一种动物胶原蛋白肽的制备方法与流程

1.本发明涉及一种动物胶原蛋白肽的制备方法，属于农副产品加工技术领域。


背景技术：

2.胶原蛋白是人体组织结构的主要成分之一，它遍及全身的各个组织器官，如：皮肤、骨骼、软骨、韧带、角膜以及各种内膜筋膜等，是维持皮肤和组织器官形态、结构的主要成分，也是修复各损伤组织的重要物质。随着人们生活水平的逐渐提高，家禽的加工市场前景广阔，但对于家禽的一些内脏基本都是直接遗弃，但若能对这些进行二次利用，则能够充分利用资源，实现废物的再利用，符合当今绿色发展的时代要求。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了解决上述问题，提供了一种动物胶原蛋白肽的制备方法。
4.本发明采用如下技术方案：一种动物胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
5.(1)原料预处理：将鸡爪、鸡皮、鸡骨等家禽产物解冻后，将鸡爪去除趾骨得到原料并处理得到组织颗粒；
6.(2)脱脂处理：取原料组织颗粒加入质量4-6倍的蒸馏水，然后向其中加入质量浓度为0.5％的naoh及质量浓度为0.5％的na2co3溶液，混合均匀后加热至35-40℃搅拌0.5-1h，待冷却后密封保存；
7.(3)除杂蛋白：将脱脂后的原料至于0.1mol/l的naoh溶液中浸泡5-6h，蒸馏水清洗至中性；
8.(4)超细粉的制备：进料气体通过文丘里喷嘴以40-50m/s的速度带着进入的除杂后原料粉末喷入平碟型的粉碎室，得到原料粉末粒径在10-20μm；
9.(5)超声波辅助酶解：将经预处理后的超细微原料制成溶液，料液比为1:60，加入酶解液，在酶解的过程中加入超声波辅助，酶解时间为3.5-5h；
10.(6)真空冷冻干燥：将酶提得到的胶原蛋白肽溶液放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥24-48h，得到胶原蛋白肽粉末。
11.进一步的，所述步骤(1)中解冻后70～80℃的水浸泡3～6min。
12.进一步的，所述步骤(2)中混合加热搅拌后再加入0.5％的na2co3溶液继续搅拌1h。
13.进一步的，所述步骤(3)中naoh溶液每隔2-3h更换一次。
14.进一步的，所述步骤(4)中加速超音速300-350m/s的速度做螺旋状运动。
15.进一步的，所述步骤(4)中的气流粉碎机的工作压力在6-8bar，工作功率在2.5kw。
16.进一步的，所述步骤(5)中超声波的功率为100-300w，超声时间为20-40min。
17.进一步的，所述步骤(5)中酶解液包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶及胰蛋白酶中的一种或几种。
18.本发明的有益效果：本发明制备方法简单，步骤易于操作，采用超声波辅助酶解的方法提取家禽副产物中的胶原蛋白肽，酶解程度高，得率高。
附图说明
19.图1是本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的紫外吸收光谱图。
20.图2是本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的红外光谱分析图。
21.图3是本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的x射线图。
22.图4是本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的圆二色谱图。
23.图5为本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的sds-page电泳图。
24.图6为本发明中实施例2得到的鸡爪蛋白肽的分子量分布图。横坐标为时间；纵坐标为响应值。
具体实施方式
25.下面将结合具体实施方式对本发明作进一步的解释和说明。
26.实施例一：一种动物胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
27.(1)将冷冻鸡爪、鸡皮、鸡骨等家禽副产物进行流水解冻，用70℃的水浸泡6min，把以上家禽副产物依次捞出掌心朝上置于砧板，先用小手术刀在鸡爪末端、关节处横切几下，接着沿跗跖骨纹路竖切一刀，便顺刀口方向即取出跗跖骨组织；再在每根趾骨上划一痕，扯开趾骨上的鸡爪皮，依次取出各部分趾骨，剩余部分则称为鸡爪，将所得的鸡爪分装于自封袋中，于-20℃中备用；
28.(2)将一定量的鸡副产物原料组织颗粒装入烧杯中，首先向其中加入4倍蒸馏水(以皮块质量为基准)，而后加入0.5％的naoh和0.5％的na2co3(以蒸馏水的质量为基准)，进行混合均匀后在40℃搅拌1h，后取出样品冷却淋干，再加入0.5％的na2co3(以蒸馏水的质量为基准)，继续搅拌0.5h，待冷却淋干后密封保存备用；
29.(3)除杂蛋白：在0.1mol/l的naoh溶液(液料比10：1ml/g)中浸5h，溶液每3h更换一次，碱处理后的样品用蒸馏水冲洗至近乎中性，以除去鸡爪中杂蛋白成分，除杂后原料进行冻干；
30.(4)超细粉的制备：进料气体通过文丘里喷嘴以40m/s的速度带着进入的除杂后原料粉末喷入平碟型的粉碎室，加速超音速300m/s的速度做螺旋状运动，工作压力在6bar，工作功率在2.5kw，最后使得除杂后原料粉末粒径在20μm；
31.(5)将经预处理后的超细微原料加入去离子水制成溶液，料液比为1:60，加入酶解液，在酶解的过程中加入超声波辅助，超声波的功率为100w，超声时间为40min，酶解时间为3.5h；酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶及复合蛋白酶，酶提时间为4.0h，加酶量为6000u/g；
32.(6)将酶提得到的胶原蛋白肽溶液放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥24-48h，得到胶原蛋白肽粉末，鸡爪胶原蛋白肽提取得率为45.46％。
33.实施例二：一种动物胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
34.(1)将冷冻鸡爪、鸡皮、鸡骨等家禽副产物进行流水解冻，用75℃的水浸泡5min，把以上家禽副产物依次捞出掌心朝上置于砧板，先用小手术刀在鸡爪末端、关节处横切几下，接着沿跗跖骨纹路竖切一刀，便顺刀口方向即取出跗跖骨组织；再在每根趾骨上划一痕，扯开趾骨上的鸡爪皮，依次取出各部分趾骨，剩余部分则称为鸡爪，将所得的鸡爪分装于自封袋中，于-20℃中备用；
35.(2)将一定量的鸡副产物原料组织颗粒装入烧杯中，首先向其中加入5倍蒸馏水(以皮块质量为基准)，而后加入0.5％的naoh和0.5％的na2co3(以蒸馏水的质量为基准)，进行混合均匀后在40℃搅拌1h，后取出样品冷却淋干，再加入0.5％的na2co3(以蒸馏水的质量为基准)，继续搅拌1h，待冷却淋干后密封保存备用；
36.(3)除杂蛋白：在0.1mol/l的naoh溶液(液料比10：1ml/g)中浸6h，溶液每3h更换一次，碱处理后的样品用蒸馏水冲洗至近乎中性，以除去鸡爪中杂蛋白成分，除杂后原料进行冻干；
37.(4)超细粉的制备：进料气体通过文丘里喷嘴以45m/s的速度带着进入的除杂后原料粉末喷入平碟型的粉碎室，加速超音速320m/s的速度做螺旋状运动，工作压力在7bar，工作功率在2.5kw，最后使得除杂后原料粉末粒径在15μm；
38.(5)将经预处理后的超细微原料加入去离子水制成溶液，料液比为1:60，加入酶解液，在酶解的过程中加入超声波辅助，超声波的功率为200w，超声时间为30min，酶解时间为4h；酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶及复合蛋白酶，酶提时间为4.0h，加酶量为4000u/g；
39.(6)将酶提得到的胶原蛋白肽溶液放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥24-48h，得到胶原蛋白肽粉末，鸡爪胶原蛋白肽提取得率可达到45.46％。
40.实施例三：一种动物胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：
41.(1)将冷冻鸡爪、鸡皮、鸡骨等家禽副产物进行流水解冻，用80℃的水浸泡3min，把以上家禽副产物依次捞出掌心朝上置于砧板，先用小手术刀在鸡爪末端、关节处横切几下，接着沿跗跖骨纹路竖切一刀，便顺刀口方向即取出跗跖骨组织；再在每根趾骨上划一痕，扯开趾骨上的鸡爪皮，依次取出各部分趾骨，剩余部分则称为鸡爪，将所得的鸡爪分装于自封袋中，于-20℃中备用；
42.(2)将一定量的鸡副产物原料组织颗粒装入烧杯中，首先向其中加入6倍蒸馏水(以皮块质量为基准)，而后加入0.5％的naoh和0.5％的na2co3(以蒸馏水的质量为基准)，进行混合均匀后在35℃搅拌1h，后取出样品冷却淋干，再加入0.5％的na2co3(以蒸馏水的质量为基准)，继续搅拌1h，待冷却淋干后密封保存备用；
43.(3)除杂蛋白：在0.1mol/l的naoh溶液(液料比10：1ml/g)中浸6h，溶液每3h更换一次，碱处理后的样品用蒸馏水冲洗至近乎中性，以除去鸡爪中杂蛋白成分，除杂后原料进行冻干；
44.(4)超细粉的制备：进料气体通过文丘里喷嘴以50m/s的速度带着进入的除杂后原料粉末喷入平碟型的粉碎室，加速超音速350m/s的速度做螺旋状运动，工作压力在8bar，工作功率在2.5kw，最后使得除杂后原料粉末粒径在10μm；
45.(5)将经预处理后的超细微原料加入去离子水制成溶液，料液比为1:60，加入酶解液，在酶解的过程中加入超声波辅助，超声波的功率为300w，超声时间为20min，酶解时间为5h；酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶及复合蛋白酶，酶提时间为4.0h，加酶量为3000u/g；
46.(6)将酶提得到的胶原蛋白肽溶液放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥24-48h，得到胶原蛋白肽粉末，鸡爪胶原蛋白肽提取得率可达到45.46％。
47.一、采用紫外光谱对实施例2得到的鸡爪蛋白肽进行光谱分析：
48.结果如图1所示。
49.根据图1知，uv光谱图对于鸡爪蛋白肽的波长扫描范围在200～400nm间，可见鸡爪胶原蛋白肽在220～230nm内出现特征吸收峰，是由于胶原蛋白在碱性蛋白酶的作用下三股螺旋结构逐渐被打开，分子表面出现具有紫外吸收的生色基团，肽键c＝o电子的能级跃迁产生强吸收；图中还能看到270～280nm之间微微产生一个小隆峰，这说明胶原蛋白肽中含有少许芳香族氨基酸，如酪氨酸残基(在278nm有强吸收)和苯丙氨酸残基(在259nm有强吸收)等。且随着扫描波长的增加，提取得到的鸡爪胶原蛋白肽中氨基酸得到更多暴露，结构更加疏松。
50.二、采用红外光谱对实施例1-3得到的鸡爪蛋白肽进行光谱分析
51.结果如图2所示。
52.胶原蛋白肽的红外光谱扫描谱图均由酰胺a、b与酰胺ⅰ、ⅱ、ⅲ组成。有研究报道称由n-h基团伸缩振动所产生的吸收峰，是位于3300～3500cm-1
波长范围内。在波长范围为1200～1700cm-1
的3个吸收峰分别代表反映肽构象的酰胺ⅰ带、ⅱ带与ⅲ带。由图2得位于1500～1600cm-1
波长处的是酰胺ⅰ带，1653cm-1
波长处产生一个微弱的肽键c＝o的伸缩振动，可表明胶原分子的三螺旋结构已被破坏，这个峰位是属于胶原蛋白肽的重要峰位。1300～1400cm-1
波长范围内的吸收峰是酰胺ⅱ带。1530～1510cm-1
波长区域与1550～1530cm-1
波长区域表明反平行与平行β-折叠结构的存在，图谱中的样品在这两个区域间均不存在吸收峰，则鸡爪胶原蛋白肽不具备β-折叠结构。胶原蛋白肽在波长为1300～1400cm-1
范围内的吸收峰为酰胺ⅲ带，这是肽特有的吸收峰。以上分析说明实验得到的鸡爪胶原蛋白肽，符合肽特征谱图。
53.三、采用x射线对实施例1-3得到的鸡爪蛋白肽进行分析
54.结果如图3所示。
55.胶原蛋白x-射线衍射谱通常具备3个主峰，第1个峰的2θ值约为10
°
，是反映胶原蛋白分子链间的距离(d)；第2个峰的2θ值约为20
°
，是反映胶原蛋白分子内部存在的非结晶成分含量比例的大小；第3个峰的2θ值约为30
°
。由图3可得：鸡爪胶原蛋白肽的第一个峰和第二个峰较为明显，第三个峰不明显，这说明胶原蛋白的三螺旋结构遭到严重破坏，有序程度降低，变成小分子的肽段。
56.四、采用圆二色谱对实施例1-3得到的鸡爪蛋白肽进行光谱分析。
57.结果如图4所示。
58.可得鸡爪胶原蛋白肽在波长220～224nm范围内没有出现正吸收峰，正负吸收带之间无明显的转折点，在扫描波长为194nm处出现了负吸收峰，这表明胶原分子构象中出现无规卷曲的现象，说明鸡爪胶原分子三股螺旋结构被破坏，符合胶原蛋白肽的基本构象。
59.五、根据胶原蛋白及胶原蛋白肽的区别，进行sds-page电泳实验，进行定性分析。
60.结果如图5所示。
61.从左往右第二条带、第三条带、第四条带分别是质量体积分数为5mg/ml鸡爪胶原蛋白肽的条带、marker、质量体积分数为2.5mg/ml的鸡爪胶原蛋白肽条带。凝胶电泳图谱结果显示,可清晰看到质量体积比为5mg/ml的产物有3条染色较深的条带，分别为α1链、α2链和β链，每个蛋白组分均得到了较好的反映。而质量体积比为2.5mg/ml的产物的条带不模糊，可能是由于质量体积比会直接影响上样量的多少，当质量体积比较少时，一部分蛋白组
分得不到有效反映。图谱底部有些条带聚集，颜色沉积，可能是由于一些蛋白组分密切联结，堆积在一起而无法分开。总体来说，由图可得产物的电泳条带基本都集中在α2链以下，即说明胶原蛋白三螺旋基本结构遭到破坏，大部分已被酶解为小分子肽。
62.六、实施例所得产品分子量的分布表
63.据食品安全国家标准gb 31645—2018规定：富含胶原蛋白的新鲜动物组织在水解到一定程度后，分子量变为较小时，称为胶原蛋白肽。鸡爪胶原蛋白肽分子量分布情况见表1和图6，可得对鸡爪胶原蛋白肽而言，71％胶原蛋白肽分子量在1.35kda≤mw《17kda范围内，27％胶原蛋白肽分子量小于1.35kda。研究表明：胶原蛋白肽具有的小分子量组分百分含量较多，则其溶解度较好；相对而言，若胶原蛋白肽分子的大分子量组分含量较高，则其溶解性能较差。综上可得小分子量的胶原蛋白肽更易被人体所吸收，其体内消化转换率更高。
64.如下表1所示，为产物分子量分布表
65.表1产物的分子量分布表
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