烟酰胺核糖在制备肺纤维化治疗药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及治疗肺纤维化的药物。


背景技术：

2.肺纤维化是一种慢性、进行性、纤维化性的间质性肺部疾病。肺纤维化的组织学典型表现为正常肺解剖结构重塑、细胞外基质沉积、炎症细胞浸润及成纤维细胞和肺泡上皮细胞表型的显著变化。肺纤维化患者表现出进行性的呼吸困难及肺部感染，患者生存质量极差，通常需要采用持续性氧疗，患者最终往往因严重呼吸衰竭伴发多器官功能衰竭而死亡。肺与肝、肾组织具有不同的组织来源，且肺纤维化与肝、肾组织纤维化的病因学、病理学、病理生理机制及临床表现具有明显差异，因而临床中治疗肝、肾纤维化的药物并不能对肺纤维化起到足够的治疗作用。
3.据统计，肺纤维化确诊后平均生存期仅为3年。而且除肺移植外，目前无其他有效治疗措施。因此亟需探索和研发可以有效治疗肺纤维化的临床药物。中国专利cn105708829a公开的复合维生素氨基酸口服液含有烟酰胺、b1、b2和b6等成分，虽然通过多种维生素、氨基酸复合而成的保健品口服液起到了一定改善作用，但无法从药理学与生理学解释其改善肺纤维化作用的机制，尚无法解决肺纤维化治疗药物匮乏之问题。
4.已有文献研究报道，在纤维化的肺组织中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量下降，通过给予丁酸、白屈菜赤碱等对肺纤维化进行干预后，肺组织中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量有所升高，但据此无法确定通过提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量从而治疗肺纤维化之途经。
5.烟酰胺核糖英文名为nicotinamide riboside，cas号为1341-23-7，分子式为c
11h16
n2o5，具体结构如下所示：
[0006][0007]
烟酰胺核糖与烟酰胺同为维生素pp的衍生物，但与烟酰胺具有不同的理化性质与生物作用。目前，尚未见到利用烟酰胺核糖治疗肺纤维化的报道。


技术实现要素：

[0008]
本发明针对肺纤维化的治疗手段不足的问题，提供了烟酰胺核糖在制备肺纤维化治疗药物中的应用。
[0009]
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0010]
烟酰胺核糖在制备用于治疗肺纤维化的药物中的应用。
[0011]
优选的，所述药物采用注射给药、呼吸道给药(例如雾化吸入)、皮肤给药(例如透皮贴)、黏膜给药(例如舌下含服)、腔道给药(例如口服)或其他可以使用的给予药物的方式。其中，黏膜给药、呼吸道给药、注射给药因具有更好的吸收率和更低的首过消除效应，相较腔道给药和皮肤给药具有更高的血药浓度和更快、更好的疗效(黏膜给药、呼吸道给药、注射给药具有相近的疗效)，但口服给药具有更高的安全性。
[0012]
优选的，所述药物为溶液型、胶体溶液型、乳剂型、混悬型、气体分散型、微粒分散型或固体分散型的制剂。
[0013]
优选的，所述烟酰胺核糖用于治疗特发性肺间质纤维化。
[0014]
优选的，所述烟酰胺核糖用于在强度或严重程度上降低、逆转肺纤维化或推迟肺纤维化的发生。
[0015]
优选的，所述烟酰胺核糖的给药剂量为0.005～1g/kg，每天给药1～3次。
[0016]
烟酰胺核糖在制备用于治疗肺纤维化并发症的药物中的应用。
[0017]
优选的，所述肺纤维化并发症为肺动脉高压。
[0018]
本发明的有益效果体现在：
[0019]
本发明针对肺纤维化动物模型，通过在利用不同种类哺乳动物造模后给予其一定剂量的烟酰胺核糖，发现经过药物(烟酰胺核糖)干预后可以在强度、严重程度上降低、逆转肺纤维化或推迟肺纤维化的发生，揭示了烟酰胺核糖是肺纤维化潜在的药物治疗手段。本发明的进步意义在于首次发现并证实了烟酰胺核糖能够有效治疗肺纤维化，为开发肺纤维化临床治疗药物提供了新的途径。
附图说明
[0020]
图1是实例1、2、3、4中诱导肺纤维化的手术操作流程；其中：(a)为皮肤切开状态图，(b)为暴露气管状态图，(c)为博来霉素气管内注射状态图。
[0021]
图2是实例5中肺部组织冻存样本的蛋白印迹法测定结果；其中：(a)为western blot条带原始图片，(b)为tgf-β1条带灰度分析柱状图；所有con组和s-o组均为3天、7天和14天样本的平均水平，3天、7天和14天的组内样本在组织水平、蛋白水平和基因水平均具有良好的一致性。
[0022]
图3是实例6中肺部组织病理改变程度结果；其中：(a)为con组肺部组织固定样本石蜡切片he染色图，(b)为i组肺部组织固定样本石蜡切片he染色图(l-7d)，(c)为i组肺部组织固定样本石蜡切片he染色图(l-14d)。
[0023]
图4是实例7中肺部组织冻存样本的蛋白印迹法测定结果；其中：(a)为western blot条带原始图片(同组别多列并排条带代表相应组内不同动物个体)，(b)为tgf-β1条带灰度分析柱状图；c-n组为14天的结果。
[0024]
图5是实例9中肺部组织病理改变程度结果(肺部组织固定样本石蜡切片he染色)。
[0025]
图6是实例3中肺部组织固定样本石蜡切片免疫荧光染色的结果；其中：(a)为正常对照组、假手术组、肺纤维化组、肺纤维化药物干预组、药物干预对照组tgf-β1免疫荧光图，(b)为正常对照组、假手术组、肺纤维化组、肺纤维化药物干预组、药物干预对照组tgf-β1叠加dapi免疫荧光图。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
[0027]
(一)烟酰胺核糖药理实验流程
[0028]
本发明采用博来霉素诱导的肺纤维化哺乳动物模型，发现并验证了烟酰胺核糖对肺纤维化的治疗作用，实验流程按以下步骤进行：
[0029]
1)以8～12周年龄的c57bl/6小鼠、8～24周年龄的sd大鼠、0.5～3年龄的家兔等哺乳动物为实验对象，分为正常对照(con)组、假手术(s-o)组(只切开和缝合，不进行注射)、肺纤维化(i)组、肺纤维化药物干预(i-n)组、药物干预对照(c-n)组。其中肺纤维化组、肺纤维化药物干预组通过手术将博来霉素以1.5～5u/kg体重、0.05～0.5ml/只进行气管内注射(溶剂为生理盐水)，以诱导出肺纤维化(具体为特发性肺间质纤维化，即ipf)的疾病、病症、状况，每组动物个体数为6～10只；
[0030]
2)自手术当天开始(0d)，对肺纤维化药物干预组以及对未进行手术的药物干预对照组以注射给药(耳缘静脉注射或腹腔注射；溶剂为生理盐水)、黏膜给药(舌下含服，无溶剂)等不同方式给予相应哺乳动物烟酰胺核糖，烟酰胺核糖的给药剂量为每次0.005～1g/kg体重，每天1～3次；针对注射给药方式，对正常对照组及假手术组以同等注射体积量注射生理盐水；各组动物在实验期间均正常饲养；
[0031]
3)在实验进行3～28天后(3d～28d)进行取样、检测：对各组动物留取样本，样本包括肺部组织冻存样本、肺部组织固定样本；对肺部组织冻存样本按照蛋白印迹法处理，以确定tgf-β蛋白、il-1β、il-6的含量，对肺部组织冻存样本进行免疫荧光染色，以确定tgf-β的基因转录水平，对肺部组织固定样本进行石蜡切片he染色，以确定肺组织病理改变程度；
[0032]
4)根据样本检测结果，对药物干预情况下肺纤维化在强度、严重程度上的降低、逆转或推迟发生进行判定。
[0033]
(二)实验结果
[0034]
实例1
[0035]
以8周年龄的c57bl/6小鼠为实验对象，博来霉素以1.5u/kg体重、0.05ml/只进行气管内注射；肺纤维化药物干预组、药物干预对照组腹腔注射烟酰胺核糖0.005g/kg体重，每天3次；实验7天后留取样本、检测。
[0036]
实例2
[0037]
以9周年龄的c57bl/6小鼠为实验对象，博来霉素以3u/kg体重、0.05ml/只进行气管内注射；肺纤维化药物干预组、药物干预对照组口服给药烟酰胺核糖0.01g/kg体重，每天2次；实验3天后留取样本、检测。
[0038]
实例3
[0039]
以10周年龄的c57bl/6小鼠为实验对象，博来霉素以5u/kg体重、0.05ml/只进行气管内注射；肺纤维化药物干预组、药物干预对照组口服给药烟酰胺核糖0.05g/kg体重，每天2次；实验7、14天后留取样本、检测。
[0040]
实例4
[0041]
以12周年龄的c57bl/6小鼠为实验对象，博来霉素以5u/kg体重、0.05ml/只进行气管内注射；肺纤维化药物干预组、药物干预对照组口服给药给予烟酰胺核糖1g/kg体重，每
天1次；实验28天后留取样本、检测。
[0042]
参见图1，针对小鼠的诱导肺纤维化的手术操作，同样适用于大鼠、家兔。
[0043]
参见图6，检测结果展示了给予或不给予烟酰胺核糖情况下博来霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织tgf-β1的表达及分布。从图6a、图6b可以看出，正常对照组、假手术组、药物干预对照组的肺组织tgf-β1含量较低且分布范围较小，肺纤维化组的肺组织tgf-β1含量较高且广泛分布于间质组织，肺纤维化药物干预组的tgf-β1含量较低且分布范围较小。即从分子与组织学层面同时说明给予烟酰胺核糖可降低、逆转或推迟发生肺纤维化。
[0044]
实例5
[0045]
以8周年龄的sd大鼠为实验对象，博来霉素以1.5u/kg体重(低剂量，l)、5u/kg体重(高剂量，h)进行气管内注射(0.2ml/只)；肺纤维化药物干预组、药物干预对照组口服给药烟酰胺核糖0.005g/kg体重，每天3次；分别实验3天、7天、14天后留取样本、检测。
[0046]
参见图2，通过蛋白印迹法(western blot)获得博来霉素对动物肺组织tgf-β1蛋白质表达的影响结果。结果表明：与con组未诱导肺纤维化相比，在高低不同的诱导剂量下博来霉素可以引发tgf-β1的升高，即从分子层面提示成功诱导了肺纤维化(不同实验天数的结果都和con组有显著性差别，p＜0.05)。
[0047]
实例6
[0048]
以16周年龄的sd大鼠为实验对象，博来霉素以1.5u/kg体重(低剂量，l)、5u/kg体重(高剂量，h)进行气管内注射(0.2ml/只)；肺纤维化药物干预组、药物干预对照组通过经皮给药给予烟酰胺核糖0.5g/kg体重，每天1次；分别实验7天、14天后留取样本、检测。
[0049]
参见图3，通过he染色获得博来霉素对动物肺组织学结构的影响结果。结果表明：以未诱导出肺纤维化的con组为参照，通过气管注射一定剂量的博来霉素，可使肺间质增厚、纤维组织增生，及成纤维细胞、肌成纤维细胞增殖(图3c较图3b更为明显)。即从组织学层面提示成功诱导了肺纤维化。
[0050]
实例7
[0051]
以24周年龄的sd大鼠为实验对象，博来霉素以3u/kg体重、0.2ml/只进行气管内注射；肺纤维化药物干预组、药物干预对照组腹腔注射烟酰胺核糖1g/kg体重，每天1次；分别实验7天、14天后留取样本、检测。
[0052]
参见图4，通过蛋白印迹法(western blot)获得烟酰胺核糖对博来霉素诱导肺纤维化动物肺组织纤维化相关蛋白质表达的影响结果。结果表明：正常对照组、假手术组、药物干预对照组tgf-β1蛋白低表达，肺纤维化组tgf-β1蛋白高表达，肺纤维化药物干预组tgf-β1蛋白较低表达，提示经博来霉素诱导肺纤维化的纤维化相关蛋白升高，给予烟酰胺核糖则抑制了纤维化相关蛋白升高，即从分子层面说明通过烟酰胺核糖干预可降低肺纤维化(i-n-7d和i-7d、i-n-14d和i-14d比较均为p＜0.05)。
[0053]
实例8
[0054]
以0.5年龄的家兔为实验对象，博来霉素以3u/kg体重、0.5ml/只进行气管内注射；肺纤维化药物干预组、药物干预对照组耳缘静脉注射烟酰胺核糖0.1g/kg体重，每天1次；实验7天后留取样本、检测。
[0055]
实例9
[0056]
以1.5年龄的家兔为实验对象，博来霉素以5u/kg体重、0.5ml/只进行气管内注射；
肺纤维化药物干预组、药物干预对照组通过雾化吸入(呼吸道给药)的方式给予烟酰胺核糖0.5g/kg体重，每天2次；实验7、14天后留取样本、检测。
[0057]
参见图5，通过he染色获得烟酰胺核糖对博来霉素诱导肺纤维化动物肺组织学结构的影响结果。结果表明：正常对照组、假手术组、药物干预对照组的肺组织未出现纤维化改变，肺纤维化组的肺组织纤维化改变较重，肺纤维化药物干预组的纤维化程度较轻或未出现纤维化改变，即从组织学层面说明通过烟酰胺核糖干预可降低、逆转肺纤维化(相较于i-7d表现出的明显肺纤维化组织学特征，i-n-7d明显改善，并与con、s-o组相似；实验14天与7天的结果相似)。
[0058]
实例10
[0059]
以3年龄的家兔为实验对象，博来霉素以1.5u/kg体重、0.5ml/只进行气管内注射；肺纤维化药物干预组、药物干预对照组口服给药烟酰胺核糖1g/kg体重，每天1次；实验28天后留取样本、检测。