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体以低结合亲和力结合至所述第一抗原。
[0790]
62.如第33段至第61段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体结合至所述第一抗原的结合亲和力低于所述第二嵌合受体结合至所述第二抗原的结合亲和力。
[0791]
63.如第33段至第62段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体以低结合亲合力结合至所述第一抗原。
[0792]
64.如第33段至第63段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体和/或所述第二嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。
[0793]
65.如第64段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体和/或所述第二嵌合受体是car。
[0794]
66.如第65段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体是第一car并且所述第二嵌合受体是第二car。
[0795]
67.如第65段或第66段所述的分离的细胞，其中各个car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40
细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域、myd88细胞内信号传导域和2b4细胞内信号传导域。
[0796]
68.如第67段所述的分离的细胞，其中所述第一car的所述一个或多个细胞内信号传导域与所述第二car的所述一个或多个细胞内信号传导域不同。
[0797]
69.如第67段所述的分离的细胞，其中所述第一car和所述第二car各自包含cd3ζ链细胞内信号传导域。
[0798]
70.如第69段所述的分离的细胞，其中所述第一car和所述第二car各自另外包含选自由以下组成的组的额外细胞内信号传导域：cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域、myd88细胞内信号传导域和2b4细胞内信号传导域。
[0799]
71.如第70段所述的分离的细胞，其中所述第一car的所述额外细胞内信号传导域与所述第二car的所述额外细胞内信号传导域不同。
[0800]
72.如第64段至第71段中任一段所述的分离的细胞，其中各个car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域。
[0801]
73.如第72段所述的分离的细胞，其中所述第一car的所述跨膜域与所述第二car的所述跨膜域不同。
[0802]
74.如第64段至第73段中任一段所述的分离的细胞，其中各个car包含间隔区，所述间隔区在所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
[0803]
75.如第33段至第74段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体和/或所述第二嵌合受体的所述抗原结合域包含一个或多个抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。
[0804]
76.如第33段至第75段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体和所述第二嵌合受体的所述抗原结合域包含一个或多个单链可变片段(scfv)。
[0805]
77.如第76段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个scfv各自包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。
[0806]
78.如第77段所述的分离的细胞，其中所述vh和所述vl由肽接头隔开。
[0807]
79.如第78段所述的分离的细胞，其中所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。
[0808]
80.如第77段至第79段中任一段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个scfv各自包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
[0809]
81.如第33段至第80段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体和/或所述第二嵌合受体的所述抗原结合域包含两个单链可变片段(scfv)。
[0810]
82.如第81段所述的分离的细胞，其中所述两个scfv各自结合至相同抗原上的不同表位。
[0811]
83.如第33段至第80段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体被重组表达。
[0812]
84.如第76段至第83段中任一段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个scfv各自由肽接头隔开。
[0813]
85.如第84段所述的分离的细胞，其中所述肽接头包含ggggsggggsggggs(seq id no:27)或eaaakeaaakeaaakeaaak(seq id no:74)的氨基酸序列。
[0814]
86.如第33段至第85段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第一嵌合受体由载体或来自所述细胞的基因组的所选基因座表达。
[0815]
87.如第33段至第86段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第二嵌合受体被重组表达。
[0816]
88.如第33段至第87段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第二嵌合受体由载体或来自所述细胞的基因组的所选基因座表达。
[0817]
89.如第33段至第88段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞另外包含抑制性嵌合受体，所述抑制性嵌合受体包含抗原结合域。
[0818]
90.如第89段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体抑制所述细胞的一种或多种活性。
[0819]
91.如第89段或第90段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体结合不表达于肿瘤细胞上的抗原。
[0820]
92.如第89段或第90段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体结合表达于非肿瘤细胞上的抗原。
[0821]
93.如第92段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体结合表达于非肿瘤细胞上的抗原，所述表达于非肿瘤细胞上的抗原来源于选自由以下组成的组的组织：脑、神经元组织、内分泌、骨、骨髓、免疫系统、内皮组织、肌肉、肺、肝脏、胆囊、胰腺、胃肠道、肾脏、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、软组织和皮肤。
[0822]
94.如第91段至第93段中任一段所述的分离的细胞，其中所述肿瘤细胞是急性髓性白血病(aml)细胞。
[0823]
95.如第89段至第94段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体包含酶抑制域。
[0824]
96.如第95段所述的分离的细胞，其中所述酶抑制域当在免疫受体近端时抑制免疫受体激活。
[0825]
97.如第95段或第96段所述的分离的细胞，其中所述酶抑制域包含酶催化域。
[0826]
98.如第97段所述的分离的细胞，其中所述酶催化域来源于选自由以下组成的组的酶：csk、shp-1、pten、cd45、cd148、ptp-meg1、ptp-pest、c-cbl、cbl-b、ptpn22、lar、ptph1、ship-1和rasgap。
[0827]
99.如第89段至第98段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体另外包含一个或多个细胞内抑制性协同信号传导域。
[0828]
100.如第99段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个细胞内抑制性辅助信号传
导域选自由以下组成的组：pd-1、ctla4、tigit、lair1、grb-2、dok-1、dok-2、slap、lag3、havr、btla、gitr和pd-l1。
[0829]
101.如第89段至第100段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体结合选自由以下组成的组的抗原：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar2、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136和tmem200a。
[0830]
102.如第89段至第101段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体包含来源于以下的抗原结合域：抗emcn抗体、抗caln1抗体、抗il12rb2抗体、抗cdh26抗体、抗il18r1抗体、抗slc8a3抗体、抗abcb1抗体、抗atp9a抗体、抗cdcp1抗体、抗jam2抗体、抗pcdh9抗体、抗tmem200a抗体、抗adgrl4抗体、抗art4抗体、抗bace2抗体、抗calcrl抗体、抗lifr抗体、抗met抗体、抗mpzl2抗体、抗ptprb抗体或抗wls抗体。
[0831]
103.如第102段所述的分离的细胞，其中所述抗emcn抗体是选自由以下组成的组的单克隆抗体：cbfye-0213、v.7.c7.1、l6h10、l4b1、l5f12、l10b5、l3f12、l6h3、l9h8和l10f12。
[0832]
104.如第33段至第103段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调控t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞(esc)、esc衍生细胞、多能干细胞和诱导型多能干细胞(ipsc)以及ipsc衍生细胞。
[0833]
105.如第33段至第104段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是自体的。
[0834]
106.如第33段至第104段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是同种异体的。
[0835]
107.一种嵌合受体，其包含两个或更多个抗原结合域，其中所述两个或更多个抗原结合域各自结合至选自由表1中列出的抗原组成的组的抗原，或其中所述两个或更多个抗原结合域的两个抗原结合域结合至选自由表3中列出的抗原配对组成的组的抗原配对，
[0836]
其中各个抗原结合域结合至不同的抗原。
[0837]
108.一种嵌合受体，其包含两个或更多个抗原结合域，其中所述两个或更多个抗原结合域各自结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70，
[0838]
其中各个抗原结合域结合至不同的抗原。
[0839]
109.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合ms4a3并且第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0840]
110.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合vstm1并且第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0841]
111.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合lat2并且第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0842]
112.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合mlc1并且第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0843]
113.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合cd131并且第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0844]
114.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合gapt并且第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0845]
115.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合pram1并且第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0846]
116.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合slc22a16并且第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0847]
117.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合slc17a9并且第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0848]
118.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合spns3并且第二抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0849]
119.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合flt3。
[0850]
120.如第119段所述的嵌合受体，其中所述结合flt3的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0851]
(a)包含seq id no:1的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:2的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0852]
(b)包含seq id no:3的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:4的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0853]
(c)包含seq id no:5的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:6的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0854]
(d)包含seq id no:7的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:8的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0855]
(e)包含seq id no:9的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:10的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0856]
(f)包含seq id no:11的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:12的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0857]
(g)包含seq id no:13的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:14的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0858]
(h)包含seq id no:15的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:16的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0859]
121.如第119段或第120段所述的嵌合受体，其中第二抗原结合域结合cd33。
[0860]
122.如第121段所述的嵌合受体，其中所述结合cd33的第二抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0861]
(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0862]
(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0863]
123.如第119段或第120段所述的嵌合受体，其中第二抗原结合域结合clec12a。
[0864]
124.如第123段所述的嵌合受体，其中所述结合clec12a的第二抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0865]
(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0866]
(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0867]
(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0868]
125.如第107段或第108段所述的嵌合受体，其中一个抗原结合域结合clec12a。
[0869]
126.如第125段所述的嵌合受体，其中所述结合clec12a的抗原结合域包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0870]
(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0871]
(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0872]
(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0873]
127.如第125段或第126段所述的嵌合受体，其中第二抗原结合域结合cd33。
[0874]
128.如第127段所述的嵌合受体，其中所述结合cd33的第二抗原结合域包含选自
由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0875]
(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0876]
(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0877]
129.如第107段至第128段中任一段所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。
[0878]
130.如第129段所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体是car。
[0879]
131.如第130段所述的嵌合受体，其中所述car是双特异性car。
[0880]
132.如第130段或第131段所述的嵌合受体，其中所述car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3-ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域、myd88细胞内信号传导域和2b4细胞内信号传导域。
[0881]
133.如第130段至第132段中任一段所述的嵌合受体，其中所述car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域。
[0882]
134.如第120段至第133段中任一段所述的嵌合受体，其中所述car包含间隔区，所述间隔区在所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
[0883]
135.如第107段至第134段中任一段所述的嵌合受体，其中各个抗原结合域包含一个或多个抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。
[0884]
136.如第107段至第135段中任一段所述的嵌合受体，其中各个抗原结合域包含一个或多个单链可变片段(scfv)。
[0885]
137.如第136段所述的嵌合受体，其中所述一个或多个scfv各自包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。
[0886]
138.如第137段所述的嵌合受体，其中所述vh和所述vl由肽接头隔开。
[0887]
139.如第138段所述的嵌合受体，其中所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。
[0888]
140.如第137段至第139段中任一段所述的嵌合受体，其中所述一个或多个scfv各自包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
[0889]
141.如第107段至第140段中任一段所述的嵌合受体，其中所述抗原结合域中的至少一个包含两个单链可变片段(scfv)。
[0890]
142.如第141段所述的嵌合受体，其中所述两个scfv各自结合至相同抗原上的不
同表位。
[0891]
143.如第135段至第142段中任一段所述的嵌合受体，其中所述一个或多个scfv各自由肽接头隔开。
[0892]
144.如第143段所述的嵌合受体，其中所述肽接头包含ggggsggggsggggs(seq id no:27)或eaaakeaaakeaaakeaaak(seq id no:74)的氨基酸序列。
[0893]
145.如第141段至第144段中任一段所述的嵌合受体，其中所述抗原结合域中的至少一个包含两个单链可变片段(scfv)，并且所述两个scfv各自结合至flt3并且包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0894]
(a)包含seq id no:1的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:2的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0895]
(b)包含seq id no:3的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:4的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0896]
(c)包含seq id no:5的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:6的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0897]
(d)包含seq id no:7的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:8的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0898]
(e)包含seq id no:9的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:10的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0899]
(f)包含seq id no:11的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:12的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0900]
(g)包含seq id no:13的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:14的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0901]
(h)包含seq id no:15的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:16的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0902]
146.如第141段至第145段中任一段所述的嵌合受体，其中所述抗原结合域中的至少一个包含两个单链可变片段(scfv)，并且所述两个scfv各自结合至cd33并且包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0903]
(a)包含seq id no:17的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:18的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0904]
(b)包含seq id no:19的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:20的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0905]
147.如第141段至第146段中任一段所述的嵌合受体，其中所述抗原结合域中的至少一个包含两个单链可变片段(scfv)，并且所述两个scfv各自结合至clec12a并且包含选自由以下组成的组的重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)：
[0906]
(a)包含seq id no:21的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:22的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；
[0907]
(b)包含seq id no:23的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含seq.id no:24的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl；以及
[0908]
(c)包含seq id no:25的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vh和包含
seq.id no:26的氨基酸序列或与其至少90％同一的序列的vl。
[0909]
148.一种分离的细胞，其包含如第107段至第147段中任一段所述的嵌合受体。
[0910]
149.如第148段所述的分离的细胞，其中所述细胞另外包含额外嵌合受体，所述额外嵌合受体包含抗原结合域。
[0911]
150.如第149段所述的分离的细胞，其中所述额外嵌合受体结合至选自由以下组成的组的抗原：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、flt3、cd33、clec12a、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[0912]
151.如第150段所述的分离的细胞，其中所述两个嵌合受体各自结合至不同的抗原。
[0913]
152.如第148段至第151段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是免疫应答细胞。
[0914]
153.如第152段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体结合至所述两个抗原中的任一个皆能够激活所述免疫应答细胞。
[0915]
154.如第152段所述的分离的细胞，其中所述额外嵌合受体结合至其同源抗原能够刺激所述免疫应答细胞。
[0916]
155.如第152段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体结合至所述两个抗原中的任一个和所述额外嵌合受体结合至其同源抗原为激活所述免疫应答细胞所需要的。
[0917]
156.如第152段所述的分离的细胞，其中所述免疫应答细胞表现出对针对所述嵌合受体结合的所述两个抗原中的任一个都呈阳性并且针对所述额外嵌合受体结合的抗原呈阳性的靶细胞的细胞溶解活性与对仅针对单个抗原呈阳性的靶细胞的细胞溶解活性相比程度更大。
[0918]
157.如第149段至第156段中任一段所述的分离的细胞，其中所述额外嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。
[0919]
158.如第157段所述的分离的细胞，其中所述额外嵌合受体是car。
[0920]
159.如第157段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体是第一car并且所述额外嵌合受体是第二car。
[0921]
160.如第159段所述的分离的细胞，其中所述第二car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域、myd88细胞内信号传导域和2b4细胞内信号传导域。
[0922]
161.如第160段所述的分离的细胞，其中所述第一car的所述一个或多个细胞内信号传导域与所述第二car的所述一个或多个细胞内信号传导域不同。
[0923]
162.如第161段所述的分离的细胞，其中所述第一car和所述第二car各自包含cd3ζ链细胞内信号传导域。
[0924]
163.如第162段所述的分离的细胞，其中所述第一car和所述第二car各自另外包含选自由以下组成的组的额外细胞内信号传导域：cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域、myd88细胞内信号传导域和2b4细胞内信号传导域。
[0925]
164.如第163段所述的分离的细胞，其中所述第一car的所述额外细胞内信号传导域与所述第二car的所述额外细胞内信号传导域不同。
[0926]
165.如第160段至第164段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第二car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域。
[0927]
166.如第165段所述的分离的细胞，其中所述第一car的所述跨膜域与所述第二car的所述跨膜域不同。
[0928]
167.如第143段至第166段中任一段所述的分离的细胞，其中所述第二car包含间隔区，所述间隔区在所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
[0929]
168.如第146段至第167段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞另外包含抑制性嵌合受体，所述抑制性嵌合受体包含抗原结合域。
[0930]
169.如第149段所述的分离的细胞，其中所述额外嵌合受体是包含抗原结合域的抑制性嵌合受体。
[0931]
170.如第168段或第169段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体抑制所述细胞的一种或多种活性。
[0932]
171.如第168段至第170段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体结合不表达于肿瘤细胞上的抗原。
[0933]
172.如第168段至第170段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体结合表达于非肿瘤细胞上的抗原。
[0934]
173.如第168段至第170段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体结合表达于非肿瘤细胞上的抗原，所述表达于非肿瘤细胞上的抗原来源于选自由以下组成的组的组织：脑、神经元组织、内分泌、骨、骨髓、免疫系统、内皮组织、肌肉、肺、肝脏、胆囊、胰腺、胃肠道、肾脏、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、软组织和皮肤。
[0935]
174.如第171段至第173段中任一段所述的分离的细胞，其中所述肿瘤细胞是急性髓性白血病(aml)细胞。
[0936]
175.如第168段至第174段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体包含酶抑制域。
[0937]
176.如第175段所述的分离的细胞，其中所述酶抑制域当在免疫受体近端时抑制免疫受体激活。
[0938]
177.如第175段或第176段所述的分离的细胞，其中所述酶抑制域包含酶催化域。
[0939]
178.如第177段所述的分离的细胞，其中所述酶催化域来源于选自由以下组成的组的酶：csk、shp-1、pten、cd45、cd148、ptp-meg1、ptp-pest、c-cbl、cbl-b、ptpn22、lar、ptph1、ship-1和rasgap。
[0940]
179.如第168段至第178段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体另外包含一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域。
[0941]
180.如第179段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域选自由以下组成的组：pd-1、ctla4、tigit、lair1、grb-2、dok-1、dok-2、slap、lag3、havr、btla、gitr和pd-l1。
[0942]
181.如第168段至第180段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体结合选自由以下组成的组的抗原：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar2、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136和tmem200a。
[0943]
182.如第149段至第181段中任一段所述的分离的细胞，其中所述额外嵌合受体和/或抑制性嵌合受体的所述抗原结合域包含一个或多个抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。
[0944]
183.如第149段至第181段中任一段所述的分离的细胞，其中所述额外嵌合受体和/或抑制性嵌合受体的所述抗原结合域包含一个或多个单链可变片段(scfv)。
[0945]
184.如第183段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体的所述抗原结合域来源于抗emcn抗体、抗caln1抗体、抗il12rb2抗体、抗cdh26抗体、抗il18r1抗体、抗slc8a3抗体、抗abcb1抗体、抗atp9a抗体、抗cdcp1抗体、抗jam2抗体、抗pcdh9抗体、抗tmem200a抗体、抗adgrl4抗体、抗art4抗体、抗bace2抗体、抗calcrl抗体、抗lifr抗体、抗met抗体、抗mpzl2抗体、抗ptprb抗体或抗wls抗体。
[0946]
185.如第184段所述的分离的细胞，其中所述抗emcn抗体是选自由以下组成的组的单克隆抗体：cbfye-0213、v.7.c7.1、l6h10、l4b1、l5f12不，、l10b5、l3f12、l6h3、l9h8和l10f12。
[0947]
186.如第183段至第185段中任一段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个scfv各自包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。
[0948]
187.如第186段所述的分离的细胞，其中所述vh和所述vl由肽接头隔开。
[0949]
188.如第187段所述的分离的细胞，其中所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。
[0950]
189.如第186段至第188段中任一段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个scfv各自包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
[0951]
190.如第168段至第189段中任一段所述的分离的细胞，其中所述额外嵌合受体和/或抑制性嵌合受体的所述抗原结合域包含两个单链可变片段(scfv)。
[0952]
191.如第190段所述的分离的细胞，其中所述两个scfv各自结合至相同抗原上的不同表位。
[0953]
192.如第182段至第191段中任一段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个scfv各自由肽接头隔开。
[0954]
193.如第192段所述的分离的细胞，其中所述肽接头包含ggggsggggsggggs(seq id no:27)或eaaakeaaakeaaakeaaak(seq id no:74)的氨基酸序列。
[0955]
194.如第146段至第189段中任一段所述的分离的细胞，其中各个嵌合受体被重组表达。
[0956]
195.如第146段至第194段中任一段所述的分离的细胞，其中各个嵌合受体由载体或来自所述细胞的基因组的所选基因座表达。
[0957]
196.如第146段至第195段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调控t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞(esc)、esc衍生细胞、多能干细胞和诱导型多能干细胞(ipsc)以及ipsc衍生细胞。
[0958]
197.如第146段至第196段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是自体的。
[0959]
198.如第146段至第196段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是同种异体的。
[0960]
199.一种抑制性嵌合受体，其包含细胞外抗原结合域，所述细胞外抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar2、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136和tmem200a。
[0961]
200.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是emcn。
[0962]
201.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是jam2。
[0963]
202.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是ms4a15。
[0964]
203.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是c4bpa。
[0965]
204.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是trpm1。
[0966]
205.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是sctr。
[0967]
206.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是slc2a2。
[0968]
207.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是kcnq2。
[0969]
208.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是perp。
[0970]
209.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是wls。
[0971]
210.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是ffar2。
[0972]
211.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是ptprb。
[0973]
212.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是nckap1。
[0974]
213.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是mpzl2。
[0975]
214.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是plscr4。
[0976]
215.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是tmem47。
[0977]
216.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是adgrl4。
[0978]
217.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是met。
[0979]
218.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是bace2。
[0980]
219.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是atp8b1。
[0981]
220.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是lifr。
[0982]
221.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是art4。
[0983]
222.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是calcrl。
[0984]
223.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是cntnap3。
[0985]
224.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是pcdh9。
[0986]
225.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是il18r1。
[0987]
226.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是slc8a3。
[0988]
227.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是cdh26。
[0989]
228.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是tmem163。
[0990]
229.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是abca13。
[0991]
230.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是cachd1。
[0992]
231.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是cyyr1。
[0993]
232.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是abcb1。
[0994]
233.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是adgrg6。
[0995]
234.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是atp9a。
[0996]
235.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是caln1。
[0997]
236.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是cdcp1。
[0998]
237.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是il12rb2。
[0999]
238.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是slc16a14。
[1000]
239.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是tmem136。
[1001]
240.如第199段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原是tmem200a。
[1002]
241.如第199段至第240段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中当表达于细胞上时所述抑制性嵌合受体抑制所述细胞的一种或多种活性。
[1003]
242.如第199段至第241段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原不表达于肿瘤细胞上。
[1004]
243.如第199段至第242段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原表达于非肿瘤细胞上。
[1005]
244.如第243段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原表达于非肿瘤细胞上，所述非肿瘤细胞来源于选自由以下组成的组的组织：脑、神经元组织、内分泌、骨、骨髓、免疫系统、内皮组织、肌肉、肺、肝脏、胆囊、胰腺、胃肠道、肾脏、膀胱、雄性生殖器官、雌性生殖器官、脂肪、软组织和皮肤。
[1006]
245.如第199段至第244段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抑制性嵌合受体包含酶抑制域。
[1007]
246.如第245段所述的抑制性嵌合受体，其中所述酶抑制域当在免疫受体近端时抑制免疫受体激活。
[1008]
247.如第245段或第246段所述的抑制性嵌合受体，其中所述酶抑制域包含酶催化域。
[1009]
248.如第247段所述的抑制性嵌合受体，其中所述酶催化域来源于选自由以下组成的组的酶：csk、shp-1、pten、cd45、cd148、ptp-meg1、ptp-pest、c-cbl、cbl-b、ptpn22、lar、ptph1、ship-1和rasgap。
[1010]
249.如第199段至第248段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抑制性嵌合受体另外包含一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域。
[1011]
250.如第249段所述的抑制性嵌合受体，其中所述一个或多个细胞内抑制性辅助信号传导域选自由以下组成的组：pd-1、ctla4、tigit、lair1、grb-2、dok-1、dok-2、slap、lag3、havr、btla、gitr和pd-l1。
[1012]
251.如第199段至第250段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原结合域包含一个或多个抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。
[1013]
252.如第199段至第251段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原结合域包含一个或多个单链可变片段(scfv)。
[1014]
253.如第252段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原结合域来源于抗emcn抗体、抗caln1抗体、抗il12rb2抗体、抗cdh26抗体、抗il18r1抗体、抗slc8a3抗体、抗abcb1抗体、抗atp9a抗体、抗cdcp1抗体、抗jam2抗体、抗pcdh9抗体、抗tmem200a抗体、抗adgrl4抗体、抗art4抗体、抗bace2抗体、抗calcrl抗体、抗lifr抗体、抗met抗体、抗mpzl2抗体、抗ptprb抗体或抗wls抗体。
[1015]
254.如第253段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗emcn抗体是选自由以下组成的组的单克隆抗体：cbfye-0213、v.7.c7.1、l6h10、l4b1、l5f12、l10b5、l3f12、l6h3、l9h8和l10f12。
[1016]
255.如第252段至第254段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中所述一个或多个scfv各自包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。
[1017]
256.如第255段所述的抑制性嵌合受体，其中所述vh和所述vl由肽接头隔开。
[1018]
257.如第256段所述的抑制性嵌合受体，其中所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。
[1019]
258.如第255段至第257段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中所述一个或多个scfv各自包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
[1020]
259.如第199段至第258段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗原结合域包含两个单链可变片段(scfv)。
[1021]
260.如第259段所述的抑制性嵌合受体，其中所述两个scfv各自结合至相同抗原上的不同表位。
[1022]
261.如第251段至第260段中任一段所述的抑制性嵌合受体，其中所述一个或多个scfv各自由肽接头隔开。
[1023]
262.如第261段所述的抑制性嵌合受体，其中所述肽接头包含ggggsggggsggggs(seq id no:27)或eaaakeaaakeaaakeaaak(seq id no:74)的氨基酸序列。
[1024]
263.一种分离的细胞，其包含如第199段至第262段中任一段所述的抑制性嵌合受体。
[1025]
264.如第263段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体被重组表达。
[1026]
265.如第263段或第264段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体由载体或来自所述细胞的基因组的所选基因座表达。
[1027]
266.如第263段至第265段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞另外包含嵌合受体，所述嵌合受体包含细胞外抗原结合域，所述细胞外抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：flt3、cd33、clec12a、ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[1028]
267.一种分离的细胞，其包含：
[1029]
(a)抑制性嵌合受体，其包含细胞外抗原结合域，所述细胞外抗原结合域结合至第一抗原，其中所述第一抗原选自由以下组成的组：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar2、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136和tmem200a，并且
[1030]
(b)嵌合受体，其包含一个或多个细胞外抗原结合域，其中各个抗原结合域结合至选自由表1中列出的抗原组成的组的抗原。
[1031]
268.一种分离的细胞，其包含：
[1032]
(a)抑制性嵌合受体，其包含细胞外抗原结合域，所述细胞外抗原结合域结合至第一抗原，其中所述第一抗原选自由以下组成的组：emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、perp、wls、ffar2、ptprb、nckap1、mpzl2、plscr4、tmem47、adgrl4、met、bace2、atp8b1、lifr、art4、calcrl、cntnap3、pcdh9、il18r1、slc8a3、cdh26、tmem163、abca13、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、caln1、cdcp1、il12rb2、slc16a14、tmem136和tmem200a，并且
[1033]
(b)嵌合受体，其包含一个或多个细胞外抗原结合域，其中各个抗原结合域结合至选自由以下组成的组的抗原：flt3、cd33、clec12a、ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9、spns3、、adgre2、il3ra、cd117、cd93、il1rap、cd244、ccr1、lilrb2、piezo1、cd38、emb、myadm、lilra2、cd300lf和cd70。
[1034]
269.如第266段至第268段中任一段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。
[1035]
270.如第269段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体是car。
[1036]
271.如第270段所述的分离的细胞，其中所述car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域、myd88细胞内信号传导域和2b4细胞内信号传导域。
[1037]
272.如第270段或第271段所述的分离的细胞，其中所述car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和
btla跨膜域。
[1038]
273.如第208段至第272段中任一段所述的分离的细胞，其中所述car包含间隔区，所述间隔区介于所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
[1039]
274.如第266段至第273段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体和/或所述嵌合受体的所述抗原结合域包含一个或多个抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。
[1040]
275.如第266段至第273段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体和/或所述嵌合受体的所述抗原结合域包含一个或多个单链可变片段(scfv)。
[1041]
276.如第275段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体的所述抗原结合域来源于抗emcn抗体、抗caln1抗体、抗il12rb2抗体、抗cdh26抗体、抗il18r1抗体、抗slc8a3抗体、抗abcb1抗体、抗atp9a抗体、抗cdcp1抗体、抗jam2抗体、抗pcdh9抗体、抗tmem200a抗体、抗adgrl4抗体、抗art4抗体、抗bace2抗体、抗calcrl抗体、抗lifr抗体、抗met抗体、抗mpzl2抗体、抗ptprb抗体或抗wls抗体。
[1042]
277.如第276段所述的抑制性嵌合受体，其中所述抗emcn抗体是选自由以下组成的组的单克隆抗体：cbfye-0213、v.7.c7.1、l6h10、l4b1、l5f12、l10b5、l3f12、l6h3、l9h8和l10f12。
[1043]
278.如第275段至第277段中任一段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个scfv各自包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。
[1044]
279.如第278段所述的分离的细胞，其中所述vh和所述vl由肽接头隔开。
[1045]
280.如第279段所述的分离的细胞，其中所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。
[1046]
281.如第278段至第280段中任一段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个scfv各自包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
[1047]
282.如第266段至第281段中任一段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体和/或所述嵌合受体的所述抗原结合域包含两个单链可变片段(scfv)。
[1048]
283.如第282段所述的分离的细胞，其中所述两个scfv各自结合至相同抗原上的不同表位。
[1049]
284.如第274段至第283段中任一段所述的分离的细胞，其中所述一个或多个scfv各自由肽接头隔开。
[1050]
285.如第284段所述的分离的细胞，其中所述肽接头包含ggggsggggsggggs(seq id no:27)或eaaakeaaakeaaakeaaak(seq id no:74)的氨基酸序列。
[1051]
286.如第267段至第285段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是免疫应答细胞。
[1052]
287.如第286段所述的分离的细胞，其中所述抑制性嵌合受体结合至所述第一抗原能够抑制所述免疫应答细胞。
[1053]
288.如第286段或第287段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体结合至所述第二抗原能够激活所述免疫应答细胞。
[1054]
289.如第267段至第288段中任一段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体以低结
合亲和力结合至所述第二抗原。
[1055]
290.如第267段至第289段中任一段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体结合至所述第二抗原的结合亲和力低于所述抑制性嵌合受体结合至所述第一抗原的结合亲和力。
[1056]
291.如第267段至第290段中任一段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体以低结合亲合力结合至所述第一抗原。
[1057]
292.如第266段至第291段中任一段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体被重组表达。
[1058]
293.如第266段至第292段中任一段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体由载体或来自所述细胞的基因组的所选基因座表达。
[1059]
294.如第263段至第293段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调控t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、骨髓细胞、巨噬细胞、人胚胎干细胞(esc)、esc衍生细胞、多能干细胞和诱导型多能干细胞(ipsc)以及ipsc衍生细胞。
[1060]
295.如第263段至第294段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是自体的。
[1061]
296.如第263段至第294段中任一段所述的分离的细胞，其中所述细胞是同种异体的。
[1062]
297.一种分离的核酸，其编码如第1段至第22段中任一段所述的嵌合受体。
[1063]
298.一种分离的核酸，其编码如第107段至第140段中任一段所述的嵌合受体。
[1064]
299.一种分离的核酸，其编码如第199段至第258段中任一段所述的抑制性嵌合受体。
[1065]
300.一种载体，其包含如第297段所述的核酸。
[1066]
301.如第300段所述的载体，其中所述载体另外包含如第298段所述的核酸。
[1067]
302.如第300段或第301段所述的载体，其中所述载体另外包含如第299段所述的核酸。
[1068]
303.一种载体，其包含如第298段所述的核酸。
[1069]
304.如第303段所述的载体，其中所述载体另外包含如第299段所述的核酸。
[1070]
305.一种载体，其包含如第299段所述的核酸。
[1071]
306.一种基因修饰的细胞，其包含如第297段所述的核酸。
[1072]
307.如第306段所述的基因修饰的细胞，其中所述细胞另外包含如第298段所述的核酸。
[1073]
308.如第306段或第307段所述的基因修饰的细胞，其中所述细胞另外包含如第299段所述的核酸。
[1074]
309.一种基因修饰的细胞，其包含如第298段所述的核酸。
[1075]
310.如第309段所述的基因修饰的细胞，其中所述细胞另外包含如第299段所述的核酸。
[1076]
311.一种基因修饰的细胞，其包含如第299段所述的核酸。
[1077]
312.一种基因修饰的细胞，其包含如第300段至第305段中任一段所述的载体。
[1078]
313.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的如第24段至第106段、第146段至第198段、第263段至第296段或第306段至第312段中任一段所述的
分离的细胞中的任一者。
[1079]
314.一种在受试者中刺激针对肿瘤细胞的细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向患有肿瘤的受试者施用治疗有效剂量的如第24段至第106段、第146段至第198段、第263段至第296段或第306段至第312段中任一段所述的分离的细胞中的任一种。
[1080]
315.一种在受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效剂量的如第24段至第106段、第146段至第198段、第263段至第296段或第306段至第312段中任一段所述的分离的细胞中的任一种。
[1081]
316.一种减小受试者的肿瘤负担的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如第24段至第106段、第146段至第198段、第263段至第296段或第306段至第312段中任一段所述的分离的细胞中的任一种。
[1082]
317.如第316段所述的方法，其中所述方法减少了肿瘤细胞的数目。
[1083]
318.如第316段所述的方法，其中所述方法减小了肿瘤大小。
[1084]
319.如第316段所述的方法，其中所述方法减小了肿瘤体积。
[1085]
320.如第316段所述的方法，其中所述方法消除了所述受试者的肿瘤。
[1086]
321.一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的如第24段至第106段、第146段至第198段、第263段至第296段或第306段至第312段中任一段所述的细胞中的任一种。
[1087]
322.一种治疗或预防受试者的骨髓病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如第24段至第106段、第146段至第198段、第263段至第296段或第306段至第312段中任一段所述的分离的细胞中的任一种。
[1088]
323.如第322段所述的方法，其中所述骨髓病症是骨髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、慢性髓单核细胞性白血病、急性髓性白血病(aml)、急性成髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和真性红细胞增多症。
[1089]
324.如第322段所述的方法，其中所述骨髓病症是急性髓性白血病(aml)。
[1090]
325.如第321段至第324段中任一段所述的方法，其中所述方法减小或消除了所述受试者的肿瘤负担。
[1091]
326.一种药物组合物，其包含有效量的如第24段至第106段、第146段至第198段、第263段至第296段或第306段至第312段中任一段所述的细胞和药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂或其组合。
[1092]
327.如第326段所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗和/或预防骨髓病症。
[1093]
328.一种用于治疗和/或预防骨髓病症的药盒，所述药盒包含如第24段至第106段、第146段至第198段、第263段至第296段或第306段至第312段中任一段所述的细胞。
[1094]
329.如第328段所述的药盒，其中所述药盒另外包括使用所述细胞治疗和/或预防受试者的骨髓病症的书面说明书。
[1095]
330.一种用于治疗和/或预防骨髓病症的药盒，其包含如第297段至第299段中任一段所述的分离的核酸。
[1096]
331.如第330段所述的药盒，其中所述药盒另外包括使用所述核酸产生一种或多种抗原特异性细胞以用于治疗和/或预防受试者的骨髓病症的书面说明书。
[1097]
332.一种用于治疗和/或预防骨髓病症的药盒，所述药盒包含如第300段至第305段中任一段所述的载体。
[1098]
333.如第332段所述的药盒，其中所述药盒另外包括使用所述载体产生一种或多种抗原特异性细胞以用于治疗和/或预防受试者的骨髓病症的书面说明书。
[1099]
334.一种治疗和/或预防骨髓病症的方法，所述方法包括施用有效量的至少一种结合至抗原的抗体，其中所述抗原选自由以下组成的组：ms4a3、vstm1、lat2、mlc1、cd131、gapt、pram1、slc22a16、slc17a9和spns3。
[1100]
335.如第334段所述的方法，其中所述骨髓病症选自由以下组成的组：骨髓发育不良综合征、骨髓增生性肿瘤、慢性髓单核细胞性白血病、急性髓性白血病(aml)、急性成髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和真性红细胞增多症。
[1101]
336.如第335段所述的方法，其中所述骨髓病症是急性髓性白血病(aml)。
[1102]
337.如第334段至第336段中任一段所述的方法，其中所述方法减小或消除了所述受试者的肿瘤负担。
[1103]
338.一种嵌合抗原受体(car)，其中所述car包含细胞外抗原结合域、一个或多个细胞内信号传导域、跨膜域和在所述抗原结合域与所述跨膜域之间的间隔区，其中所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
[1104]
339.一种嵌合受体，其包含细胞外抗原结合域，其中所述抗原结合域包含两个或更多个抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)。
[1105]
340.如第339段所述的嵌合受体，其中所述两个或更多个抗体、抗体的抗原结合片段、f(ab)片段、f(ab')片段、单链可变片段(scfv)或单结构域抗体(sdab)各自结合至相同抗原上的不同表位。
[1106]
341.如第339段或第340段所述的嵌合受体，其中所述抗原结合域包含两个或更多个单链可变片段(scfv)。
[1107]
342.如第341段所述的嵌合受体，其中所述两个或更多个scfv各自包含重链可变域(vh)和轻链可变域(vl)。
[1108]
343.如第342段所述的嵌合受体，其中各个vh和vl由肽接头隔开。
[1109]
344.如第343段所述的嵌合受体，其中所述肽接头包含seq id no:27的氨基酸序列。
[1110]
345.如第341段至第344段中任一段所述的嵌合受体，其中所述两个或更多个scfv各自包含结构vh-l-vl或vl-l-vh，其中vh是重链可变域，l是肽接头，并且vl是轻链可变域。
[1111]
346.如第341段至第345段中任一段所述的嵌合受体，其中所述两个或更多个scfv各自由肽接头隔开。
[1112]
347.如第346段所述的嵌合受体，其中所述肽接头包含ggggsggggsggggs(seq id no:27)或eaaakeaaakeaaakeaaak(seq id no:74)的氨基酸序列。
[1113]
348.如第339段至第347段中任一段所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体是嵌合t细胞受体或嵌合抗原受体(car)。
[1114]
349.如第348段所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体是car。
[1115]
350.如第349段所述的嵌合受体，其中所述car包含一个或多个细胞内信号传导域，并且所述一个或多个细胞内信号传导域选自由以下组成的组：cd3ζ链细胞内信号传导域、cd97细胞内信号传导域、cd11a-cd18细胞内信号传导域、cd2细胞内信号传导域、icos细胞内信号传导域、cd27细胞内信号传导域、cd154细胞内信号传导域、cd8细胞内信号传导域、ox40细胞内信号传导域、4-1bb细胞内信号传导域、cd28细胞内信号传导域、zap40细胞内信号传导域、cd30细胞内信号传导域、gitr细胞内信号传导域、hvem细胞内信号传导域、dap10细胞内信号传导域、dap12细胞内信号传导域和myd88细胞内信号传导域。
[1116]
351.如第349段或第350段所述的嵌合受体，其中所述car包含跨膜域，并且所述跨膜域选自由以下组成的组：cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3ζ链跨膜域、cd4跨膜域、4-1bb跨膜域、ox40跨膜域、icos跨膜域、ctla-4跨膜域、pd-1跨膜域、lag-3跨膜域、2b4跨膜域和btla跨膜域。
[1117]
352.如第348段至第351段中任一段所述的嵌合受体，其中所述car包含间隔区，所述间隔区在所述抗原结合域与所述跨膜域之间，并且所述间隔区具有选自由seq id no:55-64组成的组的氨基酸序列。
[1118]
353.一种分离的细胞，其包含如第339段至第352段中任一段所述的嵌合受体。
[1119]
354.如第353段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体被重组表达。
[1120]
355.如第353段或第354段所述的分离的细胞，其中所述嵌合受体由载体或来自所述细胞的基因组的所选基因座表达。
[1121]
356.一种药物组合物，其包含如第353段至第355段中任一段所述的分离的细胞和药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂或其组合。
[1122]
357.一种分离的核酸，其编码如第339段至第352段中任一段所述的嵌合受体。
[1123]
358.一种载体，其包含如第357段所述的核酸。
[1124]
359.一种基因修饰的细胞，其包含如第357段所述的核酸。
实施例
[1125]
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于本文所提供的一般性描述，可以实践各个其他实施方案。
[1126]
以下是用于进行本发明要求的标的物的具体实施方案的实施例。所述实施例仅出于说明目的而提供，并且不希望以任何方式限制本发明的范围。已经努力确保所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是当然应当允许一定程度的实验误差和偏差。
[1127]
实施例1：针对aml靶标的生物信息筛检
[1128]
生物信息筛检分析
[1129]
针对与aml相关的潜在靶标对来自aml和正常造血样品的微阵列数据、rna-seq数据和蛋白质组学数据以及来自脱靶组织的数据进行了分析。微阵列数据集获自geo，rna-seq数据集获自癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，tcga)，而蛋白质组学数据集获自人蛋白质图谱(human protein atlas)和人蛋白质组图谱(human proteome map)。起初针对与aml相关的基因和蛋白质靶标对各个数据集进行了分析。然后对来自aml靶标的初始个别微阵列、rna-seq和蛋白质组学生物信息学分析的数据进行了比较，以提供精化的aml靶标列表。在aml细胞系中通过抗体染色和流式细胞术并且在原发性aml样品中通过抗
体染色和流式细胞术来验证推定的aml靶标。分析了所有数据以提供最终的aml靶标列表。组合微阵列表达、rna-seq表达和hpa毒性的生物信息学分析同时允许更稳定的途径来鉴定和验证aml抗原靶标。
[1130]
首先去除了在初步分析中具有亚细胞定位go注释的基因。7806个基因被鉴定为膜或细胞表面局部化的。接下来，去除了与aml造血细胞相比表达于健康成红血球细胞和t细胞中的基因。去除了除骨髓、脾脏、淋巴结、阑尾或扁桃体以外的组织中具有“支持”或“增强”高免疫组织化学蛋白表达的基因。接下来基于rna-seq表达数据，针对与非造血组织表达相比在aml组织中具有至少2倍基因表达的基因对基因进行了阳性淘选。然后在所有aml样品中和flt3-itd亚群中以更严格的要求再次筛检其余靶标以去除在多个组织中具有中等表达的基因并且仅保留推定的aml基因中具有至少4倍增加的基因，如rna-seq数据集中所示。然后针对具有单克隆人反应性流式细胞术抗体可用性、已知的生物学和lsc表达的基因对其余基因进行手动过滤。
[1131]
实施例2：逻辑闸选策略
[1132]
然后将实施例1中鉴定的新颖aml抗原配对以进行and和not闸选。
[1133]
去除了根据rna-seq或hpa数据库具有重叠组织毒性的and配对。可以通过具有至少两个毒性组织的任何基因来确定能与not靶标配对的潜在靶标。
[1134]
使用tcga rnaseq数据库，使用以下标准确定了not靶标：not靶标在aml组织上具有低表达而在所希望的组织上具有高表达。
[1135]
通过这个策略确定的单个或“or”闸选靶标包括flt3、ms4a3、cd33、clec12a、adgre2、slc22a16、cd123/il3ra、mlc1、spns3和gapt。其他aml抗原描述于表1中。aml抗原的微阵列、rna-seq和蛋白表达数据示于图1至图25中。
[1136]
通过这个策略确定的“and/not”闸选靶标包括lat2、piezo1、cd38、emb、cd131/csf2rb、lilra2、cd85h、slc17a9、myadm、cd300lf、cd244、cd93和cd117/c-kit。
[1137]
配对“and”闸选靶标描述于表3中。
[1138]
通过这个策略确定的“not”闸选靶标包括emcn、jam2、ms4a15、c4bpa、trpm1、sctr、slc2a2、kcnq2、pepr、wls和ffar。“not”也描述于表2中。not抗原闸选靶标的微阵列、rna-seq和蛋白表达数据示于图26至图34中。
[1139]
实施例3：表达flt3嵌合抗原受体的t细胞
[1140]
对来自两个不同供体的t细胞进行了基因修饰以表达包含六个不同flt3 scfv多肽的car。car还包括yfp标签作为报告基因。通过流式细胞术对各个供体t细胞系中的flt3 car表达进行了定量，如通过yfp报告标签表达所测定。图35a示出了对于所测试的六个flt3 scfv中的每一个，来自供体1的表达yfp和flt3 car的细胞％，图35b示出了对于所测试的六个flt3 scfv中的每一个，来自供体1的yfp阳性细胞的平均荧光强度。图35c示出了对于所测试的六个flt3 scfv中的每一个，来自供体2的表达yfp和flt3 car的细胞％，图35d示出了对于所测试的六个flt3 scfv中的每一个，来自供体2的yfp阳性细胞的平均荧光强度。nv象征着无载体而且是阴性对照。
[1141]
接下来评估了flt3 car t细胞的体外杀伤活性。将flt3 car与aml细胞系molm13以1∶1比率混合；flt3 表达细胞系sem和flt3阴性细胞系k562作为对照。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。
[1142]
如图36a至图36d中所示，来自两个供体的flt3 car t细胞杀伤了表达flt3的细胞。图36a和图36c示出了杀伤sem细胞，图36b和图36d示出了杀伤molm13细胞。图36a和图36b是来自供体1的t细胞，图36c和图36d是来自供体2的t细胞。
[1143]
还通过elisa对flt3 car t细胞在与sem或molm13细胞一起孵育之后的细胞因子分泌进行了定量(图37a至图37f和图38a至图38f)。图37a至图37c示出了与sem细胞一起孵育之后，来自供体1的各个flt3 car t细胞系中诱导的tnf-α、ifn-γ和il-2分泌。图37d至图37f示出了与sem细胞一起孵育之后，来自供体2的各个flt3 car t细胞系中诱导的tnf-α、ifn-γ和il-2分泌。图38a至图38c示出了与molm13细胞一起孵育之后，来自供体1的各个flt3 car t细胞系中诱导的tnf-α、ifn-γ和il-2分泌。图38d至图38f示出了与molm13细胞一起孵育之后，来自供体2的各个flt3 car t细胞系中诱导的tnf-α、ifn-γ和il-2分泌。
[1144]
实施例4：表达flt3嵌合抗原受体的t细胞的体内表征
[1145]
接下来，在鼠类模型中体内表征了实施例3中产生的flt3 car t细胞。将表达flt3的患者来源的肿瘤细胞(诸如molm13和mv411)异种移植至小鼠体内。然后将flt3 car t细胞输注至异种移植小鼠中。在实验过程中抽取了血液，并且在时程结束时收集了脾脏、骨髓和外周血。使用未处理的小鼠作为对照。与未处理的小鼠相比，在flt3 car t细胞处理的小鼠中，输注flt3 car t细胞减少了异种移植的肿瘤细胞负担和生长。
[1146]
实施例5：表达flt3嵌合抗原受体和emcn嵌合抑制性受体的t细胞
[1147]
对t细胞进行了基因修饰以表达识别aml抗原flt3的car和识别非aml抗原emcn(内皮粘蛋白)的抑制性car。为了证实双重修饰的t细胞是功能性的，将t细胞与表达同源flt3抗原的细胞一起孵育，并通过如实施例3中所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。简而言之，将flt3 car与aml细胞系molm13以1∶1比率混合；flt3 表达细胞系sem或flt3阴性细胞系k562作为对照。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。表达flt3 car的双重修饰的t细胞增殖并响应于表达flt3的细胞而产生了效应细胞因子。
[1148]
接下来，将双重修饰的t细胞与表达同源emcn抗原的细胞和表达同源flt3抗原的细胞一起共孵育。通过如以上所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。仅表达同源flt3抗原的细胞被杀伤，而仅表达emcn抗原的细胞未被杀伤。
[1149]
还如实施例4中所述在体内表征了双重修饰的flt3和emcn car t细胞。与未处理的小鼠相比，在处理的小鼠中，输注flt3和emcn car t细胞减少了异种移植的肿瘤细胞负担和生长。
[1150]
实施例6：表达flt3嵌合抗原受体和jam2嵌合抑制性受体的t细胞
[1151]
对t细胞进行了基因修饰以表达识别aml抗原flt3的car和识别非aml抗原jam2的抑制性car。为了证实双重修饰的t细胞是功能性的，将t细胞与表达同源flt3抗原的细胞一起孵育，并通过如实施例3中所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。简而言之，将flt3 car与aml细胞系molm13以1∶1比率混合；flt3 表达细胞系sem或flt3阴性细胞系k562作为对照。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。表达flt3 car的双重修饰的t细胞增殖并响应于单独flt3抗原而产生了效应细胞因子。
[1152]
接下来，将双重修饰的t细胞与表达同源jam2抗原的细胞和表达同源flt3抗原的细胞一起共孵育。通过如以上所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。仅表达同
源flt3抗原的细胞被杀伤，而仅表达jam2抗原的细胞未被杀伤。
[1153]
还如实施例4中所述在体内表征了双重修饰的flt3和jam2 car t细胞。与未处理的小鼠相比，在处理的小鼠中，输注flt3和jam2 car t细胞减少了异种移植的肿瘤细胞负担和生长。
[1154]
实施例7：表达clec12a嵌合抗原受体和ms4a15嵌合抑制性受体的t细胞
[1155]
对t细胞进行了基因修饰以表达识别aml抗原clec12a的car和识别非aml抗原ms4a15的抑制性car。为了证实双重修饰的t细胞是功能性的，将t细胞与表达同源clec12a抗原的细胞一起孵育，并通过如实施例3中所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。简而言之，将clec12a car与表达clec12a的aml细胞系以1∶1比率混合；ms4a15 表达细胞系或阴性细胞系作为对照。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。表达clec12a car的双重修饰的t细胞增殖并响应于单独clec12a抗原而产生了效应细胞因子。
[1156]
接下来，将双重修饰的t细胞与表达同源clec12a抗原的细胞和表达同源ms4a15抗原的细胞一起共孵育。通过如以上所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。仅表达同源clec12a抗原的细胞被杀伤，而仅表达ms4a15抗原的细胞未被杀伤。
[1157]
还如实施例4中所述在体内表征了双重修饰clec12a和ms4a15 car t细胞。与未处理的小鼠相比，在处理的小鼠中，输注clec12a和ms4a15 car t细胞减少了异种移植的肿瘤细胞负担和生长。
[1158]
实施例8：表达clec12a嵌合抗原受体和slc34a2嵌合抑制性受体的t细胞
[1159]
对t细胞进行了基因修饰以表达识别aml抗原clec12a的car和识别非aml抗原slc34a2的抑制性car。为了证实双重修饰的t细胞是功能性的，将t细胞与表达同源clec12a抗原的细胞一起孵育，并通过如实施例3中所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。简而言之，将clec12a car与表达clec12a的aml细胞系以1∶1比率混合；slc34a2 表达细胞系或阴性细胞系作为对照。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。表达clec12a car的双重修饰的t细胞增殖并响应于单独clec12a抗原而产生了效应细胞因子。
[1160]
接下来，将双重修饰的t细胞与表达同源clec12a抗原的细胞和表达同源slc34a2抗原的细胞一起共孵育。通过如以上所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。仅表达同源clec12a抗原的细胞被杀伤，而仅表达slc34a2抗原的细胞未被杀伤。
[1161]
还如实施例4中所述在体内表征了双重修饰clec12a和slc34a2 car t细胞。与未处理的小鼠相比，在处理的小鼠中，输注clec12a和slc34a2 car t细胞减少了异种移植的肿瘤细胞负担和生长。
[1162]
实施例9：表达il1rap嵌合抗原受体和slc2a2嵌合抑制性受体的t细胞
[1163]
对t细胞进行了基因修饰以表达识别aml抗原il1rap的car和识别非aml抗原slc2a2的抑制性car。为了证实双重修饰的t细胞是功能性的，将t细胞与表达同源il1rap抗原的细胞一起孵育，并通过如实施例3中所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。简而言之，将il1rap car与表达il1rap的aml细胞系以1∶1比率混合；slc2a2 表达细胞系或阴性细胞系作为对照。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。表达il1rap car的双重修
饰的t细胞增殖并响应于单独il1rap抗原而产生了效应细胞因子。
[1164]
接下来，将双重修饰的t细胞与表达同源il1rap抗原的细胞和表达同源slc2a2抗原的细胞一起共孵育。通过如以上所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。仅表达同源il1rap抗原的细胞被杀伤，而仅表达slc2a2抗原的细胞未被杀伤。
[1165]
还如实施例4中所述在体内表征了双重修饰的il1rap和slc2a2 car t细胞。与未处理的小鼠相比，在处理的小鼠中，输注il1rap和slc2a2 car t细胞减少了异种移植的肿瘤细胞负担和生长。
[1166]
实施例10：表达cd33嵌合抗原受体和trpm1嵌合抑制性受体的t细胞
[1167]
对t细胞进行了基因修饰以表达识别aml抗原cd33的car和识别非aml抗原trpm1的抑制性car。为了证实双重修饰的t细胞是功能性的，将t细胞与表达同源cd33抗原的的细胞一起孵育，并通过如实施例3中所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。简而言之，将cd33 car与表达cd33的aml细胞系以1∶1比率混合；trpm1 表达细胞系或阴性细胞系作为对照。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。表达cd33 car的双重修饰的t细胞增殖并响应于单独cd33抗原而产生了效应细胞因子。
[1168]
接下来，将双重修饰的t细胞与表达同源cd33抗原的细胞和表达同源trpm1抗原的细胞一起共孵育。通过如以上所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。仅表达同源cd33抗原的细胞被杀伤，而仅表达trpm1抗原的细胞未被杀伤。
[1169]
还如实施例4中所述在体内表征了双重修饰的cd33和trpm1 car t细胞。与未处理的小鼠相比，在处理的小鼠中，输注cd33和trpm1 car t细胞减少了异种移植的肿瘤细胞负担和生长。
[1170]
实施例11：表达slc22a16嵌合抗原受体和sctr嵌合抑制性受体的t细胞
[1171]
对t细胞进行了基因修饰以表达识别aml抗原slc22a16的car和识别非aml抗原sctr的抑制性car。为了证实双重修饰的t细胞是功能性的，将t细胞与表达同源slc22a16抗原的细胞一起孵育，并通过如实施例3中所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。简而言之，将slc22a16 car与表达slc22a16的aml细胞系以1∶1比率混合；sctr 表达细胞系或阴性细胞系作为对照。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。表达slc22a16 car的双重修饰的t细胞增殖并响应于单独slc22a16抗原而产生了效应细胞因子。
[1172]
接下来，将双重修饰的t细胞与表达同源slc22a16抗原的细胞和表达同源sctr抗原的细胞一起共孵育。通过如以上所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。仅表达同源slc22a16抗原的细胞被杀伤，而仅表达sctr抗原的细胞未被杀伤。
[1173]
还如实施例4中所述在体内表征了双重修饰的slc22a16和sctr car t细胞。与未处理的小鼠相比，在处理的小鼠中，输注slc22a16和sctr car t细胞减少了异种移植的肿瘤细胞负担和生长。
[1174]
实施例12：表达piezo1嵌合抗原受体和kcnq2嵌合抑制性受体的t细胞
[1175]
对t细胞进行了基因修饰以表达识别aml抗原piezo1的car和识别非aml抗原kcnq2的抑制性car。为了证实双重修饰的t细胞是功能性的，将t细胞与表达同源piezo16抗原的细胞一起孵育，并通过如实施例3中所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。简
而言之，将piezo1 car与表达piezo1的aml细胞系以1∶1比率混合；kcnq2 表达细胞系或阴性细胞系作为对照。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。表达piezo1 car的双重修饰的t细胞增殖并响应于单独piezo1抗原而产生了效应细胞因子。
[1176]
接下来，将双重修饰的t细胞与表达同源piezo1抗原的细胞和表达同源kcnq2抗原的细胞一起共孵育。通过如以上所述的杀伤和细胞因子产生测定来表征t细胞激活。仅表达同源piezo1抗原的细胞被杀伤，而仅表达kcnq2抗原的细胞未被杀伤。
[1177]
还如实施例4中所述在体内表征了双重修饰的piezo1和kcnq2 car t细胞。与未处理的小鼠相比，在处理的小鼠中，输注piezo1和kcnq2 car t细胞减少了异种移植的肿瘤细胞负担和生长。
[1178]
实施例13：表达il3ra嵌合抗原受体和perp嵌合抑制性受体的t细胞
[1179]
对t细胞进行了基因修饰以表达识别aml抗原il3ra的car和识别非aml抗原perp的抑制性car。为了证实双重修饰的t细胞是功能性的，将t细胞与表达同源il3ra抗原的细胞一起孵育，并通过如实施例3中所述的杀伤和细胞因子产生分析来表征t细胞激活。简而言之，将il3ra car与表达il3ra的aml细胞系以1∶1比率混合；perp 表达细胞系或阴性细胞系作为对照。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。表达il3ra car的双重修饰的t细胞增殖并响应于单独il3ra抗原而产生了效应细胞因子。
[1180]
接下来，将双重修饰的t细胞与表达同源il3ra抗原的细胞和表达同源perp抗原的细胞一起共孵育。通过如以上所述的杀伤和细胞因子产生分析来表征t细胞激活。仅表达同源il3ra抗原的细胞被杀伤，而仅表达perp抗原的细胞未被杀伤。
[1181]
还如实施例4中所述在体内表征了双重修饰的il3ra和perp car t细胞。与未处理的小鼠相比，在处理的小鼠中，输注il3ra和perp car t细胞减少了异种移植的肿瘤细胞负担和生长。
[1182]
实施例14：aml细胞中的flt3、cd33和clec12a表达
[1183]
材料和方法
[1184]
生物信息分析鉴定了flt3、cd33和clec12a高度表达于aml中。通过从ncbi geo下载并正规化超过1100名aml患者来源的健康造血细胞样品来构建微阵列数据库。使用这个数据库，选择性地鉴定了aml细胞中与健康造血细胞相比具有高转录表达的基因。
[1185]
使用流式细胞术分析aml细胞的细胞表面上的flt3、cd33和clec12a蛋白水平证实了生物信息表达结果。在冰上将冷冻保存的aml患者来源的髓单核细胞(bmmc)、外周血单核细胞(pbmc)以及健康的bmmc和pbmc(作为对照)解冻，然后用识别人flt3、cd33和clec12a蛋白的抗体染色。洗涤细胞，染色以区分活/死细胞，并且使用cytoflex流式细胞仪和flowjo软件进行分析。
[1186]
结果
[1187]
与健康的造血细胞相比，flt3、cd33和clec12a高度表达于aml患者样品中。图39示出了含有超过1100个健康样品和aml患者样品的基于微阵列的基因表达数据库的热图。细胞群体按从上到下的顺序为：aml-5/7(q)、aml-9q、aml 8、aml abn(3q)、成aml细胞、aml bmmc nk、aml复合物、aml flt3itd mut、aml itd(16)、aml inv(16)/t(16；16)、aml lpc(白
血病祖细胞)、aml lsc(白血病干细胞)、aml mds-7(q)、aml mds-y、aml mds复合物、aml nk、aml pbmc nk、aml t(11q23)、aml t(15；17)、aml t(6；9)、aml t(8；21)、b细胞、b初始细胞、杆状核细胞、cd4 t细胞、cd8 t细胞、cd8 t中央细胞、cd8 t效应细胞、cd8 t初始细胞、cmp(普通髓祖细胞)、早期pm(早期前髓细胞)、成红血球细胞、gmp(粒细胞巨噬细胞祖细胞)、h ub(健康脐带血)、h wbm(健康全骨髓)、hsc(造血干细胞)、晚期pm(晚期前髓细胞)、lmpp(淋巴预处理多能祖细胞)、mep(巨核细胞红细胞祖细胞)、mm(后髓细胞)、单核细胞、mpp(多能祖细胞)、my(骨髓细胞)、嗜中性粒细胞、pm(前髓细胞)、pmn(多形核细胞)、前b细胞、祖b细胞。
[1188]
指定初级细胞和细胞系中flt3、cd33和clec12a的平均正规化表达(log2表达标度)也示于表4中。括号中的数字表明每组的样品数。
[1189]
[1190]
[1191][1192]
对4个代表性aml患者髓单核细胞(bmmc)样品的流式细胞术分析示出了大多数成aml细胞表达flt3和/或cd33蛋白(数据未示出)。因此，flt3“or”cd33逻辑闸选car可以广泛靶向成aml细胞群体。对4个代表性aml患者髓单核细胞(bmmc)样品的流式细胞术分析示出了大多数成aml细胞表达flt3和/或clec12a蛋白(数据未示出)。因此，flt3“or”clec12a逻辑闸选car可以广泛靶向成aml细胞群体。对2个代表性aml患者髓单核细胞(bmmc)样品的流式细胞术分析示出了大多数aml白血病干细胞(lsc)增浓群体表达flt3或flt3和cd33蛋白。因此，flt3“or”cd33逻辑闸选car靶标可以靶向aml lsc增浓群体。
[1193]
实施例15：flt3 car t细胞的体外表征
[1194]
材料和方法
[1195]
细胞表面表达
[1196]
通过流式细胞术测定flt3在molm-13、thp-1和sem细胞中的细胞表面表达。用人flt3抗体(与pe-cy7缀合，克隆：bv10a4h2；biolegend)对细胞进行染色。使用同型对照作为背景抗体染色的阴性对照。测定了阴性群体与flt3 群体之间的比率，证实了molm-13、thp-1和sem皆稳定flt3受体。
[1197]
t细胞测定
[1198]
对来自供体1的t细胞进行基因修饰以表达具有三个不同flt3 scfv多肽的car。所用的flt3 scfv是ml0006、nc7(sb00819)和d4-3(sb00816)。car具有cd8信号序列、cd8铰链、cd8跨膜域、4-1bb共刺激域和cd3ζ信号传导域。各自还在c末端上具有yfp标签。
[1199]
从pbmc分离初级t细胞并冷冻。将t细胞解冻并且用人t激活蛋白cd3/cd28 dynabeads激活，并且在含il-2的cts optmizer t细胞扩增培养基中培养过夜。接下来，用含有所选car载体的car慢病毒转导t细胞。通过抗体染色和流式细胞术评估了car表达。在转导之后第9天，共培养t细胞和靶细胞以进行细胞毒性测定(et比率：1∶1，96孔板，200ul总培养基体积)。用celltrace紫染料对靶细胞进行染色以便与t细胞区分。
[1200]
对于细胞因子产生测定，在共培养5或18小时之后收集上清液，并存储在-80度下以用于luminex测定。
[1201]
对于细胞毒性测定，在孵育18至20小时之后收集细胞，并且用碘化丙啶细胞生存力染料进行染色以区分活/死的靶细胞。通过流式细胞术评估了细胞毒性并且通过flowjo分析了数据。将细胞毒性活性相对于无病毒t细胞对照组进行正规化。在某些情况下，还用k562细胞毒性对照组对数据进行正规化。
[1202]
产生的d4-3(sb00816)和nc7(sb00819)flt3 car的蛋白质和核苷酸序列示于表5中。
[1203]
[1204]
[1205]
[1206][1207]
评估了flt3 car t细胞的体外杀伤活性。将具有nc7或d4-3 flt3 scfv的flt3 car与molm-13、thp-1或sem细胞按1∶1比率混合。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。通过流式细胞术评估了杀伤效率。通过将对flt3阴性k562细胞系的杀伤正规化来计算最终杀伤效率。还进行了剂量反应测定。将nc7flt3 car与molm-13细胞以增加的效应细胞:靶细胞比率(1∶9、1∶3、1∶1、3∶1和9∶1 e∶t比率)混合，并且如先前所述通过流式细胞术评估了杀伤效率百分比。
[1208]
评估了flt3 car t细胞的体外细胞因子产生。将所有三个flt3 car(ml006、nc7和d4-3)分别以1∶1比率与aml细胞系moml-13、molm-14或eol 1混合。将t细胞和细胞系共培养18小时，并收集上清液以供使用luminex多路测定进行细胞因子定量。在所有情况下，都将细胞因子水平与未工程改造的t细胞阴性对照物的水平相比较。
[1209]
结果
[1210]
nc7(sb00819)和d4-3(sb00816)flt3 car t细胞对人白血病细胞系molm-13、thp-1和sem示出了有效的细胞毒性活性。图40a示出了显示白血病细胞系中的flt3蛋白表达(x轴)的流式细胞术直方图。两种flt3 car t细胞杀伤了moml-13和thp-1人白血病细胞(e∶t比率1∶1)以及表达flt3的sem细胞(图40b)。
[1211]
图40c示出了molm-13 aml细胞的剂量依赖性flt3 car t细胞杀伤。当flt3 t细胞(e，效应细胞)的比率与molm-13细胞(t，靶细胞)相比增加时，杀伤百分比增加。因此，flt3 car t细胞对人白血病细胞示出了有效的体外杀伤活性。
[1212]
另外，当与不同的表达flt3的aml细胞系一起孵育时，三种flt3 car t细胞中有两种分泌细胞因子。当与molm-14细胞(图41a)、molm-13细胞(图41b)和eol 1细胞(图41c)一起孵育时，nc7 flt3 car和d4-3 flt3 car都分泌tnfα、ifn-γ和il-2。因此，flt3 car t细胞对各种人aml肿瘤细胞系示出了有效的反应性。
[1213]
实施例16：cd33 car t细胞的体外表征
[1214]
材料和方法
[1215]
细胞表面表达
[1216]
使用流式细胞术证实了molm-13、mv4-11和thp-1细胞中的cd33受体表达。使用同型对照作为背景抗体染色的阴性对照，并且用人cd33抗体(与bv421结合，克隆：wm53；biolegend)对细胞进行染色，并测定了阴性群体与cd33 群体之间的比率。
[1217]
t细胞分析
[1218]
对来自供体1的t细胞进行基因修饰以表达具有两个不同cd33 scfv多肽的car。所用的cd33 scfv来源于hu195(林妥珠单抗)和mylo(吉妥珠单抗)cd33抗体。car具有igk信号序列、flag标签、cd28铰链、cd28跨膜域、cd28细胞内共刺激域和cd3ζ信号传导域。产生的hu195和mylo cd33 car的蛋白质和核苷酸序列示于表6中。
[1219]
[1220]
[1221][1222]
评估了cd33 car t细胞的体外杀伤活性。将具有hu195(sb01052)或mylo(sb01056)cd33 scfv的cd33 car与molm-13、mv4-11或thp-1细胞以1∶1比率混合。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。使用未修饰的t细胞作为阴性对照。还对molm-13和mv4-11细胞系中的cd33 car进行剂量反应测定。将cd33 car与molm-13或mv4-11细胞以增加的效应细胞:靶细胞比率(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1 e∶t比率)混合，并且如先前所述通过流式细胞术评估了杀伤效率百分比。通过将对cd33阴性k562细胞系的杀伤正规化来计算最终杀伤效率。
[1223]
评估了cd33 car t细胞的体外细胞因子产生。将两个cd33 car分别以1∶1比率与aml细胞系moml-13、molm-14或eol 1混合。将t细胞和细胞系共培养18小时，并收集上清液以供使用luminex多路测定进行细胞因子定量。在所有情况下，将细胞因子水平与未工程改造的t细胞阴性对照的水平相比较。
[1224]
结果
[1225]
cd33 car t细胞在体外对多个人急性髓性白血病(aml)细胞系示出了有效的细胞
毒性活性。图42a示出了显示aml细胞系molm-13、mv4-11和thp-1中的cd33蛋白表达的细胞表面表达流式细胞术直方图。图42b示出了两种不同cd33 car t细胞在体外共培养细胞毒性测定中杀伤了人aml细胞。另外，两种cd33抗体皆以剂量依赖性方式诱导细胞毒性(图42c)。体外细胞毒性测定示出了在较高效应细胞：靶细胞(e：t)比率下，molm-13和mv4-11aml细胞系的cd33 car t细胞杀伤增加。
[1226]
cd33 car t细胞对多个aml肿瘤细胞系示出了有效的反应性。cd33 car t细胞在与人急性髓性白血病(aml)细胞系一起共培养时示出了有效的细胞因子分泌(il-2、ifn-γ、tnf-α)，如通过luminex测定所检测。图43a示出了两种不同的cd33 car t细胞(sb01052和sb01056)在与molm-13细胞一起孵育之后分泌il-2、ifn-γ和tnf-α。图43b示出了两种不同的cd33 car t细胞(sb01052和sb01056)在与mv4-11aml细胞一起孵育之后分泌il-2、ifn-γ和tnf-α。图43c示出了两种不同的cd33 car t细胞(sb01052和sb01056)在与thp-1aml细胞一起孵育之后分泌il-2、ifn-γ和tnf-α。
[1227]
实施例17：clec12a car t细胞的体外表征
[1228]
材料和方法
[1229]
细胞表面表达
[1230]
通过流式细胞术使用pe抗人cd371(clec12a)抗体(biolegend，克隆50c1)测定clec12a在各个aml、白血病或淋巴瘤细胞系(u937、thp-1、hl-60、my-14、molm-14、molm-13、nalm6、raji、k562和sem)中的表达，并且测定阴性群体与clec12a 群体之间的比率。
[1231]
t细胞测定
[1232]
对来自供体1的t细胞进行基因修饰以表达具有三个不同clec12a scfv多肽的car。所用的clec12a scfv是克隆357、378和161。car具有cd8信号序列(cd8ss)、cd8铰链、cd8跨膜域、细胞内cd3ζ信号传导域和4-1bb共刺激域(4-1bb co-stim)。yfp标签融合至cd3ζ信号传导域的c末端。产生的clec12a car的蛋白质和核苷酸序列示于表7中。
[1233]
[1234]
[1235]
[1236]
[1237]
[1238][1239]
评估了clec12a car t细胞的体外杀伤活性。将clec12acar与u937、thp-1、hl-60或molm-14细胞以1∶1比率混合。将t细胞和细胞系共培养18小时，然后用活/死染色剂染色。通过流式细胞术评估了杀伤效率。使用表达sb00819的flt3 car t细胞作为car t细胞细胞毒性和细胞因子产生的比较基准。通过使用下式将杀伤相对于未转导的对照t细胞样品和未工程改造的k562基础杀伤对照进行正规化来计算最终杀伤效率：杀伤％＝(1-比率ne)*100％；比率t:c＝活靶细胞％/活对照细胞％；比率nlv＝无慢病毒样品的靶标/对照；比率ne(正规化实验)＝比率tc/比率nlv。
[1240]
评估了clec12a car t细胞的体外细胞因子产生。将所有clec12a car分别与aml细胞系u937、thp-1、hl-60或molm-14以1∶1比率混合。将t细胞和细胞系共培养18小时，并收集上清液以供使用luminex多路测定进行il-2细胞因子定量。在所有情况下，都将细胞因子水平与未工程改造的t细胞阴性对照的水平相比较。
[1241]
结果
[1242]
在aml、all、淋巴瘤和白血病细胞系u937、thp-1、hl-60、my-14、molm-14、molm-13、nalm6、raji、k562和sem上表达clec12a。图44示出了所有测试细胞系中的clec12a表达的流式细胞术图。各图上指明了各个细胞群体中clec12a染色的细胞与未染色的细胞的比率。
[1243]
sb01261具有来源于357clec12a抗体克隆的抗clec12ascfv结构域。sb01262具有来源于378clec12a抗体克隆的抗clec12a scfv结构域。sb01263具有来源于161clec12a抗体克隆的抗clec12a scfv结构域。
[1244]
图45a示出了aml细胞系u937、thp-1、hl-60和molm-14中的clec12a蛋白表达的细
胞表面表达流式细胞术直方图。图45b示出了三种不同的clec12a car t细胞在四个不同的aml细胞系u937、thp-1、hl-60或molm-14中的体外共培养细胞毒性测定中杀伤了人aml细胞。因此，clec12a car t细胞在体外对多个人急性髓性白血病(aml)细胞系示出了有效的细胞毒性活性。
[1245]
clec12a car t细胞在与人急性髓性白血病(aml)细胞系一起共培养时示出了有效的il-2细胞因子分泌，如通过luminex测定所检测。图45c示出了三种不同的clec12a car t细胞与u937、thp-1、hl-60或molm-14细胞一起孵育之后分泌il-2。因此，clec12a car t细胞对多种aml肿瘤细胞系示出了有效的反应性。
[1246]
还产生了使用以flag标签替代yfp标签的378来源scfv的额外clec12a car(sb01161)，并表征细胞毒性和细胞因子分泌活性。使用具有nc-7scfv和yfp标签的flt3 car(sb00819)以及具有hu195 scfv和flag标签的cd33 car(sb01052)作为对照。针对具有低clec12a表达的aml细胞系、molm-13和mv4-11以及具有高clec12a表达的aml细胞系molm-14、u937、thp-1和hl-60测试所有六个car(四个clec12a car、flt3 car和cd33car)。
[1247]
clec12a car在与具有低clec12a表达的细胞系molm-13(图46a)和mv4-11(图46b)以及具有高clec12a表达的细胞系molm-14(图45c)、u937(图45d)、thp-1(图46e)和hl-60(图46f)一起孵育之后示出了细胞毒性和il-2产生。在各个图中，数字是指图例中指明的样品。
[1248]
实施例18：具有替代共刺激域或分泌信号肽的clec12a car t细胞的体外表征
[1249]
材料和方法
[1250]
如先前所述和表6中所示用cd28共刺激域替换4-1bb共刺激域产生了三种clec12a car。另外，用igk信号序列肽替代cd8信号序列肽产生了三种clec12a car。具有不同共刺激域或信号序列肽的九种car的图示于图47中。具有cd8信号序列的car包括c末端的yfp标签。具有igk信号序列的car包括信号序列与scfv结构域之间的flag标签。
[1251]
用先前产生的三种clec12a car和六种新clec12a car对细胞进行转导。在用flag抗体染色之后通过流式细胞术(对于igk信号序列car)或通过yfp表达信号(对于cd8信号序列car)测定转导效率。使用flt3 car(sb00819)和cd33 car(sb01052)作为对照。
[1252]
如先前在实施例17中所述，测定与hl-60、molm14、mv4-11、molm-13和k562细胞一起孵育之后的t细胞细胞毒性和细胞因子产生。
[1253]
产生的六种额外clec12a car的蛋白质和核苷酸序列示于表8中。
[1254]
[1255]
[1256]
[1257]
[1258]
[1259]
[1260]
[1261]
[1262]
[1263][1264]
结果
[1265]
如图48a中所示，所有九种clec12a car都有效地转导至t细胞中。图48b示出了各种car的平均荧光强度(mfi)。
[1266]
在测试的各个细胞系中，clec12a-cd28 car t细胞与4-1bb型式相比示出了更高细胞毒性和细胞因子产生(图49、图50、图51和图52)。在各种情况下，以短缩名称来提起car构建体，例如sb01561表示为1561。具有cd28共刺激域的clec12a car(sb01561、sb01562、sb01563)与具有41bb共刺激域的car(sb01261、sb01262、sb01263)相比对多种aml和白血病细胞系示出了更佳的细胞毒性和增加的细胞因子分泌(il-2、ifng和tnfa)。另外，iggk信号肽与cd8构建体(sb011638、sb01169、sb01170)相比引起类似或更佳的细胞毒性和细胞因子产生。图49示出了指定clec12a car t细胞对hl-60、molm14、mv4-11和molm-13细胞的细胞毒性，如在与所述car t细胞一起孵育之后的细胞系杀伤百分比所指示。图50示出了指定clec12a car t细胞在与hl-60、molm14、mv4-11、molm-13和k562细胞一起孵育之后的il-2产生。图51示出了指定clec12a car t细胞在与hl-60、molm14、mv4-11、molm-13和k562细胞一起孵育之后的ifn-γ产生。图52示出了指定clec12a car t细胞在与hl-60、molm14、mv4-11、molm-13和k562细胞一起孵育之后的tnf-α产生。
[1267]
实施例19：抗flt3和抗cd33 car t细胞的体内表征
[1268]
材料和方法
[1269]
car结构
[1270]
flt3 car(sb00819)具有cd8信号序列、flt3 scfv、cd8铰链、cd8跨膜域、4-1bb共刺激域、cd3ζ信号传导域和yfp标签。flt3 scfv来源于flt3抗体nc7。cd33 car(sb01052)具有iggk信号序列、flag标签、cd33 scfv、cd28铰链、cd28跨膜域、cd28共刺激域和cd3ζ信号传导域。cd33 scfv来源于cd33抗体hu195(林妥珠单抗；hu195；sgn-33；人源化抗cd33抗体)。
[1271]
体内单剂量实验方案：
[1272]
人aml细胞系molm-13由于其稳定的flt3和cd33表面蛋白表达而被选择为体内aml
细胞靶标以测试flt3和cd33car t细胞。对人aml细胞系molm-13进行工程改造以表达萤火虫荧光素酶(fluc或luc)报告基因(工程改造的细胞表示为molm-13-luc)。在这些细胞注射至nsg免疫受损小鼠中之后，通过对小鼠注射fluc底物(例如荧光素)并使用生物发光成像系统(amy ht，spectral instruments imaging)来监测molm-13-luc体内肿瘤植入和生长，以便对由molm-13细胞内的荧光素酶产生的光的量进行定量。
[1273]
在第0天注射(静脉内)1.0
×
106个molm-13-luc aml细胞。molm-13-luc注射后，在第5天或第8天或第5天 第12天(每天10
×
106个细胞/小鼠)注射(静脉内)10
×
106个car t细胞/小鼠。每周两次评估molm-13-luc生物发光和小鼠体重，持续至多4周。评估总存活率，持续至多4周。
[1274]
给药方案和car t细胞示于以下表9中。
[1275][1276]
剂量递增材料和方法
[1277]
对于体内剂量递增实验，在第0天对nsg小鼠注射(静脉内)人molm-13-luc aml细胞(如以上所述)。在第5天，对小鼠注射(静脉内)不同浓度的flt3 car t细胞或cd33 car t细胞，单独或组合：9
×
106或18
×
106个flt3 car t细胞；0.625
×
106、1.25
×
106、2.5
×
106、5
×
106或10
×
106个cd33 car t细胞；或4.5
×
106个flt3 car t细胞与2.5
×
106个cd33 car t细胞、9
×
106个flt3 car t细胞与5
×
106个cd33 car t细胞或18
×
106个flt3 car t细胞与10
×
106个cd33 car t细胞的组合。评估了fluc生物发光、体重和存活率，大约每周两次，持续4周。当达到终点标准时将小鼠处死。使用两个对照组：1.未注射molm-13-luc或t细胞
的小鼠，以及2.注射1.0
×
106个molm-13-luc细胞和10.0
×
106个未工程改造的t细胞的小鼠。
[1278]
结果
[1279]
图53a至图53j提供了在第5天、第8天或第5天和第12天用flt3或cd33car处理后对各个小鼠组中的fluc生物发光信号的定量。图53a示出了第5天用cd33 car t细胞处理的未携带肿瘤的小鼠中的背景fluc生物发光。图53b示出了第5天用flt3 car t细胞处理的未携带肿瘤的小鼠中的背景fluc生物发光。图53c示出了未处理的携带molm-13-luc肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。终点标准是达到第14天并且将小鼠处死。图53d示出了仅用pbs处理的未携带肿瘤的小鼠中的背景fluc生物发光。图53e示出了第5天用flt3 car t细胞处理一次的携带molm-13-luc肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图53f示出了第8天用flt3 car t细胞处理一次的携带molm-13-luc肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。终点标准是达到第14天并且将小鼠处死。图53g示出了在第5天和第12天用flt3 car t细胞处理两次的携带molm-13-luc肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图53h示出了第5天用cd33 car t细胞处理一次的携带molm-13-luc肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图53i示出了第8天用cd33 car t细胞处理一次的携带molm-13-luc肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。终点标准是达到第14天并且将小鼠处死。图53j示出了在第5天和第12天用cd33 car t细胞处理两次的携带molm-13-luc肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。各个处理组中的体内fluc生物发光图像示于图53k中。
[1280]
在第5天或在第5天和第7天用flt3 car t细胞处理的小鼠与用未转导的t细胞处理的小鼠相比示出了更低肿瘤负担并且存活更久。在第5天或在第5天和第7天用cd33 car t细胞处理的小鼠与用未转导的t细胞处理的小鼠相比示出了更低肿瘤负担并且存活更久。因此，当在肿瘤引发后第5天或第5天 第12天注射时，flt3和cd33 car t细胞都对molm-13-luc aml细胞示出了有效的体内功效。
[1281]
car t细胞剂量递增研究结果示于图54中。示出了各个处理组中的体内fluc生物发光图像。在第16天将注射molm-13-luc细胞和未工程改造的t细胞的小鼠处死。在第23天将用9
×
106个flt3 car t细胞处理的小鼠处死。第26天在所述时程结束之前没有其他处理组被处死(图54a)。图54b至图54m提供了各个小鼠组中fluc生物发光信号的定量。图54b示出了未工程改造的t细胞处理的未携带肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54c示出了未工程改造的t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54d示出了用9
×
106个flt3 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54e示出了用18
×
106个flt3 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54f示出了用0.625
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54g示出了用1.25
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54h示出了用2.5
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54i示出了用5
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54j示出了用10
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54k示出了用4.5
×
106个flt3 car t细胞和2.5
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54l示出了用9
×
106个flt3 car t细胞和5
×
106个cd33t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。图54m示出了用18
×
106个flt3 car t细胞和10
×
106个cd33 t细胞处理的携带molm-13肿瘤的小鼠中的fluc生物发光。
[1282]
).用单独或与flt3 car t细胞组合的cd33 car t细胞处理的小鼠示出了molm-13-luc生物发光信号显著降低。因此，flt3和cd33 car t细胞在不同剂量下对molm-13-luc aml细胞示出了有效的体内活性。
[1283]
实施例20：抗clec12a car t细胞的体内表征
[1284]
材料和方法
[1285]
car结构
[1286]
使用来源于357、378和161clec12a抗体的三种clec12a结合蛋白以及cd28(sb01561、sb01562、sb01563)或4-1bb共刺激域(sb01261、sb01262、sb01263)制造六种clec12a car。car也具有cd8信号序列、cd8铰链、cd8跨膜域、cd3ζ信号传导域和yfp标签。clec12a car列于以下表5中。28z是指cd28共刺激域，bbz是指4-1bb共刺激域。使用具有nc7 scfv的flt3 car t细胞和具有hu195 scfv的cd33 car t细胞作为对照。
[1287]
单剂量实验方案：
[1288]
人aml细胞系molm-14由于其稳定的clec12a表面表达而被选择为体内aml细胞靶标以用于测试clec12a car t细胞(参见图44至图45a)。对molm-14aml细胞进行工程改造以表达萤火虫荧光素酶(称为fluc或luc)报告基因(工程改造的细胞表示为molm-14-luc或molm-14-fluc)。在这些细胞注射至nsg免疫受损小鼠中之后，通过对小鼠注射fluc底物(例如荧光素)并使用生物发光成像系统(amy ht，spectral instruments imaging)来监测molm-14-luc体内肿瘤植入和生长，以便对由molm-13细胞内的荧光素酶产生的光的量进行定量。
[1289]
在第0天注射(静脉内)1.0
×
106个molm-14-luc aml细胞。molm-14-luc注射后，在第5天注射(静脉内)10
×
106个car t细胞/小鼠。每周两次评估molm-14-luc生物发光和小鼠体重，持续至多4周。评估了总存活率，持续至多4周。
[1290]
所用的给药方案和car t细胞示于以下表10中。
[1291][1292]
结果
[1293]
体内功效研究结果示于图55a、图55b和图55c中。各个小鼠组的相对肿瘤生物发光被显示为第7天/第5天(图55a)和第11天/第5天(图55b)的比较。molm-14肿瘤细胞生物发光信号(fluc)相对于第5天fluc的倍数变化示于y轴上。因此，从第5天至第7天或第11天的肿瘤生物发光增加被显示为荧光信号增加，而从第5天至第7天或第11天的肿瘤生物发光减少被显示为生物发光信号减少。在第7天和第11天用cd33和flt3 car t细胞处理可以减轻肿瘤负担，具有cd28共刺激域的clec12acar t细胞也是如此(图55a和图55b)。在大部分情况下，具有cd28共刺激域的car在减小肿瘤负担或延长小鼠存活时间方面比具有4-1bb共刺激域的car更有效。具有4-1bb共刺激域的357clec12a car(sb01261)还引起第7天的肿瘤负担与第5天相比降低(图55a)。各个处理组中的体内生物发光图像示于图55c中。
[1294]
因此，具有cd28共刺激域的clec12a car在限制molm-14肿瘤生长方面比具有4-1bbz构象的car更有效。
[1295]
实施例21：体外和体内flt3 car铰链优化
[1296]
材料和方法
[1297]
体外测定
[1298]
为了优化和增加flt3(d4-3)car t细胞活性，对替代铰链进行了体外和体内功能筛检。尝试优化包括铰链区的flt3(d4-3)：合成具有cd8铰链(标准d4-3铰链)的d4-3 flt3 car(标准sb00816)、具有cd8铰链的nc7 flt3 car(稳定car活性的阳性对照)(sb00819)、具
有lngfr(低亲和力神经生长因子受体)铰链的d4-3 flt3 car(sb1076)、具有截短lngfr(tlngfr)铰链的d4-3 flt3 car(sb1077)和具有pdgfr(血小板衍生生长因子受体)铰链的d4-3 flt3 car(sb01078)。具有不同铰链的d4-3 flt3 car的图示于图56a中。
[1299]
在d4-3 flt3 car中还评估了其他铰链。合成具有igg4最小接头(sb01071)、无二硫键的igg4最小接头(sb01072)、具有增强二硫键的igg4最小接头(sb01073)和igg1最小接头(sb01074)的car。还评估了这些car的t细胞细胞毒性以及il2、ifn-γ和tnf-α产生，并且与原始d4-3 car序列以及具有lngfr和pdgfr铰链序列的car相比较。
[1300]
如先前实施例15中所述，测定了与molm14、mv4-11、molm-13和sem细胞一起孵育之后的t细胞细胞毒性和细胞因子产生。
[1301]
产生的flt3 car的蛋白质和核苷酸序列示于表11中。
[1302]
[1303]
[1304]
[1305]
[1306]
[1307]
[1308]
[1309]
[1310]
[1311]
[1312]
[1313]
[1314][1315]
体内测定
[1316]
小鼠材料和方法
[1317]
将表达萤火虫荧光素酶(fluc或luc)的molm-13细胞系用于如实施例19中所述的体内实验。
[1318]
在第0天注射(静脉内)1.0
×
106个molm-13-luc aml细胞。molm-13-luc注射后，在第5天(每天10
×
106个细胞/小鼠)注射(静脉内)10
×
106个car t细胞/小鼠。每周两次评估molm-13-luc生物发光和小鼠体重，持续至多4周。评估了总存活率，持续至多4周。
[1319]
所用的给药方案和car t细胞示于以下表12中。
[1320]
[1321][1322]
结果
[1323]
体外测定
[1324]
当使用lngfr和pdgfr铰链(分别是sb1077和sb1078)时，flt3铰链优化引起flt3 car活性的统计显著增加。在d4-3car中使用lngfr或pdgfr铰链导致与molm-13细胞(图56b)、molm-14细胞(图56c)、mv4-11细胞(图56d)和sem细胞(图56e)一起孵育之后细胞毒性和il-2产生与cd8铰链相比增加。在图56b至图56e中的每一个中，上图示出了各个car与指定细胞系一起孵育之后的细胞毒性，而下图示出了各个car与指定细胞系一起孵育之后的il-2产生。
[1325]
在其他铰链序列的情况下观测到类似的结果。图57a示出了相对于未转导的car t细胞正规化的杀伤百分比。图57b至图57d示出了指定car t细胞与molm-13细胞一起孵育之后的il-2(图57b)、ifn-γ(图57c)和tnf-α(图57d)产生。
[1326]
体外测定
[1327]
用lngfr或pdgfr铰链构建的flt3(d4-3)car示出了car t细胞对molm-13 aml细胞的体内功效与具有cd8铰链的d4-3 flt3 car相比有所增加，如小鼠存活率增加所示(图58a)。图58b示出了体内肿瘤molm-13细胞在用指定car处理后的生物发光。因此，具有lngfr或pdgfr铰链的d4-3 flt3 car在体外和体内aml模型中都比具有cd8铰链的d4-3 flt3 car更有效。
[1328]
实施例22：双顺反子flt3 or cd33 car t细胞的体外表征
[1329]
材料和方法
[1330]
使用cd33 hu195 scfv和flt3 nc7 scfv、sb01658、sb01659、sb01530和sb01266制造四种不同的双顺反子flt3和cd33 car。
[1331]
sb01658car是具有以下结构的cd33“or”flt3双顺反子car：cd8信号序列-flag-cd33(hu195)scfv-cd28铰链-cd28跨膜-cd28共刺激域-cd3ζ刺激域
‑‑
t2a-e2a
‑‑
cd8信号序列-flt3(nc7)scfv-cd8铰链-cd8跨膜-4-1bb共刺激域-cd3ζ信号传导域-yfp。
[1332]
sb01659 car是具有以下结构的cd33“or”flt3双顺反子car：cd8信号序列-flag-cd33(hu195)scfv-cd28铰链-cd28跨膜-cd28共刺激域-cd3ζ刺激域
‑‑
e2a-t2a
‑‑
cd8信号序
列-flt3(nc7)scfv-cd8铰链-cd8跨膜-4-1bb共刺激域-cd3ζ信号传导域-yfp。
[1333]
sb01530 car是具有以下结构的cd33“or”flt3双顺反子car：cd8信号序列-flag-cd33(hu195)scfv-cd28铰链-cd28跨膜-cd28共刺激域-cd3ζ刺激域
‑‑
t2a
‑‑
cd8信号序列-flt3(nc7)scfv-cd8铰链-cd8跨膜-4-1bb共刺激域-cd3ζ信号传导域-yfp。
[1334]
sb01266 car是具有以下结构的cd33“or”flt3双顺反子car：cd8信号序列-flag-cd33(hu195)scfv-cd28铰链-cd28跨膜-cd28共刺激域-cd3ζ刺激域
‑‑
t2a
‑‑
cd8信号序列-flt3(nc7)scfv-cd8铰链-cd8跨膜-4-1bb共刺激域-cd3ζ信号传导域-yfp。sb01530是sb01266的密码子优化型式。
[1335]
产生的双顺反子flt3和cd33 car的蛋白质和核苷酸序列示于表13中。
[1336]
[1337]
[1338]
[1339]
[1340]
[1341]
[1342]
[1343]
[1344]
[1345]
[1346]
[1347]
[1348]
[1349]
[1350][1351]
k562细胞工程改造
[1352]
用具有抗嘌呤霉素基因的表达flt3或cd33的慢病毒对1
×
106个k5672靶细胞进行转导。转导之后72小时使用cytoflex流式细胞仪评估flt3或cd33表达。用4ug/ml嘌呤霉素选择转导的细胞，持续3周。3周嘌呤霉素选择之后，使用流式细胞术测定flt3和cd33表达。在无嘌呤霉素的完全培养基中将工程改造的细胞培养一周。将工程改造的细胞在低温保存培养基中冷冻并存储在液氮中。
[1353]
利用工程改造的k526细胞的双顺反子car t细胞测定
[1354]
如先前实施例15至实施例17中所述，测定与mv4-11、molm-13和sem细胞一起孵育之后的t细胞细胞毒性和细胞因子产生。
[1355]
单顺反子flt3 car具有nc7 scfv和4-1bb共刺激域(sb00819)。单顺反子cd33 car具有hu195 scfv与cd28共刺激域(sb01052)。双顺反子flt3和cd33 car是如以上所述的sb01659。
[1356]
结果
[1357]
sb01659双顺反子car与sb01266双顺反子car相比在t细胞中具有更佳表达(图59a)。sb01659双顺反子car在与molm-13细胞(图59b)、mv4-11细胞(图59c)和sem细胞(图59d)一起孵育之后与cd33单顺反子car(sb01052)和其他双顺反子car(sb01658、sb01266和sb01530，图59b、59c和59d)相比也示出了优越的细胞毒性和il-2产生。在各种情况下，以短缩名称提起car构建体，例如sb01659表示为1659。not表明样品未添加t细胞，nv表明样品含未转导的t细胞。sb01266h和sb01266g是sb01266 car的两种单独制剂。
[1358]
对k562细胞进行了工程改造以过度表达flt3或cd33。既不表达flt3又不表达cd33的未工程改造的k562细胞示于图60a中。表达flt3的k562细胞示于图60b中。表达cd33的k562细胞示于图60c中。
[1359]
cd33“or”flt3双顺反子car sb01659对工程改造的k562细胞的效能胜过了cd33和flt3单顺反子car(图61)。上排诸图示出了在flt 、cd33-k562细胞中的t细胞细胞毒性、il-2产生、ifn-γ、tnf-α。中排诸图示出了flt-、cd33 k562细胞中的t细胞细胞毒性、il-2产生、ifn-γ、tnf-α。下排诸图示出了flt3 、cd33-和flt-、cd33 k562细胞的1∶1混合物中的t细胞细胞毒性、il-2产生、ifn-γ、tnf-α。阴性对照(-)是未转导的t细胞。在各种条件下，flt3/cd33双顺反子car t细胞与单顺反子flt3或cd33 car t细胞相比示出了更佳的激活和刺激。
[1360]
cd33“or”flt3双顺反子car sb01659对白血病细胞系的效能胜过了cd33和flt3单顺反子car(图62)。上排诸图示出了在与具有高flt3表达和高cd33表达的molm-13细胞一起
孵育之后的t细胞细胞毒性、il-2产生、ifn-γ、tnf-α。中排诸图示出了在与具有较低flt3表达和较高cd33表达的mv4-11细胞一起孵育之后的t细胞细胞毒性、il-2产生、ifn-γ、tnf-α。下排诸图示出了在与具有较高flt3表达和较低cd33表达的sem细胞一起孵育之后的t细胞细胞毒性、il-2产生、ifn-γ、tnf-α。阴性对照(-)是未转导的t细胞。在大部分细胞系中，flt3/cd33双顺反子car t细胞与单顺反子flt3或cd33 car t细胞相比示出了更佳的激活和刺激，但sem细胞系中的细胞毒性和il-2产生除外。然而，双顺反子flt3/cd33 car t细胞仍然在sem细胞中诱导了显著的细胞毒性(大于50％而且大于单顺反子cd33 car t细胞)并且在sem细胞中诱导了优越的ifn-γ和tnf-α产生。
[1361]
实施例23：二价flt3 car car t细胞的体外表征
[1362]
材料和方法
[1363]
合成了两种二价flt3 car，它们具有环scfv(sb01861)或串联scfv(sb01862)与nc7和d4-3 scfv。环scfv的结构示于图63a中。串联scfv的结构示于图63b中。
[1364]
用作对照物的单价flt3 car是具有nc7 scfv的sb00819。
[1365]
如先前实施例15至实施例17中所述测定了与mv4-11和sem细胞一起孵育之后的t细胞细胞毒性和细胞因子产生。
[1366]
产生的flt3 car的蛋白质和核苷酸序列示于表14中。
[1367]
[1368]
[1369]
[1370]
[1371]
[1372][1373]
结果
[1374]
新颖二价car设计显著改善了对低靶抗原密度细胞的杀伤。flt3二价car sb01861和sb01862以比单价flt3 car sb00819高2至2.5倍的效率杀伤了mv4-11细胞(低flt3表达)(图63c上图)。
[1375]
另外，flt3二价car以与单价flt3 car类似的效率杀伤sem细胞(高flt3表达)(图63c下图)。因此，与单价car相比，二价car设计结构可用于构建更有效的car回路，有更大能力响应于低靶标密度。
[1376]
实施例24：与cd28共刺激域一起使用的铰链和跨膜域的优化
[1377]
材料和方法
[1378]
合成具有hu195 scfv以及cd8铰链和跨膜序列的cd33 car。car还包含cd28共刺激域和cd3ζ刺激域。
[1379]
如先前实施例15至实施例17中所述，测定与mv4-11、molm-13和k562 cd33表达细胞一起孵育之后的t细胞细胞毒性和细胞因子产生。
[1380]
cd8铰链和跨膜蛋白和核苷酸序列示于表15中。还提供了car构建体sb01364、sb01373和sb01374的蛋白质和核苷酸序列。
[1381]
[1382]
[1383]
[1384]
[1385]
[1386][1387]
结果
[1388]
与包含cd28共刺激域的car组合测试了cd8铰链和跨膜结构域。使用cd8铰链和跨膜序列代替先前car构建体中所用的cd28铰链和跨膜域。car构建体sb01364、sb01372、sb01373和sb01374在t细胞中示出了高表达(数据未示出)。sb01364具有cd8铰链序列1(seq id no：206)、cd8跨膜序列1(seq id no：209)和gmcsf信号序列；sb01372具有cd8铰链序列2(seq id no：207)、cd8跨膜序列2(seq id no：210)和cd8信号序列；sb01373具有cd8铰链序列2(seq id no：207)、cd8跨膜序列2(seq id no：210)和gmcsf信号序列；sb01374具有cd8铰链序列1(seq id no：206)、cd8跨膜序列2(seq id no：210)和cd8信号序列。
[1389]
图64a示出了指定car构建体与molm-13细胞一起孵育之后的细胞毒性以及il-2、ifn-γ和tnf-α分泌。图64b示出了指定car构建体与mv4-11细胞一起孵育之后的细胞毒性以及il-2、ifn-γ和tnf-α分泌。图64a示出了在与k563 cd33表达细胞一起孵育之后指定car构建体的细胞毒性以及il-2、ifn-γ和tnf-α分泌。使用cd33 car sb01052作为对照。使用未转导的t细胞作为阴性对照(nv)。在各种情况下，以短缩名称提起car构建体，例如sb01372表示为1372。
[1390]
杀伤和细胞因子测定(图64a至图64c)示出了成功地使用一起用于sb01373中的cd8铰链2和跨膜2代替car中的cd28铰链和cd28跨膜构象，并保留了car活性。
[1391]
实施例25：hsc上的抑制性嵌合受体靶标的鉴定
[1392]
使用实施例1和实施例2中所述的生物信息筛检鉴定了造血干细胞上表达的其他not靶标。简而言之，通过根据go和人蛋白质图谱注释为“细胞表面”或“膜”基因鉴定了7，860个hsc膜相关基因。通过微阵列数据在健康的hsc和aml细胞中测定所鉴定的hsc蛋白的表达，并且鉴定了115个基因。然后通过rna-seq证实了已被证实高度表达于hsc上的基因低表达于aml细胞中，从而15个基因在hsc上具有高表达而在aml细胞上具有低表达。针对hsc中的蛋白质表达证实了所得命中。鉴定了10个具有证实的膜表达的基因并示于表16中。
profiling.plos one 7(7)：e40321.doi.org/10.1371/journal.pone.0040321)。预计17个基因在手动处理之后具有细胞表面表达。证实了9个基因在hsc中具有高表达并且在aml细胞中具有低表达。九个其他基因示于表17中。
[1399][1400]
实施例26：内皮安全性靶抗原的鉴定
[1401]
使用实施例1和实施例2中所述的生物信息筛检对u133血液样品微阵列数据集鉴定了内皮安全性靶标。u133数据集包括39个内皮细胞样品(10新鲜样品和29个来自培养的内皮细胞)和876个aml样品。简而言之，鉴定了具有go注释或affy注释的表面表达的基因(9885个)。去除了人蛋白质图谱中有强大证据证明非表面或膜定位的基因，剩余了7860个基因。评估了这些基因在内皮样品中的表达与aml样品相比更高，得到了32个基因。
[1402]
接下来，在人蛋白质图谱中证实了各个基因的蛋白质表达，在genecards中证实了表面表达，并且在uniprot中证实了细胞外域(ecd)的大小，余下了16个潜在靶基因。
[1403]
表18提供了内皮细胞中的内皮安全性靶抗原清单及其与aml细胞相比的倍数变化(log2表达标度)。
[1404]
[1405][1406]
接下来，在内皮细胞上评估先前鉴定的hsc not靶抗原的表达。此类双重靶标可用于保护hsc和内皮细胞免受aml靶向car影响。评估了实施例25中鉴定的19个基因的内皮表达。鉴定了12个具有双重表达的基因：emcn、pcdh9、jam2、cachd1、cyyr1、abcb1、adgrg6、atp9a、cdcp1、slc16a14、tmem136和tmem200a。因此，鉴定的内皮靶标可用于保护健康内皮细胞免受可能对内皮细胞具有中靶脱组织毒性的car免疫细胞影响。另外，鉴定的十二种双重内皮和hsc靶抗原可用作单个“not”靶抗原，以同时保护健康内皮细胞和造血干细胞(hsc)免受可能对健康hsc或内皮细胞具有中靶脱组织毒性的car免疫细胞影响。
[1407]
表18至表20中提供了鉴定的aml、造血和内皮靶标在各个细胞系和样品组织中的基因表达定量。表18示出了aml样品中的基因表达。表19示出了健康造血样品中的基因表达。表20示出了内皮细胞中的基因表达。
[1408]
caln1、il12rb2、abca13、cdh26、il18r1、slc8a3、tmem163高度表达于健康造血细胞中，并且因此可用作hsc安全性not靶标。adgrl4、art4、atp8b1、bace2、calcrl、cntnap3、lifr、met、mpzl2、nckap1、plscr4、ptprb、tmem47和wls高度表达于内皮细胞中，并且因此可用作内皮安全性not靶标。abcb1、adgrg6、atp9a、cachd1、cdcp1、cyyr1、emcn、jam2、pcdh9、slc16a14、tmem136和tmem200a高度表达于健康造血细胞和内皮细胞中，并且因此可用作hsc和内皮安全性not靶标。
[1409]
表19.aml样品中的基因表达
[1410][1411]
[1412]
[1413]
[1414][1415]
表21.内皮细胞中的基因表达
[1416]
[1417][1418]
实施例27：单价和双顺反子ftl3和cd33 car自然杀伤(nk)细胞的表征
[1419]
材料和方法
[1420]
nk细胞中的car表达
[1421]
从pbmc分离了初级nk细胞并冷冻。将冷冻的nk细胞解冻并且用cd335(nkp46)-生物素、cd2-生物素和macs抗生物素macsibead颗粒激活。使激活的nk细胞在含il-2的nk macs培养基中扩增并且在第15天冷冻。当准备就绪时，将扩增的nk细胞解冻，并且在完全培养基中静置过夜。用所选car慢病毒对nk细胞进行转导，以产生flt3car(sb00819)nk细胞、cd33 car(sb01052)nk细胞或双顺反子flt3和cd33 car(sb01659)nk细胞。在转染之后第6天评估了car表达。
[1422]
nk细胞细胞毒性测定
[1423]
如实施例15至实施例18中所述，使用sem细胞和1∶2et比进行了nk细胞细胞毒性测定和细胞因子产生测定。将car nk细胞与sem靶细胞一起孵育20小时，并且收集细胞上清液以用于细胞因子产生。通过如先前所述的流式细胞术和luminex测定来评估细胞毒性和细胞因子产生。将细胞毒性百分比相对于仅靶细胞对照组进行正规化。使用表达egfp的未工程改造的nk细胞作为阴性对照。
[1424]
如实施例15至实施例18中所述，使用pl-21aml细胞进行了nk细胞细胞毒性测定。已知pl-21aml细胞表达flt3和cd33(reiter k等，leukemia(2018)32，313-322证明了pl-21细胞中的flt3表达，而keamey cj等，oncoimmunology，5：8，e1196308，doi：10.1080/2162402x.2016.1196308证明了pl-21细胞中的cd33表达，二者都以引用的方式并入)。
[1425]
结果
[1426]
在慢病毒转导之后第6天，nk细胞示出了高达45％car表达。flt3 car nk细胞就flt3 car而言为28.8％阳性(数据未示出)。cd33 car nk细胞就cd33 car而言为25.8％阳性(数据未示出)。双顺反子flt3/cd33 car nk细胞就flt3 car而言为3.9％阳性并且就cd33而言为26.9％阳性(数据未示出)。
[1427]
car nk细胞对sem细胞示出了显著的细胞毒性和细胞因子产生。flt3 car nk细胞(sb00819)、cd33 car nk细胞(sb01052)和flt3 or cd33双顺反子car nk细胞(sb01659)与egfp阴性对照nk细胞相比示出了统计学上显著的sem细胞杀伤活性(图66a)。在与sem细胞
共培养之后，flt3 car nk细胞与egfp阴性对照nk细胞相比示出了更大程度的ifn-γ(图66b)和tnf-α(图66c)细胞因子分泌。
[1428]
flt3、cd33和flt3/cd33 car nk细胞还对pl-21细胞示出了显著的细胞毒性。cd33 car nk细胞(sb01052)和flt3 or cd33双顺反子car nk细胞(sb01659)与egfp对照nk细胞相比对pl-21aml细胞示出了显著的细胞毒性(图66d)。flt3 car nk细胞(sb00819)与egfp对照nk细胞相比示出了倾向于增强pl-21细胞杀伤。
[1429]
因此，单价flt3 car nk细胞、单价cd33 car nk细胞和双顺反子flt3/cd33 car nk细胞在杀伤两种不同的aml靶细胞和分泌细胞因子方面是有效的。
[1430]
以引用的方式并入
[1431]
本技术中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献都出于所有目的以引用的方式整体并入在此，达到如同个别地指明各个别出版物、专利、专利申请或其他文献是出于所有目的以引用的方式并入的程度。
[1432]
等效方案
[1433]
尽管已经说明并描述了各个具体实施方案，但以上说明书不具限制性。应当理解，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下进行各种变化。在审阅本说明书后，许多变化对本领域技术人员将变得显而易见。