制造包括富血小板血浆的组合物的方法、离心装置和可用于驱动所述方法的套件、组合物以及组合物的用途与流程

1.本发明涉及一种用于离心的方法、装置和用于制造包括富血小板血浆的组合物的装置、用于所述装置的套件、组合物本身以及组合物的用途。
2.本发明尤其具有制造组合物的有利应用，所述组合物包括从人类或动物患者采集的血液中获得的富血小板血浆。


背景技术：

3.一段时间以来，已知使用包括血液衍生物的组合物，例如富血小板血浆(通常称为“prp”)来治疗皮肤损伤和骨软骨或关节病变。prp是通过单次或双次离心过程从可能是人类或动物的患者身上采集的全血中获得的。双次离心可以分两步分离全血成分。
4.在第一步中，从含有血小板的血浆中分离血沉棕黄层(包括大多数白细胞)和红细胞。
5.第二步包括将血小板以颗粒形式沉积在容器底部，并在上部沉积无血小板(platelet-free)或低血小板(platelet-poor)血浆。
6.为了获得包括prp的最终组合物，将形成的血小板颗粒再悬浮并溶解在小于起始体积的血浆中，以浓缩血小板。包括prp的液体组合物的血小板浓度至少为初始浓度的4-6倍，使血小板保持活力、活性和功能，能够释放生长因子。
7.然而，在已知类型的装置中，仅对加速度和加速度时间进行控制和指令。另一方面，由于惯性和摩擦，减速度遵循粒子速度的自然损失。因此，由于血小板承受的应力，随机减速度可能太长或太短，对获得的prp质量产生负面影响。
8.此外，进行垂直离心的已知装置在加速度停止期间产生内部漩涡，导致红细胞与血浆重新混合，最终成分中的红细胞数量随之增加，其另一个缺点是刺激过度的免疫系统介导的反应。
9.已知装置能够仅自动制造包括prp的液态组合物。然而，已知装置无法在无菌和受控环境中自动制造包括凝胶形式prp的组合物。事实上，操作员必须手动向prp的液体组合物(例如葡萄糖酸钙、氯化钙和/或凝血酶)中添加胶凝剂，然后必须在约37℃的温度下培养所述组合物，直至完全胶凝。
10.因此，迄今为止，以凝胶形式制造组合物(包括prp)的操作具有多个缺点。人工制造凝胶状组合物的过程不会提供高水平的安全性，因为可能会发生人为错误。由于不可能使移动式通风柜在任何工位的无菌条件下工作，很明显，获得的凝胶状组合物不能始终满足无菌要求，因为不可能在每个工位都安装通风柜。此外，由于工艺纯粹是手工操作，因此存在不确定因素，不能保证良好的工艺重复性，即不可能保证组成prp的成分的相同质量，prp由两个连续且不同的生产工艺制造。已知类型的凝胶形式的组合物进一步不均匀，例如就其内部的prp分布而言。使用已知的方法，所获得的凝胶形式的组合物未完全凝胶化，含有大量仍然是液体或半固体的组分，其易于滴落，失去其特征的活性成分并污染周围环境。
此外，已知类型的凝胶组合物没有稳定的形状，因此会变形，使得其处理和应用较复杂。
11.此外，已知组合物具有：保存在最终产物中的全血回收的血小板的有限百分比和低浓度因子(即血小板含量与起始产物之间的比率)。
12.因此，从组合物本身的功能性、有效性和适用性的角度来看，已知凝胶组合物的质量较差。
13.《新生物技术》第32卷，2015年1月25日第1期，第199-211页，daniel tzu-bishih等人的“用于体外干细胞扩增的人血小板裂解物补充剂的制备、质量标准和性质(preparation,quality criteria,and properties of human blood platelet lysate supplements for ex vivo stem cell expansion)”描述了通过两个离心步骤获得的prp。已添加抗凝剂的全血离心第一步在20-22℃温度下以1000g进行10分钟。然后在21-22℃温度下以约3000
×
g进行第二上清液离心5分钟，并将沉淀的浓缩物重新悬浮在50-70ml血浆中。


技术实现要素：

14.因此，本发明的目的是提供一种方法、离心装置和用于制造组合物的装置，所述组合物尤其包括富血小板血浆，用于所述装置的套件、组合物本身和组合物的用途，其不存在现有技术的缺点，是简单、经济、高质量的。应注意，通过连接离心装置和一次性使用套件，在无需清洗和/或消毒与血液、红细胞、血浆、白细胞、血小板和prp接触的部件的情况下，可有利地获得所述装置。
15.本发明提供一种用于制造组合物的方法、离心装置和装置，所述组合物尤其包括富血小板血浆，用于所述装置的套件、组合物本身以及根据所附权利要求书的内容的组合物的用途。
附图说明
16.为了更好地理解本发明，仅通过非限制性示例说明了两个实施例，其中：
[0017]-图1是根据本发明的用于制造包括富血小板血浆的组合物的装置中包括的本发明离心装置的透视图和示意图，为了更好地突出其它部分，移除了几个部分；
[0018]-图2a是本发明套件实施例的示意图；
[0019]-图2是图1装置的流体动力学图；
[0020]-图3a示出了用于液体组合物的收集单元的第一实施例；且
[0021]-图3b示出了凝胶形式的组合物的收集单元的第二实施例。
具体实施方式
[0022]
在图1中，附图标记(100)整体表示根据本发明的离心装置，而在图(2a)中，附图标记(10)表示根据本发明的套件。在图2中，附图标记(1)整体表示用于制造包括富血小板血浆(其在下文中将被表示为prp)(尤其由富血小板血浆构成)的组合物的装置。
[0023]
所述组合物可有利地可注射(即以液体形式)或可应用于和/或可缝合于皮肤损伤部位(即以凝胶形式，尤其是凝胶膏)。
[0024]
prp从人或动物患者采集的全血中获得，随后进行离心，即分离。采集的全血量最
好在10到200ml之间。
[0025]
图1所示装置(1)中包括的离心装置(100)包括主体(cp)，主体基本上容纳装置(1)的单元，以及铰接至主体(cp)的闭合元件(e)。
[0026]
闭合元件(e)被配置为布置在打开位置(图1)和闭合位置(图中未示出)之间，在打开位置(图1)中，操作员可以访问单元，在闭合位置中，操作员无法访问装置(1)的单元。装置(1)有利地包括用于验证闭合元件(e)正确闭合的元件(未示出)。应注意，图1还包括附图标记(13)和(17)，指示根据本发明的套件中包括的以下元件将分别定位的位置：-由四路连接器(13)构成的节点(13)和收集接口(17)。通过有利地组合套件(10)和离心装置(100)获得的装置(1)包括离心单元(2)，由套件中的分离容器和离心装置(100)的离心站构成，以及通过利用离心力的作用来分离作为不同密度及其物理状态(液体或固体)的功能的全血成分。离心单元(2)配备有分离容器(3)(如图2所示)，所述分离容器(3)由驱动单元(例如电机)围绕其轴线旋转(基本垂直)。事实上，离心装置(100)优选地是单站离心机，其被配置成当容纳在相对离心站中时围绕相对垂直轴旋转离心容器(3)。
[0027]
离心单元(2)有利地对全血进行双重离心，以便将血液分离成单个组分。因此，分离容器(3)在两个连续离心循环中旋转，以分离全血成分，从而获得富血小板血浆(prp)。
[0028]
在第一离心期间，装置(1)将全血分离成包括血小板的血浆、包括白血细胞和红血细胞的血沉棕黄层。血沉棕黄层和红细胞是废料，随后被清除。在第二离心中，血浆被分离成血小板；形成血小板和无血小板或贫血小板血浆的颗粒。最后，基本上将沉积在分离容器(3)底部的血小板颗粒的整个体积再悬浮在部分血浆中，以获得prp。发生血小板颗粒再悬浮的血浆部分相当于全血初始量(优选体积)的约10％。血浆的剩余部分(约为初始量的90％)被清除。
[0029]
在未示出的可能实施例中，分离容器(3)仅包括具有基本圆柱形的侧壁。分离容器(3)有利地包括相对入口、相对固定壁和可移动壁，其限定用于容纳液体的相对可变内部容积，其中可移动壁相对于固定壁可移动以改变内部容积。这使得容器能够在泵(7或11)启动后改变其在装置(1)中的体积。分离容器(3)在其上端通过连接元件(ec)连接到离心单元(2)。连接元件(ec)防止振动传递至装置(1)。连接元件优越地闭合分离容器(3)，并且在本发明的优选实施例中防止运动传递到装置(1)的其它部件。事实上，连接元件(ec)包括：三路连接器，其中连接器的每个相对不同的单路可分别液压连接到第二导管(12)的第一端、第一导管(8)的第二端和分离容器(3)的入口；以及，任选地，用于减少摩擦的装置，优选由旋转接头构成，布置在其中一个通道处，以便即使在分离容器进行离心时，也能够实现所述通道和分离容器(3)入口的液压连接。如果存在减少摩擦的方法，则即使容器处于离心步骤，连接元件(ec)也可以保持钩挂在容器(3)上，并且不会将运动传递到其连接的导管(8和12)。如果没有减少摩擦的方法，则必须在离心步骤期间将连接元件(ec)从离心容器(3)上拆下。
[0030]
根据所述实施例，分离容器(3)不具有底壁(其向下打开)。活塞设置在分离容器(3)的内部，配置为以交替运动在其内部滑动。活塞的布置方式使分离容器(3)向下闭合。活塞可具有密封件，所述密封件向下且密封地闭合分离容器(3)。
[0031]
如图2所示，装置(1)包括三个容器4、5和6。
[0032]
每个容器(4、5和6)有利地例如由用于医用输液的袋子制造。
[0033]
容器(4、5、6)可以有利地布置在主体(cp)中制造的外壳中，或者可以悬挂在装置(1)主体侧壁处的适当挂钩上。收集容器(4)充满收集的全血，其中添加了抗凝剂(尤其是acd-a)。用于中间储存的容器(5)最初是空的，并且基本上用作成分的中间储存(特别是对于包括血小板或无血小板或贫血小板血浆的血浆)。容器(6)中充满清洗液。
[0034]
容器(4)中的全血通过泵(7)供应至离心单元(2)。泵(7)沿导管(8)布置，所述导管将收集容器(4)与离心单元(2)连接。
[0035]
泵(7)有利地是蠕动的，并且导管(8)穿过泵(7)。
[0036]
第一离心优选地在具有加速度值(a1)和/或预设或可预设加速度持续时间(ta1)的加速度下进行。加速度值(a1)有利地包括在100和2500g之间(其中g表示重力加速度)。加速度持续时间(ta1)在1到20分钟之间。
[0037]
加速度后，发生具有预设或可预设减速度值(d1)和/或持续时间(td1)的受控减速度，从而实现全血单个成分的分离。
[0038]
术语受控减速度是指操纵减速度，即具有预设减速度值(d1)(即具有要消散的减速度值——rad/min2或rad/s2)和/或减速度持续时间值(td1)，在此值之间血液颗粒必须基本静止。因此，术语受控减速度与因惯性和摩擦而产生的自然减速度无关，所述自然减速度发生在闭合下游，因此也发生在分离容器(3)的下游。
[0039]
减速度值(d1)与加速度值(a1)相关。加速度值(a1)越高，减速度必须越缓慢(即缓慢)，以便在减速度过程中尽可能减少血液中漩涡的形成。
[0040]
减速度值(d1)有利地包括在：0.2和0.5rad/min2之间。另一方面，减速度持续时间(td1)包括在2和20分钟之间。在这种情况下，减速度值(d1)优选包括在0.0009和0.5rad/sec2之间，并且有利地是0.2和0.5rad/sec2。
[0041]
在第一离心步骤的试验减速度结束时，将离心后的血液静置(即进入停滞状态)一段时间，以促进分离容器(3)中的红细胞沉淀。这一时间通常约为2分钟。
[0042]
在第一离心结束时，含有血小板的血浆布置在分离容器(3)的上部。从全血中分离出的红细胞布置在分离容器(3)的下部，即底部，并且在血浆和红细胞之间布置浅黄色的外套(包括大部分白细胞)。将包括血小板的血浆供应至配置用于中间储存其的容器5。从离心单元(2)到容器(5)的供给通过泵(11)完成。泵(11)沿导管(12)布置，导管(12)随后在节点(13)处分为导管(14、15和16)。节点(13)基本上由多路连接器，尤其是4路连接器构成。导管(14)将节点(13)连接到容器(5)。泵(11)有利地是蠕动的。这使得每次使用后无需清洁和消毒蠕动泵(7和11)。导管(15)将节点(13)连接到容器(6)。
[0043]
导管(16)将节点(13)连接到收集接口(17)。
[0044]
当泵(11)已将包括血小板的血浆输送至容器(5)时，对分离容器(3)(空的，或更确切地说，包括红细胞和白细胞)进行清洁循环以清除其中的任何残留物。特别地，泵(11)通过导管(15)从容器(6)向分离容器(3)供应清洗液，然后从分离容器(3)收集清洗液。在所述方法的另一个实施例中，泵(11)从容器(6)向容器(3)输送清洗液，泵(7)通过导管(8)从容器(3)向容器(4)收集并引导清洗液。
[0045]
在清洁循环之后，通过泵(11)向离心单元(2)新供应包括血小板的血浆，以便进行第二离心。第二离心在具有预设或可预设加速度值(a2)和/或持续时间(ta2)的加速度下进行。
[0046]
加速度值(a2)有利地包括在100和2500g之间。加速度持续时间(ta2)在1到20分钟之间。
[0047]
在第二加速度之后，发生第二受控减速度和/或预设或可预设减速度值(d2)和/或持续时间(td2)，以便将血小板颗粒与血小板贫乏或无血小板血浆分离。血小板颗粒沉积在分离容器(3)的底部和侧面；而没有或只有可忽略数量的血小板的血浆排列在分离容器(3)的上部。
[0048]
第二离心的加速度值(a2)有利地大于第一离心的加速度值(a1)。另一方面，第二离心的受控减速度(td2)反而低于第一离心的受控减速度持续时间(td1)。
[0049]
将部分体积的无血小板或贫血小板血浆(例如，约90％的初始量-体积-全血)排出并送入容器(5)。剩余体积的血浆(约占全血初始体积的10％)用于重新溶解至少一部分血小板颗粒，最好基本上是整个血小板颗粒。血小板在至少一部分血浆中的再悬浮通过以下方式发生：以低加速度(例如，以20g的顺序)通过短时间离心激活离心单元(2)，例如重复5至10次，以获得prp。
[0050]
然后可以从收集接口(17)收集包括prp的组合物。
[0051]
所述装置(1)有利地包括电子控制单元(ecu)。电子控制单元(ecu)配置为以加速度值(a1或a2)和/或加速度持续时间(ta1或ta2)和/或预设减速度值(d1或d2)和/或预设或可预设减速度持续时间(td1、td2)激活离心单元(2)，以实现全血分离或至少部分血浆中血小板悬浮的方式。
[0052]
如图2所示，装置(1)包括传感器(18)，传感器(18)配置为至少检测以下特征：进料流速、导管(8、12和15)的正确插入、气泡的存在、相关导管(8、12、15)中待供应流体的存在和/或待供应流体的浊度变化。
[0053]
传感器(18)包括例如液体存在传感器或另一类型的传感器。传感器(18)可以彼此不同。
[0054]
传感器(18)优选为四个，即传感器(18a、18b、18c和18d)。传感器(18a和18b)布置在收集容器(4)下游的导管(8)处，并依次布置。传感器(18a和18b)能够检测容器(4)的排空和血流中是否存在任何气泡。
[0055]
传感器(18c)沿导管12和节点(13)的上游布置。传感器(18c)检测泵(11)输送的液体的浊度，从而区分血浆(通常为黄色)和红细胞(通常为红色)。当检测到红细胞时，传感器(18c)能够中断流向容器(5)的流量。因此，传感器(18c)仅允许将血浆(有或没有血小板)临时储存在容器(5)中。
[0056]
取而代之的是，传感器(18d)沿着导管(15)和容器(6)的上游布置，并检测清洗液进料流速。
[0057]
此外，传感器(18a和18b或18c和18d)可分别校准泵7或11。校准包括对泵(7或11)实际输送的有效流量(即步长/ml)进行校正。由于泵(7或11)的有效流量在很大程度上取决于泵内部弹簧的磨损、插入泵(7或11)的导管的硬度、泵(7或11)的开启或闭合等，因此必须在装置(1)每次启动时重新计算有效流量。特别是，由于传感器(18a和18b或18c和18d)之间组成的导管(8)部分的长度保持不变(即，两个传感器之间组成的单个导管的长度不变)，因此所述部分导管的内部体积始终恒定且已知。因此，通过确定泵(7)或(11)在传感器(18a和18b)或(18c或18d)之间移动体积的步骤数，在装置(1)每次启动时，可以重新计算泵(7或
11)的有效流量。
[0058]
在未示出的可能实施例中，包括prp的液体组合物可直接从收集接口(17)收集。
[0059]
在图3a和3b中分别示出的替代实施例中，装置(1)还包括连接到或可连接到装置(1)的收集接口(17)的组合物的收集单元(20)。具体而言，收集单元(20)可通过连接装置(22)，尤其是鲁尔连接器，连接到装置(1)。
[0060]
根据图3a中所示的实施例，在液体组合物的情况下，装置(1)不必执行到目前为止所描述的进一步操作。因此，在这种情况下，液体组合物准备好被收集单元(20)的至少一个收集容器(19)，优选注射器收集。收集单元有利地包括多个容器(19)，例如三个。
[0061]
根据图3b所示的实施例，在凝胶形式的组合物的情况下，收集单元(20)包括凝胶容器(21)。凝胶容器(21)优选由pvc制成。包括prp的组合物的固化在凝胶容器(21)中完成。在这种情况下，prp的收集接口(17)被配置成通过设置在凝胶容器(21)上的连接装置(22)，特别是鲁尔连接器，连接到凝胶容器(21)。凝胶容器(21)具有连接装置(26)，尤其是无针的，用于连接凝胶流体的输送装置，并且优选地，还可以具有空气过滤器(25)。空气过滤器(25)(如果存在)使空气能够排出，并进一步使凝胶容器(21)保持无菌。空气滤清器(25)特别疏水。胶凝液包括(尤其是由)葡萄糖酸钙。凝胶流体的输送装置优选为注射器，但也可以从装置(1)自动供应。
[0062]
根据图3b所示的实施例，连接装置(26)布置在导管(16)处。
[0063]
凝胶容器(21)至少包括下壁(23)和/或上壁(24)。至少下壁(23)和/或上壁(24)可弹性变形，以便在施加在其上的压缩力的作用下变形。
[0064]
聚合物支架布置在凝胶容器(21)中，尤其是使用生物聚合物(例如聚乳酸)制造。聚合物支架用作含有凝胶形式prp的组合物的支撑基质，保持其柔韧性。因此，支架有助于实现凝胶形式的组合物，尤其是适用且可缝合的石膏。
[0065]
脚手架有利地具有网格结构，其厚度在5到500μm之间，优选在100到350μm之间。例如，通过叠加两层材料获得网格结构。
[0066]
在未图示的可能实施例中，聚合物支架可通过3d打印制造。
[0067]
在一个可能的实施例中，有机泡沫可布置成与聚合物支架接触。有机泡沫例如由以下材料制成：海藻酸钠、壳聚糖、明胶和/或胶原蛋白。有机泡沫的厚度在1mm和10mm之间，最好在1mm和3mm之间。有机泡沫(如果存在)能够增加凝胶形式的组合物的柔韧性并加速度凝胶过程，防止材料损失。
[0068]
在可能的替代实施例中，为了改进凝胶形式的组合物的处理和去除，凝胶容器(21)可以设置有便于打开的元件，以便不损坏组合物。
[0069]
在未示出的可能实施例中，装置(1)包括用于凝胶容器(21)的外壳。所述外壳包括相互连接的板和支架(未示出)。
[0070]
板和支撑件优选地通过弹性返回装置(未示出)彼此有利地连接，以便对插入其间的凝胶容器(21)施加压缩力。
[0071]
凝胶容器(21)在插入外壳期间被压缩，从而使空气完全排出。弹性返回装置有利地为铰链或弹簧。弹性返回装置优选至少一个，优选至少四个。弹性回位装置(如果存在)能够按照引入凝胶容器(21)的含有prp的组合物的量成比例地压缩凝胶容器(21)，并进一步保证凝胶容器(21)中存在的空气被更大程度地排出
[0072]
外壳优选地配备有加热单元，用于在使用中加热凝胶容器(21)的至少一个壁(23)或(24)，至少在35
°
和42
°
之间，特别是大约37
°
的孵化温度(ti)下加热，以加强凝胶容器(21)中的prp加热单元例如是加热电阻。
[0073]
凝胶容器(21)的外壳有利地由铝制成，以便具有均匀的培养温度(ti)。这样，所有凝胶容器(21)基本上被加热到相同的孵化温度(ti)。
[0074]
根据图1所示，装置(100)还包括接口单元(33)，其包括屏幕。因此，装置(1)还包括接口单元(33)，接口单元(33)包括屏幕。屏幕可以是例如触摸屏，以便能够查看输出数据和输入数据。例如，输入数据包括选择在装置(1)上运行的程序。
[0075]
在优选实施例中，装置(1)包括至少一个管夹阀(34)。具体而言，装置1包括三个管夹阀(34)。管夹阀(34)分别布置在导管(14、15和16)处节点(13)的下游。
[0076]
在使用中，操作员将容器(4、5和6)安排在适当的外壳中，并执行接口单元(33)(如果存在)上指示的各种步骤，选择要在装置(1)上运行的程序。
[0077]
实验测试表明，例如，在从马身上采集全血的情况下，使用以下值进行两次离心分离会产生有利的结果：
[0078]-第一离心，加速度值(a1)约为200g，加速度持续时间(ta1)约为3分钟，控制减速度持续时间(td1)约为14分钟；
[0079]-第二离心，加速度值(a2)约为750g，加速度持续时间(ta2)约为5分钟，控制减速度持续时间(td2)约为5分钟。
[0080]
实验测试还表明，对于从马血中获得的prp，完成凝胶化的时间为10到40分钟，特别是20分钟左右。此外，实验测试表明，以凝胶形式制造组合物的过程的总持续时间为30到90分钟，尤其是60分钟。
[0081]
使用上述装置(1)制造的组合物与使用已知类型装置制造的组合物之间的比较试验表明，回收血小板的百分比和浓度因子(全血中血小板数量与最终制剂中血小板数量之间的比率)通过装置(1)和相关方案获得的血小板数量大于已知类型装置的血小板数量，因此能够获得更大的浓度因子，而不会显著减少含有血浆的血小板的体积。
[0082]
本发明还涉及用于制造可注射组合物的一次性无菌套件(以下称为“可注射一次性套件”)和用于制造凝胶形式的可注射组合物(以下称为“凝胶一次性套件”)的一次性无菌套件，以与装置(100)一起使用用于获取装置(1)。
[0083]
上述套件包括从以下中选择的至少一种元件：用于收集血液的袋(即收集容器(4))；一剂抗凝液；用于收集的针和管；一个250ml的洗涤袋(即容器6)，其中装有清洗液，例如盐水；一个250ml的空袋，用作临时储存血浆的中间储存(即用于中间储存的容器(5))；优选至少部分由pvc制成的导管(8、12、14、15和16)；多路连接器，尤其是4路连接器(即节点(13))；以及分离容器(3)，所述分离容器(3)例如设置有连接元件、活塞和用于活塞的密封件。
[0084]
除了上述所示的组分外，“可注射一次性套件”还包括至少一个注射器，用于关节内或皮下注射包括prp的液体组合物。
[0085]“凝胶一次性使用套件”包括凝胶液注射器、凝胶容器(21)、聚合物支架和优选有机泡沫以及上述组件。
[0086]
包括使用装置(1)和/或到目前为止描述的方法获得的prp的组合物可以用作药
物，尤其是用于治疗皮肤损伤和/或骨软骨或关节病变。
[0087]
上述组合物可用于制备用于治疗皮肤损伤和/或骨软骨或关节病变的药物。
[0088]
到目前为止描述的本发明具有多个优点。
[0089]
主要地，装置(1)具有多用途的优点，因为相同的装置(1)可用于实现prp的各种配方。
[0090]
此外，简单地通过改变收集单元(20)，可以获得具有两种不同稠度的两种组合物(即液体或凝胶膏的形式)。
[0091]
本发明的优点是，通过从患者处收集一次血液，可以制备多种剂量的组合物。对于液体组合物和凝胶形式的组合物，剂量数量在1到4之间，最好是2。
[0092]
所述装置(1)和所述方法能够使用体积在10到200ml之间的全血。
[0093]
所述装置(1)限定并限制可在其中制造包括prp的组合物的封闭无菌环境。
[0094]
此外，所述装置(1)能够使包括prp的组合物的生产过程完全自动化，操作员手动干预凝胶化。
[0095]
所述装置(1)对收集的血液进行基本上垂直的离心。
[0096]
装置(1)进行双重离心，两种方法都有控制的减速度。第一步的控制减速度可促进红细胞和白细胞从血浆中分离，同时避免再混合。一般来说，控制减速度可进一步降低血小板承受的压力因此，通过逐渐引导减速度，从而避免速度或加速度的急剧变化，可以避免在分离容器(3)中形成不希望的漩涡以及随后的成分混合。
[0097]
聚合物支架，特别是包括聚乳酸，作为其厚度、形状和几何形状的功能，能够实现对包括prp的组合物的支撑，其能够在不损失材料(即不滴落)的情况下支撑组合物，具有良好的刚度，但也能够使石膏具有柔韧性并适应其应用的解剖区域。此外，支架的存在使得能够将组合物以凝胶形式缝合在伤口周围的皮肤上。此外，由于支架是使用天然抗菌材料制成的，因此他减少了感染的风险。
[0098]
此外，所述支架能够创建用于细胞迁移、整合和生长的功能性结构，以改造病变组织。
[0099]
根据其组合物(例如海藻酸钠、明胶、胶原或壳聚糖)，有机泡沫(如果存在)能够吸收全部液体prp，促进prp的凝胶化，并使凝胶形式的组合物更具弹性且适应皮肤损伤的形状。
[0100]
凝胶形式的组合物可以具有不同的尺寸，从而能够使组合物的尺寸适应伤口的尺寸。可以凝胶形式的组合物具有，例如，直径或侧面在1到20cm之间，优选在3到9cm之间。
[0101]
外壳(未示出)的优点是能够从凝胶容器(21)中排出大部分空气，防止凝胶膏表面或内部形成气泡。
[0102]
因此，有可能获得具有优异机械特性的凝胶形式的组合物。此外，由于外壳配备有用于加热凝胶容器(21)的装置，例如加热至37
°
，因此组合物本身的凝胶化被促进并变得更快速。
[0103]
包括凝胶容器(21)的装置(1)能够维持适合包括prp的组合物凝胶化的封闭和无菌微环境。当凝胶容器(21)闭合时，培养温度(ti)在其内部保持几乎恒定，并且，凝胶组合物在容器(21)打开之前保持无菌。此外，凝胶容器(21)优选由pvc制成，凝胶形式的组合物不会粘附在其壁上。事实上，关于其它材料，pvc已表明，在凝胶化期间，组合物不会粘附在
塑料表面(而不是聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氨酯)。
[0104]
因此，凝胶形式的组合物容易从pvc中移除，而不会损失生物材料、稠度损失、损坏或改变组合物本身。
[0105]
从组合物本身的功能性和有效性的角度来看，包括用装置(1)和相对实现方法获得的prp的组合物具有更高的质量。
[0106]
此外，所述组合物具有从全血中回收并保存在最终产物中的高百分比血小板，以及高且至少包括在4和7之间的浓度因子。
[0107]
在相关实施例中，根据本发明的制造包括富血小板血浆(prp)的组合物的方法包括在离心单元(2)中对全血进行第一离心步骤，以便分离包括血小板的血浆。所述方法的特征在于，所述第一离心步骤包括第一加速度子步骤，所述第一加速度子步骤具有预设加速度值(a1)下的预设持续时间(ta1)，以从全血中获得红细胞沉淀物；以及随后的第一减速度子步骤，其减速度值(d1)预设并包括在0.0009和0.5rad/s2之间，预设减速度持续时间(td1)大于2分钟，优选小于50分钟。关于这一点，请参见下文中的实验数据，这表明，根据所述方法，如果采集相同的血液，可以提取出很大比例的血小板。
[0108]
优选的是，所述方法还包括含有血小板的血浆的第二离心步骤，以便将其分离为血小板颗粒和贫血小板血浆，第二离心步骤被细分为具有预设持续时间(ta2)和预设加速度值(a2)的第二加速度子步骤以及具有预设持续时间(td2)和具有预设减速度值(d2)的第二减速度子步骤。制备包括富血小板血浆(prp)的组合物的方法的实施例是优选的，尤其是其中离心的第一步以预设减速度值(d1)进行，所述预设减速度值(d1)包括0.0009和0.5rad/s2之间，预设减速度持续时间(td1)大于2分钟，优选小于50分钟，包括：向离心单元(2)供应(优选自动)全血的步骤；
[0109]
全血的第一离心步骤，以便从废料中分离包括血小板的血浆；
[0110]
包括血小板的血浆的中间储存步骤，优选自动储存；
[0111]
清洁离心单元(2)的步骤，最好是自动的，尤其是清洁如前所述的离心装置中的容器(3)；
[0112]
包括血小板的血浆的第二离心步骤，以便将其分离成血小板颗粒和贫血小板血浆；
[0113]
使血小板颗粒在至少一部分贫血小板血浆中再悬浮的步骤，在所述步骤结束时获得富血小板血浆(prp)；
[0114]
其中，每个离心步骤细分为具有预设持续时间(ta1、ta2)和/或以预设加速度值(a1、a2)执行的加速度子步骤和具有预设持续时间(td1、td2)和具有预设减速度值(d1、d2)的减速度子步骤。
[0115]
在所述方法中，第一加速度的值(a1)优选地低于第二加速度的值(a2)，第一加速度持续时间(ta1)短于或长于第二加速度持续时间(ta2)，并且第二减速度持续时间(td2)短于第一减速度持续时间(td1)。
[0116]
本发明的方法有利地包括血小板颗粒的再悬浮步骤，所述步骤包括将无血小板血浆的预定部分自动插入离心单元(2)中，以及持续时间在0.2秒到1分钟之间的连续多个进一步离心步骤。
[0117]
所述方法优选地包括另一子步骤，所述子步骤优选地自动地将包括基本呈液态的
富血小板血浆(prp)的组合物收集在收集容器(19)中。
[0118]
或者，所提出的方法可包括另一子步骤：优选地自动地将富血小板血浆(prp)供应到凝胶容器(21)，其中布置有聚合物支架和优选有机泡沫；将凝胶容器(21)加热至35至42℃之间，特别是约37℃的孵化温度(ti)；以及向凝胶容器(21)提供凝胶流体，以获得凝胶形式的组合物。
[0119]
根据权利要求1所述，本发明用于离心的装置(100)包括：
[0120]-离心站，其中可容纳分离容器(3)以进行离心以获得离心单元(2)；
[0121]-电子控制单元(ecu)，其被配置为能够在第一离心步骤中以预设加速度值(a1)和预设加速度持续时间(ta1)激活离心单元(2)，以从全血中获得红细胞沉淀物；
[0122]
其中，电子控制单元(ecu)配置为能够在第一离心步骤结束时，在第一减速度步骤中激活离心单元(2)，其中预设减速度值(d1)在0.0009和0.5rad/s2之间，预设减速度持续时间(td1)大于2分钟，最好少于50分钟。
[0123]
用于离心的装置(100)优选地还包括：
[0124]-第一和第二蠕动泵(7、11)，配置成可与导管啮合，以便泵送导管内部存在的相对流体；
[0125]-三个管夹阀(34)，每个管夹阀都易于与相应液压导管(14、15、16)的横截面啮合，以能够闭合和打开相应液压导管(14、15、16)；
[0126]-多个传感器(18)，其中多个传感器(18)中的每个传感器(18a、18b、18c、18d)包括一个相对凹槽或啮合装置，用于与液压导管的横截面啮合，所述液压导管至少部分透明且易于传输至电子控制单元(ecu)，与横截面传输或吸收的光量相关的基准，其中电子控制单元(ecu)在通过其中一个传感器(18a、18b、18c、18d)传输时，能够将相对基准与多个参考数据进行比较，参考数据涉及：全血、红细胞，等离子体和空气。
[0127]
这使得能够通过将所述装置与根据本发明的一次性套件组合来获得用于自动化和控制本发明方法的各个步骤的装置(1)，特别是通过使用保存所获得的prp的无菌性的闭合液压回路。
[0128]
在本发明的优选方面中，所述装置(100)还包括外壳，其中凝胶容器(21)可容纳在所述外壳中，并且任选地，所述外壳包括至少一个选自以下元件中的元件：
[0129]-加热单元，用于在使用中加热凝胶容器(21)的至少一个壁(23)或(24)，至少在35
°
和42℃之间的培养温度(ti)下加热；
[0130]-用于在封装时压缩凝胶容器(21)的压缩装置，包括：弹性返回装置、通过弹性返回装置彼此连接的板和支架。
[0131]
用于制造包括富血小板血浆(prp)的组合物的装置(1)的优选实施例包括：
[0132]-第一全血收集容器(4)；
[0133]-第二容器(5)，用于中间储存从收集的全血中分离的包括血小板或贫血小板血浆的血浆；
[0134]
任选地，包括清洗液的容器(6)；
[0135]
包括富血小板血浆(prp)的组合物的收集单元(17)；
[0136]
全血离心单元(2)，包括分离容器(3)，所述分离容器(3)在两个连续离心循环中旋转设置，以便分离全血成分以获得富血小板血浆(prp)；
[0137]
第一泵(7)，用于将全血从第一容器(4)供应至离心单元(2)，并将在两个离心循环结束时从离心单元(2)获得的废料组分供应至第一容器(4)；
[0138]
第二泵(11)，其被配置成在第一离心循环结束时将包括血小板的血浆从离心单元(2)供应到第二容器(5)，反之亦然；以及向收集单元(17)供应包括富血小板血浆(prp)的组合物；以及优选地在第二离心循环结束时从离心单元(2)向第二容器(5)供应废贫血小板血浆；
[0139]
电子控制单元(ecu)，其被配置成以预设加速度值(a1、a2)和/或预设加速度持续时间(ta1、ta2)激活离心单元(2)；
[0140]
其中，电子控制单元(ecu)配置为在每个加速度持续时间(ta1、ta2)结束时激活离心单元(2)和/或预设减速度值和/或预设减速度持续时间(td1、td2)。
[0141]
装置(1)可有利地包括多个传感器(18、18a、18b、18c、18d)，其被配置为至少检测以下特征：第一泵(7)或第二泵(11)的进料流速、导管(8、12、14、15、16)的存在、导管(8、12、14、15、16)中气泡的存在，待供应至相关导管(8、12、14、15、16)的流体的存在和/或待供应至相关导管(8、12、14、15、16)的流体浊度的变化。在装置(1)的优选实施例中，相对收集单元(17)可配置成容纳组合物的收集容器(19)，尤其是注射器。
[0142]
所述装置(1)可有利地包括凝胶容器(21)，所述凝胶容器(21)可连接到所述收集单元(17)，并配置成在内部容纳聚合物支架，尤其是聚乳酸，以及任选地有机泡沫；凝胶容器(21)至少包括可弹性变形的下壁(23)和/或上壁(24)。在这种情况下，凝胶容器(21)可以优选地包括用于将容器(21)连接到收集单元(17)的第一连接装置(22)和用于连接凝胶流体输送装置的第二连接装置(26)，特别是包括葡萄糖酸钙的注射器。
[0143]
本发明的装置(1)可有利地包括：凝胶容器(21)的外壳，所述外壳具有第一板和支架，所述第一板和支架最好通过弹性返回装置彼此连接，以便对插入其间的凝胶容器(21)施加压缩力。
[0144]
在优选实施例中，装置(1)可包括加热单元，用于在使用中加热凝胶容器(21)的至少一个表面(23、24)。
[0145]
同样有利的是用于制造包括富血小板血浆(prp)的组合物的装置(1)的套件，所述组合物包括从以下中选择的至少一种元素：收集容器(4)；包括清洗液的容器(6)；中间储存容器(5)；多个导管(8、12、14、15、16)，尤其适合插入蠕动泵中，以便泵送导管内部或管夹阀(34)中的相对流体；多路连接器；以及分离容器(3)。为了插入蠕动泵(7、11)或管夹阀(34)，各导管(8、12、14、15、16)至少具有相对横截面，可压缩且可插入蠕动泵(7、11)和管夹阀(34)的适当外壳中即可。为了使传感器(18a、18b、18c、18d)向电子控制单元(ecu)传输与各导管(8、12)传输或吸收的光量有关的基准，导管必须具有相对的横截面，至少部分透明。请注意，即使未规定，术语“导管”也指液压管道。
[0146]
所述套件优选包括聚合物支架和有机泡沫。
[0147]
在本发明的特别优选实施例中，所述套件包括：
[0148]-分离容器(3)，其包括相对入口、相对固定壁和可移动壁，所述可移动壁限定用于容纳液体的相对可变内部容积，其中所述可移动壁相对于所述固定壁可移动以改变所述内部容积；
[0149]-收集容器(4)；
[0150]-用于中间储存的容器(5)；
[0151]-容纳清洗液的容器(6)；
[0152]-至少第一、第二、第三、第四和第五根导管(8、12、14、15、16)，每根导管至少包括一个适合插入蠕动泵的相对横截面，以便泵送导管(8、12)内部的相对流体和/或与管夹阀(34)啮合能够闭合和打开相应的液压导管(14、15、16)，其中第一、第二、第三、第四和第五导管(8、12、14、15、16)分别具有第一和第二端，其中第一、第三和第四导管(8、14、15)的第一端可分别连接到收集容器(4)；至用于中间储存的容器(5)和含有清洗液的容器(6)；并且其中，任选地，第一和第二导管(8、12)包括至少部分透明的另一相对横截面；
[0153]-四路连接器(13)，其中连接器的每个相对不同的单路可分别液压连接到第二、第三、第四和第五导管(12、14、15、16)的第二端；
[0154]-可液压连接到第五导管(16)的第一端的收集接口(17)；
[0155]-连接元件(ec)，包括三路连接器，其中每个相对不同的单路连接器分别可液压连接到第二导管(12)的第一端、第一导管(8)的第二端和分离容器(3)的入口；以及，任选地，用于减少摩擦的装置，优选由旋转接头构成，布置在其中一个通道处，以使所述通道能够液压连接到分离容器(3)的入口，即使在分离容器经受离心时也是如此。
[0156]
所述套件有利地还包括从以下各项中选择的收集单元(20)：
[0157]-第一收集单元(20)，包括可液压连接到接口(17)的连接装置(22)和凝胶容器(21)，凝胶容器(21)至少包括可弹性变形的下壁(23)和/或上壁(24)，并配置为内部容纳聚合物支架，尤其是由聚乳酸制成的聚合物支架，以及优选有机泡沫；
[0158]-第二收集单元(20)，包括可液压连接到接口(17)的连接装置(22)和至少一个收集容器(19)，以及可选的至少一个多路液压分支点，其中每一路可连接到所提供的单个收集容器(19)。在这种情况下，可包括三个容器和一个x形液压分支点，如图3a所示。第一收集单元(20)优选包括聚乳酸聚合物支架和/或凝胶容器内部的有机泡沫。
[0159]
优选地，组合物包括使用根据本发明的方法制造的富血小板血浆(prp)，有利地，当组合物为凝胶形式时，组合物包括：聚合物支架，尤其由聚乳酸制成，具有网格结构，厚度在5到500μm之间；以及优选有机泡沫，其尤其使用选自海藻酸钠、明胶、胶原蛋白和/或壳聚糖中的材料制造，并且具有1mm至10mm、优选1mm至3mm的厚度。
[0160]
优选用作药物的组合物，尤其是用于治疗皮肤损伤和/或骨软骨或关节病变的组合物，尤其优选用作药物的组合物，尤其是在治疗皮肤损伤和/或骨软骨或关节病变和/或使用所述组合物制备用于治疗皮肤损伤和/或骨软骨或关节病变的药物方面。
[0161]
根据本专利申请和相关附图，所述领域的技术专家将清楚地看到如何将本发明的套件(10)的各种组件彼此连接，如何将根据本发明的离心装置(100)的元件连接以获得装置(1)根据本发明以及如何激活管夹阀(34)和泵(7和11)，以启动本发明方法的各种实施例。实验数据
[0162]
加速度数据报告为相对离心力(rcf)，测量单位为加速度单位g。当使用立式单站离心装置时，其转子半径与分离容器(3)的半径相同，从每分钟旋转数(rpm)到g或到rcf的转换公式为20mm：rcf＝1.12x转子半径，单位为mm x(rpm/1000)2。示例
比较示例1
[0163]
采集外周静脉全血样本，分为50ml等份，并按照daniel tzu-bishih等人《体外干细胞扩增用人类血小板裂解物补充剂的制备、质量标准和性质》中所述的方案，使用普通台式离心机进行第一，离心《新生物技术》第32卷，2015年1月25日第1期，第199-211页，
[0164]-以1000g x 10分钟进行第一离心
[0165]-以3000g x 5分钟进行第二离心
[0166]
在此过程中，使用了台架离心机的正常减速度，时间为45秒。示例1
[0167]
按照以下方案，使用第二等分试样，使用根据本发明的离心装置进行离心试验：
[0168]-第一离心，加速度值(a1)为200g，持续时间(ta1)为3分钟，减速度值(d1)为0.0009至0.5rad/s2，减速度持续时间(td1)为14分钟，
[0169]-第二离心，加速度值(a2)为750g，持续时间(ta2)为5分钟，减速度持续时间(td1)为5分钟。
[0170]
prp的制备按照两个试验的相同程序进行：血小板颗粒在收集的全血体积的10％(5ml)的血浆中再溶解。在每个离心步骤(第一步和第二步)结束时，评估所用方法和装置的有效性，采集血浆和prp样本，进行血小板、白细胞和红细胞计数。使用abbot diagnostics型号cell dyn 3500plus血液分析仪对样本进行计数。
[0171]
将每个细胞群检索到的数量与原始全血样本计数得到的数量进行比较。
[0172]
下表中报告了第一离心的结果：表1
[0173]
本发明的离心装置和方法能够从全血中提取血浆中更多的血小板。
[0174]
下表中报告了第二离心的结果以及与两个示例中获得的prp相关的参数：表2
[0175]
当使用离心装置和根据本发明的方法时，最终制备(prp)中血小板的最终回收率更高。通过本发明的装置和方法获得的血小板浓度因子(定义为prp中血小板浓度相对于全血增加的次数)显著更大。浓度系数越大，制剂的效果越好。
[0176]
采用相同血液采集的等分样品进行了进一步的对比分析，以便使用daniel tzu-bishih等人在上述文件中指出的加速度值和持续时间来评估目前可用的离心机减速度过程的有效性。因此，使用具有不同类型的快速减速度(比较示例1v)、中等减速度(比较示例1m)和慢速减速度(比较示例1m)的台式离心机，按照daniel tzu-bishih等人编写的上述文件的方案进行prp制备，获得下表中报告的结果，其中我们还报告使用根据本发明的方法和装置获得的结果。表3表4
[0177]
从下表5中总结的对比试验的总结果来看，很明显，根据本发明，可获得血小板回收率百分比，所述百分比显著大于根据daniel tzu-bishih等人的上述引用文件可获得的百分比，独立于目前可用的已知类型的台式离心机类型。这有助于提高血小板恢复的性能，并且在采集相同比例的全血的情况下，也有助于在相对治疗应用中实现更有效的prp。方法血小板的恢复％示例171％比较示例152％比较示例1v55％比较示例1m41％比较示例1l43％
表5
[0178]
减速度d1、d2的加速度值a1、a2和相对预设持续时间ta1、ta2、td1、td2的组合示例。
[0179]
第一离心步骤： a1 gta1 mind1 rad/s2td1 min示例1.1100100.3610示例1.2180100.3813示例1.320030.3714示例1.4500100.4120表6
[0180]
第二离心步骤：第二离心步骤：表7