一种胃癌标志物miRNA-21的可视化检测试剂、试剂盒及检测方法与流程

一种胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.胃癌是世界范围内危害生命健康的恶性肿瘤之一，2018年全球胃癌新增患者103.3万，死亡患者为78.2万，发病率和致死率较高。绝大多数患者特异性症状不明显，导致多数就诊患者已处于中晚期，其5年生存率仅为20～30％。而早期胃癌患者的5年生存率可达95％以上，因此，胃癌的早期诊断与治疗是提高胃癌患者治愈率与生存率，降低死亡率的关键。
3.目前胃癌早期诊断方法多样，但存在很多不足，不能适用于大众化的方便、快捷的检测。如胃镜检查和病理活检方法均对患者造成一定的创伤，而且不宜检出临床症状较轻的患者。另外，肿瘤晚期患者的样品采样也较为困难。因此，胃镜和病理活检方法不适用于胃癌早期诊断。多项肿瘤标记物联合检测筛查胃癌技术逐步应用于临床，现有的标记物癌胚抗原有cea、ca72-4和ca19-9，但上述癌胚抗原对早期胃癌检出的敏感性低，不能用于胃癌的筛查和早期诊断。
4.肿瘤基因突变检测对指导肿瘤靶向治疗、耐药监测及预后判断有重要意义。传统的基因检测方法包括核酸印迹、微阵列和核酸酶扩增法、基因测序、荧光法、特征性熔解曲线信息对照法和胶体金免疫层析法等。但这些方法需要繁琐的实验步骤和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，难以用于大批量样本的快速检测。


技术实现要素：

5.针对现有胃癌早期检测方法存在的上述问题，本发明提供一种胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂、试剂盒及检测方法，该检测试剂盒可实现对胃癌早期标志物mirna-21的快速、无酶、可视化和超灵敏检测，且检测方法简单、特异性强、准确度高，在胃癌早期诊断中具有极高的实际应用价值。
6.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
7.一种胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂，包括：巯基dna1功能化纳米金、巯基dna2功能化纳米金和用于核酸支点置换反应的3种dna分子材料；
8.所述dna1的序列为：5
′‑
cttcgacggtcatgtactagatcagagg-3
′
；
9.所述dna2的序列为：5
′‑
cacgctgtcctaaccatgaccgtcgaag-3
′
；
10.用于核酸支点置换反应的3种所述dna分子材料分别为：
[0011]3′‑
ggagactagatcatcaatcctgtcgcacctacaact-5
′
；
[0012]5′‑
ctaacttacggcctctgatctagtagttag-3
′
；
[0013]3′‑
agagtgattgaatgcc-5
′
。
[0014]
相对于现有技术，本发明提供的胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂中提供的巯基dna1功能化纳米金和巯基dna2功能化纳米金作为显色探针，结合本技术用于核酸支点置换反应设计的3种dna分子，可实现胃癌标志物mirna-21的快速、无酶、无标记、可视化和超灵敏检测(对mirna-21的检测下限可达到1nm)。其中，上述用于核酸支点置换反应的3种dna分子可实现mirna-21的自组装反应和支点置换反应，实现了靶标分子mirna-21的无酶、快速扩增，同时，上述两种巯基dna功能化的纳米金显色探针与无酶扩增的核酸发生自组装反应进行显色，进而实现了胃癌标志物mirna-21的可视化、快速检测。利用本发明提供的可视化检测试剂对胃癌标志物mirna-21进行检测的方法简单、灵敏度高、特异性强、准确度高，无酶的加入、成本低，在胃癌标志物的早期检测中具有极高的实际应用价值。
[0015]
优选的，所述dna1上的巯基修饰位置在3
′
端。
[0016]
优选的，所述dna2上的巯基修饰位置在5
′
端。
[0017]
本发明还提供了所述胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂在作为胃癌早期诊断产品中的应用。
[0018]
本发明提供的胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂在作为胃癌早期诊断产品的应用中，可实现对ⅰ期胃癌患者的快速、准确的诊断，为胃癌的筛查和早期诊断提供了可靠的保障。
[0019]
本发明还提供了一种胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂盒，该试剂盒包括所述胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂。
[0020]
优选的，所述试剂盒包括巯基dna1功能化纳米金溶液、巯基dna2功能化纳米金溶液和核酸支点置换反应溶液。
[0021]
优选的，所述巯基dna1功能化纳米金溶液的制备方法为：所述巯基dna1功能化纳米金溶液的制备方法为：向沸腾的浓度为0.18-0.22mg/ml的氯金酸溶液中加入11-12mg/ml的柠檬酸钠溶液，所述氯金酸溶液与所述柠檬酸钠溶液的体积比为1:8-12，并继续加热，直至溶液变成酒红色，冷却至15-35℃，得到纳米金；取所述纳米金与80-120μm的dna1溶液按3000:6-12的体积比混合均匀，避光放置14-18h后，加入tris-乙酸缓冲液和nacl溶液，所述tris-乙酸缓冲液和nacl溶液的体积比为1:8-12，继续避光放置20-30h，弃上清，用tris-乙酸缓冲液重悬沉淀，得到所述巯基dna1功能化纳米金溶液；其中，所述tris-乙酸缓冲液的浓度为0.02-0.2m；所述nacl溶液的浓度为：0.8-1.2m，加入量为所述纳米金体积的8-12倍；重悬沉淀所用的tris-乙酸缓冲液的体积为所述纳米金体积的900-1100倍。
[0022]
优选的，所述巯基dna2功能化纳米金溶液的制备方法为：向沸腾的浓度为0.18-0.22mg/ml的氯金酸溶液中加入11-12mg/ml的柠檬酸钠溶液，所述氯金酸溶液与所述柠檬酸钠溶液的体积比为1:8-12，并继续加热，直至溶液变成酒红色，冷却至15-35℃，得到纳米金；取所述纳米金与80-120μm的dna2溶液按3000:6-12的体积比混合均匀，避光放置14-18h后，加入tris-乙酸缓冲液和nacl溶液，所述tris-乙酸缓冲液和nacl溶液的体积比为1:8-12，继续避光放置20-30h，弃上清，用tris-乙酸缓冲液重悬沉淀，得到所述巯基dna2功能化纳米金溶液；其中，所述tris-乙酸缓冲液的浓度为0.02-0.2m；所述nacl溶液的浓度为：0.8-1.2m，加入量为所述纳米金体积的8-12倍；重悬沉淀所用的tris-乙酸缓冲液的体积为所述纳米金体积的900-1100倍。
[0023]
优选的，所述核酸支点置换反应溶液的制备方法为：所述核酸支点置换反应溶液
的制备方法为：将3种所述dna分子材料加入75-85mm的nacl溶液中，使3种所述dna分子材料的浓度均达到0.8-1.2μm。
[0024]
本发明还提供了一种非诊断目的胃癌标志物mirna-21的可视化检测方法，具体采用所述胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：
[0025]
a、将待测样品与所述核酸支点置换反应溶液混合，静置10-20min，得到混合样品；其中，待测血清与核酸支点置换反应溶液的体积比为1:1-10；
[0026]
b、将所述混合样品依次与所述巯基dna1功能化纳米金溶液和所述巯基dna2功能化纳米金溶液混合，静置10-20min，得到反应液；其中，混合样品、巯基dna1功能化纳米金溶液和巯基dna2功能化纳米金溶液的体积比为1:5-10:5-10；
[0027]
c、根据所述反应液相对于阴性对照溶液的颜色深度来判断所述胃癌标志物mirna-21的有无；所述反应液相对于所述阴性对照溶液的颜色加深，则所述待测样品中存在所述胃癌标志物mirna-21，反之则所述待测样品中不存在所述胃癌标志物mirna-21。
[0028]
相对于现有技术，利用本发明提供的胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂进行非诊断目的胃癌标志物mirna-21的可视化检测方法，可实现无酶检测，检测方法简单、检测周期短、成本低、准确度高，可用于大批量样本的快速检测。
附图说明
[0029]
图1是本发明实施例2中对空白对照、阴性对照和ⅰ期胃癌患者血清的检测结果照片。
具体实施方式
[0030]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0031]
实施例1
[0032]
一种胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂，包括：巯基dna1功能化纳米金、巯基dna2功能化纳米金和用于核酸支点置换反应的3种dna分子材料；
[0033]
dna1的序列为：5
′‑
cttcgacggtcatgtactagatcagagg-3
′
(seq idno.1)；
[0034]
dna2的序列为：5
′‑
cacgctgtcctaaccatgaccgtcgaag-3
′
(seq idno.2)；
[0035]
用于核酸支点置换反应的3种dna分子材料分别为：
[0036]3′‑
ggagactagatcatcaatcctgtcgcacctacaact-5
′
(seq idno.3)；
[0037]5′‑
ctaacttacggcctctgatctagtagttag-3
′
(seq idno.4)；
[0038]3′‑
agagtgattgaatgcc-5
′
(seq idno.5)。
[0039]
其中，dna1上的巯基修饰位置在3
′
端；dna2上的巯基修饰位置在5
′
端。
[0040]
包括上述试剂的胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂盒，包括巯基dna1功能化纳米金溶液、巯基dna2功能化纳米金溶液和核酸支点置换反应溶液。
[0041]
其中，巯基dna1功能化纳米金溶液的制备方法为：向沸腾的浓度为0.2mg/ml的氯金酸溶液中加入11.4mg/ml的柠檬酸钠溶液，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为1:10，并继续加热，直至溶液变成酒红色，冷却至25℃，得到纳米金；取纳米金与100μm的dna1溶液
按3000:9的体积比混合均匀，避光放置16h后，加入tris-乙酸缓冲液和nacl溶液，tris-乙酸缓冲液和nacl溶液的体积比为1:10，继续避光放置24h，弃上清，用tris-乙酸缓冲液重悬沉淀，得到巯基dna1功能化纳米金溶液。tris-乙酸缓冲液的浓度为0.1m；nacl溶液的浓度为：1m，加入量为纳米金体积的10倍；重悬沉淀所用的tris-乙酸缓冲液的体积为纳米金体积的1000倍；
[0042]
巯基dna2功能化纳米金溶液的制备方法为：向沸腾的浓度为0.2mg/ml的氯金酸溶液中加入11.4mg/ml的柠檬酸钠溶液，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为1:10，并继续加热，直至溶液变成酒红色，冷却至25℃，得到纳米金；取纳米金与100μm的dna2溶液按3000:9的体积比混合均匀，避光放置16h后，加入tris-乙酸缓冲液和nacl溶液，tris-乙酸缓冲液和nacl溶液的体积比为1:10，继续避光放置24h，弃上清，用tris-乙酸缓冲液重悬沉淀，得到巯基dna2功能化纳米金溶液。tris-乙酸缓冲液的浓度为0.1m；nacl溶液的浓度为：1m，加入量为纳米金体积的10倍；重悬沉淀所用的tris-乙酸缓冲液的体积为纳米金体积的1000倍。
[0043]
核酸支点置换反应溶液的制备方法为：将3种dna分子材料加入80mm的nacl溶液中，使3种dna分子材料的浓度均达到1μm。
[0044]
利用上述试剂盒进行胃癌标志物mirna-21的可视化检测方法，包括以下步骤：
[0045]
a、将待测血清与核酸支点置换反应溶液按照1:1的体积比混合，静置10min，得到混合样品；
[0046]
b、将混合样品依次与巯基dna1功能化纳米金溶液和巯基dna2功能化纳米金溶液混合，静置10min，得到反应液；其中混合样品、巯基dna1功能化纳米金溶液和巯基dna2功能化纳米金溶液的体积比为1:5:5；用不含mirna-21的阴性血清代替待测血清，进行上述步骤，得到阴性对照溶液；
[0047]
c、根据反应液相对于阴性对照溶液的颜色深度来判断胃癌标志物mirna-21的有无；反应液相对于阴性对照溶液的颜色加深，则待测样品中存在胃癌标志物mirna-21(阳性)，反之则待测样品中不存在胃癌标志物mirna-21(阴性)；上述阴性对照溶液为用健康的血清代替待测血清得到的反应液。
[0048]
实施例2
[0049]
利用实施例1中的胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂盒和检测方法，对已确诊的8例胃癌i期患者血清、12例胃癌ⅱ期患者血清、11例胃癌ⅲ期患者血清和15例正常健康人血清分别进行检测，并设置空白对照和阴性对照。其中，空白对照为在检测过程中用水代替待测血清得到的反应液，阴性对照为在检测过程中用正常健康人的血清代替待测血清得到的反应液。具体检测结果如表1所示：
[0050]
表1检测结果
[0051][0052][0053]
上述检测过程中，空白对照、阴性对照和ⅰ期胃癌患者血清的检测结果如图1所示。可见，对ⅰ期胃癌患者血清进行检测得到的反应液的颜色深度明显较空白对照和阴性对照颜色深。
[0054]
实施例3
[0055]
实施例1中的胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂盒和检测方法的灵敏度。
[0056]
制备血清模拟样品，具体是向健康人血清中加入胃癌标志物mirna-21，得到含有不同浓度的胃癌标志物mirna-21的血清模拟样品。
[0057]
用mirna-21浓度分别为0.1nm、1nm、10nm和50nm的血清模拟样品进行检测。经检测，上述胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂盒和检测方法可实现对1nm的mirna-21的血清模拟样品的准确检测。
[0058]
实施例4
[0059]
一种胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂，包括：巯基dna1功能化纳米金、巯基dna2功能化纳米金和用于核酸支点置换反应的3种dna分子材料；
[0060]
dna1的序列为：5
′‑
cttcgacggtcatgtactagatcagagg-3
′
(seq idno.1)；
[0061]
dna2的序列为：5
′‑
cacgctgtcctaaccatgaccgtcgaag-3
′
(seq idno.2)；
[0062]
用于核酸支点置换反应的3种dna分子材料分别为：
[0063]3′‑
ggagactagatcatcaatcctgtcgcacctacaact-5
′
(seq idno.3)；
[0064]5′‑
ctaacttacggcctctgatctagtagttag-3
′
(seq idno.4)；
[0065]3′‑
agagtgattgaatgcc-5
′
(seq idno.5)。
[0066]
其中，dna1上的巯基修饰位置在3
′
端；dna2上的巯基修饰位置在5
′
端。
[0067]
包括上述试剂的胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂盒，包括巯基dna1功能化纳米金溶液、巯基dna2功能化纳米金溶液和核酸支点置换反应溶液。
[0068]
其中，巯基dna1功能化纳米金溶液的制备方法为：向沸腾的浓度为0.18mg/ml的氯金酸溶液中加入11mg/ml的柠檬酸钠溶液，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为1:8，并继续加热，直至溶液变成酒红色，冷却至15℃，得到纳米金；取纳米金与80μm的dna1溶液按3000:6的体积比混合均匀，避光放置14h后，加入tris-乙酸缓冲液和nacl溶液，tris-乙酸
缓冲液和nacl溶液的体积比为1:8，继续避光放置20h，弃上清，用tris-乙酸缓冲液重悬沉淀，得到巯基dna1功能化纳米金溶液。tris-乙酸缓冲液的浓度为0.02m；nacl溶液的浓度为：0.8m，加入量为纳米金体积的8倍；重悬沉淀所用的tris-乙酸缓冲液的体积为纳米金体积的900倍；
[0069]
巯基dna2功能化纳米金溶液的制备方法为：向沸腾的浓度为0.18mg/ml的氯金酸溶液中加入11mg/ml的柠檬酸钠溶液，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为1:8，并继续加热，直至溶液变成酒红色，冷却至15℃，得到纳米金；取纳米金与80μm的dna2溶液按3000:6的体积比混合均匀，避光放置14h后，加入tris-乙酸缓冲液和nacl溶液，tris-乙酸缓冲液和nacl溶液的体积比为1:8，继续避光放置20h，弃上清，用tris-乙酸缓冲液重悬沉淀，得到巯基dna2功能化纳米金溶液。tris-乙酸缓冲液的浓度为0.02m；nacl溶液的浓度为：0.8m，加入量为纳米金体积的8倍；重悬沉淀所用的tris-乙酸缓冲液的体积为纳米金体积的900倍。
[0070]
核酸支点置换反应溶液的制备方法为：将3种dna分子材料加入80mm的nacl溶液中，使3种dna分子材料的浓度均达到0.8μm。
[0071]
利用上述试剂盒进行胃癌标志物mirna-21的可视化检测方法，包括以下步骤：
[0072]
a、将待测血清与核酸支点置换反应溶液按照1:5的体积比混合，静置10min，得到混合样品；
[0073]
b、将混合样品依次与巯基dna1功能化纳米金溶液和巯基dna2功能化纳米金溶液混合，静置10min，得到反应液；其中混合样品、巯基dna1功能化纳米金溶液和巯基dna2功能化纳米金溶液的体积比为1:8:8；用不含mirna-21的阴性血清代替待测血清，进行上述步骤，得到阴性对照溶液；
[0074]
c、根据反应液相对于阴性对照溶液的颜色深度来判断胃癌标志物mirna-21的有无；反应液相对于阴性对照溶液的颜色加深，则待测样品中存在胃癌标志物mirna-21(阳性)，反之则待测样品中不存在胃癌标志物mirna-21(阴性)；上述阴性对照溶液为用健康的血清代替待测血清得到的反应液。
[0075]
实施例5
[0076]
一种胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂，包括：巯基dna1功能化纳米金、巯基dna2功能化纳米金和用于核酸支点置换反应的3种dna分子材料；
[0077]
dna1的序列为：5
′‑
cttcgacggtcatgtactagatcagagg-3
′
(seq idno.1)；
[0078]
dna2的序列为：5
′‑
cacgctgtcctaaccatgaccgtcgaag-3
′
(seq idno.2)；
[0079]
用于核酸支点置换反应的3种dna分子材料分别为：
[0080]3′‑
ggagactagatcatcaatcctgtcgcacctacaact-5
′
(seq idno.3)；
[0081]5′‑
ctaacttacggcctctgatctagtagttag-3
′
(seq idno.4)；
[0082]3′‑
agagtgattgaatgcc-5
′
(seq idno.5)。
[0083]
其中，dna1上的巯基修饰位置在3
′
端；dna2上的巯基修饰位置在5
′
端。
[0084]
包括上述试剂的胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂盒，包括巯基dna1功能化纳米金溶液、巯基dna2功能化纳米金溶液和核酸支点置换反应溶液。
[0085]
其中，巯基dna1功能化纳米金溶液的制备方法为：向沸腾的浓度为0.22mg/ml的氯金酸溶液中加入12mg/ml的柠檬酸钠溶液，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为1:12，并
继续加热，直至溶液变成酒红色，冷却至35℃，得到纳米金；取纳米金与100μm的dna1溶液按3000:12的体积比混合均匀，避光放置18h后，加入tris-乙酸缓冲液和nacl溶液，tris-乙酸缓冲液和nacl溶液的体积比为1:12，继续避光放置30h，弃上清，用tris-乙酸缓冲液重悬沉淀，得到巯基dna1功能化纳米金溶液。tris-乙酸缓冲液的浓度为0.2m；nacl溶液的浓度为：1.2m，加入量为纳米金体积的12倍；重悬沉淀所用的tris-乙酸缓冲液的体积为纳米金体积的1100倍；
[0086]
巯基dna2功能化纳米金溶液的制备方法为：向沸腾的浓度为0.22mg/ml的氯金酸溶液中加入12mg/ml的柠檬酸钠溶液，氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为1:12，并继续加热，直至溶液变成酒红色，冷却至35℃，得到纳米金；取纳米金与100μm的dna2溶液按3000:12的体积比混合均匀，避光放置18h后，加入tris-乙酸缓冲液和nacl溶液，tris-乙酸缓冲液和nacl溶液的体积比为1:12，继续避光放置30h，弃上清，用tris-乙酸缓冲液重悬沉淀，得到巯基dna2功能化纳米金溶液。tris-乙酸缓冲液的浓度为0.2m；nacl溶液的浓度为：1.2m，加入量为纳米金体积的12倍；重悬沉淀所用的tris-乙酸缓冲液的体积为纳米金体积的1100倍。
[0087]
核酸支点置换反应溶液的制备方法为：将3种dna分子材料加入80mm的nacl溶液中，使3种dna分子材料的浓度均达到1.2μm。
[0088]
利用上述试剂盒进行胃癌标志物mirna-21的可视化检测方法，包括以下步骤：
[0089]
a、将待测血清与核酸支点置换反应溶液按照1:10的体积比混合，静置10min，得到混合样品；
[0090]
b、将混合样品依次与巯基dna1功能化纳米金溶液和巯基dna2功能化纳米金溶液混合，静置10min，得到反应液；其中混合样品、巯基dna1功能化纳米金溶液和巯基dna2功能化纳米金溶液的体积比为1:10:10；用不含mirna-21的阴性血清代替待测血清，进行上述步骤，得到阴性对照溶液；
[0091]
c、根据反应液相对于阴性对照溶液的颜色深度来判断胃癌标志物mirna-21的有无；反应液相对于阴性对照溶液的颜色加深，则待测样品中存在胃癌标志物mirna-21(阳性)，反之则待测样品中不存在胃癌标志物mirna-21(阴性)；上述阴性对照溶液为用健康的血清代替待测血清得到的反应液。
[0092]
对实施例4和实施例5中的胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂盒的检测灵敏度进行鉴定，鉴定方法同实施例3。结果显示，实施例4和实施例5中得到的胃癌标志物mirna-21的可视化检测试剂盒的检测灵敏度均可实现对1nm的mirna-21的血清模拟样品的准确检测。
[0093]
为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。