一种酪氨酸酶响应的级联放大纳米药物及其制备和应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种基于酪氨酸酶响应的级联放大纳米药物，以及其对于黑色素瘤精准治疗的应用。


背景技术：

2.癌症的临床治疗中，化疗是最常用的方法之一，但是由于其系统的全身用药，且化疗药的肿瘤选择性不强，因此经常会导致严重的毒副作用。纳米药物的提出，显著改善上述问题，通过将化疗药物组装成纳米药物，能够增加药物的肿瘤内累计，增强选择性。在此基础上，根据异常的肿瘤组织内源信号，如高活性氧(ros)，高谷胱甘肽(gsh)，低ph等，开发出多种通过刺激相应信号源实现药物释放的纳米释药系统。但是目前纳米药物在临床中的表现仍然有限，目前在临床上使用的纳米药物仅仅能降低毒副作用，并未达到大幅度提高治疗效果。
3.在现有的肿瘤组织学认知的基础上，虽然利用高渗透和滞留效应(enhanced permeability and retention effect,epr effect)能够一定程度提高药物的肿瘤内蓄积。但是后续如何促进提高肿瘤治疗效果，避免毒副作用，仍是目前亟待解决的关键科学问题。目前提高肿瘤的化疗效果主要分为两种策略，其中一种是利用两种或多种在肿瘤杀伤机理方面具有协同作用的化疗药物，进行肿瘤的治疗。此种方法能大幅增强肿瘤的杀伤作用，但相应的系统毒副作用也会增强。另外一种方法是利用响应激活的原理，体内输送化疗前药，并促进前药在肿瘤组织内高效激活。此种方法通过化学修饰，遮蔽药物在系统循环中的毒副作用。但是相应的由于肿瘤组织与正常组织之间的激活信号差异不够显著，导致高效的瘤内选择性药物激活仍然难以实现。
4.级联放大策略可用来放大肿瘤组织中的刺激信号，促进化疗前药的高效激活。如文献“a tumor-specific cascade amplification drug release nanoparticle for overcoming multidrug resistance in cancers”中，利用特异性放大肿瘤组织中的ros信号，可实现高效激活化疗药。但是其存在的问题是，若响应的刺激信号放大过程发生在正常组织，则会造成更严重的毒副作用。如申请号为202010885949.x的专利文献中公开利用光敏剂增强ros，其缺点不仅限于受光穿透性影响，仅能实现浅表层的ros信号放大，而且仍不能避免对正常组织更强的毒副作用。
5.因此开发出一种针对肿瘤兼备特异性和高效性的纳米药物，即在系统循环过程中具备较低的系统毒副作用，同时针对黑色素瘤具有精准的药物激活，癌细胞杀伤作用的纳米药物，是本领域技术人员需要解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种针对黑色素瘤治疗的纳米药物，利用黑色素瘤内特异性高表达的酪氨酸酶，实现肿瘤组织内ros信号特异性放大。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种酪氨酸酶响应的级联放大纳米药物，所述纳米药物为两亲性聚合物和化疗前药在水中自组装形成的胶束型纳米颗粒；所述两亲性聚合物的亲水段为聚乙二醇，疏水段为以活性氧(ros)响应基团连接对乙酰基氨基酚的聚甲基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯链段；所述化疗前药为活性氧响应基团修饰的化疗药物。
9.本发明利用两亲性的聚合物载体包裹化疗药物，两亲性聚合物在自组装形成胶束的过程中，其疏水端与疏水性化疗药物通过疏水作用以及分子间的π-π堆叠作用，使得化疗药物包裹在聚合物胶束内部，从而制得所述的纳米药物。
10.本发明在构建两亲性聚合物的疏水段时，采用以ros响应连接键连接含对乙酰氨基酚作为可聚合单体，在纳米药物进入肿瘤组织后，细胞内较高的ros水平触发ros响应连接键，释放对乙酰氨基酚的小分子，黑色素瘤内特异性高表达的酪氨酸酶，催化含对乙酰氨基酚的氧化，促进肿瘤组织内ros的升高，从而加速化疗前药的释放与激活。该级联放大过程只有在高表达酪氨酸酶的肿瘤中实现，在其他肿瘤和正常健康组织中不会触发，因此，大大降低系统的毒副作用。
11.所述ros响应连接键的类型可以为硫醚，缩硫酮，乙烯基二硫醚，苯硼酸酯，硒醚，碲醚，草酸酯等。
12.进一步的，所述可聚合单体的制备方法包括：首先含ros响应连接键的化合物的羧基和对乙酰氨基酚通过酯键连接，然后再加入甲基丙烯酸羟乙酯或丙烯酸羟乙酯酯化，获得可聚合的ros响应的单体。
13.所述对乙酰氨基酚的结构式如下：
[0014][0015]
进一步的，所述两亲性聚合物中，疏水段通过酯键与亲水段连接。酯键可通过酯酶催化水解，促进疏水段释放。
[0016]
进一步的，采用可逆加成-断裂链转移聚合法或原子转移自由基聚合法制备所述的两亲性聚合物。
[0017]
所述可逆加成-断裂链转移聚合法为利用聚乙二醇大分子链转移剂聚合含对乙酰基氨基酚的甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯单体。具体的，可逆加成-断裂链转移聚合法(raft)包括：利用大分子链转移剂peg-pettc，可聚合单体，经aibn引发自由基活性聚合。
[0018]
所述原子转移自由基聚合法为利用引发剂聚合含对乙酰基氨基酚的甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯单体。具体的，原子转移自由基聚合法(atrp)包括：利用大分子链引发剂peg-br，可聚合单体，链转移剂cubr，进行原子转移自由基聚合。
[0019]
进一步的，所述两亲性聚合物的结构式如式(ⅰ)或(ⅱ)所示，
[0020][0021]
其中，r为h或ch3；n＝1-50，m＝40-300。
[0022]
所述化疗前药为结构修饰过的化疗药物，其本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质，可降低药物的系统毒副作用。
[0023]
所述化疗前药为ros响应连接键修饰的化疗药物。化疗前药会在放大的ros信号作用下，迅速高效释放和激活。所述化疗药物包括但不限于阿霉素、喜树碱衍生物、伊立替康、紫杉醇。
[0024]
进一步的，所述化疗前药的结构式如式(ⅲ)或(ⅳ)所示：
[0025][0026]
本发明还提供了一种制备所述酪氨酸酶响应的级联放大纳米药物的方法，具体的，利用聚合物胶束制备方法如溶剂置换法，透析法，超声法或液膜法将两亲性聚合物与化疗前药在水中自组装形成胶束型纳米颗粒。
[0027]
其中，溶剂置换法包括：首先将两亲性聚合物和化疗前药溶解于良溶剂中，再在振荡条件下将混合液加入到水中，产物自组装形成所述纳米药物。
[0028]
进一步的，所述两亲性聚合物与化疗前药的摩尔比为4-15:1。两亲性聚合物的包药效率随着聚合物用量的增大而提高，但是聚合物用量过多，造成聚合物的浪费。在此质量比范围内，能保证较高的包药率和聚合物利用率。
[0029]
本发明还提供了所述的酪氨酸酶响应的级联放大纳米药物在制备黑色素瘤治疗药物中的应用。
[0030]
与正常组织或者其他类型的肿瘤组织相比，黑色素瘤中特异性高表达酪氨酸酶，其主要催化体内酪氨酸形成黑色素，同时升高组织内的ros水平。本发明提供的纳米药物中
含有对乙酰氨基酚，高表达的酪氨酸酶催化酚羟基氧化，促进肿瘤组织中ros的升高，实现级联放大，加速化疗前药的释放与激活。
[0031]
本发明具备的有益效果：
[0032]
本发明提供的纳米药物能够针对黑色素瘤实现精准治疗，在药物到达肿瘤组织后，较高的ros水平触发对乙酰氨基酚的释放，黑色素瘤中特异性高表达的酪氨酸酶催化对乙酰氨基酚的氧化，促进肿瘤组织内ros的升高，从而加速化疗前药的释放与激活。而在不含有黑色素瘤的肿瘤和健康组织中上述过程则不会发生，因此显著增强了纳米药物的肿瘤选择性，实现了肿瘤的精准治疗。
附图说明
[0033]
图1为实施例1中两亲性聚合物的凝胶渗透色谱。
[0034]
图2为实施例1中纳米药物tr-carn形成示意图。
[0035]
图3为实施例1中纳米药物tr-carn的动态光散射图。
[0036]
图4为实施例1中纳米药物tr-carn透射电镜图。
[0037]
图5为实施例1中纳米药物在双氧水的作用下，以化疗药dox为示例的药物释放曲线。
[0038]
图6为实施例1中纳米药物tr-carn在不同细胞株上的细胞毒性，其中apap，bdox分别为对乙酰氨基酚(apap)和阿霉素前药(bdox)小分子处理细胞；apap bdox是用两种药物处理细胞；tr-carn是用peg-papap包裹bdox形成的纳米药物处理细胞。
[0039]
图7为实施例1中纳米药物在b16f10细胞水平上，提高ros能力的表征。
[0040]
图8为实施例1中纳米药物在c57bl/6小鼠的b16f10肿瘤模型中的抑瘤效果的评估，图示为抑瘤曲线。
[0041]
图9为实施例1中纳米药物在c57bl/6小鼠的b16f10肿瘤模型中的抑瘤效果的评估，图示为抑瘤周期终点时，肿瘤的照片。
[0042]
图10为实施例1中纳米药物在c57bl/6小鼠的b16f10肿瘤模型中的抑瘤效果的评估，图示为小鼠体重变化曲线。
具体实施方式
[0043]
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0044]
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0045]
实施例中涉及的化合物英文缩写说明如下：
[0046]
apap-对乙酰氨基酚；dmap-4-二甲氨基吡啶；dmf-n,n-二甲基甲酰胺；edc-1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；dcm-二氯甲烷；hema-甲基丙烯酸羟乙酯；aibn-偶氮二异丁腈；dmso-二甲基亚砜。
[0047]
实施例1
[0048]
1、采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备两亲性聚合物
[0049]
(1)对乙酰氨基酚(10g,66.2mmol)、硫代二乙酸(10.9g,72.8mmol)和dmap(1.6g,13.2mmol)溶解在50ml无水dmf中，edc(19.0g,99.3mmol)溶解在30ml无水dcm中并在冰水浴下滴加到上述溶液中。12小时后，在溶液中加入甲基丙烯酸羟乙酯hema(10.3g，79.5mmol)，然后在冰水浴下滴加edc(19.0，99.3mmol)的30ml无水dcm溶液。24小时后，通过旋转蒸发除去溶剂。将粗产物溶解在200ml dcm中并用1m hcl(50ml*3)和饱和盐溶液洗涤。产物通过柱色谱纯化，得到产物可聚合单体hsapap。其反应过程为：
[0050][0051]
(2)聚合物peg-papap通过raft聚合得到。取上一步得到的可聚合单体(0.20g,0.5mmol)，大分子链转移剂peg-pettc(0.20g,0.037mmol)和aibn(6.56mg,0.04mmol)溶解在2ml dmf中。通过n2去除o
2 0.5小时后，将反应加热至70℃15小时。通过在乙醚中沉淀获得peg-papap。
[0052][0053]
如图1所示，通过凝胶渗透色谱表征聚合物，得到聚合物的分子量为15.6kda，多分散性指数为1.115。由此可知获得的两亲性聚合物具有良好的单分散性。
[0054]
2、纳米药物tr-carn的制备
[0055]
(1)bdox的制备：4-(羟甲基)苯基硼酸片那醇酯(0.5g，2.1mmol)，对硝基苯甲酰氯(0.47g，2.4mmol)溶解在20ml二氯甲烷中，冰浴条件下，滴加10ml含有0.6ml三乙胺的二氯甲烷溶液。室温反应过夜，用硅胶柱分离，乙酸乙酯：正己烷＝1：3。得到的产物称取(0.2g，0.5mmol)，阿霉素盐酸盐(0.2g，0.34mmol)溶解在dmf中，并加入三乙胺(143μl，1.03mmol)。反应在避光条件下，室温反应24h。经硅胶柱分离，二氯甲烷：甲醇＝15:1。
[0056]
(2)tr-carn通过共沉淀法制备。将peg-papap(25mg)和bdox(8mg)溶解在300μl dmso中，并在剧烈搅拌下将溶液加入4ml去离子水中。并且通过透析去除dmso。过滤除去沉淀的bdox。自组装过程如图2所示。
[0057]
如图3所示，通过共沉淀法制备得到的纳米颗粒粒径大约为65nm。多分散性指数为0.20。同时，利用透射电镜观察到纳米颗粒为粒径为65nm左右的球状颗粒(图4)。
[0058]
在体内应用时，合适的粒径能够促进纳米颗粒在血液内较长的循环时间，同时利于纳米颗粒在肿瘤内蓄积。本实施例制备的纳米颗粒粒径为65nm左右，既能防止过早的肾脏清除，又能防止肝脏中细胞清除系统对大颗粒的清除，适用于体内的应用。
[0059]
3、dox的体外释放
[0060]
tr-carns(1ml)密封在截留分子量为3500da的透析袋中，并在含有或不含有0.1mm h2o2的37ml含有2％tween 80的pbs中孵育。每隔一定时间收集透析袋外的100μl溶液，用hplc测定dox浓度。
[0061]
ros响应释放能力是评价tr-carn在体内应用中非常重要的一部分，良好的响应释放能力，能保证药物的充分激活，并随后产生细胞毒性。如图5所示，在0.1mm的双氧水中，大
约4h，纳米颗粒中包裹的bdox约有30％被还原成dox，并释放出来。而在不含有双氧水的环境下，没有发现dox的释放。
[0062]
4、tr-carn在不同细胞株上的细胞毒性
[0063]
通过使用mtt测定，用于评估apap、bdox、apap bdox和tr-carn在b16f10、4t1和nih/3t3细胞株上的细胞毒性。apap、bdox、apap bdox和tr-carn分别表示对乙酰氨基酚、阿霉素前药、乙酰氨基酚 阿霉素前药、peg-papap包裹bdox形成的纳米药物处理细胞。
[0064]
将细胞以每孔3500个细胞的密度接种在96孔板中并孵育过夜。将细胞暴露于连续稀释的药物中并再培养48小时，然后将培养基更换为含有0.75mg/ml mtt的新鲜溶液。孵育3小时后，黄色mtt被代谢成深蓝色晶体，小心去除mtt培养基溶液。最后，在孔中加入0.1ml dmso，轻轻摇动平板使沉淀溶解。使用酶标仪在562nm和620nm处测定每个孔中的吸光度，并计算在量个波长下的吸光度差值。细胞活力通过计算加药孔与空白对照组吸光值差值的比值即可获得。
[0065]
本项目中的级联放大概念的触发机制是细胞株中是否存在酪氨酸酶。如图6所示，通过细胞水平的毒性分析，我们可知，在有酪氨酸酶的b16f10细胞株中，dox，bdox apap，tr-carn表现出几乎近似的细胞毒性。而在不含有酪氨酸酶的4t1和nih/3t3细胞株中，dox的细胞毒性远远高于bdox apap和tr-carn组。这说明证实由于酪氨酸酶的存在，诱导了细胞内ros级联信号放大的过程，并促进了化疗前药的释放和激活。
[0066]
5、细胞内ros的测定
[0067]
将b16f10细胞在处理前以100000个细胞/板的密度在玻璃底培养皿中培养24小时。细胞暴露于apap、bdox、tr-carn和dox四组实验组。dox剂量为0.1μm，apap剂量为1μm。2小时后，细胞在无血清培养基中用dcfh-da染色30分钟，细胞核用hoechst33342染色15分钟。用pbs洗涤3次后，在激光共聚焦显微镜上获得细胞图像。其中dcfh-da的激发和发射波长为488nm和523nm。
[0068]
为了进一步佐证细胞内的级联放大过程，本项目利用dcfh-da验证了apap和tr-carn提高b16f10细胞株中ros的能力。如图7所示，孵育两个小时后，用激光共聚焦观察到apap和tr-carn能显著提高细胞内的ros水平。而bdox则不能提高细胞内的ros水平。这再次证明了酪氨酸酶催化对乙酰氨基酚提高肿瘤细胞内ros水平的能力。
[0069]
6、在c57bl/6小鼠的b16f10肿瘤模型中的抑瘤效果评估
[0070]
c57bl/6小鼠皮下注射106个b16f10细胞。肿瘤体积达到60mm3左右时，小鼠被随机分配到五个治疗组(n＝6)：pbs、apap、bdox、dox、tr-carn。dox等效剂量为5mg/kg，apap等效剂量为1.5mg/kg。药物通过尾静脉注射，每两天注射一次，共给药5次。使用公式计算肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积＝(最短直径)2×
(最长直径)
×
0.5。
[0071]
通过在c57bl/6小鼠的b16f10皮下瘤模型中的抑瘤评估。如图8-10所示，本项目中相比于dox组，tr-carn表现出显著增强的抑瘤效果。同时，由于其体内循环过程中化疗前药的毒性较低，因此在tr-carn组中，小鼠的体重降低也较dox组更小。
[0072]
实施例2
[0073]
1、采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备两亲性聚合物
[0074]
(1)丙烯酸羟乙酯通过硫醚键连接对乙酰氨基酚构建可聚合单体：
[0075]
对乙酰氨基酚(10g,66.2mmol)、硫代二乙酸(10.9g,72.8mmol)和dmap(1.6g,
13.2mmol)溶解在50ml无水dmf中，edc(19.0g,99.3mmol)溶解在30ml无水dcm中并在冰水浴下滴加到上述溶液中。12小时后，在溶液中加入丙烯酸羟乙酯hea(9.2g，79.5mmol)，然后在冰水浴下滴加edc(19.0，99.3mmol)的30ml无水dcm溶液。24小时后，通过旋转蒸发除去溶剂。将粗产物溶解在200ml dcm中并用1m hcl(50ml*3)和饱和盐溶液洗涤。产物通过柱色谱纯化，得到产物可聚合单体。其反应过程为：
[0076][0077]
步骤(2)同实施例1。
[0078]
2、纳米药物的制备
[0079]
制备方法同实施例1。
[0080]
3、性能表征
[0081]
在c57bl/6小鼠的b16f10皮下瘤模型中的抑瘤效果显示，相比于dox组，本实施例制备的纳米颗粒表现出显著增强的抑瘤效果。
[0082]
实施例3
[0083]
1、原子转移自由基聚合法制备两亲性聚合物
[0084]
(1)可聚合单体hsapap的制备同实施例1。
[0085]
(2)可聚合单体hsapap(0.20g,0.51mmol)，大分子链引发剂peg-br(0.20g,0.037mmol)和cubr(5.7mg,0.04mmol)溶解在2ml dmf中。通氮气15min后，用针筒加入五甲基二乙烯三胺(pmdeta,6.9mg,0.04mmol)，再通氮气30min，在65℃条件下，反应15h。后用去离子水透析，冻干后，得到两亲性聚合物，其反应过程为：
[0086][0087]
2、纳米药物的制备
[0088]
制备方法同实施例1。
[0089]
3、性能表征
[0090]
在c57bl/6小鼠的b16f10皮下瘤模型中的抑瘤效果显示，相比于dox组，本实施例制备的纳米颗粒表现出显著增强的抑瘤效果。
[0091]
以上实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。