菌斑检测方法与流程

1.本发明涉及菌斑检测。特别地，本发明的方法涉及检测牙菌斑的方法，其包括在优选接触牙菌斑的化学试剂的存在下使目标牙齿区域经受光子的步骤。


背景技术：

2.在生物膜中，微生物相比于浮游细菌对抗菌剂更不敏感。生物膜耐受性和抗性背后的机制包括抗菌剂通过生物膜基质的缓慢渗透、生物膜内微环境的改变、细菌细胞的不同应激反应以及所谓的持久性细胞亚群的形成。在生物膜中，潜在的抗性可以通过水平基因转移轻松地在不同物种之间转移。据估计，近80％的微生物感染是由生物膜引起的。这也与抗药性有关，其中易感病原体菌株会产生抗药性，并且固有的低易感物种的选择使种群具有更强的抗药性。
3.常见的生物膜感染包括由牙齿斑引起的牙齿感染，以及皮肤感染、尿路感染、中耳感染、心内膜炎以及与植入物或导管相关的感染。
4.生物膜中的微生物的成功抗菌治疗通常需要比治疗浮游微生物时高100到1000倍的消毒剂或抗生素浓度。例如，在一项试验中，杀死远缘链球菌(streptococcus sobrinus)的单种生物膜需要的氟化胺和氯己定的浓度要比杀死其浮游生物高100倍。类似地，与其浮游形式相比，大肠杆菌(escherichia coli)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)在生物膜中需要高1000倍浓度的抗生素才能有效治疗。
5.牙医经常不得不与牙周或牙髓感染的耐抗生素细菌作战。据观察，对消毒剂例如氯己定的抗性可能与抗生素抗性相关。氯己定是牙医治疗口腔感染的常用药。
6.迄今为止，抗生素已帮助人类应对细菌感染，然而病原体已对大多数抗生素产生抗药性，开发新抗生素的困难有可能使人类回到抗生素出现之前的时代。
7.因此，例如在牙齿领域，需要新的抗菌策略以避免在治疗由细菌或酵母生物膜引起的牙周、牙髓或粘膜局部感染时过度使用抗生素。实现这一目标所必需的一个步骤是能够可靠地检测牙菌斑的存在。


技术实现要素：

8.本发明的一个目的是提供检测存在于目标牙齿表面上的牙菌斑的方法。
9.具体而言，目的是提供一种使生物表面经受光以能够检测生物膜例如菌斑的存在的方法。
10.本发明基于这样的想法，即通过使包括生物表面的目标区域经受高能和低能光子的组合来检测生物膜的存在。令人惊讶地发现，在表面的目标区域上使用例如同时使用高能和低能光子将产生比单独使用这种光子更好的效果。
11.看起来——尽管这只是一种可能性，并且本发明的范围不限于以下说明——低能光子将深入表面，而高能光子将对表面产生影响。
12.因此，可以通过光子上转换反应激活相同的目标区域，其中吸收两种或更多种光子并导致目标分子激发到更高的能量状态。
13.在一个实施方式中，提供了一种方法，其中目标牙齿区域与光敏剂接触，并且目标区域经受主要能量在1.24ev至1.65ev之间的第一光子和主要能量在2.8ev至3.5ev之间的第二光子的组合。通常，所述第一光子和所述第二光子构成指向目标区域的所有光子的大部分，优选超过90％。
14.另一个实施方式提供用于检测哺乳动物口腔中的生物膜的光敏剂，其中将所述光敏剂施加到目标牙齿区域并且该区域随后或同时经受主要能量在2.8ev至3.5ev之间的第一光子；和主要能量在1.24ev至1.65ev之间的第二光子。
15.另一个实施方式提供了一种试剂盒，其用于测定哺乳动物口腔中，特别是牙齿表面和粘膜中包含微生物、病毒或真菌生长的生物膜，所述试剂盒包括能够同时发射由高能光子组成的第一光和由低能光子组成的第二光的光电组件或装置，以及至少一种光敏剂，所述第一光和所述第二光占从光电组件或装置发射的所有光的至少80％，所述光敏剂可通过高能光子和低能光子中的至少一种激活。
16.更具体地，本发明的特征在于独立权利要求中所述的内容。
17.获得了相当大的优势。由于活性氧或高能氧的寿命短，使用高能和低能光子来靶向内源性和外源性分子会引起目标分子位点特异性作用。
18.根据本发明，高能光子被内源性(细胞内)分子吸收以产生活性氧单线态和活性氧。同时低能光子被光敏剂外源性(细胞外)吸收而产生活性氧单线态和活性氧。
19.活性氧单线态和活性氧物质不仅有助于检测生物膜，而且有助于随后灭活、杀死和以其他方式减少存在于生物膜或牙齿表面菌斑中的微生物，例如细菌、病毒和真菌：
20.因此，本发明的检测生物膜例如菌斑的方法可以用作包括选自诊断和治疗及其组合的组的进一步步骤的方法中的第一步。
21.因此，该治疗将实现良好的组织渗透。由于两种或多种不同能量的光子可以靶向不同区域的分子，因此可以同时对病原体的不同区域进行抗菌治疗。不同能量的光子也具有不同的组织治疗和组织刺激作用。高能光子和低能光子的结合会影响细菌的通信，因为它们可能对含有遗传物质或其他分子的噬菌体产生有害影响。该光也可能对这种被评估为群体感应的通讯分子的产生、形成或激活产生影响。
22.似乎高能光子通常被与细胞内氧化应激反应相关或涉及的物质所吸收。因此，它们能够破坏病原体治疗适应性。这类物质的一个实例是过氧化物酶的黄素基团。
23.高能光子和低能光子可与几种不同类型的光敏剂一起使用，其中激活可以通过不同的机制发生，例如发热、氧自由基和单线态氧。通过利用两种或多种非特异性但根本不同的机制靶向病原体的治疗组合，可以实现有效的抗菌治疗。在一个实施方式中，具有低能光子的icg与高能光子一起使用以对病原体膜提供光热疗治疗(icg 80％通过发热起作用，20-15％通过单线态氧形成起作用)。高能光子可用于激活细菌固有的内源性卟啉分子。这种分子具有高量子产率，主要通过单线态氧起作用，导致局部氧化爆发。
24.将光子靶向固有细菌分子的内源性抗菌疗法与外源性光动力或光热疗法相结合的一个重要好处是，它可以解决在治疗过程中添加的外源性光敏剂倾向于从目标区域漂白的问题。
25.光敏剂可以表现出牙菌斑特异性结合以允许牙菌斑的早期检测。
26.然而，内源性抗菌光疗法并不限于外源性光敏剂的存在。
27.用光子靶向细菌固有的内源性分子会获得不依赖光敏剂附着和吸收的作用。这有助于平衡治疗，使光敏剂较少的区域与光敏剂较多的区域得到同样好的治疗。内源性抗菌疗法对病原体内源性分子的光漂白作用也具有抗病原体功能，因为与添加的外源性光敏剂不同，这些分子对病原体是必不可少的。
28.从长期来看，细菌的内源性和外源性靶向在体内对许多细菌产生最佳效果，因为外源性治疗的有效性局限于光敏剂附着和/或摄入目标病原体。
29.例如，同时吸收1.53ev和3.06ev光子可以激发内源性卟啉，从而产生除组织愈合作用之外的抗菌效果。高能光子减少了生物膜细胞外多糖基质的形成，从而与外源性pdt产生协同作用，并降低了生物膜的致病性。
30.不同的光敏剂、光子能量和治疗参数可用于针对在生命周期不同部分的不同年龄的生物膜。例如牙菌斑和生物膜的组成因人而异。与龋齿发病率高的个体相比，尤其是在牙菌斑形成的早期，龋齿发病率低的人群在牙菌斑内表现出不同的细菌数量、不同的物种和不同的系统发育多样性。
31.使用本技术，不管人们的龋病发生率是高还是低，都可以得到有效治疗。
32.本方法通常将实现自发荧光，其特别是指牙菌斑中的固有荧光。此外，它通常还将实现光敏剂荧光，其指外来光敏剂的荧光。优选地，它将实现基于自发荧光和荧光两者的荧光。
33.因此，自发荧光是由旧菌斑产生的。这是菌斑的一个特征。
34.荧光由光敏剂产生。
35.这种菌斑的双重作用，可用于菌斑分析。首先使用峰值为405和/或810的led在有或没有特定滤波的情况下测量菌斑的自发荧光，然后在结合或不结合icg的光发射的情况下测量icg对光的吸收。
36.使用本方法检测牙菌斑是有利的，因为它也开启了可靠的仪器检测，辅助牙菌斑存在的视觉评估(如牙医或其他牙齿专业人员进行的)，或可能完全取代这种检测(例如允许个人进行自我检测)。
37.本方法允许基于荧光、吸收或自发荧光对菌斑进行成像。它还允许基于荧光、光反射、自发荧光或总强度或其组合来确定强度。
38.本检测方法还可用于检测和确定生物膜、变色和牙菌斑，以辅助牙齿表面的美容治疗。
39.接下来将参考附图更详细地研究实施方式。
附图说明
40.图1是显示了用滨松(hamamatsu)1394和nir光源在室内光照下观察到的染料斑特异性的照片；
41.图2是表示染料光吸收的灰度波动的示意图；
42.图3是显示根据本发明的一个实施方式的用双波长pdt增强的氯已定的抗微生物效果的柱状图；
43.图4是显示pdt治疗对1、2和4天龄变形链球菌生物膜的抗微生物效果的柱状图；
44.图5是显示对4天龄的生物膜进行双波长和单波长治疗的功效的柱状图；
45.图6是显示波长为405nm的光与pdt相比的抗菌效果图；
46.图7是显示对变形链球菌生物膜pdt治疗14天后的抗微生物效果的柱状图；和
47.图8是显示icg的吸光度随入射光波长变化的图。
具体实施方式
48.定义
49.在本文中，“光动力疗法”，也简称为“pdt”，代表任何将光转化为某种形式的活性氧的疗法。
[0050]“菌斑”与“牙菌斑”同义使用，指的是在牙齿表面，特别是哺乳动物口腔(口)表面上生长的生物膜或细菌团。通常，菌斑生长在牙齿表面。如本领域中已知的，菌斑主要是无色的，但也可以染上颜色，例如由于牙垢的形成，从而对美容造成损害。菌斑常见于牙齿的各种表面，也沿着牙龈线，甚至更低，在颈缘的牙龈线以下。细菌菌斑被认为是导致蛀牙和牙龈疾病的主要原因之一。
[0051]“牙膜”或“获得性牙釉质膜”(简称为“aep”)代表由吸附在牙釉质表面的蛋白质、碳水化合物和脂质形成的脱细胞生物膜。aep由唾液、口腔细菌碎片和外酶以及龈沟液(crf)形成。龈沟液在表膜中提供血浆蛋白。口腔疾病中，尤其是龋齿和牙周炎中，aep的成分会发生变化。发炎的牙龈可以将aep的组成改变到能够使更多的病原菌附着在表膜上形成菌斑的方向。aep会在几分钟内在牙齿上形成，并作为细菌随后牙菌斑形成的着陆区。
[0052]
牙菌斑和牙膜去除可以作为美容治疗进行。
[0053]“活性氧”的实例包括单线态氧、氧自由基和氧离子。
[0054]“抗微生物光动力疗法”，也简称为“apdt”，是一种基于光化学的方法，其使用光子激活“光敏剂”，在激活状态下，这些“光敏剂”赋予抗微生物效果。
[0055]“有益剂”通常是对组织或治疗效果具有有益效果的化合物或物质。此类化合物的示例如下：宿主防御肽、酶、产生氧化氢的酶、某些ph值液体、酸、碱、抗菌酶、蜂蜜、过氧化氢、树脂、水溶性维生素e(trolox)、edta、d-维生素、抗原、激素、催乳素、吸湿材料、α生育酚、维拉帕米、碳酸氢钠、亚氯酸钠、石榴、芦荟、洋甘菊、姜黄素、水琴素(aquacumin)、小苏打、海盐、姜黄、活性炭、柠檬汁、椰子油拉、薄荷油(peppermint oil)、留兰香油、肉桂油、dmso、二氧化钛、碳酸钙、角叉菜胶、月桂基硫酸钠、单氟磷酸钠、苄醇、椒样薄荷油(menthapiperita oil)、石油菊粉油(petroselinum sativum oil)、苯甲酸钠、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、麦芽糖糊精、柠檬酸、柠檬烯、二氧化硅、薄荷胡椒提取物(menthapiperita extract)、甘油、荨麻提取物、碳酸氢盐。
[0056]“抗微生物蓝光”，也简称为“abl”，通常是指波长范围为405至470nm的光，在不涉及外源性光敏剂的情况下表现出固有的抗微生物效果。
[0057]“光敏剂”是能够吸收例如在紫外线或可见光区域的电磁辐射并将其转移到邻近分子的化合物或分子。通常，光敏剂具有离域π键。
[0058]
光敏剂可以是天然存在的化合物(“天然光敏剂”)和合成化合物。天然光敏剂的实例包括：金丝桃素、姜黄素、苯酚衍生物、尾孢菌素、补骨脂素、黄酮素、当归素、α-三噻吩、苯
丙氨酸、thc、大麻二酚(cbd)。合成光敏剂包括：rb(玫瑰红)、mb、卟啉衍生物、姜黄素衍生物、亚甲蓝、吲哚菁绿、赤藓红、苯酮衍生物、富勒烯衍生物、氧杂蒽衍生物。
[0059]
在一个优选的实施方式中，使用“菌斑特异性光敏剂”。术语“菌斑特异性”指的是与至少基本上没有菌斑的牙齿表面相比，优先结合或吸附到含有或涂有菌斑的牙齿表面的光敏剂。因此，当暴露于牙齿表面时，更多的菌斑特异性光敏剂聚集在含菌斑的表面上而不是聚集在无菌斑的表面上(每表面单位)。通常，菌斑表面上的特异性光敏剂的浓度(每平方单位)大于无菌斑表面上的10％，特别是大于20％，优选至少30％，例如40％或更多。
[0060]
此外，在实施方式中，对于菌斑特异性光敏剂，当使用菌斑成像光时，施用的光敏剂的光吸收或荧光在菌斑中更高。
[0061]
术语“吸附”，当分别用于将光敏剂结合或粘附到口腔表面或生物膜或牙菌斑时，包括光敏剂的附着或结合的任何类型，并且通常基于物理或化学键或其组合的形成。
[0062]
特别优选的光敏剂是吲哚菁绿(以下简称为“icg”)。
[0063]
术语“增效物质或试剂”代表能够增强其他试剂的效果或活性的试剂，从而使它们的组合效果大于每种单独效果的总和。
[0064]“增效物质或试剂”的实例包括离子、离子清除剂、表面活性剂、含氧化合物、产生活性氧的化合物、有机和无机盐、二价离子、色素、抗微生物肽、edta、免疫刺激剂和抗生素或描述但不限于氯已定的其他抗微生物化合物。
[0065]“外源性”当用于细菌时代表细菌的“外部”。
[0066]“内源性”代表“固有地存在”于细菌中。当提及细菌中的分子和物质时，“内源性”与术语“细胞内”可互换使用。
[0067]
在本文中，“哺乳动物”具有本领域的常规含义。特别感兴趣的目标是人类以及饲养和作为宠物的动物，包括狗、猫、兔子、马、牛、绵羊、山羊和猪。
[0068]“非相干性的”当与光有关时意味着发射光波的幅度和相位在空间和时间上随机波动。一个实施方式包括使用led作为非相干光源。另一个实施方式包括使用uvc灯作为非相干光源。
[0069]“高能光子”是能量在3.5ev至2.8ev，特别是约3.2至2.9ev或3.17至2.95ev的范围内的光子。通常，这种光子包含在波长范围为约350-450nm，例如约390-410nm的光中。
[0070]“低能光子”是能量在1.24ev至2.48ev，特别是1.3至2.4ev，例如1.4至1.6ev或1.45至1.56ev的范围内光子。通常，这样的光子包含在波长范围为约500至1000nm，例如约780至830nm的光中。
[0071]
具有“主要能量在3.5ev至2.8ev范围内”的光子的光，例如以光束或光线的形式的光，指的是其中至少50％，特别是至少60％、或至少70％、或至少80％或至少90％、或至少95％的光子-如它们的能量所示的-具有在3.5ev至2.8ev范围内的能量。
[0072]
具有“主要能量在1.24ev至2.48ev范围内”的光子的光，例如以光束或光线的形式的光，其中至少50％，特别是至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％的光子-如它们的能量(或波长)所示的-具有在1.24ev至2.48ev范围内的能量。
[0073]
在本上下文中，波长的特定值将通常包括在该值的任一侧的关于该特定值的范围，例如5至20，特别是约10至15nm。因此，例如，“405nm”将被认为包括约395nm至415nm的波长范围，即405nm
±
10nm。类似地，“810nm”将被认为包括约395nm至825nm的波长范围，即
810nm
±
15nm。
[0074]
一般而言，已经发现，与单独施用每组光子相比，同时施用低能光子和高能光子，特别是与低能光子激活的光敏剂一起施用，增加了光的抗微生物效果。当以单剂量施用时，这可以在微生物的浮游形式中看到，但在生物膜中更为明显。
[0075]
2018年10月26日提交的共同未决专利申请fi 20185904中公开了高能和低能光子的使用。
[0076]
如将在以下实施方式中讨论的，高能光子和低能光子也可用于菌斑的检测。
[0077]
基本上，本检测牙菌斑的方法包括在光敏剂存在下使目标牙齿区域经受高能和低能光子的步骤。通常，在第一步中，光敏剂被吸附到目标牙齿区域，然后目标牙齿区域分别受到高能光子和低能光子的作用。在一个实施方式中，牙菌斑特异性光敏剂或至少一种牙菌斑特异性光敏剂和其他光敏剂的混合物被吸附到目标牙齿区域，随后含有吸附的光敏剂的牙齿区域经受高能光子和低能光子。
[0078]
在一个实施方式中，目标牙齿区域分别同时经受高能光子和低能光子。在另一个实施方式中，目标牙齿区域顺序地经受高能光子和低能光子。
[0079]
一个实施方式包括将高能光子和低能光子引导到目标牙齿区域以实现该区域的自发荧光和荧光，并且检测优选分别检测响应于高能光子和低能光子而产生的自发荧光和荧光。在一个实施方式中，检测由天然细胞内和细胞外荧光团产生的自发荧光。
[0080]
一个实施方式包括使表现出早期牙菌斑的牙齿区域经受低能光子，以及使表现出包含细胞内和细胞外荧光团卟啉分子的旧生物膜的牙齿区域经受高能光子。
[0081]
在一个实施方式中，使用波长为405nm
±
10nm的第一光和波长为810nm
±
15nm的第二光的组合，第一和第二光均包括非相干光，例如由光电装置例如发光二极管(led)产生的非相干光。
[0082]
在一个实施方式中，使用波长为405nm
±
10nm的第一光、波长为810nm
±
15nm的第二光和波长为780nm
±
10nm的第三光的组合，第一光、第二光和第三光包括非相干光，例如由光电装置例如发光二极管(led)产生的非相干光。
[0083]
在一个实施方式中，使用波长为405nm
±
10nm的第一光、波长为810nm
±
15nm的第二光、波长为780nm
±
10nm的第三光和波长为830
±
15nm的第四光，第一光、第二光、第三光和第四光包括非相干光，例如由光电装置如发光二极管(led)产生的非相干光。
[0084]
在本技术的实施方式中，光敏剂优选选自牙菌斑特异性光敏剂，该光敏剂通常优先粘附于含有牙菌斑的牙齿表面而不是粘附于不含牙菌斑的牙齿表面。这种光敏剂以吲哚菁绿(“icg”)为代表。
[0085]
吲哚菁绿是特别优选的光敏剂，适用于例如与上述第一光、第二光和任选的第三光和任选的第四光的组合结合使用。
[0086]
在一个实施方式中，接触目标牙齿区域的步骤包括将光敏剂从包含光敏剂的液体组合物例如漱口水吸附到牙齿区域。例如，液体组合物可包含0.00001至10％，特别是0.0001至0.1％重量的光敏剂。
[0087]
一个实施方式包括通过使用位于从目标牙齿区域到检测器(例如观察者的眼睛或仪器的检测器组件)的光路中的滤波器来检测来自目标牙齿区域的自发荧光和/或荧光。
[0088]
例如，可以提及使用405/780/810/830nm光的特定滤波来增强对荧光和/或自发荧
光的检测，或对icg光吸收或光发射能力或其变化的检测。
[0089]
405和810峰值发光二极管会在旧牙菌斑中产生荧光。当icg被添加到这个菌斑时，没有任何滤波，这个菌斑吸收光，而不是发射光。
[0090]
一个实施方式包括检测一种、两种、三种或四种不同波长的光的吸收和比较光的峰值吸收。在一个特别优选的实施方式中，检测具有780nm波长的光和具有810nm波长的光的icg吸收，并且确定峰值吸收之间的比率。
[0091]
一个实施方式包括检测由一种、两种、三种或四种不同波长的吸收激发引起的荧光或自发荧光发射和比较光的峰值发射。在一个特别优选的实施方式中，在455nm、500nm、582nm和622nm处测量由405nm
±
10nm激发引起的卟啉和黄素荧光，并与在810nm
±
10nm激发并在820至850nm范围内测量的icg发射进行比较。第二个特别优选的实施方式，icg发射，激发波长为780nm，测量发射范围为800至820nm，激发波长为810nm，测量发射范围为820至850nm。
[0092]
icg与细菌结合后将红移20nm(图8)，因此测量游离icg与结合icg的比率，可以检测到细菌结合的程度。牙菌斑细菌组成在牙菌斑年龄期间会发生变化，早期牙菌斑不会引起405nm光的大量自发荧光，但在icg牙菌斑成像中仍然清晰可见。比较icg的激发和405nm至450nm的自发荧光，可以获得有关细菌生物膜年龄和厚度以及细菌组成的信息。
[0093]
游离icg和结合icg的吸收或发射和发射比信息以及405nm自发荧光可用于引导和聚焦使用至少两种不同波长进行的治疗，如上所述，“双光治疗”，目标区域，并为了改变发射光之间的比率，以提高对某些类型生物膜的治疗效果。可以通过测量405nm和/或810nm吸收或随后的荧光发射的下降来跟踪进一步的治疗进展。测量信息可以反馈给设备/用户，治疗参数例如强度、光比、持续时间、外源性光敏剂的重新提交可以改变/发出信号。
[0094]
在一个实施方式中，光敏剂(特别是icg)受到外部刺激并且观察到其发射和吸收特性的变化。
[0095]
在一个实施方式中，外部刺激可以通过生物手段提供(例如施用含糖溶液)，以刺激生物膜中细菌酸的形成，或者利用施加外部电场、磁场、声能、力或电磁辐射的外部致动器。因此，在一个实施方式中，在第一时间点，拍摄牙齿的第一图像，在第一时间点之后的第二时间点，允许个体用含糖溶液漱口或冲洗牙齿，并且，在第二个时间点之后的第三个时间点，拍摄牙齿的第二图像。
[0096]
特别地，icg可用于测量牙齿生物膜的酸形成能力，通过跟踪将碳水化合物溶液施用于牙科生物膜后生物膜形成的变化，并测量由生物膜ph变化引起的icg吸收和发射特性的变化。
[0097]
405和/或810nm光的特定滤波可用于增强自发荧光的检测，或icg光吸收或光发射能力的检测。滤波器可以位于照明led光源的前面，或位于摄像头单元的前面。滤波可以是低通、高通或带通滤波或它们的任何组合。因此，可以检测一种或几种自发荧光并将其信息组合起来。
[0098]
滤波器也可以放置在观察者的眼睛和发光板之间。例如，滤波器可以位于眼镜中，其中滤波器安装在眼镜框架中，并作为带有光源的试剂盒提供，以检测牙菌斑。
[0099]
还可以使用双波长光和近红外传感器来监测新旧牙菌斑。高能光子吸收和激发卟啉分子，可以检测旧牙菌斑，使用nir相机检测早期牙菌斑的低能光子吸收可以检测早期牙
菌斑。
[0100]
因此，可以提供滤波器，该滤波器可以位于照明led光源的前面，或者位于摄像单元的前面。在一个实施方式中，使用选自低通滤波器、高通滤波器、带通滤波器及其组合的组中的一个或多个滤波器来执行滤波。
[0101]
检测可以通过检测一种或几种波长的自发荧光并任选地组合通过检测几种波长的自发荧光获得的信息来进行。通常，目标牙齿区域经受峰值波长为约405nm的第一光和峰值波长为约810nm的第二光，所述第一光包括高能光子，所述第二光包括低能光子。
[0102]
一个实施方式包括
[0103]-使目标牙齿区域经受峰值波长为约405nm或810nm或两者的光(任选地依次地)；
[0104]-测量由目标牙齿区域响应于这种光产生的第一自发荧光，任选地使用滤波来区分预定的自发荧光；然后
[0105]-在牙菌斑特异性光敏剂存在下，使目标牙齿区域经受峰值波长为约405nm或810nm或两者的光(任选地依次地)；
[0106]-测量由目标牙齿区域响应于这种光产生的第二自发荧光，任选地使用滤波来区分预定的自发荧光；和
[0107]-确定第一自发荧光和第二自发荧光的比率。
[0108]
通常，确定牙菌斑特异性光敏剂的吸附速率和任选的光漂白速率。
[0109]
在一个实施方式中，荧光icg将在对应于来自发射光的光的约10至30nm(例如20nm)的红移的波长范围内确定。
[0110]
一个实施方式包括测量游离icg与结合icg的比率，以检测细菌结合的程度。
[0111]
如上所述，牙菌斑细菌组成会根据牙菌斑年龄而变化，早期牙菌斑不会引起405nm光的大量自发荧光，但在icg牙菌斑成像中仍然清晰可见。
[0112]
在一个实施方式中，比较icg的激发和405nm至450nm的自发荧光以确定细菌生物膜的一个或多个参数。
[0113]
特别地，一个或多个参数选自目标牙齿区域的生物膜厚度、生物膜密度、生物膜细菌组成、生物膜的ph值及其组合。
[0114]
基于上述，在一个实施方式中，目标牙齿区域经受峰值波长为405nm、780nm和810nm的光，并且确定牙菌斑特异性光敏剂的光吸收。
[0115]
一个实施方式包括测量液相中游离牙菌斑特异性光敏剂的光的第一吸收，测量牙菌斑特异性光敏剂对目标牙齿区域的第二吸收，以及确定目标牙齿区域的选自生物膜厚度、生物膜密度、生物膜细菌组成、生物膜的ph值及其组合的至少一个参数。
[0116]
可以根据牙菌斑特异性光敏剂吸收光谱的偏移来确定细菌生物膜的ph值。
[0117]
一个实施方式包括在峰值波长为约810nm的光和峰值波长为约830nm的光下测量菌斑特异性光敏剂荧光，并确定荧光的比率，用于确定游离icg和结合icg的值以及用于检测抗菌活性的位点。
[0118]
在任何上述实施方式中，高光谱成像或光谱可以用于菌斑检测或分析。
[0119]
可以通过使用传感器并且优选算法来生成图像。
[0120]
在一个具体的实施方式中，在监测荧光特性变化的同时，以电磁辐射、电场、化学或机械能或它们的组合的形式给予牙菌斑的外部刺激。
[0121]
在一个实施方式中，测量光或荧光强度(荧光强度、总强度、反射强度、自发荧光强度)。
[0122]
除了牙菌斑外，本技术还可用于使用高能光子或低能光子检测和确定或分析牙膜的数量和/或质量。因此，一个实施方式提供了一种检测、确定或分析牙膜的数量或质量或两者的方法，包括在光敏剂存在下使目标牙齿区域经受高能光子和低能光子的步骤。
[0123]
获得性釉质薄膜(aep)，分析作为唾液诊断中潜在的重要辅助手段。因此，本技术可用于收集表膜并且它还提供良好的产量并且理想地去除存在于牙齿表面上的所有(或基本上所有)有机材料是非常有益的。
[0124]
基于上述，一种用于检测牙齿表面上的生物膜例如牙菌斑的试剂盒，包括例如光电装置和至少一种光敏剂，所述光电装置能够同时发射由高能光子组成的第一光和由低能光子组成的第二光，所述第一光和所述第二光占从光电组件或装置发出的所有光的至少80％，所述至少一种光敏剂可施加到牙齿表面、能够被吸收到所述生物膜并被高能光子和低能光子中的至少一种激活。
[0125]
通常，光电装置能够与一种光敏剂或多种光敏剂一起发射主要能量在2.8ev至3.5ev之间的高能光子和主要能量在1.24ev至1.65ev之间的低能光子。
[0126]
在一个实施方式中，光电装置包括具有两个或更多个发光表面(epi)的发光部件以及一种光敏剂或多种光敏剂。
[0127]
通常，该装置包括能够检测由荧光或自发荧光发射的光并且能够产生与所检测的荧光或自发荧光相对应的检测信号的传感器。
[0128]
光电装置可以被提供为牙刷的形状，或者可以插入牙齿咬合面之间的口腔中的口部件的形状，或者杆状照明器的形状。
[0129]
此外，所使用的光电装置可包括微型光谱仪传感器、温度传感器、光传感器、ph传感器、力传感器、陀螺仪、压力传感器或其组合。
[0130]
在一个实施方式中，光敏剂以水溶性泡腾片、凝胶或糊剂的形式提供，并且还包括一次性使用的吸嘴和光涂抹器。在一个实施方式中，光敏剂以水溶性泡腾片的形式提供，并且该试剂盒包括能够发射双光子的手持式光施加器。
[0131]
通常，光电装置能够在400至430nm的第一波长处优选以1至120j/cm2的剂量，特别是以约10至约250mw/cm2的功率密度持续0.5秒至120分钟的时间发射光、特别是非相干光，并且在780至830nm的第二波长处，优选以1至120j/cm2的剂量，特别约10至约2500mw/cm2的功率密度持续0.5秒至120分钟的时间发射光、特别是非相干光。
[0132]
特别地，光电装置包括作为光源的发光二极管(即led)的光电装置。
[0133]
本技术可用于一种方法中，其中牙齿表面上的生物膜(例如牙菌斑)的检测被纳入包括诊断和治疗(特别是抗微生物治疗)或其组合在内的一系列步骤中。此外，检测生物膜的本方法可以作为这种一系列步骤的第一步进行，随后进行诊断和/或治疗(特别是抗微生物治疗)。它还可以作为中间步骤或作为包括用于诊断和/或治疗(特别是抗微生物治疗)或生物表面特别是牙齿的步骤的序列的最后步骤进行。
[0134]
因此，在一个实施方式中，本技术用于评估抗微生物治疗的效果。
[0135]
关于在菌斑和aep的检测中高能光子和低能光子的产生和使用(即“双光治疗”)，进一步参考以下讨论，主要涉及这种光子在生物膜治疗中的使用。
[0136]
如牙齿实践中那样，使用低能光子与外源性光敏剂一起治疗，从长远来看，往往会失去其在生物膜中的功效。这种抗性形成的原因有很多，包括负责流入泵表达的基因的激活。不管实际原因或不同解释的组合如何，在本发明的生物膜研究中，当持续每天施用高能光子时，都遇到了类似的现象。
[0137]
双光治疗作为单剂量的功效提高以及维持疗效的治疗能力，可以通过在内源性和外源性光敏剂存在下，光同时产生自由基氧来解释。内源性光敏剂是细胞内的光反应性分子。这些分子可以是例如含有氨基酸侧链的蛋白质或与发色辅基结合的蛋白质，例如黄素和血红素。
[0138]
在一个实施方式中，发色团结合蛋白在细胞功能包括线粒体中的电子转移反应中起着关键作用，且它们的氧化可能具有有害影响。
[0139]
含有侧链的蛋白质中的损伤可能在旁观者损伤中起重要作用。另一方面，外源性光敏剂具有快速而有效地产生自由基氧的能力，这些自由基氧会破坏细胞膜和细胞壁结构，并在进入细胞时破坏其他结构。生物表面中活性氧的目标包括dna、rna、蛋白质、脂质和甾醇。
[0140]
在第一实施方式中，本技术提供了一种用电磁辐射治疗生物表面的方法，电磁辐射为两种不同能级的光形式，具有主要能量在3.5ev至2.8ev范围内的光子的第一光和具有主要能量在1.24ev至2.48ev范围内的光子的第二光。所述治疗是通过将第一光和第二光的光子同时指向生物表面来进行的。
[0141]
如上所述，术语“主要能量”通常意味着超过50％，特别是超过60％，例如超过70％或超过80％的光能量位于所示的范围内。
[0142]
在一个实施方式中，光子的至少50％的能量分别在3.17ev至2.95ev和1.56ev至1.45ev。
[0143]
在一个实施方式中，
[0144]-在至少两个不同的能级，第一能级和第二能级，产生非相干辐射光能；
[0145]-由非相干辐射光能提供第一光和第二光，其中，第一光具有对应于第一能级的主要能量的波长，第二光具有对应于第二能级的主要能量的波长；
[0146]-然后将第一光和第二光同时指向生物表面。
[0147]
在一个实施方式中，使用光电组件及其装置产生光，该光电组件和装置能够同时发射由高能光子组成的第一光和由低能光子组成的第二光，第一光和第二光占从光电组件或装置发射的所有光的至少80％。
[0148]
通过以上讨论的光，实现了表面生物材料的内源性和外源性刺激，优选以产生活性氧单线态或活性氧物质或两者。
[0149]
通过治疗，可以防止或对抗表面的生物污染，例如生物组织的微生物或病毒或真菌污染。该治疗可用于美容目的以及抗微生物、抗病毒和抗真菌治疗。
[0150]
光可以直接使用，也可以与光敏物质(光敏剂)结合用于光动力疗法(pdt)。这将在下面更详细地讨论。
[0151]
在一个实施方式中，高能光子和低能光子与至少一种外源性光敏剂结合施用，该外源性光敏剂能够被低能光子激活。
[0152]
在一个实施方式中，提供了一种用于哺乳动物组织的局部治疗的光敏物质(光敏
剂)，其中光敏剂施用于组织的表层部分，例如哺乳动物皮肤上或粘膜上，并且经此治疗的该部分随后或同时经受两种不同波长的光，即，具有其主要能量在2.8ev至3.5ev之间的高能光子的第一光，和具有主要能量在1.24ev至1.65ev之间的低能光子的第二光。
[0153]
在这样的实施方式中，高能光子被具有2.48ev或更高的光子能量的内源性(细胞内)分子(例如卟啉或核黄素)吸收，以产生活性氧单线态和活性氧。同时，低能光子被光敏剂外源性(细胞外)吸收，从而产生活性氧单线态和活性氧。内源性和外源性产生的活性氧单线态和活性氧物质都可以灭活、杀死或以其他方式降低组织、生物膜、唾液、皮肤、斑块和牙齿表面和粘膜中的微生物(例如细菌、病毒和真菌)的水平。
[0154]
在本发明的一个实施方式中，高能光子被细胞内氧化应激反应机制(例如过氧化物酶的黄素基团)吸收，从而破坏病原体治疗的适应性。
[0155]
在另一个实施方式中，通过将至少一种光敏剂与载体一起施加在目标上(例如组织、生物膜、唾液、皮肤、斑块和牙齿表面和粘膜上)，而与目标中的微生物(例如细菌、病毒和真菌)接触。因此，光敏剂可以以水溶液、含醇溶液、亲水凝胶、疏水凝胶、亲水聚合物、疏水聚合物的形式或以糊剂、洗剂、片剂、胶带、膏药或创可贴的形式施用。
[0156]
看起来高能光子和低能光子会以不同的深度渗透到微生物或组织、生物膜、唾液、皮肤、斑块和牙齿表面以及粘膜中。因此，通过本技术，活性氧单线态和活性氧物质产生在目标(例如组织、生物膜、唾液、皮肤、斑块、牙齿表面和粘膜)的不同深度处，从而灭活、杀死或以其他方式破坏微生物(例如细菌、病毒和真菌)，或至少减少其含量。
[0157]
正如将在具体参考一种革兰氏阳性细菌(变形链球菌，streptococcus mutans)的实施例中显示的那样，本技术对细菌是有效的。通常，革兰氏阳性细菌以链球菌属代表，例如化脓性链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、牛链球菌、咽峡炎链球菌、血链球菌、猪链球菌、轻型链球菌和肺炎链球菌、葡萄球菌，例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、棒状杆菌、李斯特菌、芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、雷氏杆菌、赖氏菌属和棒形杆菌。
[0158]
本技术所针对的另一组细菌由革兰氏阴性细菌代表，例如变形菌门、水状菌门、衣原体、拟杆菌门、绿菌门、蓝藻门、蓝藻门、纤维杆菌门、疣微菌门、浮游菌门、螺旋体门、酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、嗜热菌门、卟啉单胞菌和绿藻门中的细菌。具体实例包括：大肠杆菌、沙门氏菌，例如肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、莫拉氏菌、螺杆菌、寡养单胞菌、蛭弧菌、淋球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、卡他莫拉氏菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、幽门螺杆菌、牙龈卟啉单胞菌、放线共生放线杆菌和不动杆菌属的细菌，例如鲍曼不动杆菌、阿尔伯不动杆菌(acinetobacter albensis)和蜂属不动杆菌(acinetobacter apis)。
[0159]
该治疗对病毒也有效，例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、小核糖核酸病毒、披膜病毒、正粘病毒、弹状病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒和肝炎病毒。
[0160]
该治疗也显示出对真菌如念珠菌属特别是白色念珠菌的有效性。
[0161]
如下文详细讨论的，光敏剂可以与载体混合，以提供溶液、凝胶、糊剂、洗剂或甚至膏药、胶带、片剂或创可贴形式的光敏剂，其能够应用在目标组织或其他生物表面的生物膜或感染区域。
[0162]
光敏剂通常以例如凝胶的液体形式以约0.01mg/ml至10g/ml，例如0.1mg/ml至1g/ml的量施用。
[0163]
在一个实施方式中，通过使用抗菌光电组件及其装置，同时发射被内源性分子吸收的高能光子和被外源性分子吸收的低能光子来实施上述任何一个实施方式的方法。
[0164]
在进一步的实施方式中，在上述任一个实施方式所述的方法中使用的抗微生物光电组件及其装置发射高能光子和低能光子，并且馈入电压或电流彼此独立地以1hz至1ghz的频率交替或脉冲。
[0165]
在进一步的实施方式中，在上述任一个实施方式所述的方法中使用的抗微生物光电组件及其装置同时发射高能(在2.48ev至1.24ev的范围内)光子和低能光子(在3.5ev至2.8ev的范围内)。根据该实施方式，该光电装置可包括任选的光电检测器，以检测内源性和外源性分子或其光分解副产物的光致发光。
[0166]
一个实施方式包括具有多个串联或并联连接的半导体芯片的光电组件及其装置，这些芯片的发射能量可以分别在2.48ev至1.24ev的范围内以及在3.5ev至2.8ev的范围内变化。
[0167]
要治疗的目标区域可能会有所不同。在一个实施方式中，该区域为约0.1cm2至4cm2。这种有限的治疗区域通常用于局部治疗，例如用于治疗哺乳动物皮肤的一部分或其他表现出感染或生物膜或两者兼有的其他区域。在另一个实施方式中，治疗区域为约10至100cm2。该区域适用于牙齿治疗的情况，可以通过使用咬嘴来达到。
[0168]
指向目标区域的功率或瓦数通常在0.01w至500w的范围内变化，特别是约0.1至50w，例如1至25w。
[0169]
在一个实施方式中，光以0.001w/cm2至2kw/cm2，优选0.01w/cm2至20w/cm2，特别是约0.050w/cm2至约10w/cm2指向目标区域。
[0170]
作为治疗的结果，目标区域的温度通常会升高。在一个实施方式中，温度升高在约0.1至20℃的范围内变化，例如0.2至10℃。特别是约0.5至5℃。特定治疗部位的局部峰值温度可以在有限的时间(通常小于30秒，特别是小于15秒)内超过上述值。
[0171]
在根据本发明的实施方式中，在光电装置用于产生和传递光动力辐射能以预防或治疗疾病的方法中，包括以下步骤：
[0172]
(i)在多个能级产生非相干辐射光能；
[0173]
(ii)提供能够吸收至少一部分辐射能的介质或分子；
[0174]
(iii)以基本精确的光能波长传送光能，该光能波长需要光活化能够吸收至少一部分辐射能的介质或分子；预防或治疗疾病治疗；和
[0175]
(iv)通过内源性地、外源性地或内源性和外源性二者地在所述目标中产生活性氧单线态和活性氧物质来预防或治疗性治疗目标。
[0176]
本发明的一个实施方式是，该光电装置用于病原微生物(例如细菌、病毒或真菌)的程序性细胞死亡，其由高光子和低高光子和内源性光敏化合物或多种不同化合物的组合控制。
[0177]
如上所述，在一个实施方式中，上述任一实施方式的光治疗通过光动力疗法(pdt)进行。此类疗法包括光和被光激活的无毒目标分子。目标分子吸收光子的能量并达到激发态。然后，目标分子可以通过光子(荧光)的发射、热量的发射或形成所谓的三重态退出该状态。然后，这种三重态可以通过电荷转移(i型反应)或能量转移(ii型反应)与氧反应。在i型机制中，电荷被转移到底物或分子氧上，产生活性氧物质，如过氧化氢和氧自由基，如超氧
离子或羟基自由基。在ii型机制中，仅能量-而不是电荷-直接转移到分子氧，由此产生高活性单线态氧(1o2)。
[0178]
pdt的抗菌作用基于光照时的氧化爆发，并依赖于对细胞结构和分子的破坏，因此是一种非特异性机制。这种爆发是非常有反应性的，因此有效范围短于0.3微米，从而使治疗位置特定。
[0179]
不同作用机制和活化波长之间的比率是目标分子特异性的，因此必须针对某些光和目标分子组合物专门设计pdt、ptt和pht治疗。一些光敏剂或目标分子具有更高的发热能力，而另一些则通过三重态形成而进行反应。例如，吲哚菁绿(icg)以热量的形式释放超过80％的吸收能量，但卟啉的单线态氧量子产率在0.5至0.8之间。因此，由于病原体杀灭的确切机制可能会变化，因此光敏剂的选择也将治疗的分类定义为光动力、光热或光热治疗。
[0180]
光热效应与病原体的局部加热有关。一种可能的病原体杀灭方法是使用具有适当波长的病原体选择性发热光敏剂来局部加热目标病原体。众所周知，由于缺乏活跃的血液循环和导热性，生物膜的冷却能力低于健康组织。
[0181]
除了外源性光敏剂激活外，所施用的光子还可以通过与病原体内源性分子的相互作用来影响病原体。黄素和卟啉光反应在蓝光诱导杀死细菌的内在机制中至关重要。
[0182]
植物光敏素、蓝光感应黄素结合蛋白和/或无铁卟啉有几种细菌对应物。细菌中的三大类黄素光传感器，lov(光、氧、电压)域、bluf蛋白(使用黄素腺嘌呤二核苷酸fad的蓝光传感)和隐花色素调节响应蓝光的多种生物活动。
[0183]
细菌lov蛋白表现出多种与光响应lov结构域相关的效应结构域，例如组氨酸激酶、转录调节剂、假定的磷酸二酯酶和应激因子调节剂，指出它们作为传感和信号蛋白的生理作用。因此，某些能量光子的施用可能会改变细菌对给定疗法的反应。大量的细菌lov蛋白是组氨酸蛋白激酶超家族的成员。组氨酸激酶是多功能的，并且在细菌中通常是转移酶类的跨膜蛋白，其在跨细胞膜的信号转导中起作用。例如，负责抗药性的细菌流入泵可以是组氨酸激酶。组氨酸激酶受体激活可以位于周质感应、跨膜感应或细胞质感应中。
[0184]
bluf蛋白可以通过与dna结合蛋白相互作用的光敏蛋白来控制与光合作用相关的基因的表达。许多bluf蛋白在bluf结构域下游携带额外的具有酶促或其他特性的结构域，并且这些蛋白中的大多数似乎是同源二聚体。例如，名为blrp1的蛋白是来自肺炎克雷伯菌的二聚环核苷酸磷酸二酯酶，其在光照条件下显示出四倍的酶活性增加。appa和pac只是许多带有bluf结构域的光敏蛋白的两个例子，这些蛋白大约有100个氨基酸残基长，负责光的检测，被称为“1组”蛋白。许多其他bluf蛋白的氨基酸残基少于200个，被称为“ii组”蛋白。这些蛋白在每个亚基中仅具有bluf结构域，但可能在c端区域携带稳定性所需的二级结构元件。
[0185]
光解酶和隐花色素蓝光光感受器是具有不同功能的进化相关的黄素蛋白。与隐花色素，光解酶修复了许多种类的细菌中受紫外线损伤的dna。
[0186]
在抗病毒治疗中，病毒群同时被三种或更多抗病毒药物靶向。
[0187]
在抗真菌治疗中，真菌群体同时被一种、两种、三种或更多种抗真菌药物靶向。
[0188]
如上文所述的一个实施方案中，结合有益剂的施用位点的外源性效应与病原体内部分子在其功能环境中受到影响的内源性效应来进行治疗，其中有益剂的施用位点由细胞壁结构、eps基质、细胞间信号传导构成。
[0189]
这种治疗以关键功能位点和内外膜结构为目标，产生细菌氧化应激反应机制和温度应激难以控制的氧化爆发，从而进一步破坏细胞壁和细胞质膜的稳定性。所描述的大规模攻击远远超出了传统的pdt，因为病原体和病原体种群在不同位置受到外源性和内源性氧化和温度爆发的攻击。
[0190]
pdt、pht和ptt也可以通过如下方式来增强：添加活性分子或破坏细胞壁结构的消毒剂化合物、能够改变细胞壁稳定性的消毒剂，目标区域的外部加热，使用可充当活性氧转运剂的单线态氧清除剂、使用去除二价离子从而破坏革兰氏阴性菌的细菌细胞壁稳定性的离子清除剂，使用离子泵抑制剂增加光敏剂的内源浓度，应用免疫反应刺激剂、微生物外排泵抑制剂、蛋白转运例如孔蛋白刺激剂，应用抗生素来降低病原体的活力，以及将抗生素或抗菌物质作为光敏剂或与光敏剂结合使用。
[0191]
一个实施方式包括在第一时间段使用第一光敏剂和在第二时间段使用不同于第一光敏剂的第二光敏剂。通常，可以分别使用第一光和第二光激活第一光敏剂和第二光敏剂。优选地，第一和第二光敏剂组合使用，或交替使用或在治疗期间的预定时间点使用它们中的至少一种。
[0192]
在一个实施方式中，第一光敏剂选自包括高能光子活化光敏剂(“i型光敏剂”)的组，而第二光敏剂选自包括低能光子活化光敏剂(“ii型光敏剂”)的组。
[0193]
一种潜在的治疗方法是根据治疗期间观察到的疗效调整i型和ii型机制的治疗比例。治疗可以同时结合i和ii机制，或更多地依赖其中一种机制，并以特定的时间间隔添加/替换通过以另一种机制起作用的化合物，以进一步提高治疗疗效。
[0194]
例如，将ii型光敏剂与低能光子和高能光子结合，并间歇添加i型光敏剂或通过电荷转移过程产生活性氧的色素。一种可能的组合是将ii型光敏剂吲哚菁绿与具有高能和低能光子的i型光敏剂姜黄素组合。当检测到特定情况时，还可以监控治疗并改变机制。
[0195]
在一个实施方式中，通过在黑暗期间脉冲光以允许例如氧气的目标分子的补充来实现治疗增强，或者通过在治疗中添加额外的目标分子例如超氧化水或氧生成化合物，例如过氧化氢来实现治疗增强。该实施方式特别旨在增加存在的氧气量以增强光动力疗法的效果。
[0196]
脉冲之间的等待时间可以是治疗脉冲长度的0.01到100倍。这一点尤其重要，因为最大治疗功率受到发热和散热的限制。如果以允许产生活性氧的方式传递光，则治疗更有效并且治疗所需的时间更短。
[0197]
高能光子和低能光子的使用是有益的，因为不同能量的光子具有不同的组织刺激特性。低能光子可以使2cm深度的有益组织加热2.7度。这会增加氧分压和血液循环，从而刺激细胞的新陈代谢，包括促进免疫反应。
[0198]
高能光子，尤其是能量为3.06ev的光子，具有内源性细菌杀灭效应，但该波长对组织的渗透力有限。这些相同的目标分子可以通过光子上转换反应激活，其中两个或更多光子同时吸收以将目标分子激发到更高的能量状态。
[0199]
在一个实施方式中，3.06ev和1.53ev的选择是特别好的组合。1.53ev的光子能量恰好是3.06ev的光子能量的1/2，但它具有更高的组织渗透性。因此，通过使目标同时吸收1.53ev光子和3.06ev光子，可以激发内源性卟啉，从而产生除组织愈合作用之外的抗菌作用。高能光子减少生物膜胞外多糖基质的形成，与外源性pdt协同作用，降低生物膜的致病
性。
[0200]
本发明适用于治疗由病原体如细菌、病毒和/或真菌引起的皮肤、口腔、牙齿表面、牙龈、粘膜、喉咙和生殖器的病症。
[0201]
还可以执行该方法使得光仅用于刺激组织。
[0202]
pdt治疗是非特异性的，因此对其产生抗药性很困难。通过使用通过单线态氧、电荷转移和发热起作用的不同类型的光敏剂，可以提高pdt治疗的稳健性。在热诱导病原体杀灭方面，光热疗法从根本上比pdt更强大。这两种技术具有协同效应，使得这些高效系统的组合成为可能。
[0203]
即使治疗是高度稳健的，也会发生更多抵抗细菌的治疗的选择性。在口服环境中，可以通过将治疗集中在有利的区域而不治疗其他区域来缓解这种情况。与抗菌漱口水相比，这将保持口腔菌群的变化最小，并在有利的部位(例如牙齿和牙龈表面)提供有效的细菌杀灭。
[0204]
光系统还可以包括组织刺激光，例如近红外光，其可渗透入组织并刺激血液循环和免疫反应。
[0205]
除了加强pdt和ptt治疗外，光还可以用于刺激牙齿骨形成，并且可以使用装置热量来增加氟化物与牙釉质的结合。
[0206]
装置具有重要的生热表面功能，可提高治疗效果，增加氟化物结合率，还有助于氟化物和光敏剂通过热扩散更深入地渗透到生物膜中。这进一步提高了治疗效果。
[0207]
当生物膜从0小时老化到96小时的成熟生物膜时，生物膜代谢和细菌组成发生变化。这给pdt治疗带来了压力，因为0h、12h、24h、32h、48h、72h和96h的不同年龄的生物膜需要不同的治疗才能获得最有效的整体治疗结果。
[0208]
在本技术中，优选光敏剂对生物膜具有特异性，使其固有的光学和光特性(反射、吸收、荧光、透射、漂白)成为检测和测量细菌生物膜特性例如覆盖率和厚度的手段。
[0209]
吸收的光还会加热目标组织，从而可以通过比较不同组织位置的温差来测量组织健康状况。特别是通过热量监测，可以检测到癌症组织或炎症，因为与健康组织相比，它们的冷却能力较低。吸收和随时间变化的漂白和荧光强度可用于测量生物膜厚度和细菌数量，从而更好地跟踪目标区域的疾病状态或整体健康状况。监测对于监测慢性牙周炎和牙龈健康以及早期发现癌症特别有用。
[0210]
出于监测治疗的目的和为了连续治疗的安全性，当用荧光显微镜设置监测光敏剂的吸收最大值时，光敏剂可以对目标组织具有选择性，从而导致目标生物膜中的光吸收高于清洁牙本质或健康组织。监测数据可用于调整治疗以适应治疗过程中的变化，例如一种或多种光敏剂的漂白或将电源导向到高生物膜区域或计划个性化的治疗选项，例如更频繁地使用、引导将机械清洁集中到特定区域或推荐专家访问。
[0211]
可以通过再矿化部位和牙釉质消失部位的不同光吸收和发射来监测矿化过程。特别是将蓝光与nir光一起使用可以同时检测更深的蛀牙以及牙齿和牙釉质的表面变化。
[0212]
吲哚菁绿与病原体结合后会发生红移，可以通过测量红移和光漂白率来量化和表征生物膜及其总量。光漂白的总吸收和速率对应于生物膜的厚度和生物膜中活性物质的量。此外，光谱仪分析可用于检测斑块特性，例如糖水平、ph值、脂肪、卡路里量、蛋白质量、生物膜中细胞外多聚物质的量。出于这些目的，治疗中使用的光电装置可以结合微型光谱
仪传感器、温度传感器、光传感器、ph传感器、力传感器、陀螺仪、压力传感器。
[0213]
两种或多种光子可以同时吸收以产生具有不同荧光和化学性质的超激发态。超激发态的能量高于正常激发态。超激发态形成的速率可用于量化生物膜厚度并检测组织更深处的病原体。
[0214]
如前所述，可以通过抑制微生物流出泵、影响生物膜外部和内部eps基质、影响病原体的外部结构、通过破坏病原体与病原体的通讯或群体感应、向目标部位提供更高的浓度或氧气或活性氧、刺激免疫反应、促进氧化应激转移、酶的使用、增加病原体和生物膜的对活性物质的吸收、添加单线态氧的化学猝灭剂(类胡萝卜素、β-胡萝卜素和α-生育酚)来增强治疗效果。添加无机盐，特别是碘化钾，添加二价离子、抗菌肽、消毒剂、载液和抗生素。光子可用于激活和增强抗生素的作用，以及与抗生素治疗一起减少/防止细菌抗生素抗性形成，并刺激组织愈合和免疫反应。
[0215]
治疗可结合使用抗生素和消毒剂以达到协同抗病原体作用。例如，使用氯己定光疗以靶向生物膜是口腔消毒的新方法。附录iii所示的氯己定对变形链球菌生物膜的双波长光动力疗法治疗的结果是全新的。高能和低能光子与光敏剂的使用大大增加了对生物膜的抗菌作用，从而为改善生物膜治疗提供了有前景的新方法。有效性基于光子和阴离子光敏剂能够深入生物膜并提供有效杀灭生物膜内部和表面细菌的能力。氯己定的作用大多只存在于生物膜表面。高能光子减少了生物膜eps基质的形成，从而进一步提高了后续治疗中氯己定的有效性。
[0216]
可能的对目标部位的活性成分应用方法由水溶液、含醇溶液、含氯己定溶液、亲水凝胶、疏水凝胶、亲水聚合物、疏水聚合物、糊剂、洗剂、胶带、膏药或创可贴组成。
[0217]
上述类型的水溶液包括漱口水。特别地，光敏剂与氯己定溶液或漱口水一起使用。
[0218]
在一个实施方式中，有益剂与装置一起递送，该装置可以是1nm至10mm厚的膜、凝胶、乳液，其可以由聚合物、无机分子网络、纳米/微米颗粒/纤维组装体、纤维网络、无纺布、泡沫、水凝胶、糊剂或这些成分的组合构成。
[0219]
具有有益剂的基材可以附着、放置在顶部或内部或与施加光的光电装置分开。
[0220]
在一个实施方式中，例如icg的有益剂被保存在疏水或两亲性介质中以更好地稳定储存和易于施用。这可以通过将有益物质掺入膜或凝胶中或掺入疏水或两亲性载液或凝胶中来实现。在这种应用上是以dmso为主要溶剂的凝胶。干凝胶由具有凝胶状特征的疏水物质组成，例如其中一种成分是聚二甲基硅氧烷(pdsm)的凝胶。凝胶可归类为缓释凝胶，活性物质可单独或与归类为抗生素的分子一起掺入凝胶中。
[0221]
由有机或无机聚合物组成的膜、凝胶或乳液，其中包含光敏剂和可能嵌入的一种或多种增强化合物。膜、凝胶和乳液可以具有毛细作用，因此当放置在潮湿的表面时，水会进入。膜、凝胶和乳液对治疗光是透明的。膜、凝胶或乳液可以由聚合物组成，这些聚合物可以留在治疗表面上，用于后续治疗和保护部位免受其他病原体和污垢的侵害。膜、凝胶或乳液的特别用途是治疗口疮性口炎病变、疱疹疮和皮肤伤口。
[0222]
薄膜、凝胶或乳液可以部分或全部制成水溶性的，其中水溶性聚合物是支链淀粉、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、海藻酸钠、聚乙二醇、黄原胶、黄蓍胶、瓜尔胶、金合欢胶、阿拉伯胶、聚丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯共聚物、羧乙烯基聚合物、淀粉酶、高淀粉酶淀粉、羟丙基化高淀粉酶淀粉、糊精、果胶、甲壳素、壳聚糖、果聚糖、爱生兰
(elsinan)、胶原蛋白、明胶、玉米醇溶蛋白、谷蛋白、大豆蛋白分离物、乳清蛋白分离物或酪蛋白。
[0223]
两个光源可以制作在同一个led外壳中，也可以并入一个发光面。高能光子和低能光子之间的发射量可以从50％-50％分布到1％-99％，反之亦然，99％-1％或介于两者之间。将低能光子和高能光子放在一起有助于提供更安全的解决方案，因为光子通过不同的机制发挥作用，具有不同的光学特性，并且所需的总强度低于仅具有高能或低能光子的强度。
[0224]
基于以上所述，第一实施方式提供了一种光电装置，其能够在具有或不具有光敏剂的情况下发射主要能量在2.8ev至3.5ev之间的高能光子和主要能量在1.24ev至1.65ev之间的低能光子，从而能够实施在长期使用的预防性和治疗性牙齿/口腔护理中实现持续抗微生物作用的方法。
[0225]
第二实施方式提供了上述类型的光电装置，其中两个波长同时或彼此以100ms的时间间隔发射。
[0226]
光电装置可包括具有两个或更多个发光表面(epi)的发光组件。
[0227]
光电装置还可以包括能够监测治疗进展、斑块量的传感器。优选的是，光电装置能够基于监控反馈来调节治疗光。
[0228]
光电装置的不同设计是可能的。该装置可以是牙刷式的形状，可以是吸嘴或棒状照明器。用于治疗的光电装置可以包含微型光谱仪传感器、温度传感器、光传感器、ph传感器、力传感器、陀螺仪和压力传感器。
[0229]
基于上述内容，本技术还提供了一种用于治疗组织、生物膜、唾液、皮肤、斑块、牙齿表面和粘膜中的微生物、病毒或真菌感染的试剂盒。该试剂盒包括至少两个组件，即光电组件或其装置和至少一种光敏剂。光电组件或装置能够同时发射由高能量组成的第一光和由低能量光子组成的第二光。通常，所述第一光和所述第二光占从光电组件或装置发射的所有光的至少80％。光敏剂是能够被高能光子和低能光子中的至少一个激活的光敏剂，优选二者。光敏剂可以是上述任何种类。因此，试剂盒的光敏剂优选以以下形式提供：
[0230]
进一步地，基于上述，以下代表优选实施方式：
[0231]
1.用高能光子和低能光子和牙菌斑特异性光敏剂监测牙菌斑的方法。
[0232]
2.实施方式1的方法，其中，低能光子吸收到菌斑特异性光敏剂检测早期菌斑，而高能光子激活生物膜卟啉分子检测旧生物膜。
[0233]
3.实施方式2的方法，其中，光敏剂是吲哚菁绿。
[0234]
4.实施方式1-3的方法，其中，滤波器位于观察者眼睛或检测器组件之间。
[0235]
5.实施方式4的方法，其中，405/810nm光的特定滤波可用于增强自发荧光的检测，或icg光吸收或光发射能力的检测。滤波器可以位于照明led光源的前面，或位于摄像单元的前面。滤波可以是低通、高通或带通滤波或它们的任何组合。因此，可以检测一种或多种自身荧光并将其信息组合。
[0236]
6.实施方式1的方法，其中，菌斑的双重作用可用于菌斑分析。首先使用有或没有特定滤波的405/810峰值led测量菌斑的自发荧光，然后在结合或不结合icg的光发射的情况下测量icg对光的吸收。
[0237]
7.—种用于光动力或光热疗法的装置，能够检测治疗进展的变化，可能但不限于
通过监测光敏剂的光漂白、生物膜的厚度、生物膜的密度、生物膜的ph值和细菌生物膜的组成。
[0238]
8.可用于监测生物膜的厚度、密度、染料结合以及机械和化学特性的传感器。传感器可以检测一种或多种波长的光吸收和一种或多种波长的光发射，或执行荧光或吸收光谱测量。
[0239]
9.装置可以有一个或多个传感器和一种算法，该装置可以通知用户并根据传感器反馈调整设备操作。
[0240]
10.传感器可以通过nir光吸收或荧光读数或两者同时监测吲哚菁绿光漂白。传感器还可以监测405nm吸收与icg吸收的比率。生物膜厚度、密度和细菌组成可以根据治疗过程中的icg吸收和光漂白率进行评估。细菌和生物膜组成可以通过405nm光吸收和780nm、810nm光吸收的比率来测量。
[0241]
11.icg在水相和结合相中的状态可以通过780nm和810nm吸收比来评估。可以根据icg吸收光谱的偏移来估计细菌生物膜的ph值。
[0242]
12.810nm和830nm波长的icg荧光及其比值可用于检测游离icg和结合icg和检测抗菌活性位点。
[0243]
13.装置可以在icg吸收测量部位利用或产生变化的电场来观察生物膜的机械和化学特性。
[0244]
14.带有传感器的装置可以具有算法和不限于陀螺仪的附加传感器，以允许确定治疗区域的位置并且可以将传感器读数精确定位到该位置。
[0245]
其他优选实施方式由以下表示
[0246]
1.一种包含光敏化合物和介质的组合物，所述介质包含：
[0247]
(i)水相；
[0248]
(ii)主要能量在2.8ev至3.5ev之间的高能光子；和
[0249]
(iii)主要能量在1.24ev至1.65ev之间的低能光子。
[0250]
2.一种组合物，包含光敏化合物和介质，所述介质包括：
[0251]
(i)pdms凝胶；
[0252]
(ii)生物膜；
[0253]
(iii)主要能量在2.8ev至3.5ev之间的高能光子；和
[0254]
(iv)主要能量在1.24ev至1.65ev之间的低能光子。
[0255]
3.实施方式1或2的组合物，其中所述光敏化合物选自在1.24ev至1.65ev的能量范围内的光子吸收组。
[0256]
4.实施方式1至3中任一项所述的组合物，其中所述光敏化合物是吲哚菁绿。
[0257]
5.实施方式1至4中任一项所述的组合物，其中所述光子在3.17ev至2.95ev以及1.56ev至1.45ev中具有至少50％的能量。
[0258]
以下实验说明本技术的使用，在一些实施方式中进一步结合双光治疗：
[0259]
实验
[0260]
在第一系列测试中，在用滨松1394和nir光源治疗后，在室内光线下观察到了染料斑块的特异性。
[0261]
如图1和图2分别所示，牙齿和牙龈的非生物膜区域与存在生物膜的区域之间存在
明显的强度差异。
[0262]
然后可以将治疗集中在生物膜区域，在图1中表示为深色，在图2中表示为较低的灰度值。
[0263]
在第二系列测试中，评估了双波长pdt对氯己定的增强作用。结果如图3所示，这表明多波长pdt与氯己定的组合比对照和仅使用一种波长的治疗产生更强的效果。
[0264]
在第三系列测试中，分别比较了变形链球菌生物膜对多波长和单波长pdt治疗的适应性。
[0265]
进行了两个单独的单物种生物膜模型实验，以研究重复发生的光动力疗法对生物膜形成的影响。变形链球菌生物膜实验根据生物膜年龄和施用的治疗分为不同的类别。
[0266]
对1天、2天和4天龄的生物膜进行一次性pdt治疗。然后将这种效果与每天治疗的4天龄的生物膜进行比较，并假设在每天治疗的样品中生物膜生长会受到强烈抑制。在最后一次光动力疗法治疗后，通过连续稀释cfu方法评估细菌的生存力。
[0267]
材料和方法
[0268]
变形链球菌(atcc 25175)细菌在bhi-肉汤(bio-rad 3564014)的生长室(36℃，5％co2)中生长超过18小时。所得细菌悬浮液用0.9％nacl悬浮液稀释至光密度为0.46。
[0269]
通过在每个孔中加入100μl稀释的变形链球菌悬浮液和100μl bhi-肉汤培养基，使生物膜在孔板的底部生长。细菌平板在生长室(36℃，5％co2)中培养，每天更换bhi-肉汤培养基。
[0270]
曝光：
[0271]
在曝光前，用吲哚菁绿悬浮液代替生长培养基，室温避光培养10分钟。培养后，用0.9％nacl溶液洗涤生物膜两次。根据所需光量和已知强度计算治疗时间。
[0272]
通过将孔板置于已知的led光源下进行曝光。使用thorlabs pm100d和s121c传感器头分析给定的光强度。改变治疗时间以产生所需的光量。
[0273]
cfu：曝光后，通过使用无菌接种棒将生物膜从孔板底部机械刮下，从孔中除去生物膜。然后将100μl所得细菌悬浮液以1:1至1:10000的不同稀释比例涂在bhi板上。
[0274]
测试和结果
[0275]
通过使用250μg/ml icg和810nm光完成了pdt连续治疗链球菌生物膜的第一个实验。生长1天、2天、4天的不同年龄的生物膜，并且对每个生物膜进行一次治疗，以评价一次性治疗对不同年龄生物膜的影响。
[0276]
除了这三个测试之外，还生长了一个4天龄的生物膜，该膜每天都接受pdt治疗。最初的假设是每天治疗的生物膜的cfu接近于零。单波长治疗的结果显示在图10中，该图显示了pdt治疗对1、2和4天龄的变形链球菌生物膜的功效。制成了4天龄的生物膜的两种变体。一个每天接受pdt治疗，其他仅在第4天接受治疗。
[0277]
随着生物膜老化，对照中总细菌量的增长和pdt治疗对该生物膜模型的强烈影响如预期的那样。每天治疗的生物膜的不良治疗效果令人惊讶，因为人们普遍认为细菌不能对光动力治疗产生抗性。重复上述所有实验至少3次和4天，每天治疗过的生物膜重复12次以验证这一发现。
[0278]
当使用联合治疗时，没有观察到类似的效果。在这种治疗中，生物膜的目标是结合内源性和外源性治疗。之前在细菌平板研究中表明，需要70j/cm2的405nm光才能杀死变形
链球菌。在双重组合实验中，红光(峰值810nm)与蓝光(峰值405nm)组合。多光实验的重点是研究抗性诱导作用，因此它集中在每天进行光治疗和仅在第4天进行治疗的4天龄的生物膜模型中。假设是，日常治疗会导致最差的结果，如之前观察到的那样。实验结果如图7所示。
[0279]
图7是柱状图，显示分别用双波长和单波长pdt系统治疗的4天龄的生物膜。在双波长系统中，每天治疗和4天治疗之间的细菌杀灭没有明显差异，而单波长pdt在连续治疗中未能实现强力的细菌杀灭。
[0280]
因此，用双波长组合光治疗更有效，并且没有观察到细菌生物膜对治疗的适应性。
[0281]
似乎同时结合内源性和外源性光动力治疗将提高生物膜靶向pdt的效率。图6显示了与pdt相比，用405nm光治疗的抗菌效果。
[0282]
可以看出，405nm的光只有在超过70j/cm2的能量密度时才能显示出对变形链球菌的强效性。对于pdt，其灭杀效果要强得多。4j/cm2的剂量已经完全抑制了变形链球菌的生长。
[0283]
最后应该指出的是，在第四系列的测试中，治疗革兰氏菌(-)细菌获得了与上述相似的结果。
[0284]
与传统的pdt相比，高能和低能光子与光敏剂一起使用对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有更好、更稳定和更强大的抗菌效果，传统pdt可能对革兰氏阴性菌或阳性菌物种缺乏有效性，因为不同的细胞壁结构对不同性质的光敏剂敏感。建议使用活性物质的高能和低能光子治疗，因为它对治疗区域革兰氏阴性菌和阳性菌之间的平衡影响最小。
[0285]
图7是柱状图，其显示pdt治疗14天后对变形链球菌生物膜的抗微生物效果的条形图。每对左侧的条形表示100j光治疗的结果，右侧条形表示50j光治疗的结果。显而易见，目前的光治疗对微生物非常有效。
[0286]
工业实用性
[0287]
本发明可用于为美容目的以及其他非治疗用途进行的检测。它还可以用于抗细菌和抗病毒以及抗真菌的检测和治疗。因此，一般来说，可以检测并任选地治疗生物膜、牙菌斑中和牙齿表面上的病毒或真菌感染。