一种防治松材线虫及其媒介昆虫松墨天牛的CuBTC纳米农药制剂的制作方法

一种防治松材线虫及其媒介昆虫松墨天牛的cubtc纳米农药制剂
技术领域
1.本发明涉及纳米农药制剂技术领域，具体涉及一种防治松材线虫及其媒介昆虫松墨天牛的cubtc纳米农药制剂。


背景技术：

2.松墨天牛作为松材线虫病的主要传播媒介昆虫，受到广泛的关注，原因在于松材线虫是我国危害较大的外来入侵物种之一，也是松树枯萎病的病原。被松材线虫感染后的树木，其水分运输、光合作用、呼吸和蒸腾作用均会受到抑制，树皮变得干枯，针叶开始褪绿，变成褐色，逐渐萎蔫至死亡，给我国的林业造成了巨大的经济损失。松墨天牛成虫不仅能在取食过程中传播松材线虫，其幼虫也会蛀食衰弱松树的皮层和边材，造成不规则的扁平坑道，后蛀人木质部，导致松树逐渐枯死。目前，针对松墨天牛幼虫没有很好的防治措施，而成虫啃食叶片，较先进的治理办法是通过无人机喷洒微胶囊混剂，有较好的触杀效果，然而不稳定的微胶囊形态以及突释现象明显等问题为成虫的防治带来阻碍。松墨天牛现有的防治方法是通过注射的方式将农药注射到树干里，由于大多农药为疏水性的，很难在树干内运输，无法实现对松墨天牛的胃毒或触杀。因此，急需一种行之有效的方法来共同防治松墨天牛。
3.纳米农药制剂是指利用纳米材料与制备技术，将原药、载体与辅剂进行高效配伍创制的农药制剂产品。利用纳米技术将农药粒子从传统的5μm降至200nm，农药的功能得到充分的发挥。相比较于传统的农药剂型，本发明涉及的纳米材料cubtc具有更小的尺寸、更大的比表面积，从而具有更好的分散性、更强的吸附力和更好的利用率。此外，纳米农药制剂的载体cubtc通过对农药分子的包封，可提高农药分子在环境中的稳定性。纳米颗粒间的摩擦力(摩擦力源于静电力、范德华力和表面吸附力)非常显著，纳米颗粒包含大量的孔隙，其比表面积大，从而使得药剂可以稳定负载在纳米材料中。
4.除虫菊素(pyrethrins)是采用人工种植的除虫菊的花经溶剂法提取的浸膏配制而成，属菊科，是一种多年生宿根性植物，除虫菊素是一种典型的神经毒剂，具有触杀、胃毒和驱避作用，能对周围神经系统、中枢神经系统及其他器官组织同时起作用，对害虫击倒力强，杀虫谱广，使用浓度低，另除虫菊素是由除虫菊花中萃取的具有杀虫活性的六种物质组成，因此杀虫效果好，昆虫不易产生抗药性，可用于制造杀灭抗性很强的害虫的农药。除虫菊素具有杀虫和环保两大功能，对人、畜低毒，对植物及环境安全，是任何化学杀虫剂无法相比的，其特征和优势在于：
5.(1)对哺乳动物低毒：除虫菊素是现有的杀虫剂中毒性最低的产品之一，即使偶然吞咽也会很快代谢；
6.(2)高效广谱性：由于除虫菊素中含有一组结构相近的杀虫成分，所以对杀虫有高效广谱性。
7.(3)触杀作用极强，致死率极高，且使用浓度低。
8.(4)作用快速：除虫菊素具有快速击倒、堵死气门致死的触杀作用。
9.但除虫菊素具有对光、热、酸、碱均不稳定易分解，暴露于空气中易氧化而失去杀虫活性，必须避光冷藏的缺点。目前，还未有将除虫菊素用于防治松材线虫及其媒介昆虫松墨天牛的相关报道，所以如何克服上述缺点并将除虫菊素用于防治松材线虫及其媒介昆虫松墨天牛，是需要解决的问题。


技术实现要素：

10.针对上述现有技术，本发明的目的是提供用于防治媒介昆虫松墨天牛纳米农药制剂。本发明将除虫菊素负载到cubtc纳米农药载体上用于防治松材线虫及其媒介昆虫松墨天牛，有效解决了传统农药制剂药效低、可控性差、无法杀死树干内害虫、害虫易产生抗药性等问题。
11.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
12.本发明的第一方面，提供除虫菊素在防治松材线虫及其媒介昆虫松墨天牛中的用途。
13.本发明的第二方面，提供一种负载除虫菊素的cubtc纳米农药制剂，由以下方法制备：
14.(1)将硝酸铜溶于甲醇中，超声分散至溶解，得到第一溶液；将1,3,5-苯三甲酸溶于甲醇中，超声分散至溶解，得到第二溶液；将第二溶液滴加入到第一溶液中，边滴加边搅拌，然后静置反应；反应结束后，离心、洗涤，冷冻过夜，最后冷冻干燥得到cubtc纳米农药制剂载体；
15.(2)将步骤(1)得到的cubtc纳米农药制剂载体分散到乙醇中，得到cubtc分散液；将除虫菊素溶于乙醇中，得到除虫菊素溶液；将除虫菊素溶液搅拌加入到cubtc分散液中，继续搅拌24～72h，离心收集沉淀，干燥，得到负载除虫菊素的cubtc纳米农药制剂。
16.优选的，步骤(1)中，所述第一溶液中，硝酸铜的浓度为1.0-2.0g/l。
17.优选的，步骤(1)中，所述第二溶液中，1,3,5-苯三甲酸的浓度为0.5-1.0g/l。
18.优选的，步骤(1)中，所述第一溶液和第二溶液加入的体积比为1:1。
19.优选的，步骤(2)中，所述冷冻的温度为-20℃～-80℃；所述冷冻干燥的温度为-56℃，冷冻干燥的时间为24～48h。
20.优选的，步骤(1)中，所述cubtc纳米农药制剂载体的尺寸200nm-500nm。
21.优选的，步骤(2)中，所述除虫菊素溶液与cubtc分散液加入的体积比为8:1。
22.优选的，步骤(2)中，cubtc分散液的浓度为2.5mg/ml，除虫菊素溶液的浓度为20mg/ml。
23.本发明的第三方面，提供负载除虫菊素的cubtc纳米农药制剂在防治松材线虫及其媒介昆虫松墨天牛中的用途。
24.本发明的纳米农药制剂分散到水中，采用无人机喷洒，进行成虫的防治；或者，将其分散到水中，采用注射的方式注入到松树中，进行松材线虫的防治。
25.本发明的有益效果：
26.(1)本发明以cubtc为载体负载除虫菊素制备得到纳米农药制剂；其中，作为载体的cubtc粒径均匀稳定，分散性好，不会出现团聚；而且cubtc内部为多孔结构，具有较大的
比表面积，载药量高，并且具有很好的缓控释效果。
27.(2)本发明所制备的纳米农药制剂由于其纳米尺寸，可以穿透植物的细胞壁屏障，将药物运输到树皮内，用于防治松材线虫和松墨天牛。
28.(3)本发明制备cubtc的合成方法简单、产率高，使用的有机溶剂可以回收利用，对设备要求低，不会造成环境污染，具有广阔的市场应用前景。
29.(4)除虫菊素吸附进cubtc后，可以有效防止除虫菊素的快速光解，大大提高了药物的利用率，并且减少了药剂的施用次数，实现了农药减量，环境友好。
附图说明
30.图1为实施例1制备的cubtc负载除虫菊素的tem电镜形貌图(远景图)。
31.图2为实施例1制备的cubtc负载除虫菊素的tem电镜形貌图(放大图)。
32.图3为实施例1制备的除虫菊素的紫外吸收标准曲线图。
33.图4为实施例1制备的fitc@cubtc松墨天牛幼虫横切面荧光图、肠道荧光图、肠道横切面荧光图以及在df-1细胞上的共聚焦摄取图：松墨天牛幼虫横切面明场图(a)和对应的荧光图(b)、中肠横切面明场图(c)和对应荧光图(d)、后肠横切面明场图(e)和对应荧光图(f)以及在df-1细胞上的共聚焦摄取图(g)。
34.图5为实施例1制备的cubtc负载除虫菊素在不同ph的pbs缓冲液下缓释速率图。
35.图6为实施例1、对比例制备的纳米农药的光解图
36.图7为实施例1制备的纳米农药的粒径分布图；
37.图8为对比例制备的纳米农药的粒径分布图。
38.图9为树干四层结构的划分示意图。
39.图10为除虫菊素在树干中的分布情况。
具体实施方式
40.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
41.正如背景技术部分介绍的，松材线虫靠松墨天牛成虫传播，松墨天牛的幼虫属钻蛀性害虫，以松树木质部组织为食。目前对于松墨天牛和幼虫缺少有效的防治方法，从松树外部施药很难杀死松墨天牛和幼虫；通过注射的方式将农药注射到树干中是较好的防治方式，但是大多数的农药均为疏水性的，很难在树干内运输，无法实现对松墨天牛幼虫的胃毒或触杀。
42.基于此，本发明提供了一种用于防治松墨天牛的新型纳米农药制剂，经研究发现除虫菊素对松墨天牛具有极强毒杀性，如果能将除虫菊素注干施药预防松墨天牛，将会是控制松墨天牛的一种有效、简便的方法，是预防具有重要价值的松树感染松材线虫病的有效手段。但是，除虫菊素为疏水性的，加之除虫菊素易光解，目前的技术难点在于如何使除虫菊素均匀分散并快速进入树干及虫体内以用于松墨天牛的防治。
43.解决除虫菊素疏水性和易光解的问题，本发明采用纳米载体负载除虫菊素，经发明人研究发现：对于不同的纳米载体，除虫菊素的负载量有差别，其分散性和传输性也各不
相同。本发明将硝酸铜溶于甲醇中，得到第一溶液；将1,3,5-苯三甲酸溶于甲醇中，得到第二溶液；将第二溶液滴加入到第一溶液中反应；得到一种cubtc纳米农药制剂载体，采用这种载体负载除虫菊素，其分散性、传输性以及防光解性最好，并且在虫体的体壁上具有优异的粘附性，实现了对松墨天牛和幼虫的胃毒或触杀。
44.本发明所使用的cubtc，目前主要是作为吸附剂和催化剂，还没有关于将cubtc应用至生产农药制剂中的相关研究，更没有关于如何通过cubtc负载农药除虫菊素防治松墨天牛的报道。
45.cubtc的尺寸、结构以及所带电荷的性质会影响其载药量、缓释效果和分散效果。本发明对cubtc的制备方法进行了优化，由于反应原料、反应溶剂的种类及配比会影响所制备的cubtc的产率、尺寸、结构以及所带电荷，因此，本发明对制备cubtc的原料、溶剂的种类及用量进行了考察，使本发明所制备的cubtc产率在98％以上，cubtc的尺寸在200nm-500nm之间，粒径均匀分散且稳定。
46.此外，本发明制备的cubtc属于mof家族的一种，是由金属-有机骨架构成，由于金属离子的骨架支撑作用，使获得的纳米粒子比常规的聚合物纳米球更稳定，分散性更好。内部几纳米尺寸的孔隙可以容纳大量的药物分子，载药量高；对光不敏感，光热不易降解，因此，采用本发明的cubtc作为载体包覆光敏性的药物除虫菊素，可以有效抵御除虫菊素的见光分解。
47.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
48.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
49.实施例1
50.(1)将0.72g硝酸铜溶于200ml甲醇中，超声分散至溶解，得到硝酸铜/甲醇溶液；
51.(2)将1.6g 1,3,5-苯三甲酸溶于40ml甲醇中，超声分散至溶解，得到1,3,5-苯三甲酸/甲醇溶液；
52.(3)将步骤(2)制备的1,3,5-苯三甲酸/甲醇溶液加入到步骤(1)的硝酸铜/甲醇溶液中，用磁力搅拌器(800rpm)边滴边搅拌25min，静置24h；反应结束后，所得溶液倒入离心管中,使用离心机(4℃，11000rpm，15min)离心得到沉淀，弃上清，加入纯净水超声洗3次，离心(11000rpm，10min，4℃)，以去除残余甲醇，再加入纯净水超声，盖上保鲜膜，橡皮筋勒紧，用针(注射器)扎孔，冷冻(-20℃)过夜，-56℃冷冻干燥48h(冷冻干燥机使用前需预制冷30min)，得到纳米载体cubtc；所得cubtc的产率为99.0％。
53.cubtc的产率＝(cubtc的实际产量/cubtc的理论计算产量)
×
100％。
54.(4)取5mg cubtc，溶于10ml fitc/h2o中，磁力搅拌2h。
55.(5)取步骤(3)制备的cubtc分散到乙醇中，得到浓度为2.5mg/ml的cubtc分散液；另取除虫菊素溶于乙醇，得到浓度为20mg/ml的除虫菊素溶液。
56.将除虫菊素溶液搅拌加入到cubtc分散液中，所述除虫菊素溶液和cubtc分散液加入的体积比为8:1，继续搅拌48h(300rpm)，离心收集沉淀，甲醇反复洗涤，真空干燥，获得cubtc负载除虫菊素的新型农药。
57.所得新型农药的载药量为68.8％，平均粒径为200nm。
58.其中，
59.包埋进cubtc中的除虫菊素的质量通过紫外分光光度计测量，然后利用标准曲线计算出浓度，再乘以溶液体积，换算出质量。
60.本实施例制备的cubtc负载除虫菊素的透射电镜如图1和图2所示，除虫菊素的紫外吸收标准曲线图如图3所示。
61.此外，cubtc具有很好的粘附性，当其粘附到松墨天牛体壁时，多次用水冲洗，cubtc仍能粘附在虫体的体壁上，并且可以沿体壁向体内快速扩散，实现触杀毒性作用，还可以通过喂食作用通过消化系统实现胃毒作用，同时具备两种不同方式的杀虫效果。图4为实施例1制备的纳米制剂粘附到幼虫体壁后，用清水冲洗幼虫体壁三次后，纳米制剂经fitc荧光处理后，在天牛幼虫的体表、气门和肠道分布图。由图4可以看出，实施例1制备的纳米制剂已渗入幼虫体内，清水冲洗后并没有冲掉幼虫体壁上的纳米制剂，说明本发明制备的纳米制剂粘附性好、在虫体内传输速度快。
62.实施例2
63.(1)将1.44g硝酸铜溶于400ml甲醇中，超声分散至溶解，得到硝酸铜/甲醇溶液；
64.(2)将0.8g 1,3,5-苯三甲酸溶于80ml甲醇中，超声分散至溶解，得到1,3,5-苯三甲酸/甲醇溶液；
65.(3)将步骤(2)制备的1,3,5-苯三甲酸/甲醇溶液加入到步骤(1)的硝酸铜/甲醇溶液中，用磁力搅拌器(800rpm)边滴边搅拌20min，静置24h；反应结束后，所得溶液倒入离心管中,使用离心机(4℃，11000rpm，15min)离心得到沉淀，弃上清，加入纯净水超声洗3次，离心(11000rpm，10min，4℃)，以去除残余甲醇，再加入纯净水超声，盖上保鲜膜，橡皮筋勒紧，用针(注射器)扎孔，冷冻(-80℃)过夜，-56℃冷冻干燥24h(冷冻干燥机使用前需预制冷30min)，得到纳米载体cubtc；所得cubtc的产率为98.6％。
66.(4)取5mgcubtc，溶于10ml fitc/h2o中，磁力搅拌2h。
67.(5)取步骤(3)制备的cubtc分散到乙醇中，得到浓度为2.5mg/ml的cubtc分散液；另取除虫菊素溶于乙醇，得到浓度为20mg/ml的除虫菊素溶液。
68.将除虫菊素溶液搅拌加入到cubtc分散液中，所述除虫菊素溶液和cubtc分散液加入的体积比为8:1，继续搅拌24h(300rpm)，离心收集沉淀，甲醇反复洗涤，真空干燥，获得cubtc负载除虫菊素的新型农药。
69.所得新型农药的载药量为70.2％，平均粒径为205nm。
70.实施例3
71.(1)将3.6g硝酸铜溶于1000ml甲醇中，超声分散至溶解，得到硝酸铜/甲醇溶液；
72.(2)将8g 1,3,5-苯三甲酸溶于200ml甲醇中，超声分散至溶解，得到1,3,5-苯三甲酸/甲醇溶液；
73.(3)将(2)中1,3,5-苯三甲酸/甲醇溶液加入到硝酸铜/甲醇溶液中，用磁力搅拌器(800rpm)边滴边搅拌30min，静置24h；反应结束后，所得溶液倒入离心管中，使用离心机(4℃，11000rpm，15min)离心得到沉淀，弃上清，加入纯净水超声洗3次，离心(11000rpm，10min，4℃)，以去除残余甲醇，再加入纯净水超声，盖上保鲜膜，橡皮筋勒紧，用针(注射器)扎孔，冷冻(-60℃)过夜，-56℃冷冻干燥36h(冷冻干燥机使用前需预制冷30min)，得到纳米
载体cubtc；所得cubtc的产率为98.3％。
74.(4)取5mgcubtc，溶于10mlfitc/h2o中，磁力搅拌2h。
75.(5)取步骤(3)制备的cubtc分散到乙醇中，得到浓度为2.5mg/ml的cubtc分散液；另取除虫菊素溶于甲醇，得到浓度为20mg/ml的除虫菊素溶液。
76.将除虫菊素溶液搅拌加入到cubtc分散液中，所述除虫菊素溶液和cubtc分散液加入的体积比为8:1，继续搅拌72h(300rpm)，离心收集沉淀，甲醇反复洗涤，真空干燥，获得cubtc负载除虫菊素的新型农药。
77.所得纳新型农药的载药量为71.5％，平均粒径为202nm。
78.对比例
79.(1)将0.72g乙酸铜和8g苯甲酸溶于200ml正丁醇中，室温搅拌至溶解，得到乙酸铜-苯甲酸/正丁醇溶液；
80.(2)将1.6g均苯三甲酸溶于40ml四氢呋喃中，室温搅拌至溶解，得到均苯三甲酸/四氢呋喃溶液；
81.(3)将步骤(2)制备的均苯三甲酸/四氢呋喃溶液逐滴搅拌加入到步骤(1)的乙酸铜-苯甲酸/正丁醇溶液中，室温反应6小时，待反应结束，8000rpm离心得到蓝色沉淀，并用四氢呋喃多次洗涤，离心收集沉淀，真空干燥，获得纳米cu-btc；所得纳米cu-btc的产率为99.0％。
82.(4)取5mgcubtc，溶于10ml fitc/h2o中，磁力搅拌2h。
83.(5)取步骤(3)制备的cubtc分散到乙醇中，得到浓度为2.5mg/ml的cubtc分散液；另取除虫菊素溶于乙醇，得到浓度为20mg/ml的除虫菊素溶液。
84.将除虫菊素溶液搅拌加入到cubtc分散液中，所述除虫菊素溶液和cubtc分散液加入的体积比为8:1，继续搅拌48h(300rpm)，离心收集沉淀，甲醇反复洗涤，真空干燥，获得cubtc负载除虫菊素的新型农药。
85.所得新型农药的载药量为39％，平均粒径为200nm。
86.试验例
87.1.光解试验
88.将除虫菊素、对比例制备的纳米农药、实施例1制备的纳米农药置于中性环境中进行光分解试验，并将实施例1和对比例制备的纳米农药分别置ph为5的酸性环境、ph为9的碱性环境中，进行光分解试验。经过试验后，检测除虫菊素的保留率，所得结果见图6。
89.注：光分解试验为：将20mg负载除虫菊素的cubtc粉末分散在10ml去离子水中，超声铺展在9.0cm培养皿中，然后在黑暗中自然干燥。培养皿暴露于紫外线下不同的时间和ph值，以除虫菊素原药和除虫菊素乳化液作为对照，同等质量浓度的除虫菊素原药用甲醇溶解，并在9.0cm培养皿中展开，而同等质量的除虫菊素乳化液直接在9.0cm培养皿中展开。不同组分的除虫菊素抗光解性能通过紫外分光光度计在254nm检测波长下进行测量。
90.图6中，实施例是在ph＝5和9下做的光解保留率，对比例是在ph＝5下做的光解保留率。从图6可以看出来，不同方法制备的cubtc都会对酸碱敏感，但是敏感度有区别，本技术在酸性或碱性环境中的光解率均低于对比例。而直接将除虫菊素原药暴露在紫外灯下，除虫菊素快速光解，保留率降低；除虫菊素乳化液的保留率稍高一些，但与cubtc负载的除虫菊素相比，乳化液的保护作用依然不够突出。与对比例的方法制备的cubtc相比，采用本
发明的方法制备的cubtc光解率低，除虫菊素的保留率高。
91.2.分散性试验
92.对比例制备的纳米农药、实施例1制备的纳米农药置于水中，在水中的分布情况见图7和8。由图7和8可知，采用本发明方法制备的纳米农药在水中分散性好。
93.对比例的cubtc的分散性很差，这在图8可以看出来，横坐标为粒径大小，因为对比例制备的纳米粒容易聚集，导致聚集态下粒径高达1000nm左右，少部分分布在100nm以内。而实施例1方法制备的纳米粒子的分散性很好，见图7，在1-10nm有少量的粒径分布，而主要集中在200-500nm之间。
94.3.传输速率试验
95.按照除虫菊素的浓度为1mg/l、10mg/l、50mg/l，将实施例1和对比例制备的纳米农药分别用水进行配制。然后分别注射到六棵直径相近，健康状况相同的松树树干中(注射深度均相同，均注射在图9中的第1层的表层)。
96.注：由于实施例1和对比例制备的纳米农药是除虫菊素负载到纳米载体上的，所以注射时根据除虫菊素的浓度计算纳米载体的浓度。根据计算出的纳米载体的浓度配置相应溶液注射到树干中。纳米载体的浓度＝除虫菊素的浓度/纳米载体的载药量。
97.根据图9将树干截面由外向内分成四层(即layer1～layer4)，六棵松树中每层的长度均相同。24h后，在注射位置，根据这四层的深度钻取碎屑，用高效液相仪分别检测碎屑中除虫菊素的浓度，所得结果见图10。由图10可知，除虫菊素的浓度为1mg/l时，实施例1制备的纳米农药已出现在树干中的第3层，对比例制备的纳米农药才出现在第1层。除虫菊素的浓度为10mg/l时，实施例1制备的纳米农药已出现在树干中的第4层，对比例制备的纳米农药才刚出现在第3层。除虫菊素的浓度为50mg/l时，对比例制备的纳米农药刚出现在第4层，但实施例1制备的纳米农药在第四层中的浓度已经很高(15mg/l左右)。由此可见，本发明制备的纳米农药其在树干中的传输速度更快，传输效率更高。
98.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。