GRP78调控抗乙型肝炎病毒颗粒分泌的抑制剂的制作方法

grp78调控抗乙型肝炎病毒颗粒分泌的抑制剂
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，涉及乙型肝炎病毒，具体涉及基于grp78的抗乙型肝炎病毒抑制剂。


背景技术：

2.乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)是引起乙型肝炎的病原体，属嗜肝dna 病毒科。hbv感染是全球性的公共卫生问题。虽然疫苗的大规模临床使用已达30多年，但hbv感染病例的数量仍然很高。据报道，全世界约2.57亿人感染hbv，每年因chb 所致的肝硬化或肝癌而死亡的有88.7万人。hbv的清除是艰难而迫切的。
3.hbv的生命周期大致可分为以下几个步骤：(1)hbv dane颗粒通过其表面hbsag 与肝细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)和牛磺胆酸共转运蛋白(ntcp)受体结合进入肝细胞；(2)核衣壳解聚，其内的rcdna释放进入细胞核中；(3)rcdna 修复转化成cccdna，后者作为病毒模板开始转录合成病毒所需的成分；(4)cccdna 的转录产物之一前基因组rna(pgrna)与p蛋白结合开始募集hbv核心蛋白(hbcag)，组装形成核衣壳，同时以pgrna为模板逆转录合成rcdna；(5)成熟的核衣壳开始新一轮的感染，少部分脱衣壳rcdna再次进入细胞核补充cccdna储蓄池，其余大部分经由多囊泡小体(mvb)转运途径分泌出肝细胞外。
4.目前，临床效果较好的抗hbv药物有核苷酸类似物(nucleoside analog，nas)和干扰素(interferon-a，ifn-a)。虽然ifn-a能有效抑制hbv复制，但是其不良反应多、应答率仅为20-30％，临床应用受限；而nas的长期使用会导致耐药性以及停药后复发等问题。重要的是，两者均不能彻底消除cccdna，故难以实现hbv的完全治愈。因此，开发新的抗hbv药物是亟需的。目前在临床开发的抗hbv药物有hbv进入抑制剂myrcludex b、衣壳组装变构剂hap_r01、hbsag释放抑制剂rep 2139等，唯独尚未有hbv分泌相关抑制剂的报道。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种基于grp78的抗乙型肝炎病毒抑制剂。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案为：
7.基于grp78的抗乙型肝炎病毒抑制剂，其特征在于：以grp78蛋白为靶点，通过抑制/阻断乙肝病毒颗粒分泌实现抗乙型肝炎病毒功能。
8.上述基于grp78的抗乙型肝炎病毒抑制剂，其特征在于：通过pres1同源性疏水小肽与grp78的结合以抑制/阻断乙肝病毒颗粒分泌实现抗乙型肝炎病毒功能。所述 pres1同源性疏水小肽选自小肽pep56、pep59或/和pep415中的一种或几种。
9.本发明提供grp78蛋白抑制剂在制备预防或治疗乙型肝炎病毒药物中的应用。
10.本发明提供grp78蛋白抑制剂在诊断乙型肝炎病毒感染中的应用。
11.所述抑制剂选自gbp-63、gbp-64、gbp-65、gbp-66、gbp-67、gbp-68中的一种或几种组合。所述gbp-63的小肽序列为fhshhnrpmksp；所述gbp-64的小肽序列为gswntfraqpti；所
述gbp-65的小肽序列为ltphkhhkhlha；所述gbp-66的小肽序列为mkahhsqlyprh；所述gbp-67的小肽序列为snigalqflppp；所述gbp-68的小肽序列为vttvgmpnksff。
12.进一步，所述抑制剂由噬菌体展示技术获得。
13.有益效果：
14.本发明提供一种基于grp78的抗乙型肝炎病毒抑制剂。本发明以grp78蛋白为靶点，通过抑制/阻断乙肝病毒颗粒分泌实现抗乙型肝炎病毒功能。本发明通过质谱鉴定发现grp78可以与乙肝病毒包膜的pres1相互作用，并证实grp78与hbvdane颗粒的分泌有关，是基于乙肝病毒颗粒分泌的靶点；pres1的小肽可以抑制乙肝病毒颗粒的分泌；借助噬菌体展示技术筛选出grp78结合的小肽，通过抑制hbv病毒颗粒的包膜化过程实现抗乙型肝炎病毒功能。
附图说明
15.图1是pres1相互作用宿主蛋白(grp78)结果图。
16.图2是grp78和pres1共定位结果图，在hepg2.2.15细胞中进行grp78和pres1的免疫染色；grp78用兔抗grp78抗体标记，pres1用鼠抗pres1单克隆抗体标记；细胞核用dapi标记；在不同放大率下检测grp78和pres1的共定位。
17.图3是grp78与pres1结构域相互作用结果图；其中hepg2细胞co-transfectedpcdna3.1-grp78和pcdna3.1-pres1-flag(行1、2、5)或转染pcdna3.1-pres1-flag(第3行)或pcdna3.1-grp78(第4行)，细胞溶解产物与pres1-flag免疫沉淀反应蛋白(通道2,3,4)或鼠标免疫球蛋白g蛋白(行5)到proteina/g琼脂糖珠；用抗flag抗体或抗grp78抗体检测沉淀蛋白复合物。
18.图4是chb患者的grp78表达结果图；采用grp78特异酶联免疫吸附试验(elisa)对50例慢性乙型肝炎(chb)患者和50例健康人血清grp78水平进行了比较。
19.图5是hbv促进grp78表达结果图；将pcdna3.1-hbv1.1(2.5ug/well)或空载体(2.5ug/well)瞬时转染hepg2细胞，通过rt-qpcr计算grp78在hepg2和hepg2.2.15中的mrna表达水平(p《0.05)。
20.图6是hbv促进grp78表达结果图；将pcdna3.1-hbv1.1(2.5ug/well)或空载体(2.5ug/well)瞬时转染hepg2细胞；westernblot检测hepg2和hepg2.2.15中grp78的蛋白表达水平(p《0.05)。
21.图7是hepg2-ntcp感染程序图。
22.图8是hbv促进grp78表达结果图；采用rt-qpcr方法计算hbv感染hepg2和阴性对照中grp78mrna的表达水平(p《0.05)。
23.图9是hbv促进grp78表达结果图；westernblot检测感染hbv的hepg2和阴性对照中grp78的蛋白表达水平(p《0.05)。
24.图10是grp78促进hbv分泌结果图；用ad-gfp或ad-grp78感染hepg2.2.15细胞，5d后取细胞上清，采用rt-qpcr方法计数hbvdna拷贝数(p《0.05)。
25.图11是grp78促进hbv分泌结果图；用ad-gfp或ad-grp78感染hepg2.2.15细胞，5d后取细胞上清，采用hbsag特异性和hbeag特异性elisa分析grp78处理对hbsag和hbeag浓度的影响。
26.图12是grp78促进hbv分泌结果图；用ad-gfp或ad-grp78感染hepg2.2.15细胞， 5d后取细胞上清，用pres1特异性抗体颗粒凝胶法检测hbv dane释放。
27.图13是grp78的三维结构与疏水小肽结合位点图。
28.图14是pres1的疏水小肽筛选与设计结果图。
29.图15是小肽的细胞毒性检测结果图。
30.图16是小肽与grp78的相互作用检测结果图。
31.图17是小肽抑制乙肝病毒颗粒的分泌效果检测结果图。
32.图18是grp78蛋白纯化结果图。
33.图19是噬菌体展示流程图；首先，将目标分子涂覆在固体介质(如96孔板)上；其次，加入噬菌体库，孵育数小时后，对未结合和非特异性结合的噬菌体进行洗涤；特异性结合的噬菌体用甘氨酸缓冲液洗脱，用er2738在37℃下扩增过夜；经过3～4轮，可以获得亲和力较高的噬菌体。
34.图20是噬菌体展示技术淘选结果图。
35.图21是小肽与grp78相互作用的itc验证实验图。
36.图22是小肽细胞毒性检测结果图；将hepg2.2.15细胞分散在96孔板每孔约5000个细胞，用6种小肽分别以0、1、10,100、150、200、500μmol/l处理细胞约12小时；24h 后弃去培养基，再次加入新鲜培养基100μl和mts溶液10μl(暗操作)，37℃孵育2h；测量490nm处的吸光度值；结果表明，6种小肽均无毒，gbp-67(图f)在150μm时表现出轻微的促进作用。
37.图23是最佳小肽筛选结果图；用六种小肽处理hepg2.2.15细胞；a)qpcr检测上清中 hbv dna水平；b)western blot法检测gapdh蛋白水平，hbv pres1蛋白颗粒凝胶法检测调整后gapdh的hbv病毒粒水平。
38.图24是gbp-68对hbv复制的影响结果图；hbeag和b)用gbp-67(nc)、gbp-68 和etv处理的hepg2.2.15培养液检测hbv dna。
39.图25是gbp-68对hbv衣壳组装的影响结果图；hepg2.2.15细胞和hepad38细胞分别用gbp-67(nc)、gbp-68、etv、上清液处理，5天后取细胞；提取细胞内gapdh 水平，调节负载量；用hbc特异性抗体衣壳法检测细胞内hbvncs。
40.图26是gbp-68对hbv包膜化的影响结果图；hepg2.2.15细胞和hepad38细胞分别用gbp-67(nc)、gbp-68、etv、上清液处理，5d后取细胞；提取细胞内gapdh水平，调节负载量；用含有pres1抗体的颗粒凝胶检测细胞内hbv病毒粒子。
41.图27是gbp-68对hbv亚病毒颗粒分泌的影响结果图；采用elisa法检测200umol/lgbp-68处理后的hepg2.2.15上清中hbsag水平。
具体实施方式
42.下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所用原料及试剂均为市售产品。除特殊说明外，本发明所述份数均为重量份，所述百分比均为质量百分比。
43.实施例
44.(一)材料与方法
45.1.1细胞培养
46.将50ml胎牛血清加入500ml的dmem培养基中，使其终浓度约为10％左右，供后续培养使用。hepg2.2.15、hepg2细胞中加入上述配制好的dmem，于37℃，5％co2的情况下孵育。
47.1.2细胞转染
48.hepg2.2.15细胞铺板至六孔板，待细胞长至密度约为80％-90％时转染，加入预混液(125μl opti-mem 2.5μg dna 5μl lipo8000)及2ml新鲜培养基，24h后重新换液，37℃培养细胞。
49.1.3蛋白提取
50.(1)细胞培养48h后弃去细胞上清，pbs洗涤3次；
51.(2)确保每个孔中均有350μlripa裂解液，在4℃下裂解20min；
52.(3)完全刮下细胞后，吸入1.5ml ep管中，并在4℃下以12000rpm离心30min；
53.(4)及时将上清吸至新ep管中；
54.(5)从管中吸10μl上清，通过bca法大致分析蛋白含量。
55.1.4western blot
56.第一天
57.(1)配备匹配的sds-page胶；
58.(2)蛋白上样25μg，恒压90v，130min，电泳；
59.(3)在距目的条带上下各0.5cm的位置裁切适当尺寸的胶；
60.(4)用直尺测量胶条大小，剪出匹配的pvdf膜，膜用甲醇浸泡30s，恒压70v， 90min，转膜，全程在冰水浴中进行；
61.(5)预先准备5％的脱脂牛奶，电转完毕后将pvdf膜放入牛奶中，进行封闭，至少3h；
62.(6)1xtbst洗膜；
63.(7)4℃过夜孵育单抗；
64.第二天
65.(8)将一抗吸入ep管中，备下次重复使用，以每次5min的间隔，洗膜4次；
66.(9)加入二抗，室温孵育2h；
67.(10)吸弃二抗，按(8)步骤洗膜；
68.(11)曝光。
69.1.5particle gel实验
70.(1)细胞处理5-7天后，收集上清，4℃，1000
×
g离心10分钟；
71.(2)将上清液转移到新的1.5ml ep管中，加入400μl 35％的peg8000/1ml上清，使peg8000的终浓度为10％，4℃旋转4h；
72.(3)超速离心后，弃上清；
73.(4)管中加入20μl tne buffer，4μl 6xdna loading，4℃，过夜缓慢溶解沉淀；
74.(5)制备1％不含核酸染料的核酸凝胶，根据蛋白调齐后的样品量上样，100v，70min；
75.(6)剪切适当大小的nc膜，分别用ddh2o、tne各活化5min、10min，引流法转膜6 h以上；
76.(7)用50％甲醇固定膜30min，ddh2o洗膜5min三次；
77.(8)预先准备5％的脱脂牛奶，将洗涤好的nc膜放入牛奶中，进行封闭，至少3h；
78.(9)1xtbst洗膜；
79.(10)4℃过夜孵育单抗；
80.第二天
81.(11)将一抗吸入ep管中，备下次重复使用，以每次5min的间隔，洗膜4次；
82.(12)加入二抗，室温孵育2h；
83.(13)吸弃二抗，以每次5min的间隔，洗膜4次；
84.(14)曝光。
85.1.6噬菌体展示
86.(1)用ph 8.0的0.1m nahco3溶液稀释grp78蛋白至终浓度为100μg/ml；
87.(2)以洁净96孔板作为介质，向每个孔加150μl靶蛋白溶液，4℃轻微震荡，过夜包被；
88.(3)每份lb中放入一个挑取的er2738单克隆，并摇菌；
89.(4)将包被液吸出，代之以封阻液，4℃封闭1h以上；
90.(5)将孔内液体弃净，快速洗板6次；
91.(6)噬菌体用tbst稀释至其滴度为2x10
11
后，每个包被孔加100μl，25℃温和震荡，孵育10-60min；
92.(7)移去板中溶液，借助吸水纸将液体去除干净；
93.(8)用tbst将板清洗10次，并丢弃所有剩余的液体；
94.(9)将100μl 0.2 m glycine-hcl(ph 2.2)，1mg/ml bsa洗脱液加入96孔板，低速摇动》10min，洗脱已结合grp78的噬菌体；
95.(10)收集(9)中洗脱液至1.5ml ep管，加150μl 1m tris-hcl(ph 9.1)进行中和；
96.(11)1μl洗脱物被用来评估噬菌体滴度，其余均添加到er2738菌液中，剧烈摇动扩增，37℃，4.5h；
97.(12)用bd管，4℃10000rpm离心培养物。移除上清，并再次瞬离；
98.(13)上清按4：1分为两份，一份约含80％上清，向其中加入1/6体积的peg/nacl， 4℃过夜以使噬菌体充分沉淀；
99.(14)以10000rpm，4℃的条件离心15min，留沉淀，再次短暂离心，并尽可能将上清液全部吸出；
100.(15)沉淀用1mltbs悬起，转移到1.5ml ep管后，4℃，11000rpm，8min；
101.(16)按步骤(12)再次沉淀上清；25min后，离心8min，弃去上清；
102.(17)沉淀用200μl tbs重悬，该液体可视为扩增后的洗脱物；
103.(18)按(1)包被新96孔板，以便于二轮淘选；
104.(19)计数蓝斑数，大致评估其滴度；
105.(20)进行第二轮淘选；
106.(21)5ml lb培养基中加50μl er2738培养物，吹打混匀后，转移1ml至1.5 ml ep管中；
107.(22)借助10μl枪头将蓝斑挑至1.5ml ep管中，确保1管1蓝斑；
108.(23)37℃摇床培养4.5-5h；
109.(24)离心30s，上清分两部分，分别用于测序模板的快速纯化，及作为扩增噬菌体贮液，后者与甘油按1：1稀释，贮存于-20℃；
110.(25)取(24)中的一份上清，将500μl转移至1.5ml ep管，并向该管中加入 200μl peg/nacl，室温充分混匀，8min；
111.(26)离心，弃上清，留沉淀；
112.(27)瞬时离心，弃净上清；
113.(28)借助100μl碘化物buffer，将沉淀吹起，再向管中加入250μl乙醇，并在 25℃下放置10min；
114.(29)离心10min，沉淀用70％的乙醇反复吹打，离心，洗涤两次，最后一次离心后，尽量将上清全部吸出，开盖，使残留的乙醇完全挥发，约5min左右；
115.(30)25μl te buffer被用于重悬溶解沉淀；
116.(31)取5μl溶解好的模板用于测序。
117.1.7itc实验
118.(1)样本、试剂准备
119.小肽溶液：根据分子量大小，加入小肽溶解所需的buffer量(此buffer为最后一次蛋白超滤液)，制成终浓度为1500μm的小肽母液，后续实验根据所需浓度用buffer 对母液进行稀释；
120.蛋白溶液：grp78蛋白用上述buffer稀释至合适浓度，4℃，离心10min，去除气泡，待用；
121.(2)打开仪器设备；
122.(3)仪器清洗：
123.按照仪器提示，选用deco90、甲醇、ddh2o清洗程序，清洗样品池、注射针；
124.(4)加样：
125.参比池：buffer反复润洗注射器，使注射器的阻力降为最小；然后将300μl buffer 缓慢加入参比池中；
126.样本池：用注射器将样本池中洗涤后残存的液体完全吸出；样本经离心后，注射器吸取320μl样本，(样本池有效体积为280μl)轻缓操作，避免出现气泡；将取好样的注射器插入样本池底部后，向上提起约1mm，缓缓注入样本；
127.配体样本：吸取80μl稀释好的小肽溶液至pcr管中，(有效使用体积约为60μl) 放入配体槽中；
128.(5)参数设置；
129.(6)运行；
130.(7)清洗仪器。
131.1.8mts
132.(1)人工计数后，使约5000个hepg2.2.15细胞分布于96孔板的每孔，37℃培养；
133.(2)借助无血清培养基将小肽制成终浓度为1、10、100、150、200、500μm的溶液，充分混匀，待用；
134.(3)12-16h后，将(2)中的小肽加至不同孔中，设调零组、对照组，每种条件设三个
复孔；
135.(4)24h后将上清吸出，代之以100μl新鲜dmem 10μl mts溶液(避光操作)，37℃培养；
136.(5)2h后在490nm处测吸光度值，尽可能避光进行。
137.1.9胞内病毒粒子提取
138.(1)细胞药物处理5天后，上清用于胞外particle检测，细胞用于病毒粒子提取， pbs洗涤细胞3次；
139.(2)移取450μl细胞裂解液到6孔板中，25℃裂解20min；
140.(3)上述混合物全部吸到1.5ml ep管中，以12000rpm离心25min，转移上清；
141.(4)上清中加入10u/μl的dnaseⅰ10μl，1mol/l的mgcl25μl，37℃水浴孵育 8h，中间可补加8μl daneⅰ；
142.(5)离心，转移上清，向管中加200μl peg8000，混匀，4℃沉淀病毒40min；
143.(6)超速离心后，将上清吸出，重新加入20μl tne，4μl 6x dna loading，4℃缓慢溶解沉淀。
144.1.10capsid
145.(1)将细胞上清吸至1.5ml ep管中，并按particle gel实验方法对其处理；
146.(2)待残留的细胞上清被pbs洗净后，吸取500μl细胞裂解液到孔内，室温摇晃裂解15min；
147.(3)将裂解液吸至1.5mlep管中，15000xg，10min；
148.(4)上清转移至新的ep管中，加入5μl 1mol/l mgcl2，10μl10 u/μl dnaseⅰ， 37℃，8h(每间隔4h可补加一次dnaseⅰ)；
149.(5)10000xg，室温离心10min；
150.(6)向上清中加入200μl 35％peg8000，充分混匀，冰浴40min；
151.(7)13000xg，10min，4℃离心；
152.(8)弃上清，加入20μl tne buffer、4μl 6xdna loading，4℃缓慢溶解；
153.(9)配制1％的核酸胶，后续步骤同particle gel。
154.二、结果
155.2.1grp78蛋白的发现与鉴定
156.为了开发出hbv分泌相关抑制剂，首先对可能的靶点进行了筛选。当前关于病毒分泌，报道较多的主要是内吞体分选转运复合体(escrt)家族。其主要由5个复合物 (escrt-0、ⅰ、ⅱ、ⅲ、vps4)及辅助蛋白组成，其中escrt
‑ⅱ
、ⅲ被报道与病毒的成熟、分泌有关，但是仅发现escrt-0中的hgs与hbc存在共定位，并没有直接证据可以证明其与hbv表面蛋白存在相互作用，且这些分泌均指核衣壳的分泌，尚未有完整病毒颗粒分泌的报道。其次，研究报道rab7可能参与病毒分泌，但是缺乏rab7 与病毒外膜蛋白相互作用的直接证据。因此，应重新聚焦其它可能参与hbv完整病毒颗粒分泌的宿主蛋白。假设hbv病毒组装完成后，从escrt转入多囊泡体(mvb) 或通过多囊泡体(mvb)分泌至胞外的过程需要宿主因子的引导，而这些分子中某些可以与病毒的包膜蛋白相互作用，从而指导病毒分泌。hbv病毒的包膜蛋白存在大、中、小三种表面蛋白质，被认为是与宿主接触最多的分子。其中pres1蛋白位于病毒包膜的最外围，可与肝细胞表面的ntcp受体结合，介导病毒感染。综上，参与病毒分泌调
控的宿主分子可能通过与pres1相互作用实现对病毒分泌的调控。
157.为找出可与hbv相互作用的蛋白，以gst-pres1为诱饵蛋白，在hepg2细胞中借助pull-down技术对分离得到的裂解产物进行质谱鉴定。结果显示(图1)共鉴定出4 种蛋白，因为1、2组为角蛋白，且丰度较低，4组理论分子量为42kd，且鲜少报道存在蛋白修饰情况，因此难以解释其出现的原因。3组中grp78蛋白的理论分子量为78 kd，且其166位苏氨酸、466位酪氨酸和571位丝氨酸均存在磷酸化修饰位点。而蛋白磷酸化后分子量变大，电泳迁移率减慢，因此grp78蛋白是潜在的候选蛋白质。为了进一步验证grp78与hbv病毒颗粒存在相互作用，itc实验被采用。实验显示grp78 与hbv病毒的亲和力在微摩尔级别，而对照组腺病毒与grp78的itc结果显示其亲和力为0，表明此结合为特异性结合。内源性细胞共定位可以看出，在细胞质、细胞膜上均存在grp78与pres1，但在细胞质中，二者的共定位现象更明显。
158.2.2grp78与hbv pres1结构域相互作用
159.为了验证grp78和pres1存在相互作用，分别通过内源性共定位和外源性转染的方法进行验证。在能稳定表达hbv的hepg2.2.15细胞系中采用免疫荧光共聚焦(immunofluorescence，if)的方法检测发现grp78和hbv的pres1结构域存在空间上的共定位，且主要分布于细胞质中(图2)。为了进一步验证二者存在相互作用，在 hepg2细胞系中，分别共同转染pcdna3.1-grp78和pcdna3.1-pres1-flag，单独转染 pcdna3.1-grp78、pcdna3.1-pres1-flag以及空载pcdna3.1作阴性对照。72小时后提取总蛋白完成蛋白质免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation，co-ip)，蛋白质电泳 (western blot)检测证实grp78和pres1结构域存在特异性的结合(图3)。
160.2.3hbv促进grp78的表达
161.为了检测临床hbv患者血清中grp78的含量，分别收集50份健康人的血清和50 例无明显其他疾病的慢性携带hbv的患者的血清，采用grp78 elisa试剂盒检测。统计分析结果显示，hbv患者组血清中grp78含量的平均数值与正常组相比明显高于后者，差异有统计学意义(t＝2.328，p＝0.022)(图4)。
162.为了更直观地研究hbv和grp78的功能关系，在体外进行了细胞实验。先比较了能表达hbv的hepg2.2.15细胞系和不表达hbv的hepg2细胞系(前者是由后者改造而来，在其基因组中整合了2倍hbv基因组)两种细胞系中grp78表达差异。做相同处理后24小时分别提取总rna，qrt-pcr分析结果显示hepg2.2.15细胞系中grp78 mrna水平表达量高于hepg2细胞系(图5)。之后，处理72小时后分别提取总蛋白， western blot检测发现hepg2.2.15细胞系中grp78在蛋白水平也高于hepg2细胞中的表达量(图6)。接下来，又比较了转染了pcdna3.1-hbv1.1表达质粒的hepg2细胞系和空白对照组hepg2细胞系，qrt-pcr结果显示转染了hbv的hepg2细胞系中 grp78 mrna水平表达量高于对照(图5)；western blot检测也发现转染了hbv的 hepg2细胞系中grp78蛋白水平也高于后者(图6)。
163.为了更好地模拟hbv外源性感染对grp78表达的影响，在hepg2-ntcp细胞系中感染了从hepad38细胞培养上清中收集的具有感染活性的hbv病毒颗粒(图7)， 24小时后提取总rna，qrt-pcr检测发现感染了hbv的细胞中grp78 mrna水平升高(图8)。72小时后分别提取总蛋白，western blot检测也表明grp78的蛋白水平也是增高的(图9)。
164.2.4grp78促进hbv分泌
165.发明人进一步探索grp78对hbv的作用。在hepg2.2.15细胞系中分别感染腺病毒(adenovirus，ad)grp78和ad-gfp做阴性对照，5天后收集细胞上清，一部分用于提取hbv dna，qrt-pcr检测发现过表达grp78的hepg2.2.15细胞上清中hbvdna拷贝数升高(图10)。另一部分细胞上清分别稀释3倍和1000倍检测hbsag和 hbeag，但奇怪的是，elisa结果显示grp78是否过表达并不影响上清中hbsag和 hbeag的含量(图11)，这可能是由于hbeag及由hbsag构成的亚病毒颗粒分泌途径不同所致。
166.为了进一步研究grp78是否直接影响hbv dane颗粒的分泌，在hepg2.2.15细胞系中分别感染ad-grp78和ad-gfp，5天后收集细胞上清，将细胞内参对应的细胞数调齐后，据此调整上清的上样量，采用颗粒凝胶(particle gel)的方法检测发现，过表达grp78将会导致上清中dane颗粒的分泌水平明显升高(图12)。
167.2.5基于pres1疏水小肽筛选与抑制病毒颗粒的分泌验证
168.接下来，进一步探索了grp78对hbv的作用是否是基于其与hbv pres1结合所致。grp78主要有两个功能结构域，底物结合结构域sbd和核苷酸结合结构域nbd。 nbd结合水解atp来提供能量，sbd结合的底物则多为疏水性肽段。于是，利用生物信息学对pres1的氨基酸序列进行疏水性分析，确定grp78调节病毒分泌的功能位点，是为了合成药物封闭功能位点，以达到阻断分泌的作用。设计了3条pres1同源性疏水小肽，目的是为了封闭天然pres1与grp78的结合位点，使得grp78对hbv难以发挥作用。同时以grp78结合pep415作为对照。在hepg2.2.15细胞中利用mts分别检测了4条多肽的细胞毒性，结果显示这4条多肽对细胞活率的影响极小。然后检测了小肽与grp78的相互作用，发现pep60与grp78的相互作用较弱。病毒颗粒分泌抑制实验发现，与grp78较弱的pep60的抑制效果最差，而与grp78结合较强的小肽(pep56, pep59和pep415)的抑制效果非常显著。
169.2.6grp78蛋白的表达与纯化
170.为了筛选出靶向grp78蛋白的小分子抑制剂，将重组pet-28a-grp78质粒转入 e.coli bl21中进行原核表达。经过充分的蛋白表达优化后，使grp78蛋白主要存在于细菌裂解液的上清中，上清经过镍离子亲和层析柱及一定条件的洗杂、洗脱后，(如图 18所示)在78kd处得到纯度超过90％的目的蛋白，对纯化后的grp78蛋白进行280nm 处吸光度检测，测得蛋白浓度约2mg/ml。
171.2.7噬菌体淘选
172.噬菌体展示是一项利用噬菌体作为载体，在噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置插入外源性小肽或蛋白质基因序列，使外源蛋白同结构蛋白同时表达的技术。通过该技术可以筛选出高亲和力、低毒性、类似于天然配体的小分子，克服了传统小分子库昂贵、大分子药物穿透力弱等缺点。噬菌体展示技术的淘选流程如图19所示，可将其大致分为几个迭代循环：捕获、洗涤、洗脱。
173.该实验利用噬菌体展示中的m13噬菌体系统对grp78蛋白进行了靶向淘选。以100 μg/ml的grp78蛋白为靶蛋白，2x10
11
的m13噬菌体为工具，经过2轮淘选，共挑取出144个噬菌斑，对其进行扩增后，快速纯化出测序模板，并送上海生工进行反向测序。当外源性插入基因被融合表达时，n端会出现信号肽前导序列。蛋白质分泌后，该信号肽被切断，使得外源性12肽直接表达在成熟蛋白质的n端。因此对测序结果进行分析，去除多余序列后，经汇总得到60种不同的序列(如图20所示)，其中出现次数较多的为pep-16，通过不断淘选，可以将相
hbv分泌的抑制能力。如图23b，检测结果显示，仅gbp-68用药后上清中hbv dane 颗粒的量有所下降，这一结果与qpcr结果一致。
182.2.10抑制乙肝病毒分泌的机制
183.(1)gbp-68对hbv复制的影响
184.针对hbv生命周期的关键步骤，发明人深入解析了gbp-68的抗hbv机理。首先用pbs、gbp-68、etv药物处理hepg2.2.15细胞5天后，借助elisa实验分析了上清中hbeag的水平，以探讨gbp-68对hbv分泌的作用是否与复制有关。图24a显示gbp-68对hbeag的分泌无影响。hbeag被认为可以直接反应hbv的复制情况，由此提示gbp-68对hbv分泌的抑制效果几乎与hbv的复制无关。为了核实该结论，课题组又对hepg2.2.15细胞内的dna含量进行了qpcr检测。图24b显示gbp-68 处理后胞内的hbv含量无明显变化，而etv处理后胞内hbv dna的含量明显降低。以上结果再次证明gbp-68对hbv分泌的抑制作用与其复制无关。
185.(2)gbp-68对hbv衣壳组装的影响
186.研究表明，hsp70可与hbc二聚体结合，在一定程度对hbv的衣壳组装起着促进作用，而甲基苯丙胺蓝(mb)抑制hsp70会使衣壳组装减少。结合转录组高通量测序中 grp78对hbv蛋白转运水平的影响，进一步探讨了gbp-68对hbv分泌的影响是否通过抑制核衣壳的组装而实现。hepg2.2.15细胞予以pbs、gbp-68、etv药物处理， 5天后采用capsid实验评估细胞质与上清液中的ncs颗粒含量。因为ncs颗粒由内部的核酸与外围包裹核酸的核心蛋白组成，对无包膜蛋白的ncs而言，hbc蛋白组装成的二十面体直接暴露于最外层。因此，这里采用hbc特异性鼠单抗来检测hbv nc颗粒。图25(a、b)表明，与阴性对照nc组相比，gbp-68处理后细胞质与细胞上清中ncs含量无明显差异，hepad38细胞中的结果与此一致(图25c、d)。因为ncs的含量在一定程度可以反映核衣壳的组装，综上，实验结果表明gbp-68对hbv核衣壳的组装无影响。
187.(3)gbp-68对hbv包膜化的影响
188.为了进一步探讨gbp-68对hbv衣壳组装后的包膜化环节的影响，hepg2.2.15 细胞按上述方式进行药物处理后，细胞质被用于胞内蛋白质及病毒颗粒的提取，借助 gapdh对胞内蛋白调齐后，根据上样量，利用particle gel技术对胞内外提取的hbvdane颗粒进行检测。图26a显示，与nc组相比，gbp-68处理组与etv组上清中的 hbv完整病毒颗粒均有所减少。而图26b中胞内hbv病毒颗粒含量的减少仅出现在 etv组，gbp-68处理后胞内的hbv dane颗粒几乎无明显差异。这一点与etv可以抑制hbv的复制，而gbp-68对hbv的复制无明显影响是相符的。因为pres1是hbv dane 颗粒特有的结构，结合以上的实验数据，gbp-68对hbv核衣壳的组装无影响，由此推测gbp-68是通过与grp78结合抑制hbv的包膜化过程进而抑制了hbv的分泌。类似地，在hepad38细胞中得到了相同实验结果(图26c、d)。
189.(4)gbp-68对hbv hbsag分泌的影响
190.hbvlhbs由pres1、pres2、hbsag组成，hbsag的清除被视为是功能性治愈终点。既然gbp-68减少了hbv dane颗粒的分泌，是否hbsag的释放也会随之减少呢？图27显示，gbp-68用药后hbsag的含量无明显变化。这可能由于，虽然hbv dane 颗粒的包膜蛋白含有hbsag，但hbv不仅可以分泌hbv dane，还可以产生大量亚病毒颗粒，与hbv dane颗粒相比，亚病毒颗粒缺乏与肝细胞特异性结合的pres1结构域，并且后者在含量上约是前者的100-1000倍。目前的elisa试剂盒只能大致检测出上清中s蛋白的含量，并不能区分其来源，所以血清中
hbv dane颗粒的减少，可能不会造成hbsag的大幅度改变。