改变抗原结合分子的血浆中滞留性和免疫原性的方法
本技术是国际申请日2012年3月30日，国际申请号pct/jp2012/058603,进入中国国家阶段申请日2013年12月2日，中国国家申请号201280026850.8,发明名称为“改变抗原结合分子的血浆中滞留性和免疫原性的方法”的分案申请。
技术领域
1.本发明涉及通过改变包含抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件发生变化的抗原结合结构域、与在ph中性范围条件下具有fcrn结合活性的fc区的抗原结合分子的fc区，从而改善给予了抗原结合分子的机体的药代动力学的方法、或降低抗原结合分子的免疫应答的方法。此外，本发明还涉及在给予机体时其药代动力学得到改善、或该机体的免疫应答得到降低的抗原结合分子。进而，本发明还涉及该抗原结合分子的制造方法、和含有该抗原结合分子作为有效成分的药物组合物。
背景技术：
2.抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因而作为医药品受到关注。其中，igg型的抗体药物有大量上市，现在也正在开发着数量众多的抗体药物(非专利文献1和非专利文献2)。另一方面，作为能适用于第二代抗体药物的技术，开发有各种技术，报道了使效应器功能、抗原结合能力、药代动力学、稳定性提高的技术、或者使免疫原性风险降低的技术等(非专利文献3)。通常，抗体药物的给药量非常高，因而作为课题可考虑到难以制作皮下给药制剂，制造成本高等。作为降低抗体药物的给药量的方法，可考虑提高抗体的药代动力学的方法、和提高抗体与抗原的亲和性的方法。
3.作为提高抗体的药代动力学的方法，报道有恒定区的人工氨基酸置换(非专利文献4和5)。作为增强抗原结合能力、抗原中和能力的技术，报道有亲和力成熟技术(非专利文献6)，通过对可变区的cdr区等的氨基酸导入突变可以增强对抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力，可以提高体外的生物活性，或者降低给药量，进而也可以提高体内(机体内)的药效(非专利文献7)。
4.另一方面，每一分子抗体能够中和的抗原量依赖于亲和性，可以通过增强亲和性来以少的抗体量中和抗原，可以通过各种方法增强抗体的亲和性(非专利文献6)。进而，只要可共价地与抗原结合，使亲和性无限大，则可以用一分子的抗体来中和一分子的抗原(二价的情形为二抗原)。但是，迄今为止的方法中，限制是一分子抗体对一分子抗原(二价的情形是二抗原)的化学计量的中和反应，不可能用抗原量以下的抗体量来完全中和抗原。即，在增强亲和性的效果方面存在限制(非专利文献9)。中和抗体的情形中，为了使其中和效果持续一定期间，需要给予机体内在该期间产生的抗原量以上的抗体量，仅通过上述的抗体药代动力学提高、或者亲和力成熟技术，在降低必要抗体给药量方面存在限制。因此，为了用抗原量以下的抗体量来使抗原的中和效果持续目标期间，需要用一个抗体来中和多个抗原。作为实现其的新方法，最近报道了ph依赖性地与抗原结合的抗体(专利文献1)。在血浆中的中性条件下与抗原强结合、在内体内的酸性条件下从抗原解离的ph依赖性抗原结合抗
体可以在内体内从抗原解离。ph依赖性抗原结合抗体在将抗原解离后，若抗体通过fcrn被循环至血浆中，则可以再次与抗原结合，因而可以用一个ph依赖性抗原结合抗体反复与多个抗原结合。
5.另外，与结合至fcrn而被循环的抗体相比，抗原的血浆中滞留性非常短。这种血浆中滞留性长的抗体与该抗原结合时，抗体抗原复合体的血浆中滞留性变得与抗体同样地长。因此，抗原通过与抗体结合，不仅血浆中滞留性变长，而且血浆中抗原浓度上升。
6.igg抗体通过与fcrn结合而具有长的血浆中滞留性。igg和fcrn的结合仅在酸性条件下(ph6.0)被观察到，而在中性条件下(ph7.4)基本观察不到其结合。igg抗体被非特异性地摄入细胞，但通过在内体内的酸性条件下与内体内的fcrn结合而返回到细胞表面上，在血浆中的中性条件下从fcrn解离。向igg的fc区导入突变而丧失在酸性条件下与fcrn的结合时，变得无法从内体内再循环至血浆中，因而抗体的血浆中滞留性显著受损。作为改善igg抗体的血浆中滞留性的方法，报道有提高酸性条件下对fcrn的结合的方法。通过向igg抗体的fc区导入氨基酸置换，使酸性条件下的对fcrn的结合提高，从内体内再循环至血浆中的效率提高，结果血浆中滞留性改善。导入氨基酸置换时重要的是不能提高中性条件下对fcrn的结合。若中性条件下与fcrn结合，则即使在内体内的酸性条件下与fcrn结合而返回到细胞表面上，在中性条件下的血浆中igg抗体也不会从fcrn解离，此时igg抗体未被再循环至血浆中，因而反而会损害血浆中滞留性。例如，将通过对igg1导入氨基酸置换而在中性条件下(ph7.4)观察到对小鼠fcrn的结合的抗体给予小鼠时，据报道抗体的血浆中滞留性变差(非专利文献10)。此外，在对食蟹猴给予通过对igg1导入氨基酸置换而使酸性条件下(ph6.0)的人fcrn的结合提高、但同时还观察到中性条件下(ph7.4)对人fcrn的结合的抗体时，据报道抗体的血浆中滞留性没有发生改善，血浆中滞留性未观察到变化(非专利文献10、11和12)。因此，提高抗体功能的抗体工程技术中，仅仅着眼于通过不使中性条件下(ph7.4)对人fcrn的结合增加而使酸性条件下对人fcrn的结合增加来改善抗体的血浆中滞留性，迄今为止尚未报道向igg抗体的fc区导入氨基酸置换以增加中性条件下(ph7.4)对人fcrn的结合的优点。即使提高抗体对抗原的亲和性，也不能促进抗原从血浆中的消除。上述的ph依赖性抗原结合抗体据报道与通常的抗体相比，作为促进抗原从血浆中消除的方法也是有效的(专利文献1)。
7.如此，ph依赖性抗原结合抗体可以用1个抗体与多个抗原结合，与通常的抗体相比，能促进抗原从血浆中的消除，因此具有通常的抗体所无法实现的作用。然而，迄今为止尚未报道有该ph依赖性抗原结合抗体的可以反复与抗原结合的效果、以及使促进抗原从血浆中消除的效果进一步提高的抗体工程技术。
8.另一方面，抗体药物的免疫原性在将抗体药物对人给予时的血浆中滞留性、有效性、安全性方面非常重要。据报道，人的体内若对所给予的抗体药物产生抗体，则会引起抗体药物在血浆中的消除加快、有效性降低、引起过敏反应而影响安全性等不期望的事件(非专利文献13)。
9.在考虑抗体药物的免疫原性的基础上，需要对天然抗体原本在机体内所起的功能进行理解。首先，多数抗体药物是属于igg类的抗体，但作为与igg抗体的fc区结合而起作用的fc受体，已知有fcγ受体(以下，也记载为fcγr)的存在。已知fcγr表达在树突细胞或nk细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、脂肪细胞等的细胞膜上，通过igg的fc区的结合而对免疫细
胞传达活性型或抑制型的细胞内信号。作为人fcγr的蛋白家族，报道有fcγria、fcγriia、fcγriib、fcγriiia、fcγriiib的同型，也报道有各自的异型(非专利文献14)。作为人fcγriia的异型，报道有131位为arg(hfcγriia(r))和his(hfcγriia(h))的2种。另外，作为人fcγriiia的异型，报道有158位为val(hfcγriiia(v))和phe(hfcγriiia(f))的2种。此外，作为小鼠fcγr的蛋白家族，报道有fcγri、fcγriib、fcγriii、fcγriv(非专利文献15)。
10.人fcγr分类为作为活性型受体的fcγria、fcγriia、fcγriiia、fcγriiib、以及作为抑制性受体的fcγriib。同样地，小鼠fcγr分类为作为活性型受体的fcγri、fcγriii、fcγriv、以及作为抑制性受体的fcγriib。
11.活性型fcγr若与免疫复合体交联，则会引起细胞内结构域或作为相互作用对象的fcr commonγ-链所含的免疫受体酪氨酸相关的活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activating motifs,itams)的磷酸化，将信号传递物质syk活化，开始活化信号级连，由此引起炎症性免疫反应(非专利文献15)。
12.已表明，对于fc区与fcγr的结合，抗体的铰链区以及ch2结构域内的数个氨基酸残基以及与ch2结构域结合的eu编号297位的asn上所附加的糖链是重要的(非专利文献15、非专利文献16、非专利文献17)。围绕向这些位置导入了突变的抗体，迄今为止研究了对各种fcγr具有结合特性的突变体，得到了对活性型fcγr具有更高亲和性的fc区突变体(专利文献2、专利文献3、专利文献4、专利文献5)。
13.另一方面，作为抑制型fcγr的fcγriib是表达于b细胞的唯一的fcγr(非专利文献18)。据报道，通过抗体的fc区对fcγriib的相互作用，b细胞的初次免疫得到抑制(非专利文献19)。此外，据报道b细胞上的fcγriib和b细胞受体(b cell receptor：bcr)若经由血中的免疫复合体交联，则b细胞的活化受到抑制，b细胞的抗体产生受到抑制(非专利文献20)。该bcr和fcγriib介导的免疫抑制信号的传导中需要包含在fcγriib的细胞内结构域中的免疫受体酪氨酸相关的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，itim)(非专利文献21、非专利文献22)。该免疫抑制作用经由itim的磷酸化而发生。磷酸化的结果是含sh2的肌醇多磷酸5-磷酸酶(sh2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase，ship)被补充，阻碍其它的活性型fcγr的信号级联的传导，抑制炎症性免疫反应(非专利文献23)。
14.由于该性质，因而fcγriib被期待作为直接降低针对抗体药物的免疫原性的方法。即使将在对小鼠来说是异种蛋白的exendin-4(ex4)中融合有小鼠igg1的分子(ex4/fc)给予小鼠，也不会产生抗体，但是通过给予对ex4/fc加以修饰而形成的不会与b细胞上的fcγriib结合的分子(ex4/fc mut)，却会产生针对ex4的抗体(非专利文献24)。该结果暗示ex4/fc与b细胞上的fcγriib结合，从而抑制b细胞的针对ex4的小鼠抗体的产生。
15.此外，fcγriib也表达于树突细胞、巨噬细胞、活化的嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱细胞。在这些细胞中，fcγriib也妨碍吞噬作用和炎症性细胞因子的释放等活性型fcγr的功能，抑制炎症性免疫反应(非专利文献25)。
16.对于fcγriib的免疫抑制功能的重要性，迄今为止通过使用了fcγriib敲除小鼠的研究进行了说明。据报道，fcγriib敲除小鼠中，体液免疫未受适当控制(非专利文献26)、对胶原诱导关节炎(cia)的敏感性增加(非专利文献27)、呈狼疮(lupus)样的症状、或
呈古德帕斯彻(goodpasture)综合征样的症状(非专利文献28)。
17.此外，据报道fcγriib的调节不全也与人的自体免疫疾病相关。例如，据报道fcγriib的启动子区或穿膜区的基因多态性与系统性红斑狼疮(sle)的发病频率相关(非专利文献29、非专利文献30、非专利文献31、非专利文献32、非专利文献33)、或者sle患者的b细胞表面的fcγriib的表达降低(非专利文献34、非专利文献35)。
18.这样，根据小鼠模型和临床上的发现，认为fcγriib主要通过与b细胞的相关而发挥控制自身免疫疾病、炎症性疾病的功能，是有望用于控制自身免疫疾病、炎症性疾病的目标分子。
19.已知主要用作市售抗体药物的igg1不仅与fcγriib强结合，而且与活性型fcγr也强结合(非专利文献36)。认为通过利用增强了fcγriib结合的fc区、或者与活性型fcγr相比提高了fcγriib结合的选择性的fc区，可以开发出与igg1相比具有免疫抑制性质的抗体药物。例如，暗示了通过利用具有与bcr结合的可变区、和增强了fcγriib结合的fc的抗体，可以抑制b细胞的活化的可能性(非专利文献37)。
20.但是，已知fcγriib与作为活性型fcγr之一的fcγriia的胞外区的序列为93％一致，结构极其类似。进而，作为基因多态性，fcγriia中存在第二ig结构域的131位的氨基酸为his的h型与作为arg的r型，各自与抗体的相互作用不同(非专利文献38)。因此，为了制造特异性地与fcγriib结合的fc区，认为最难的问题是对抗体的fc区赋予在不增加或减少对fcγriia的各基因多型的结合活性、同时增加fcγriib结合活性的选择性地提高fcγriib结合活性的性质。
21.迄今为止报道了通过向fc区导入氨基酸突变来使fcγriib结合的特异性提高的例子(非专利文献39)。该文献中，制作了与igg1相比、较对两基因多型的fcγriia的结合更多地维持了对fcγriib的结合的突变体。但是，该文献中报道的对fcγriib的特异性得到改善的任意突变体中，与天然型igg1相比，对fcγriib的结合减少。因此，认为这些突变体实际上难以在igg1以上的程度上引起fcγriib介导的免疫抑制性反应。
22.也增强了对fcγriib的结合的报道(非专利文献37)。该文献中，通过向抗体的fc区加以s267e/l328f、g236d/s267e、s239d/s267e等的突变来使对fcγriib的结合增强。其中，导入了s267e/l328f的突变的抗体最为强烈地与fcγriib强结合，但该突变体对fcγria和fcγriia的h型的结合却维持于和天然型igg1相同程度。即使fcγriib结合与igg1相比增强，对于不表达fcγriib而表达fcγriia的血小板之类的细胞(非专利文献25)，也并非fcγriib结合的增强，而仅是fcγriia结合的增强效果有影响。例如有报道，在系统性红斑狼疮中，血小板通过fcγriia依赖性机制活化，血小板的活化与重症度相关(非专利文献40)。进而根据其它报道，该突变使得对fcγriia的r型的结合增强至对fcγriib的结合的同程度的数百倍，r型中，与fcγriia结合相比，fcγriib结合的选择性并未提高(专利文献17)。此外，相对于树突细胞或巨噬细胞等表达fcγriia和fcγriib两者的细胞种类，为了传递抑制性信号，需要相较于fcγriia的对fcγriib的结合的选择性，对于r型来说，其无法实现。
23.fcγriia的h型和r型在高加索人和非裔美国人中以大致相同程度的频率被观察到(非专利文献41、非专利文献42)。因此，认为将对fcγriia r型的结合增强的抗体用于自身免疫疾病的治疗具有一定的限制。即使fcγriib结合与活性型fcγr相比增强，从用作自
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技术实现要素：
27.发明要解决的技术问题作为相对于给予的抗体药物引起免疫应答的主要原因，除了上述活性型fcγr的参与之外，被称为抗原呈递的作用也非常重要。抗原呈递是指巨噬细胞或树突细胞等抗原呈递细胞将细菌等外源性和内源性抗原吸收至细胞内进行分解后，将其一部分呈递至细胞表面的免疫机制。呈递的抗原被t细胞等识别，激活细胞性免疫和体液免疫。
28.作为树突细胞中的抗原呈递，存在下述通路：被作为免疫复合体(由多价的抗体和抗原形成的复合体)吸收至细胞内的抗原在溶酶体被分解、来源于抗原的肽被呈递至mhc ii类分子。该通路中，fcrn发挥重要的功能，据报道，使用缺失fcrn的树突细胞时、或使用不与fcrn结合的免疫复合体时，不会引起抗原呈递和由其导致的t细胞的活化(非专利文献43)。
29.对正常动物给予作为异物的抗原蛋白时，会高频率地产生针对所给予抗原蛋白的抗体。例如，对小鼠给予作为异种蛋白的可溶型人il-6受体时，产生针对可溶型人il-6受体的小鼠抗体。但是，即使对小鼠给予作为异种蛋白的人igg1抗体，也基本不会产生针对人igg1抗体的小鼠抗体。该差异被认为会影响给予的异种蛋白在血浆中的消除速度。
30.如参考实施例4所示，人igg1抗体对小鼠fcrn具有酸性条件下的结合能力，因而被吸收到内体内的人igg1抗体与小鼠抗体同样地受到小鼠fcrn介导的再循环。因此，将人igg1抗体给予正常小鼠时，其从血浆中的消除非常慢。另一方面，可溶型人il-6受体由于不受小鼠fcrn介导的再循环，因而在给予后迅速消除。另一方面，如参考实施例4所示，在给予了可溶型人il-6受体的正常小鼠中确认到针对可溶型人il-6r抗体的小鼠抗体的产生，而在给予了人igg1抗体的正常小鼠中未观察到针对人igg1抗体的小鼠抗体的产生。即，在小鼠中，消除快的可溶型人il-6受体比消除慢的人igg1抗体的免疫原性高。
31.这些异种蛋白(可溶型人il-6受体或人igg1抗体)从血浆中消除的通路的一部分被认为是抗原呈递细胞的摄入。被摄入抗原呈递细胞的异种蛋白在细胞内受到加工后，与mhc ii类分子缔合，输送到细胞膜上。因此，发生向抗原特异性t细胞(例如，对可溶型人il-6受体或人igg1抗体特异性地应答的t细胞)的抗原呈递时，发生抗原特异性t细胞的活化。因此认为，血浆中的消除慢的异种蛋白难以受到抗原呈递细胞的加工，结果难以发生对抗原特异性t细胞的抗原呈递。
32.已知由于在中性条件下与fcrn结合，抗体的血浆中滞留性变差。若中性条件下与fcrn结合，则即使在内体内的酸性条件下与fcrn结合而返回到细胞表面上，在中性条件下的血浆中igg抗体也不会从fcrn解离，此时igg抗体未被再循环至血浆中，因而反而会损害血浆中滞留性。例如，将通过对igg1导入氨基酸置换而在中性条件下(ph7.4)观察到对小鼠fcrn的结合的抗体给予小鼠时，据报道抗体的血浆中滞留性变差(非专利文献10)。但另一方面，在对食蟹猴给予观察到中性条件下(ph7.4)对人fcrn的结合的抗体时，据报道抗体的血浆中滞留性没有发生改善，血浆中滞留性未观察到变化(非专利文献10、11和12)。当抗原结合分子在中性条件下(ph7.4)对fcrn的结合增强而使血浆中滞留性变差时，由于抗原结合分子的消除变快，因而认为免疫原性可能变高。
33.此外，据报道fcrn表达于抗原呈递细胞并参与抗原呈递。虽然不是抗原结合分子，但在评价对髓磷脂碱性蛋白(mbp)融合了小鼠igg1的fc区的蛋白(以下mbp-fc)的免疫原性进行评价的报告中，mbp-fc特异性地反应的t细胞在mbp-fc的存在下通过培养而发生活化、增殖。这里，已知通过向mbp-fc的fc区添加使对fcrn的结合增强的突变，就体外来说，使得表达于抗原呈递细胞的fcrn介导的向抗原呈递细胞中的摄入增大，由此使t细胞的活化得到增强。然而，据报道尽管通过添加使对fcrn的结合增强的突变使得自血浆中的消除变快，但就体内来说，t细胞的活化反而减弱(非专利文献44)，因而通过使对fcrn的结合增强来使消除变快不一定会使免疫原性变高。
34.如上所述，增强具有fcrn结合结构域的抗原结合分子在中性条件下(ph7.4)对fcrn的结合造成的对抗原结合分子的血浆中滞留性的影响、以及对免疫原性的影响迄今为止尚未受到充分研究。因此，改善在中性条件下(ph7.4)具有fcrn结合活性的抗原结合分子的血浆中滞留性和免疫原性的方法迄今为止尚未被报道。
35.虽然已发现通过使用包含抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件发生变化的抗原结合结构域、与在ph中性范围条件下具有fcrn结合活性的fc区的抗原结合分子，可以促进抗原从血浆中的消除，但增强fc区在ph中性范围条件下对fcrn的结合活性造成的对抗原结合分子的血浆中滞留性和免疫原性的影响迄今为止尚未被充分研究。本发明人的研究进展中，发现具有下述问题：通过增强fc区在ph中性范围条件下对fcrn的结合活性，抗原结合分子的血浆中滞留性降低(药代动力学变差)，抗原结合分子的免疫原性变高(对抗原结合分子的免疫应答变差)。
36.本发明是鉴于上述状况而完成的发明，其目的在于提供通过改变包含抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件发生变化的抗原结合结构域、与在ph中性范围条件下具有fcrn结合活性的fc区的抗原结合分子的fc区，从而改善给予了抗原结合分子的机体的药代动力学的方法。此外，本发明的目的还在于提供通过改变包含抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件发生变化的抗原结合结构域、与在ph中性范围条件下具有fcrn结合活性的fc区的抗原结合分子的fc区，从而降低抗原结合分子的免疫应答的方法。此外，本发明的目的还在于提供将其给予机体时其药代动力学得到改善、或该机体的免疫应答得到降低的抗原结合分子。进而，本发明的目的还在于提供该抗原结合分子的制造方法，同时其目的还在于提供含有该抗原结合分子作为有效成分的药物组合物。
37.用于解决技术问题的方法本发明人为了实现上述目的而进行了深入研究，结果发现，包含抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件发生变化的抗原结合结构域、与在ph中性范围条件下具有fcrn结合活性的fc区的抗原结合分子会形成包含抗原结合分子/两分子的fcrn/活性型fcγ受体这四者的异源复合体(图48)，发现该四者复合体的形成会对药代动力学和免疫应答造成不良影响。发现通过将这种抗原结合分子的fc区改变为在ph中性范围条件下不形成包含两分子的fcrn和活性型fcγ受体这四者的异源复合体的fc区，通过改变为在ph中性范围条件下不形成两分子的fcrn和活性型fcγ受体这四者复合体的fc区，抗原结合分子的药代动力学得到改善。此外还发现，可以改变给予了抗原结合分子的机体的免疫应答。此外还发现，通过改变为在ph中性范围条件下不形成包含两分子的fcrn和活性型fcγ受体这四者的异源复合体的fc区，抗原结合分子的免疫应答得到降低。此外，本发明人在发现具有上
述性质的抗原结合分子、其制造方法的同时，还发现在给予含有这种抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子作为有效成分的药物组合物时，与以往的抗原结合分子相比，具有药代动力学得到改善、给给予的机体的免疫应答得到降低的更优异的特性，从而完成了本发明。
38.即，本发明提供以下内容。
39.〔1〕以下的任一方法，其包含将包含抗原结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合结构域、和在ph中性范围条件下具有fcrn结合活性的fc区的抗原结合分子的fc区改变为在ph中性范围条件下不会形成含有两分子的fcrn和一分子的活性型fcγ受体的异源复合体的fc区的步骤：(a)改善抗原结合分子的药代动力学的方法、或(b)使抗原结合分子的免疫原性降低的方法；〔2〕〔1〕所述的方法，其中，改变为不形成前述异源复合体的fc区的步骤包括：改变为fc区的对活性型fcγ受体的结合活性低于天然型人igg的fc区的对该活性型fcγ受体的结合活性的fc区的步骤；〔3〕〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，前述活性型fcγ受体是人fcγria、人fcγriia(r)、人fcγriia(h)、人fcγriiia(v)或人fcγriiia(f)；〔4〕〔1〕至〔3〕中任一项所述的方法，其包括对前述fc区的氨基酸中以eu编号表示的235位、237位、238位、239位、270位、298位、325位和329位中的任意一个以上的氨基酸进行置换的步骤；〔5〕〔4〕所述的方法，其包括前述fc区的以eu编号表示的氨基酸的下述任一者以上的置换：将234位的氨基酸置换为ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、lys、met、phe、pro、ser、thr或trp中的任一者、将235位的氨基酸置换为ala、asn、asp、gln、glu、gly、his、ile、lys、met、pro、ser、thr、val或arg中的任一者、将236位的氨基酸置换为arg、asn、gln、his、leu、lys、met、phe、pro或tyr中的任一者、将237位的氨基酸置换为ala、asn、asp、gln、glu、his、ile、leu、lys、met、pro、ser、thr、val、tyr或arg中的任一者、将238位的氨基酸置换为ala、asn、gln、glu、gly、his、ile、lys、thr、trp或arg中的任一者、将239位的氨基酸置换为gln、his、lys、phe、pro、trp、tyr或arg中的任一者、将265位的氨基酸置换为ala、arg、asn、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、将266位的氨基酸置换为ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、lys、phe、pro、ser、thr、trp或tyr中的任一者、将267位的氨基酸置换为arg、his、lys、phe、pro、trp或tyr中的任一者、将269位的氨基酸置换为ala、arg、asn、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、
将270位的氨基酸置换为ala、arg、asn、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、将271位的氨基酸置换为arg、his、phe、ser、thr、trp或tyr中的任一者、将295位的氨基酸置换为arg、asn、asp、gly、his、phe、ser、trp或tyr中的任一者、将296位的氨基酸置换为arg、gly、lys或pro中的任一者、将297位的氨基酸置换为ala、将298位的氨基酸置换为arg、gly、lys、pro、trp或tyr中的任一者、将300位的氨基酸置换为arg、lys或pro中的任一者、将324位的氨基酸置换为lys或pro中的任一者、将325位的氨基酸置换为ala、arg、gly、his、ile、lys、phe、pro、thr、trptyr、或val中的任一者、将327位的氨基酸置换为arg、gln、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、将328位的氨基酸置换为arg、asn、gly、his、lys或pro中的任一者、将329位的氨基酸置换为asn、asp、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、ser、thr、trp、tyr、val或arg中的任一者、将330位的氨基酸置换为pro或ser中的任一者、将331位的氨基酸置换为arg、gly或lys中的任一者、或将332位的氨基酸置换为arg、lys或pro中的任一者；〔6〕〔1〕所述的方法，其中，改变为不形成前述异源复合体的fc区的步骤包括：改变为fc区的对抑制型fcγ受体的结合活性高于对活性型fcγ受体的结合活性的fc区的步骤；〔7〕〔6〕所述的方法，其中，前述抑制型fcγ受体是人fcγriib；〔8〕〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，前述活性型fcγ受体是人fcγria、人fcγriia(r)、人fcγriia(h)、人fcγriiia(v)或人fcγriiia(f)；〔9〕〔6〕至〔8〕中任一项所述的方法，其包括对以eu编号表示的238或328位的氨基酸进行置换；〔10〕〔9〕所述的方法，其包括将以eu编号表示的238位的氨基酸置换为asp，或将328位的氨基酸置换glu；〔11〕〔9〕或〔10〕所述的方法，其包括以eu编号表示的氨基酸的下述任一者以上的置换：将233位的氨基酸置换为asp、将234位的氨基酸置换为trp、或tyr中的任一者、将237位的氨基酸置换为ala、asp、glu、leu、met、phe、trp或tyr中的任一者、将239位的氨基酸置换为asp、将267位的氨基酸置换为ala、gln或val中的任一者、将268位的氨基酸置换为asn、asp、或glu中的任一者、将271位的氨基酸置换为gly、将326位的氨基酸置换为ala、asn、asp、gln、glu、leu、met、ser或thr中的任一者、将330位的氨基酸置换为arg、lys、或met中的任一者、
将323位的氨基酸置换为ile、leu、或met中的任一者、将296位的氨基酸置换为asp；〔12〕〔1〕至〔11〕中任一项所述的方法，其中，前述fc区是这样的fc区，其氨基酸中以eu编号表示的237、248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434、和436中的任意一个以上的氨基酸包含与天然型fc区的氨基酸不同的氨基酸；〔13〕〔12〕所述的方法，其中，前述fc区的以eu编号表示的氨基酸是下述任一者以上的组合：237位的氨基酸为met、248位的氨基酸为ile、250位的氨基酸为ala、phe、ile、met、gln、ser、val、trp、或tyr中的任一者、252位的氨基酸为phe、trp、或tyr中的任一者、254位的氨基酸为thr、255位的氨基酸为glu、256位的氨基酸为asp、asn、glu、或gln中的任一者、257位的氨基酸为ala、gly、ile、leu、met、asn、ser、thr、或val中的任一者、258位的氨基酸为his、265位的氨基酸为ala、286位的氨基酸为ala或glu中的任一者、289位的氨基酸为his、297位的氨基酸为ala、298位的氨基酸为gly、303位的氨基酸为ala、305位的氨基酸为ala、307位的氨基酸为ala、asp、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、val、trp、或tyr中的任一者、308位的氨基酸为ala、phe、ile、leu、met、pro、gln、或thr中的任一者、309位的氨基酸为ala、asp、glu、pro、或arg中的任一者、311位的氨基酸为ala、his、或ile中的任一者、312位的氨基酸为ala或his中的任一者、314位的氨基酸为lys或arg中的任一者、315位的氨基酸为ala、asp或his中的任一者、317位的氨基酸为ala、332位的氨基酸为val、334位的氨基酸为leu、360位的氨基酸为his、376位的氨基酸为ala、380位的氨基酸为ala、
382位的氨基酸为ala、384位的氨基酸为ala、385位的氨基酸为asp或his中的任一者、386位的氨基酸为pro、387位的氨基酸为glu、389位的氨基酸为ala或ser中的任一者、424位的氨基酸为ala、428位的氨基酸为ala、asp、phe、gly、his、ile、lys、leu、asn、pro、gln、ser、thr、val、trp、或tyr中的任一者、433位的氨基酸为lys、434位的氨基酸为ala、phe、his、ser、trp、或tyr中的任一者、或436位的氨基酸为his、ile、leu、phe、thr、或val；〔14〕〔1〕至〔13〕中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的抗原结合结构域；〔15〕〔14〕所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域；〔16〕〔1〕至〔13〕中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据ph条件而发生变化的抗原结合结构域；〔17〕〔16〕所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以ph酸性范围下的抗原结合活性低于ph中性范围条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域；〔18〕〔1〕至〔17〕中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗体的可变区；〔19〕〔1〕至〔18〕中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合分子是抗体；〔20〕〔1〕所述的方法，其中，改变为不形成前述异源复合体的fc区的步骤包括：改变为构成fc区的二个多肽的一者具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、另一者不具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的fc区的步骤；〔21〕〔20〕所述的方法，其包括对构成前述fc区的二个多肽的一者的氨基酸序列中以eu编号表示的237、248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434、和436中的任意一个以上的氨基酸进行置换的步骤；〔22〕〔21〕所述的方法，其包括前述fc区的以eu编号表示的氨基酸的下述任一者以上的置换：将237位的氨基酸置换为met、将248位的氨基酸置换为ile、将250位的氨基酸置换为ala、phe、ile、met、gln、ser、val、trp、或tyr、将252位的氨基酸置换为phe、trp、或tyr、将254位的氨基酸置换为thr、将255位的氨基酸置换为glu、
将256位的氨基酸置换为asp、asn、glu、或gln、将257位的氨基酸置换为ala、gly、ile、leu、met、asn、ser、thr、或val、将258位的氨基酸置换为his、将265位的氨基酸置换为ala、将286位的氨基酸置换为ala或glu、将289位的氨基酸置换为his、将297位的氨基酸置换为ala、将298位的氨基酸置换为gly、将303位的氨基酸置换为ala、将305位的氨基酸置换为ala、将307位的氨基酸置换为ala、asp、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、val、trp、或tyr、将308位的氨基酸置换为ala、phe、ile、leu、met、pro、gln、或thr、将309位的氨基酸置换为ala、asp、glu、pro、或arg、将311位的氨基酸置换为ala、his、或ile、将312位的氨基酸置换为ala或his、将314位的氨基酸置换为lys或arg、将315位的氨基酸置换为ala、asp或his、将317位的氨基酸置换为ala、将332位的氨基酸置换为val、将334位的氨基酸置换为leu、将360位的氨基酸置换为his、将376位的氨基酸置换为ala、将380位的氨基酸置换为ala、将382位的氨基酸置换为ala、将384位的氨基酸置换为ala、将385位的氨基酸置换为asp或his、将386位的氨基酸置换为pro、将387位的氨基酸置换为glu、将389位的氨基酸置换为ala或ser、将424位的氨基酸置换为ala、将428位的氨基酸置换为ala、asp、phe、gly、his、ile、lys、leu、asn、pro、gln、ser、thr、val、trp、或tyr、将433位的氨基酸置换为lys、将434位的氨基酸置换为ala、phe、his、ser、trp、或tyr、或将436位的氨基酸置换为his、ile、leu、phe、thr、或val；〔23〕〔20〕至〔22〕中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的抗原结合结构域；〔24〕〔23〕所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以低钙离子浓度条
件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域；〔25〕〔20〕至〔22〕中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据ph条件而发生变化的抗原结合结构域；〔26〕〔25〕所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以ph酸性范围下的抗原结合活性低于ph中性范围条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域；〔27〕〔20〕至〔26〕中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗体的可变区；〔28〕〔20〕至〔27〕中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合分子是抗体；〔29〕抗原结合分子，其包含抗原结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合结构域、以及在ph中性范围条件下具有fcrn结合活性的fc区，该fc区包含选自下述中的任一者以上的氨基酸：234位的氨基酸为ala、235位的氨基酸为ala、lys或arg中的任一者、236位的氨基酸为arg、238位的氨基酸为arg、239位的氨基酸为lys、270位的氨基酸为phe、297位的氨基酸为ala、298位的氨基酸为gly、325位的氨基酸为gly、328位的氨基酸为arg、或329位的氨基酸为lys、或arg其中，所述氨基酸是以eu编号表示的氨基酸；〔30〕〔29〕所述的抗原结合分子，其包含选自下述中的任一者以上的氨基酸：237位的氨基酸为lys或arg中的任一者、238位的氨基酸为lys239位的氨基酸为arg、或329位的氨基酸为lys或arg中的任一者，其中，所述氨基酸是前述fc区的以eu编号表示的氨基酸；〔31〕抗原结合分子，其包含：抗原结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合结构域，以及构成fc区的二个多肽的一者具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、另一者不具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的fc区；〔32〕〔29〕至〔31〕中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述fc区是这样的fc区，构成其的二个多肽的一者的氨基酸序列中以eu编号表示的237、248、250、252、254、255、256、257、258、265、286、289、297、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434、和436中的任意一个以上的氨基酸与天然型fc区的氨基酸不同；〔33〕〔32〕所述的抗原结合分子，其包括下述中的任一者以上的组合：237位的氨基酸为met、248位的氨基酸为ile、
250位的氨基酸为ala、phe、ile、met、gln、ser、val、trp、或tyr、252位的氨基酸为phe、trp、或tyr、254位的氨基酸为thr、255位的氨基酸为glu、256位的氨基酸为asp、asn、glu、或gln、257位的氨基酸为ala、gly、ile、leu、met、asn、ser、thr、或val、258位的氨基酸为his、265位的氨基酸为ala、286位的氨基酸为ala或glu、289位的氨基酸为his、297位的氨基酸为ala、303位的氨基酸为ala、305位的氨基酸为ala、307位的氨基酸为ala、asp、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、val、trp、或tyr、308位的氨基酸为ala、phe、ile、leu、met、pro、gln、或thr、309位的氨基酸为ala、asp、glu、pro、或arg、311位的氨基酸为ala、his、或ile、312位的氨基酸为ala或his、314位的氨基酸为lys或arg、315位的氨基酸为ala、asp或his、317位的氨基酸为ala、332位的氨基酸为val、334位的氨基酸为leu、360位的氨基酸为his、376位的氨基酸为ala、380位的氨基酸为ala、382位的氨基酸为ala、384位的氨基酸为ala、385位的氨基酸为asp或his、386位的氨基酸为pro、387位的氨基酸为glu、389位的氨基酸为ala或ser、424位的氨基酸为ala、428位的氨基酸为ala、asp、phe、gly、his、ile、lys、leu、asn、pro、gln、ser、thr、val、trp、或tyr、433位的氨基酸为lys、434位的氨基酸为ala、phe、his、ser、trp、或tyr、或者436位的氨基酸为his、ile、leu、phe、thr、或val，
其中，所述氨基酸是前述fc区的以eu编号表示的氨基酸；〔34〕〔29〕至〔33〕中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的抗原结合结构域；〔35〕〔34〕所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域；〔36〕〔29〕至〔33〕中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗原结合活性根据ph条件而发生变化的抗原结合结构域；〔37〕〔36〕所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是结合活性以ph酸性范围下的抗原结合活性低于ph中性范围条件下的抗原结合活性的方式发生变化的抗原结合结构域；〔38〕〔29〕至〔37〕中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体的可变区；〔39〕〔29〕至〔38〕中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合分子是抗体；〔40〕〔29〕至〔39〕中任一项所述的抗原结合分子的多核苷酸；〔41〕可作用地连接有〔40〕所述的多核苷酸的载体；〔42〕导入有〔41〕所述的载体的细胞；〔43〕〔29〕至〔39〕中任一项所述的抗原结合分子的制造方法，其包括从〔42〕所述的细胞的培养液中回收抗原结合分子的步骤；〔44〕药物组合物，其含有〔29〕至〔39〕中任一项所述的抗原结合分子、或由权利要求43所述的制造方法得到的抗原结合分子作为有效成分。
40.另外本发明还涉及用于在本发明的方法中使用的试剂盒，其包含本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子。另外本发明还涉及含有本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子作为有效成分的、抗原结合分子的药代动力学改善剂或抗原结合分子的免疫原性降低剂。另外本发明还涉及免疫炎症性疾病的治疗方法，其包含将本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子给予对象的步骤。另外本发明还涉及本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子在制造抗原结合分子的药代动力学改善剂或抗原结合分子的免疫原性降低剂中的用途。另外本发明还涉及用于在本发明的方法中使用的、本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子。
41.发明效果根据本发明，提供改善抗原结合分子的药代动力学的方法、或降低抗原结合分子的免疫原性的方法。根据本发明，与通常的抗体相比，可以在不引起机体中不良状况的情形下利用抗体进行治疗。
附图说明
42.[图1]是示出现有的中和抗体与在中性条件对fcrn的结合增强了的ph依赖性抗原结合抗体对可溶型抗原带来的效果的图。
[0043]
[图2]是示出对正常小鼠静脉内或皮下给予fv4-igg1或fv4-igg1-f1时的血浆中
浓度变化的图。
[0044]
[图3]是示出与人fcrn结合的状态的fv4-igg1-f157与人fcγria结合的图。
[0045]
[图4]是示出与人fcrn结合的状态的fv4-igg1-f157与人fcγriia(r)结合的图。
[0046]
[图5]是示出与人fcrn结合的状态的fv4-igg1-f157与人fcγriia(h)结合的图。
[0047]
[图6]是示出与人fcrn结合的状态的fv4-igg1-f157与人fcγriib结合的图。
[0048]
[图7]是示出与人fcrn结合的状态的fv4-igg1-f157与人fcγriiia(f)结合的图。
[0049]
[图8]是示出与人fcrn结合的状态的fv4-igg1-f157与小鼠fcγri结合的图。
[0050]
[图9]是示出与人fcrn结合的状态的fv4-igg1-f157与小鼠fcγriib结合的图。
[0051]
[图10]是示出与人fcrn结合的状态的fv4-igg1-f157与小鼠fcγriii结合的图。
[0052]
[图11]是示出与人fcrn结合的状态的fv4-igg1-f157与小鼠fcγriv结合的图。
[0053]
[图12]是示出与小鼠fcrn结合的状态的fv4-igg1-f20与小鼠fcγri、小鼠fcγriib、小鼠fcγriii、小鼠fcγriv结合的图。
[0054]
[图13]是示出与小鼠fcrn结合的状态的mpm1-migg1-mf3与小鼠fcγriib和小鼠fcγriii结合的图。
[0055]
[图14]是示出人fcrn转基因小鼠中的fv4-igg1-f21、fv4-igg1-f140、fv4-igg1-f157、fv4-igg1-f424的血浆中浓度变化的图。
[0056]
[图15]是示出人fcrn转基因小鼠中的fv4-igg1和fv4-igg1-f760的血浆中浓度变化的图。
[0057]
[图16]是示出人fcrn转基因小鼠中的fv4-igg1-f11、fv4-igg1-f890、fv4-igg1-f947、fv4-igg1-f821、fv4-igg1-f939、fv4-igg1-f1009的血浆中浓度变化的图。
[0058]
[图17]是示出正常小鼠中的mpm1-migg1-mf14、mpm1-migg1-mf38、mpm1-migg1-mf39、mpm1-migg1-mf40的血浆中浓度变化的图。
[0059]
[图18]是示出使用fv4-igg1-f21、fv4-igg1-f140的免疫原性评价的结果的图。
[0060]
[图19]是示出使用ha33-igg1-f21、ha33-igg1-f140的免疫原性评价的结果的图。
[0061]
[图20]是示出使用ha33-igg1-f698、ha33-igg1-f699的免疫原性评价的结果的图。
[0062]
[图21]是示出使用ha33-igg1-f698、ha33-igg1-f763的免疫原性评价的结果的图。
[0063]
[图22]是示出给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的针对fv4-igg1-f11产生的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0064]
[图23]是示出给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的针对fv4-igg1-f821产生的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0065]
[图24]是示出给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的针对fv4-igg1-f890产生的小鼠抗体的抗体效价的图。b是a的放大图。
[0066]
[图25]是示出给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的针对fv4-igg1-f939产生的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0067]
[图26]是示出给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的针对fv4-igg1-f947产生的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0068]
[图27]是示出给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的
针对fv4-igg1-f1009产生的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0069]
[图28]是示出给予正常小鼠起14天后、21天后和28天后的针对mpm1-igg1-mf14产生的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0070]
[图29]是示出给予正常小鼠起14天后、21天后和28天后的针对mpm1-igg1-mf39产生的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0071]
[图30]是示出给予正常小鼠起14天后、21天后和28天后的针对mpm1-igg1-mf38产生的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0072]
[图31]是示出给予正常小鼠起14天后、21天后和28天后的针对mpm1-igg1-mf40产生的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0073]
[图32]是示出给予人fcrn转基因小鼠起15分钟后、7小时后、1天后、2天后、3天后、4天后和7天后的血浆中的fv4-igg1-f947和fv4-igg1-fa6a/fb4a的抗体浓度的图。
[0074]
[图33]是示出各b3突变体的与fcγriib的结合和与fcγria的结合的差异的图。
[0075]
[图34]是示出各b3突变体的与fcγriib的结合和与fcγriia(h)的结合的差异的图。
[0076]
[图35]是示出各b3突变体的与fcγriib的结合和与fcγriia(r)的结合的差异的图。
[0077]
[图36]是示出各b3突变体的与fcγriib的结合和与fcγriiia的结合的差异的图。
[0078]
[图37]是示出正常小鼠中的可溶型人il-6受体的血浆中动力学和针对小鼠血浆中的可溶型人il-6受体的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0079]
[图38]是示出给予了抗小鼠cd4抗体的正常小鼠中的可溶型人il-6受体的血浆中动力学和针对小鼠血浆中的可溶型人il-6受体的小鼠抗体的抗体效价的图。
[0080]
[图39]是示出正常小鼠中的抗il-6受体抗体的血浆中动力学的图。
[0081]
[图40]是示出对人fcrn转基因小鼠同时给予可溶型人il-6受体和抗il-6受体抗体时的可溶型人il-6受体的浓度的变化的图。
[0082]
[图41]是示出通过x射线晶体结构分析确定的6rl#9抗体的fab片段的重链cdr3的结构的图。
[0083]
[图42]是示出正常小鼠中的h54/l28-igg1、6rl#9-igg1、fh4-igg1的血浆中的抗体浓度的变化的图。
[0084]
[图43]是示出给予了h54/l28-igg1、6rl#9-igg1、fh4-igg1的正常小鼠的血浆中的可溶型人il-6受体的浓度的变化的图。
[0085]
[图44]是示出正常小鼠中的h54/l28-n434w、6rl#9-n434w、fh4-n434w的血浆中的抗体浓度的变化的图。
[0086]
[图45]是示出给予了h54/l28-n434w、6rl#9-n434w、fh4-n434w的正常小鼠的血浆中的可溶型人il-6受体的浓度的变化的图。
[0087]
[图46]是含有人vk5-2序列的抗体、与含有人vk5-2序列中的糖链添加序列经改变的h vk5-2_l65序列的抗体的离子交换色谱图。实线表示含有人vk5-2序列的抗体(重链：cim_h、序列编号：108和轻链：hvk5-2、序列编号：4)的色谱图，虚线表示具有hvk5-2_l65序列的抗体(重链：cim_h(序列编号：108)、轻链：hvk5-2_l65(序列编号107))的色谱图。
[0088]
[图47]是示出igg1、igg2、igg3和igg4的恒定区序列的比对和eu编号的图。
[0089]
[图48]是表示由一分子具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的fc区与两分子的fcrn、一分子的fcγr构成的四者复合体的形成的示意图。
[0090]
[图49]是表示具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且对活性型fcγr的结合活性低于天然型fc区的对活性型fcγr的结合活性的fc区与两分子的fcrn、一分子的fcγr的作用的示意图。
[0091]
[图50]是表示具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且具有对抑制性fcγr的选择性结合活性的fc区与两分子的fcrn、一分子的fcγr的作用的示意图。
[0092]
[图51]是表示构成fcrn结合结构域的二个多肽的仅一个具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、另一个不具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的fc区与两分子的fcrn、一分子的fcγr的作用的示意图。
[0093]
[图52]是示出从导入了ca依赖性地与抗原结合的抗体基因文库的大肠杆菌分离得到的290个克隆的序列信息的氨基酸分布(表示为library)与设计的氨基酸分布(表示为design)的关系的图。横轴表示以kabat编号表示的氨基酸的位点。纵轴表示氨基酸分布的比率。
[0094]
[图53]是示出从导入了ph依赖性地与抗原结合的抗体基因文库的大肠杆菌分离得到的132个克隆的序列信息的氨基酸分布(表示为library)与设计的氨基酸分布(表示为design)的关系的图。横轴表示以kabat编号表示的氨基酸的位点。纵轴表示氨基酸分布的比率。
[0095]
[图54]是表示将fv4-igg1-f947和fv4-igg1-f1326给予人fcrn转基因小鼠时的小鼠血浆中的fv4-igg1-f947和fv4-igg1-f1326的浓度变化的图。
[0096]
[图55]横轴表示各pd变体对fcγriib的相对结合活性的值，纵轴表示各pd变体对fcγriia r型的相对结合活性的值。将各pd变体对各fcγr的结合量的值除以作为对照的突变导入前的抗体il6r-f652(以eu编号表示的238位的pro置换为asp的突变fc)对各fcγr的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各pd变体对各fcγr的相对结合活性的值。图中的f652的描点表示il6r-f652的值。
[0097]
[图56]纵轴表示将各突变导入不具有p238d突变的gph7-b3中而得的改变体对fcγriib的相对结合活性的值、横轴表示将各突变导入具有p238d突变的il6r-f652中而得的改变体对fcγriib的相对结合活性的值。应予说明，将各改变体对fcγriib的结合量的值除以突变导入前的抗体对fcγriib的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为相对结合活性的值。这里，在导入至不具有p238d的gph7-b3中的情形、导入至具有p238d的il6r-f652中的情形均发挥fcγriib结合增强效果的改变包含在区域a中；在导入至不具有p238d的gph7-b3中的情形发挥fcγriib结合增强效果，但在导入至具有p238d的il6r-f652中的情形不发挥fcγriib结合增强效果的改变包含在区域b中。
[0098]
[图57]表示fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构。
[0099]
[图58]表示相对于fcγriib胞外区以及fc ch2结构域a，通过基于cα原子间距离的最小二乘法，使fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构与fc(wt)/fcγriib胞外区复合体的模型结构重合的图。
[0100]
[图59]表示对于fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构与fc(wt)/fcγ
riib胞外区复合体的模型结构，以fc ch2结构域a和fc ch2结构域b各自单独通过基于cα原子间距离的最小二乘法进行重合，并对p238d附近的详细结构进行比较的图。
[0101]
[图60]是示出在fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构中，在fc ch2结构域a的以eu编号表示的237位的gly的主链和fcγriib的160位的tyr之间确认到氢键的图。
[0102]
[图61]是示出在fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构中，在fc ch2结构域b的以eu编号表示的270位的asp和fcγriib的131位的arg之间确认到静电相互作用的图。
[0103]
[图62]横轴表示各2b变体对fcγriib的相对结合活性的值、纵轴表示各2b变体对fcγriia r型的相对结合活性的值。将各2b变体对各fcγr的结合量的值除以作为对照的突变导入前的抗体(以eu编号表示的238位的pro置换为asp的突变fc)对各fcγr的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各2b变体对各fcγr的相对结合活性的值。
[0104]
[图63]是表示fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构中fc链a的以eu编号表示的233位的glu与fcγriib胞外区的其周边残基的图。
[0105]
[图64]是表示fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构中fc链a的以eu编号表示的330位的ala与fcγriib胞外区的其周边残基的图。
[0106]
[图65]是示出相对于fc chain b，通过基于cα原子间距离的最小二乘法使fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体和fc(wt)/fcγriiia胞外区复合体的晶体结构重合，示出fc chain b的以eu编号表示的271位的pro的结构的图。
具体实施方式
[0107]
提供以下的定义和详细说明来使本说明书中说明的本发明容易理解。
[0108]
氨基酸本说明书中，例如，如ala/a、leu/l、arg/r、lys/k、asn/n、met/m、asp/d、phe/f、cys/c、pro/p、gln/q、ser/s、glu/e、thr/t、gly/g、trp/w、his/h、tyr/y、ile/i、val/v所示，氨基酸用单字母密码或三字母密码、或其两者来标记。
[0109]
抗原本说明书中，“抗原”只要含有抗原结合结构域所结合的表位，则其结构并不限于特定的结构。换而言之，抗原可以是无机物也可以是有机物。作为抗原，可例示如下所述的分子：17-ia、4-1bb、4dc、6-酮-pgf1a、8-异-pgf2a、8-氧代-dg、a1腺苷受体、a33、ace、ace-2、激活素、激活素a、激活素ab、激活素b、激活素c、激活素ria、激活素ria alk-2、激活素rib alk-4、激活素riia、激活素riib、adam、adam10、adam12、adam15、adam17/tace、adam8、adam9、adamts、adamts4、adamts5、地址素(addressins)、afgf、alcam、alk、alk-1、alk-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-v/β-1拮抗剂、ang、ang、apaf-1、ape、apj、app、april、ar、arc、art、artemin、抗id、aspartic、心房钠尿因子、av/b3整联蛋白、axl、b2m、b7-1、b7-2、b7-h、b-淋巴细胞刺激因子(blys)、bace、bace-1、bad、baff、baff-r、bag-1、bak、bax、bca-1、bcam、bcl、bcma、bdnf、b-ecgf、bfgf、bid、bik、bim、blc、bl-cam、blk、bmp、bmp-2bmp-2a、bmp-3成骨蛋白(osteogenin)、bmp-4bmp-2b、bmp-5、bmp-6vgr-1、bmp-7(op-1)、bmp-8(bmp-8a、op-2)、bmpr、bmpr-ia(alk-3)、bmpr-ib(alk-6)、brk-2、rpk-1、bmpr-ii(brk-3)、bmp、b-ngf、bok、蛙皮素、骨衍生神经营养因子、bpde、bpde-dna、btc、补体因子3(c3)、c3a、c4、c5、c5a、
c10、ca125、cad-8、降钙素、camp、癌胚抗原(cea)、癌相关抗原、组织蛋白酶a、组织蛋白酶b、组织蛋白酶c/dppi、组织蛋白酶d、组织蛋白酶e、组织蛋白酶h、组织蛋白酶l、组织蛋白酶o、组织蛋白酶s、组织蛋白酶v、组织蛋白酶x/z/p、cbl、cci、cck2、ccl、ccl1、ccl11、ccl12、ccl13、ccl14、ccl15、ccl16、ccl17、ccl18、ccl19、ccl2、ccl20、ccl21、ccl22、ccl23、ccl24、ccl25、ccl26、ccl27、ccl28、ccl3、ccl4、ccl5、ccl6、ccl7、ccl8、ccl9/10、ccr、ccr1、ccr10、ccr10、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、cd1、cd2、cd3、cd3e、cd4、cd5、cd6、cd7、cd8、cd10、cd11a、cd11b、cd11c、cd13、cd14、cd15、cd16、cd18、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd25、cd27l、cd28、cd29、cd30、cd30l、cd32、cd33(p67蛋白)、cd34、cd38、cd40、cd40l、cd44、cd45、cd46、cd49a、cd52、cd54、cd55、cd56、cd61、cd64、cd66e、cd74、cd80(b7-1)、cd89、cd95、cd123、cd137、cd138、cd140a、cd146、cd147、cd148、cd152、cd164、ceacam5、cftr、cgmp、cinc、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)毒素、ckb8-1、clc、cmv、cmv ul、cntf、cntn-1、cox、c-ret、crg-2、ct-1、ctack、ctgf、ctla-4、cx3cl1、cx3cr1、cxcl、cxcl1、cxcl2、cxcl3、cxcl4、cxcl5、cxcl6、cxcl7、cxcl8、cxcl9、cxcl10、cxcl11、cxcl12、cxcl13、cxcl14、cxcl15、cxcl16、cxcr、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、dan、dcc、dcr3、dc-sign、补体抑制因子(衰变促进因子)、脱(1-3)-igf-i(脑igf-1)、dhh、地高辛、dnam-1、dnase、dpp、dppiv/cd26、dtk、ecad、eda、eda-a1、eda-a2、edar、egf、egfr(erbb-1)、ema、emmprin、ena、内皮素受体、脑啡肽酶、enos、eot、约塔辛(eotaxin)1、epcam、ephrin b2/ephb4、epo、ercc、e-选择素、et-1、因子iia、因子vii、因子viiic、因子ix、成纤维细胞活化蛋白(fap)、fas、fcr1、fen-1、铁蛋白、fgf、fgf-19、fgf-2、fgf3、fgf-8、fgfr、fgfr-3、纤维蛋白、fl、flip、flt-3、flt-4、促卵胞激素、断裂因子、fzd1、fzd2、fzd3、fzd4、fzd5、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9、fzd10、g250、gas6、gcp-2、gcsf、gd2、gd3、gdf、gdf-1、gdf-3(vgr-2)、gdf-5(bmp-14、cdmp-1)、gdf-6(bmp-13、cdmp-2)、gdf-7(bmp-12、cdmp-3)、gdf-8(筒箭毒碱)、gdf-9、gdf-15(mic-1)、gdnf、gdnf、gfap、gfra-1、gfr-α1、gfr-α2、gfr-α3、gitr、胰高血糖素、glut4、糖蛋白iib/iiia(gpiib/iiia)、gm-csf、gp130、gp72、gro、生长激素释放因子、半抗原(np-cap或nip-cap)、hb-egf、hcc、hcmv gb包膜糖蛋白、hcmv gh包膜糖蛋白、hcmv ul、造血生长因子(hgf)、hep b gp120、乙酰肝素酶、her2、her2/neu(erbb-2)、her3(erbb-3)、her4(erbb-4)、单纯疱疹病毒(hsv)gb糖蛋白、hsv gd糖蛋白、hgfa、高分子量黑色素瘤相关抗原(high molecular weight melanoma-associated antigen)(hmw-maa)、hiv gp120、hiv iiib gp 120v3环、hla、hla-dr、hm1.24、hmfg pem、hrg、hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(hcmv)、人生长激素(hgh)、hvem、i-309、iap、icam、icam-1、icam-3、ice、icos、ifng、ig、iga受体、ige、igf、igf结合蛋白、igf-1r、igfbp、igf-i、igf-ii、il、il-1、il-1r、il-2、il-2r、il-4、il-4r、il-5、il-5r、il-6、il-6r、il-8、il-9、il-10、il-12、il-13、il-15、il-18、il-18r、il-23、干扰素(inf)-α、inf-β、inf-γ、抑制素、inos、胰岛素a链、胰岛素b链、胰岛素样增殖因子1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5(αv)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、ip-10、i-tac、je、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶l1、激肽释放酶l2、激肽释放酶l3、激肽释放酶l4、kc、kdr、角质形成细胞生长因子(kgf)、层连蛋白5、lamp、lap、lap(tgf-1)、潜伏型tgf-1、潜伏型tgf-1bp1、lbp、ldgf、
lect2、lefty、lewis-y抗原、lewis-y相关抗原、lfa-1、lfa-3、lfo、lif、light、脂蛋白、lix、lkn、lptn、l-选择素、lt-a、lt-b、ltb4、ltbp-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素β受体、mac-1、madcam、mag、map2、marc、mcam、mcam、mck-2、mcp、m-csf、mdc、mer、金属蛋白酶、mgdf受体、mgmt、mhc(hla-dr)、mif、mig、mip、mip-1-α、mk、mmac1、mmp、mmp-1、mmp-10、mmp-11、mmp-12、mmp-13、mmp-14、mmp-15、mmp-2、mmp-24、mmp-3、mmp-7、mmp-8、mmp-9、mpif、mpo、msk、msp、粘蛋白(muc1)、muc18、缪勒管抑制物质、mug、musk、naip、nap、ncad、n-c粘附因子、nca 90、ncam、ncam、脑啡肽酶、神经营养素-3、神经营养素-4或神经营养素-6、neurturin、神经生长因子(ngf)、ngfr、ngf-β、nnos、no、nos、npn、nrg-3、nt、ntn、ob、ogg1、opg、opn、osm、ox40l、ox40r、p150、p95、padpr、甲状旁腺激素、parc、parp、pbr、pbsf、pcad、p-钙黏蛋白、pcna、pdgf、pdgf、pdk-1、pecam、pem、pf4、pge、pgf、pgi2、pgj2、pin、pla2、胎盘碱性磷酸酶(plap)、plgf、plp、pp14、胰岛素原、松弛素原、蛋白c、ps、psa、psca、前立腺特异性膜抗原(psma)、pten、pthrp、ptk、ptn、r51、rank、rankl、rantes、rantes、松弛素a链、松弛素b链、肾素、呼吸道合胞体病毒(rsv)f、rsv fgp、ret、类风湿因子、rlip76、rpa2、rsk、s100、scf/kl、sdf-1、serine、血清白蛋白、sfrp-3、shh、sigirr、sk-1、slam、slpi、smac、smdf、smoh、sod、sparc、stat、steap、steap-ii、tace、taci、tag-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、tarc、tca-3、t细胞受体(例如，t细胞受体α/β)、tdt、teck、tem1、tem5、tem7、tem8、tert、睾丸plap样碱性磷酸酶、tfr、tgf、tgf-α、tgf-β、tgf-β泛特异性(tgf-βpan specific)、tgf-βri(alk-5)、tgf-βrii、tgf-βriib、tgf-βriii、tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4、tgf-β5、凝血酶、胸腺ck-1、促甲状腺激素、tie、timp、tiq、组织因子、tmeff2、tmpo、tmprss2、tnf、tnf-α、tnf-αβ、tnf-β2、tnfc、tnf-ri、tnf-rii、tnfrsf10a(trail r1 apo-2、dr4)、tnfrsf10b(trail r2 dr5、killer、trick-2a、trick-b)、tnfrsf10c(trail r3 dcr1、lit、trid)、tnfrsf10d(trail r4 dcr2、trundd)、tnfrsf11a(rank odf r、trance r)、tnfrsf11b(opg ocif、tr1)、tnfrsf12(tweak r fn14)、tnfrsf13b(taci)、tnfrsf13c(baff r)、tnfrsf14(hvem atar、hvea、light r、tr2)、tnfrsf16(ngfr p75ntr)、tnfrsf17(bcma)、tnfrsf18(gitr aitr)、tnfrsf19(troy taj、trade)、tnfrsf19l(relt)、tnfrsf1a(tnf ri cd120a、p55-60)、tnfrsf1b(tnf rii cd120b、p75-80)、tnfrsf26(tnfrh3)、tnfrsf3(ltbr tnf riii、tnfc r)、tnfrsf4(ox40 act35、txgp1 r)、tnfrsf5(cd40 p50)、tnfrsf6(fas apo-1、apt1、cd95)、tnfrsf6b(dcr3 m68、tr6)、tnfrsf7(cd27)、tnfrsf8(cd30)、tnfrsf9(4-1bb cd137、ila)、tnfrsf21(dr6)、tnfrsf22(dctrail r2 tnfrh2)、tnfrst23(dctrail r1 tnfrh1)、tnfrsf25(dr3 apo-3、lard、tr-3、tramp、wsl-1)、tnfsf10(trail apo-2配体、tl2)、tnfsf11(trance/rank配体odf、opg配体)、tnfsf12(tweak apo-3配体、dr3配体)、tnfsf13(april tall2)、tnfsf13b(baff blys、tall1、thank、tnfsf20)、tnfsf14(light hvem配体、ltg)、tnfsf15(tl1a/vegi)、tnfsf18(gitr配体aitr配体、tl6)、tnfsf1a(tnf-a黏附素(conectin)、dif、tnfsf2)、tnfsf1b(tnf-b lta、tnfsf1)、tnfsf3(ltb tnfc、p33)、tnfsf4(ox40配体gp34、txgp1)、tnfsf5(cd40配体cd154、gp39、higm1、imd3、trap)、tnfsf6(fas配体apo-1配体、apt1配体)、tnfsf7(cd27配体cd70)、tnfsf8(cd30配体cd153)、tnfsf9(4-1bb配体cd137配体)、tp-1、t-pa、tpo、trail、trail r、trail-r1、trail-r2、trance、运铁蛋白受体、trf、trk、trop-2、tsg、tslp、肿瘤相关抗原ca125、肿瘤相关抗原表达病毒y相关碳水化物、tweak、txb2、ung、upar、upar-1、尿激酶、vcam、vcam-1、vecad、ve-钙黏蛋白、ve-钙黏
蛋白-2、vefgr-1(flt-1)、vegf、vegfr、vegfr-3(flt-4)、vegi、vim、病毒抗原、vla、vla-1、vla-4、vnr整联蛋白、冯维勒布兰德因子、wif-1、wnt1、wnt2、wnt2b/13、wnt3、wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt5b、wnt6、wnt7a、wnt7b、wnt8a、wnt8b、wnt9a、wnt9a、wnt9b、wnt10a、wnt10b、wnt11、wnt16、xcl1、xcl2、xcr1、xcr1、xedar、xiap、xpd、hmgb1、iga、aβ、cd81,cd97,cd98,ddr1,dkk1,ereg、hsp90,il-17/il-17r、il-20/il-20r、氧化ldl,pcsk9,激肽释放酶原,ron,tmem16f、sod1,嗜铬粒蛋白a,嗜铬粒蛋白b、tau,vap1、高分子激肽原、il-31、il-31r、nav1.1、nav1.2、nav1.3、nav1.4、nav1.5、nav1.6、nav1.7、nav1.8、nav1.9、epcr、c1,c1q,c1r,c1s,c2,c2a,c2b,c3,c3a,c3b,c4,c4a,c4b,c5,c5a,c5b,c6,c7,c8,c9,因子b,因子d,因子h,properdin、sclerostin、fibrinogen,fibrin,prothrombin,thrombin,组织因子,因子v,因子va,因子vii,因子viia,因子viii,因子viiia,因子ix,因子ixa,因子x,因子xa,因子xi,因子xia,因子xii,因子xiia,因子xiii,因子xiiia,tfpi,抗凝血酶iii,epcr,血栓调节蛋白、tapi,tpa,纤溶酶原,纤溶酶,pai-1,pai-2、gpc3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、lpa、s1p以及用于激素和生长因子的受体。
[0110]
表示存在于抗原中的抗原决定基的表位，意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域所结合的抗原上的位点。所以，例如表位可通过其结构来定义。另外，也可以通过相对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原的结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多肽时，还可以通过构成表位的氨基酸残基来规定表位。另外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来规定表位。
[0111]
线性表位是下述表位，其包含氨基酸一级序列得到识别的表位。线性表位在固有序列中典型地含有至少3个氨基酸，和最普通地含有至少5个、例如约8至约10个、6至20个氨基酸。
[0112]
与线性表位相对地，立体结构表位是这样的表位，其中，含有表位的氨基酸的一级序列并非是被识别表位的单一规定成分(例如，氨基酸的一级序列不需要被规定表位的抗体所识别的表位)。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白质的三维结构。例如，蛋白质分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链变得并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法包括例如：x射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋转标记和电子顺磁共振分光学，但并非限定于此。例如，参照epitope mapping protocols in methods in molecular biology(1996)、第66卷、morris(编)。
[0113]
结合活性下述例示了通过含有针对il-6r的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法，但通过含有针对il-6r以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法也可以基于下述例示而适宜实施。
[0114]
例如，含有针对il-6r抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别存在于il-6r分子中的线性表位，可通过如下所示操作来确认。为了上述目的，合成了包含构成il-6r的细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。该肽可化学性地合成。或者，可以利用il-6r的cdna中编码相当于细胞外结构域的氨基酸序列的区域，通过基因工程技术得到。接着，对包含构成细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽、和含有针对il-6r的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性进行评价。例如，通过以固定化线性肽作为抗原的elisa，可以评价该
抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对il-6r表达细胞的结合中的、线性肽造成的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。
[0115]
另外，还可以如下所述来确认含有针对il-6r的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别立体结构表位。为了上述目的，制备了表达il-6r的细胞。可举出：含有针对il-6r的抗原结合结构域的被测抗原结合分子在与il-6r表达细胞接触时强烈地与该细胞结合，但该抗原结合分子与经固定化的包含构成il-6r细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽实质上不结合的情形等。这里，实质上不结合是指，对人il-6r表达细胞的结合活性的80％以下、通常50％以下、优选30％以下、特别优选15％以下的结合活性。
[0116]
作为测定对含有针对il-6r的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的il-6r表达细胞的结合活性的方法，可举出例如：antibodies a laboratory manual记载的方法(ed harlow,david lane,cold spring harbor laboratory(1988)359-420)。即，可通过以il-6r表达细胞为抗原的elisa或facs(fluorescence activated cell sorting)的原理来进行评价。
[0117]
在elisa形式中，对含有针对il-6r的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的il-6r表达细胞的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将被测多肽复合体添加至固定有il-6r表达细胞的elisa板，利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体，检出与细胞结合的被测抗原结合分子。或者在facs中，制作被测抗原结合分子的稀释系列，确定相对于il-6r表达细胞的抗体结合效价(titer)，由此可以比较被测抗原结合分子对il-6r表达细胞的结合活性。
[0118]
被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测出。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置。facscanto
tm iifacsaria
tm
facsarray
tm
facsvantage
tm sefacscalibur
tm
(均为bd biosciences公司的商品名)epics altra hypersortcytomics fc 500epics xl-mcl adc epics xl adccell lab quanta/cell lab quanta sc(均为beckman coulter公司的商品名)。
[0119]
例如，含有针对il-6r的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原的结合活性的优选测定方法的一例，可举出以下方法。首先，将表达il-6r的细胞与被测抗原结合分子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经fitc标记的二次抗体染色。将被测抗原结合分子用适宜的优选缓冲液稀释，由此将该抗原结合分子制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。接着，通过facscalibur(bd公司)测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用cell quest software(bd公司)进行分析而得的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。
[0120]
含有针对il-6r的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否与某抗原结合分子共有表位，可通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争elisa试验是优选的交叉阻断试验。
[0121]
具体地，在交叉阻断试验中，涂布于微量滴定板的孔上的il-6r蛋白在候选竞争抗原结合分子的存在下、或非存在下经孵育后，添加被测抗原结合分子。与孔中的il-6r蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对涂布有il-6r蛋白的孔的结合活性越降低。
[0122]
经由il-6r蛋白而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子来容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子通过使用亲和素过氧化酶结合物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争elisa试验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标记物质进行标记。具体地，公知的是放射标记或荧光标记等。
[0123]
与在候选竞争抗原结合分子复合体的非存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20％、优选至少20-50％、进一步优选至少50％的含有针对il-6r的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位、或者竞争结合于相同的表位的抗原结合分子。
[0124]
在鉴定含有针对il-6r的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位，能够通过比较两抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。
[0125]
作为这种测定结合活性的方法，例如，在前述elisa形式中，可通过比较被测抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入了突变的线性肽的结合活性来测定。作为elisa以外的方法，通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如与gst的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
[0126]
另外，鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位可通过以下方法来评价。首先，制备表达il-6r的细胞和表达在表位中导入了突变的il-6r的细胞。将这些细胞悬浮于pbs等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，用合适的缓冲液洗涤，向所得细胞悬浮液添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经fitc标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过facscalibur(bd公司)来测定。被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为使用cell quest software(bd公司)进行分析而得的荧光强度、即几何平均值。即、通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。
[0127]
本方法中，例如“实质上不与突变il-6r表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先，用标记抗体染色与表达突变il-6r的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分
子。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用作为流式细胞仪的facscalibur时，所得的荧光强度可以使用cell quest software进行分析。由多肽复合体存在下和非存在下的几何平均值，通过下式计算该比较值(δgeo-mean)，由此可以求出抗原结合分子的结合造成的荧光强度的增加比例。
[0128]
δgeo-mean＝geo-mean(多肽复合体存在下)/geo-mean(多肽复合体非存在下)将通过分析得到的、反映被测抗原结合分子对突变il-6r表达细胞的结合量的几何平均比较值(突变il-6r分子δgeo-mean值)、与反映被测抗原结合分子对il-6r表达细胞的结合量的δgeo-mean比较值进行比较。此时，计算相对于突变il-6r表达细胞和il-6r表达细胞的δgeo-mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度特别优选制备为相互相同或者实质上相同的浓度。预先确定了识别il-6r中的表位的抗原结合分子被用作对照抗原结合分子。
[0129]
被测抗原结合分子相对于突变il-6r表达细胞的δgeo-mean比较值只要小于被测抗原结合分子相对于il-6r表达细胞的δgeo-mean比较值的至少80％、优选50％、进一步优选30％、特别优选15％，则认为“实质上不与突变il-6r表达细胞结合”。计算geo-mean值(几何平均)的计算式记载于cell quest software user’s guide(bd biosciences公司)。通过对比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。
[0130]
抗原结合结构域本说明书中，“抗原结合结构域”只要与目标抗原结合，则可以使用任意结构的结构域。作为这类结构域的实例，可优选举出例如：抗体的重链和轻链的可变区、机体内存在的细胞膜蛋白avimer中所含的35个氨基酸程度的被称为a结构域的组件(wo2004/044011、wo2005/040229)、含有与在细胞膜表达的糖蛋白fibronectin中的蛋白结合的结构域10fn3结构域的adnectin(wo2002/032925)、以构成proteina的包含58个氨基酸的3个螺旋束(bundle)的igg结合结构域为scaffold的affibody(wo1995/001937)、具有含33个氨基酸残基的转角和2个反向平行螺旋以及环的亚基重复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：ar)的分子表面露出的区域darpins(designed ankyrin repeat proteins)(wo2002/020565)、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(ngal))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向扭曲的桶结构的单侧的4个环区域anticalin等(wo2003/029462)、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得免疫系统且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor(vlr))的亮氨酸残基富集重复(leucine-rich-repeat(lrr))组件反复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片结构的凹陷区域(wo2008/016854)。作为本发明的抗原结合结构域的优选实例，可举出含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选可举出“scfv(单链fv)”、“单链抗体”、“fv”、“scfv2(单链fv 2)”、“fab”或“f(ab')2”等。
[0131]
本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相同的表位结合。这里，相同的表位可以存在于例如包含序列编号：1所述的氨基酸序列的蛋白质中。另外，可以存在于包含序列编号：1所述的氨基酸序列的第20至第365个氨基酸的蛋白质中。或者，本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相互不同的表位结合。这里，不同的表位可以存在于例如包含序列编号：1所述的氨基酸序列的蛋白质中。另外，可以存在于包含序列编号：1
所述的氨基酸序列的第20至第365个氨基酸的蛋白质中。
[0132]
特异性特异性是指、特异性地结合的分子一方的分子对于其一个或多个结合对象分子以外的分子不显示任何显著性结合的状态。另外，也可以用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位为特异性的情形。另外，抗原结合结构域所结合的表位含有在多个不同的抗原中时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与含有该表位的各种抗原结合。
[0133]
抗体本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制造得到的免疫球蛋白。抗体可从天然存在其的血浆、血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全合成。作为抗体的实例，优选可举出：免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚型。作为人的免疫球蛋白，已知有igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igd、ige、igm这9种类型(同种型)。本发明的抗体中可包含这些同种型中的igg1、igg2、igg3、igg4。
[0134]
制造具有所期望结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例示与il-6r结合的抗体(抗il-6r抗体)的制作方法。与il-6r以外的抗原结合的抗体也可以根据下述例示而适宜制作。
[0135]
抗il-6r抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗il-6r抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包含：由杂交瘤产生的单克隆抗体、和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体进行了转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。应予说明，本技术发明的单克隆抗体包含“人源化抗体”和“嵌合抗体”。
[0136]
产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下所示来制作。即，使用il-6r蛋白作为敏化抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。接着，通过通常的筛选方法筛选单克隆的抗体产生细胞，由此可以选择出产生抗il-6r抗体的杂交瘤。
[0137]
具体地，单克隆抗体的制作例如如下所示地进行。首先，表达其核苷酸序列公开在序列编号：2中的il-6r基因，由此可得到由序列编号：1表示的il-6r蛋白，其用作敏化抗原用于抗体制备。即，将编码il-6r的基因序列插入公知的表达载体，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所期望的人il-6r蛋白。为了从培养上清中获得可溶型的il-6r，代替由序列编号：1表示的il-6r蛋白，表达了例如，如mullberg等(j.immunol.(1994)152(10),4958-4968)所记载的可溶型il-6r、即，由序列编号：1表示的il-6r多肽序列中的第1至357个氨基酸构成的蛋白质。另外，纯化的天然il-6r蛋白也可以同样地用作敏化抗原。
[0138]
作为用于免疫哺乳动物的敏化抗原，可使用该纯化il-6r蛋白。另外，il-6r的部分肽也可以用作敏化抗原。此时，该部分肽也可以根据人il-6r的氨基酸序列通过化学合成获得。另外，也可以通过将il-6r基因的一部分整合至表达载体并进行表达来获得。进而，还可以使用蛋白质分解酶分解il-6r蛋白来获得，用作部分肽的il-6r肽的区域和大小并不特别限于特定的方式。对于优选的区域，可以从序列编号：1的氨基酸序列中相当于第20-357个
氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为敏化抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体地，可以将8～50、优选10～30个残基的肽用作敏化抗原。
[0139]
另外，也可以将il-6r蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得的融合蛋白用作敏化抗原。为了制造用作敏化抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作：将编码所期望的两种或两种以上的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如前所述地插入表达载体。融合蛋白的制作方法记载于molecular cloning 2nd ed.(sambrook,j et al.,molecular cloning 2nd ed.,9.47-9.58(1989)cold spring harbor lab.press)。用作敏化抗原的il-6r的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于wo2003/000883、wo2004/022754、wo2006/006693等中。
[0140]
作为用该敏化抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适应性来选择。通常优选使用啮齿类的动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠、或兔、猴等。
[0141]
按照公知的方法将上述动物用敏化抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过将敏化抗原注射至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体地，将用pbs(phosphate-buffered saline)或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的敏化抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该敏化抗原对哺乳动物每4至21日给予数次。另外，敏化抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作敏化抗原时，有时期望将与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白质结合的该敏化抗原肽进行免疫。
[0142]
另外，产生所期望抗体的杂交瘤可通过使用dna免疫，如下所示来制作。dna免疫是指下述免疫方法：被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体dna的该免疫动物中，敏化抗原在该免疫动物的机体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白质抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，dna免疫期待如下优越性。
[0143]-能够维持如il-6r的膜蛋白的结构而赋予免疫刺激-无需纯化免疫抗原为了通过dna免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达il-6r蛋白的dna。编码il-6r的dna可通过pcr等公知方法合成。将所得dna插入适当的表达载体，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如pcdna3.1等市售的表达载体。作为将载体给予机体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金粒子用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行dna免疫。进而，识别il-6r的抗体的制作也可以采用国际公开wo2003/104453中记载的方法来制作。
[0144]
如此将哺乳动物免疫，确认到血清中与il-6r结合的抗体效价的上升后，从哺乳动物采集免疫细胞，供细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。
[0145]
作为与前述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物指的是赋予细胞能够在特定培养条件下存活(或死亡)的性质。选择标记物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(以下简称为hgprt缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称为tk缺陷)等。具有hgprt、tk缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为hat敏感性)。hat敏感性的细胞不能在hat选择培养基中进行dna合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的
补救途径继续dna的合成，因此在hat选择培养基中也会增殖。
[0146]
hgprt缺陷、tk缺陷的细胞各自可通过含有6硫代鸟嘌呤、8氮杂鸟嘌呤(以下简称为8ag)、或5'溴脱氧尿苷的培养基来选择。dna中整合有这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。而无法整合这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此外，被称为g418抗性的选择标记物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。
[0147]
作为这类骨髓瘤细胞，可优选使用，例如，p3(p3x63ag8.653)(j.immunol.(1979)123(4),1548-1550)、p3x63ag8u.1(current topics in microbiology and immunology(1978)81,1-7)、ns-1(c.eur.j.immunol.(1976)6(7),511-519)、mpc-11(cell(1976)8(3),405-415)、sp2/0(nature(1978)276(5685),269-270)、fo(j.immunol.methods(1980)35(1-2),1-21)、s194/5.xx0.bu.1(j.exp.med.(1978)148(1),313-323)、r210(nature(1979)277(5692),131-133)等。
[0148]
基本上，根据公知方法，例如kohler和milstein等的方法(methods enzymol.(1981)73,3-46)等，进行前述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
[0149]
更具体地，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施前述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(peg)、仙台病毒(hvj)等，进而为了提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂使用。
[0150]
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞为1至10倍。作为用于前述细胞融合的培养液，使用例如适于前述骨髓瘤细胞株的增殖的rpmi1640培养液、mem培养液、以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可优选添加胎牛血清(fcs)等血清补液。
[0151]
对于细胞融合，将前述免疫细胞和骨髓瘤细胞在前述培养液中以规定量充分混合，将预先加热至37℃左右的peg溶液(例如平均分子量1000至6000左右)通常以30至60％(w/v)的浓度添加。通过缓缓混合混合液，形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
[0152]
这样得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如hat培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。使用上述hat培养液的培养可持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。接着，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
[0153]
如此得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标记物的选择培养液来进行选择。例如，具有hgprt、tk缺陷的细胞可以通过用hat培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。即，在细胞融合中使用hat敏感性的骨髓瘤细胞时，在hat培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地增殖。使用上述hat培养液的培养可以持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体地，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。接着，可通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
[0154]
所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，与il-6r结合的单克隆抗体可以与细胞表面表达的il-6r结合。这类单克隆抗体
可通过例如facs(fluorescence activated cell sorting，荧光活化细胞分选系统)来筛选。facs是可以用激光分析与荧光抗体接触的细胞、测定各细胞发出的荧光从而可以测定抗体对细胞表面的结合的系统。
[0155]
为了利用facs来对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达il-6r的细胞。优选用于筛选的细胞是强制表达il-6r的哺乳动物细胞。作为对照，通过使用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞，可以选择性地检测出抗体对细胞表面的il-6r的结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合、而与il-6r强制表达细胞结合的抗体的杂交瘤，可以获得产生il-6r单克隆抗体的杂交瘤。
[0156]
或者，可以基于elisa的原理来评价抗体对固定化的il-6r表达细胞的结合活性。例如，将il-6r表达细胞固定于elisa板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定化细胞接触，检出与固定化细胞结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检出。通过这些筛选选择出的、产生对抗原具有结合能力的所期望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释方法等进行克隆。
[0157]
这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。
[0158]
按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予和其具有适应性的哺乳动物并使其增殖，从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适于获得高纯度的抗体。
[0159]
也可以适宜地使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因整合至适当的载体中，导入宿主，由此表达由该基因所编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经由例如vandamme等确立(eur.j.biochem.(1990)192(3),767-775)。另外，如下所述的重组抗体的制造方法也是公知的。
[0160]
例如，由产生抗il-6r抗体的杂交瘤细胞获得编码抗il-6r抗体的可变区(v区域)的cdna。为此，通常首选从杂交瘤提取总rna。作为用于从细胞提取mrna的方法，例如，可使用如下所述的方法。-胍超离心法(biochemistry(1979)18(24),5294-5299)-agpc法(anal.biochem.(1987)162(1),156-159)。
[0161]
提取的mrna可使用mrna purification kit(ge healthcare bioscience制)等进行纯化。或者还市售有quickprep mrna purification kit(ge healthcare bioscience制)等这样的用于从细胞直接提取总mrna的试剂盒。使用这种试剂盒，可从杂交瘤获得mrna。可以由所得mrna，使用反转录酶来合成编码抗体v区域的cdna。cdna可通过amv reverse transcriptase first-strand cdna synthesis kit(生化学工业社制)等合成。另外，为了cdna的合成和扩增，可以适宜采用使用了smart race cdna扩增试剂盒(clontech制)和pcr的5
’‑
race法(proc.natl.acad.sci.usa(1988)85(23),8998-9002、nucleic acids res.(1989)17(8),2919-2932)。进而，可以在这种cdna的合成过程中向cdna的两末端导入后述适合的限制酶位点。
[0162]
从所得pcr产物纯化出目标cdna片段，接着与载体dna连接。如此制作重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而
且，对于该重组载体是否具有目标cdna的碱基序列，可以通过公知的方法，例如，双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
[0163]
为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5
’‑
race法，其中使用了可变区基因扩增用的引物。首先，将从杂交瘤细胞提取的rna作为模板来合成cdna，获得5
’‑
race cdna文库。5
’‑
race cdna文库的合成中可适宜地使用smart race cdna扩增试剂盒等市售的试剂盒。
[0164]
以所得的5
’‑
race cdna文库为模板，通过pcr法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚型而具有不同的碱基序列。因此，理想的是使用iso strip小鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒(
ロシュ
·
ダイアグノスティックス
)等市售试剂盒来预先确定亚型。
[0165]
具体地，例如为了获得编码小鼠igg的基因时，可以使用下述引物，其能够扩增编码作为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因。为了扩增igg的可变区基因，通常，3'侧的引物采用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而5'侧的引物则采用5’race cdna文库制作试剂盒所附带的引物。
[0166]
采用这样扩增得到的pcr产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将经重构的免疫球蛋白的针对il-6r的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。例如，为了获得针对il-6r的抗体时，进一步优选抗体对il-6r的结合是特异性的。与il-6r结合的抗体可例如如下所述进行筛选；(1)使包含由杂交瘤获得的cdna所编码的v区域的抗体与il-6r表达细胞接触的步骤、(2)检测il-6r表达细胞与抗体的结合的步骤、和(3)选择与il-6r表达细胞结合的抗体的步骤。
[0167]
检测抗体和il-6r表达细胞的结合的方法是公知的。具体地，通过如前所述的facs等方法，可检测出抗体与il-6r表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可适宜利用il-6r表达细胞的固定标本。
[0168]
作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可适宜采用淘选法，其利用了噬菌体载体。从多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚型的文库的形式获得抗体基因时，有利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序列连接，可形成单链fv(scfv)。通过将编码scfv的基因插入噬菌体载体，可以获得在表面表达scfv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scfv的dna。通过根据需要重复该操作，可以浓缩具有所期望结合活性的scfv。
[0169]
得到目标的编码抗il-6r抗体的v区域的cdna后，通过识别插入该cdna的两末端的限制酶位点的限制酶，将该cdna消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现频率低的碱基序列。进而，为了将1拷贝的消化片段以正确方向插入载体，优选插入能提供粘性末端的限制酶。将如上所述消化的编码抗il-6r抗体的v区域的cdna插入适当的表达载体，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(c区域)的基因、和编码前述v区域的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明
的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中插入前述v区域基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如，可在保持有编码所期望抗体恒定区(c区域)的dna的表达载体的5’侧适宜地配置消化前述v区域基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。
[0170]
为了制造抗il-6r单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗体基因整合至表达载体中。用于表达抗体的表达调控区包含例如增强子和启动子。另外，可以在氨基酸末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列mgwsciilflvatatgvhs(序列编号：3)的肽，除此之外也可以添加合适的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗il-6r抗体的dna的重组细胞。
[0171]
为了表达抗体基因，编码抗体重链(h链)和轻链(l链)的dna被分别整合于不同的表达载体中。通过用整合有h链和l链的载体同时转化(co-transfect)相同的宿主细胞，可以表达具备h链和l链的抗体分子。或者，也可以将编码h链和l链的dna整合于单一表达载体中，并用其转化宿主细胞(参照国际公开wo 1994/011523)。
[0172]
用于将分离的抗体基因导入适当的宿主来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达系统均可用于分离本发明的抗原结合结构域。将真核细胞用作宿主细胞时，可适宜使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体地，动物细胞可例示下述细胞。
[0173]
(1)哺乳类细胞、：cho、cos、骨髓瘤、bhk(幼仓鼠肾)、hela、vero、hek(人胚肾)293等(2)两栖类细胞：非洲蟾蜍卵母细胞等(3)昆虫细胞：sf9、sf21、tn5等或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草(nicotiana tabacum)等烟草(nicotiana)属的细胞的抗体基因表达系统。植物细胞的转化中，可以适宜使用进行了愈伤组织培养的细胞。
[0174]
进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞。
[0175]-酵母：酿酒酵母(saccharomyces serevisiae)等酵母(saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)等毕赤酵母属-丝状真菌：黑曲霉菌(aspergillus niger)等曲霉(aspergillus)属另外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适宜利用大肠杆菌(e.coli)、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所期望的抗体。
[0176]
除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以从导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内插入编码乳汁中固有产生的蛋白质的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白质，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的dna片段注入山羊的胚胎，再将该进行了注入的胚胎导入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生
的乳汁中，能够以与乳汁蛋白的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(bio/technology(1994),12(7),699-702)。
[0177]
对人给予本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该复合体中的抗原结合结构域，可以适宜采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，该基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工修饰。基因重组型抗体包含例如人源化(humanized)抗体等。这些修饰抗体可使用公知方法适宜制造。
[0178]
为了制作本说明书中记载的多肽复合体的抗原结合结构域而使用的抗体的可变区通常由被4个框架区域(fr)夹持的3个互补决定区(complementarity-determining region；cdr)构成。cdr是实质上决定抗体结合特异性的区域。cdr的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成fr的氨基酸序列即便是在具有不同结合特异性的抗体之间也多显示高度的同一性。因此，通常认为可以通过cdr的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体。
[0179]
人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体地，将人以外的动物例如小鼠抗体的cdr移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体地，作为用于将小鼠抗体的cdr移植到人的fr中的方法，公知的是例如overlap extension pcr。overlap extension pcr中，用于合成人抗体fr的引物中添加有编码待移植小鼠抗体cdr的碱基序列。针对4个fr分别准备引物。通常，对于将小鼠cdr移植到人fr中，选择与小鼠fr同一性高的人fr，在维持cdr功能方面被认为有利。即，通常优选使用下述人fr，其包含与待移植小鼠cdr的相邻fr氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。
[0180]
另外，连接的碱基序列被设计为相互框内连接。通过各引物单独地合成人fr。结果得到各fr上添加有编码小鼠cdr的dna的产物。各产物的编码小鼠cdr的碱基序列被设计为相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠cdr部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人fr通过小鼠cdr序列而连接。
[0181]
最终3个cdr和4个fr连接得到的v区域基因，通过会与其5'末端和3'末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上所述得到的dna和编码人抗体c区域的dna以进行框内融合的方式插入表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的dna，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开ep239400、国际公开wo1996/002576)。
[0182]
通过定性或者定量地测定并评价如上所述制作的人源化抗体对抗原的结合活性，可以适宜地选择人抗体fr，以便通过cdr连接时该cdr形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体cdr形成合适抗原结合位点的方式来置换fr的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠cdr移植到人fr中使用的pcr法，向fr导入氨基酸序列的突变。具体地，可以向会与fr发生退火的引物中导入部分碱基序列的突变。通过这类引物合成的fr中导入了碱基序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸置换的突变型抗体对抗原的结合活性，可以选择具有所期望性质的突变fr序列(cancer res.,(1993)53,851-856)。
[0183]
此外，将具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物(参照国际公开wo1993/
012227、wo1992/003918、wo1994/002602、wo1994/025585、wo1996/034096、wo1996/033735)作为免疫动物，可以通过dna免疫获得所期望的人抗体。
[0184]
进而，使用人抗体文库通过淘选法获得人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的v区域以单链抗体(scfv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scfv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体v区域的dna序列。确定与抗原结合的scfv的dna序列后，将该v区域序列与所期望的人抗体c区域序列框内融合后，插入适当的表达载体，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适宜表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达，可以获得该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开wo1992/001047、wo1992/020791、wo1993/006213、wo1993/011236、wo1993/019172、wo1995/001438、wo1995/015388)。
[0185]
另外，作为获得抗体基因的方法，除了上述之外，还可适宜地使用如bernasconi等(science(2002)298,2199-2202)或wo2008/081008中记载的b细胞克隆(各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体(特别是igg1、igg2、igg3或igg4)的表达载体构建用的用途等)的方法。
[0186]
eu编号和kabat编号根据本发明中使用的方法，分配给抗体的cdr和fr的氨基酸位置依照kabat规定(sequences of proteins of immunological interest(national institute of health,bethesda,md.,1987年和1991年)。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段时，可变区的氨基酸按照kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于kabat氨基酸位置的eu编号来表示。
[0187]
离子浓度的条件金属离子浓度的条件本发明的一个方式中，离子浓度是指金属离子浓度。“金属离子”是指属于除了氢以外的碱金属和铜族等第i族、碱土类金属和锌族等第ii族、除了硼之外的第iii族、除了碳和硅之外的第iv族、铁族和铂族等第viii族、v、vi和vii族的各a亚族的元素、以及锑、铋、钋等金属元素的离子。金属原子具有释放出原子价电子而形成阳离子的性质，称这为离子化倾向。认为离子化倾向大的金属富有化学活性。
[0188]
作为本发明中优选的金属离子的例子，可举出钙离子。钙离子参与许多生命现象的调节，钙离子参与骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收缩，白细胞的运动和吞噬等的活化，血小板的变形和分泌等的活化，淋巴细胞的活化，组胺的分泌等肥大细胞的活化，儿茶酚胺α受体或乙酰胆碱受体介导的细胞应答，胞吐作用，递质从神经元末端的释放，神经元的轴浆流等。作为细胞内的钙离子受体，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白c、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，其结合模体也大量已知。还熟知例如，钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的ef手、蛋白激酶c所含的c2结构域、凝血蛋白因子ix所含的gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的c型凝集素、ldl受体所含的a结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和egf样结构域。
[0189]
本发明中，在金属离子为钙离子时，作为钙离子浓度条件，可举出低钙离子浓度条件和高钙离子浓度条件。结合活性根据钙离子浓度条件发生变化是指，低钙离子浓度和高钙离子浓度条件的不同导致抗原结合分子对抗原的结合活性发生变化。可举出例如，高钙
离子浓度条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性高于低钙离子浓度条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性的情形。此外还可举出，低钙离子浓度条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性高于高钙离子浓度条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性的情形。
[0190]
本说明书中，高钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自100μm至10mm之间的浓度。此外，在其他方式中，可以是选自200μm至5mm之间的浓度。此外，在不同的方式中，可以是选自400μm至3mm之间的浓度，在其他的方式中也可以是选自200μm至2mm之间的浓度。进而，还可以是选自400μm至1mm之间的浓度。特别优选可举出选自与机体内血浆中(血中)的钙离子浓度接近的500μm至2.5mm之间的浓度。
[0191]
本说明书中，低钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自0.1μm至30μm之间的浓度。此外，在其他方式中，可以是选自0.2μm至20μm之间的浓度。此外，在不同的方式中，可以是选自0.5μm至10μm之间的浓度，在其他的方式中也可以是选自1μm至5μm之间的浓度。进而，还可以是选自2μm至4μm之间的浓度。特别优选可举出选自与机体内的早期内体内的离子化钙浓度接近的1μm至5μm之间的浓度。
[0192]
本发明中，低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性意指，抗原结合分子在选自0.1μm至30μm之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于选自100μm至10mm之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。优选意指抗原结合分子在选自0.5μm至10μm之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自200μm至5mm之间的钙离子浓度下的抗原结合活性，特别优选意指机体内的早期内体内的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于机体内的血浆中的钙离子浓度下的抗原结合活性，具体意指抗原结合分子在选自1μm至5μm之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自500μm至2.5mm之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。
[0193]
抗原结合分子对抗原的结合活性根据金属离子浓度的条件而发生变化与否可以通过使用例如前述结合活性一项中所记载的公知测定方法来决定。例如，为了确认与低钙离子浓度条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性相比高钙离子浓度条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性变得更高，对低钙离子浓度和高钙离子浓度条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性进行比较。
[0194]
进而，本发明中，“低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”的表述也可以表述为抗原结合分子的高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于低钙离子浓度条件下的抗原结合活性。应予说明，本发明中有时也将“低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”记载为“低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”，此外，有时也将“使低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”记载为“使低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”。
[0195]
本领域技术人员可以适宜选择测定对抗原的结合活性时的钙离子浓度以外的条件，没有特别限定。例如，可以在hepes缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用biacore(ge healthcare)等进行测定。对于抗原结合分子和抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片加载作为分析物的抗原，由此可以评价对可溶型抗原的结合活性，在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片加载作为分析物的抗原结合分子，由此可以评价对膜型抗原的结合活性。
[0196]
本发明的抗原结合分子中，只要低钙离子浓度条件的抗原结合活性弱于高钙离子浓度条件的抗原结合活性，则低钙离子浓度条件下的抗原结合活性和高钙离子浓度条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的低钙离子浓度条件下的kd(dissociation constant：解离常数)和高钙离子浓度条件的kd之比kd(ca 3μm)/kd(ca 2mm)的值为2以上，进一步优选kd(ca 3μm)/kd(ca 2mm)的值为10以上，进一步优选kd(ca 3μm)/kd(ca 2mm)的值为40以上。kd(ca 3μm)/kd(ca 2mm)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。
[0197]
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(apparent dissociation constant：表观解离常数)。kd(解离常数)、和表观kd(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用biacore(ge healthcare)、斯卡查德图(scatchard plot)、流式细胞仪等。
[0198]
此外，作为示出本发明的抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性和高钙浓度条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可优选使用例如解离速度常数kd(dissociation rate constant：解离速度常数)。代替kd(解离常数)而使用kd(解离速度常数)来作为示出结合活性之比的指标时，相对于抗原的低钙浓度条件下的kd(解离速度常数)和高钙浓度条件下的kd(解离速度常数)之比kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步优选为10以上，更优选为30以上。kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。
[0199]
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速度常数)，在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(apparent dissociation rate constant：表观解离速度常数)。kd(解离速度常数)、和表观kd(表观解离速度常数)可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用biacore(ge healthcare)、流式细胞仪等。应予说明，本发明中，在测定不同钙浓度下的抗原结合分子的抗原结合活性时，钙浓度以外的条件优选为相同。
[0200]
例如，作为本发明提供的一个方式的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体的筛选来获得。
[0201]
(a)获得低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤、(b)获得高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤、(c)选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤。
[0202]
进而，作为本发明提供的一个方式的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得。
[0203]
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体或其文库与抗原接触的步骤、(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体置于低钙浓度条件下的步骤、(c)对在前述步骤(b)中发生解离的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0204]
此外，作为本发明提供的一个方式的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙
离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得。
[0205]
(a)在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤、(b)选择在前述步骤(a)中与抗原不结合的抗原结合结构域或抗体的步骤、(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗体在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤、(d)对在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0206]
进而，作为本发明提供的一个方式的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获得。
[0207]
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与固定有抗原的柱接触的步骤、(b)将在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗体在低钙浓度条件下从柱洗脱的步骤、(c)对在前述步骤(b)中被洗脱的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0208]
进而，作为本发明提供的一个方式的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
[0209]
(a)在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库通过固定有抗原的柱的步骤、(b)对在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域或抗体进行回收的步骤、(c)使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗体在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤、(d)对在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0210]
进而，作为本发明提供的一个方式的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
[0211]
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤、(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体的步骤、(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域或抗体置于低钙浓度条件下的步骤、(d)对前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中进行选择的标准的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0212]
应予说明，前述步骤可以重复2次以上。所以，根据本发明可提供通过上述筛选方法中进一步包括将(a)～(c)或(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的筛选方法而获得的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体。(a)～(c)或(a)～(d)的步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
[0213]
本发明的筛选方法中，低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性
只要是离子化钙浓度为0.1μm～30μm之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出0.5μm～10μm之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出机体内的早期内体内的离子化钙浓度，具体可举出1μm～5μm下的抗原结合活性。另外，高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为100μm～10mm之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出200μm～5mm之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出机体内的血浆中的离子化钙浓度，具体可举出0.5mm～2.5mm时的抗原结合活性。
[0214]
抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜决定。抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可以作为kd(dissociation constant：解离常数)、表观kd(apparent dissociation constant：表观解离常数)、解离速度kd(dissociation rate：解离速度常数)、或表观kd(apparent dissociation：表观解离速度常数)等来进行评价。它们可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用biacore(ge healthcare)、scatchard作图、facs等。
[0215]
本发明中，选自高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤、与选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。
[0216]
只要高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性，则高钙浓度条件下的抗原结合活性与低钙浓度条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选高钙浓度条件下的抗原结合活性是低钙浓度条件下的抗原结合活性的2倍以上、进一步优选为10倍以上、更优选为40倍以上。
[0217]
通过前述筛选方法筛选得到的本发明的抗原结合结构域或抗体可以是任意的抗原结合结构域或抗体，例如，可以筛选上述抗原结合结构域或抗体。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域或抗体，也可以筛选氨基酸序列被置换的抗原结合结构域或抗体。
[0218]
文库根据一个方式，本发明的抗原结合结构域或抗体可以由文库获得，该文库主要由多种抗原结合分子形成，所述多种抗原结合分子的序列相互不同，并且其抗原结合结构域中含有至少一个根据离子浓度的条件而使抗原结合分子对抗原的结合活性发生变化的氨基酸残基。作为离子浓度的例子，优选可举出金属离子浓度或氢离子浓度。
[0219]
本说明书中，“文库”是指多种抗原结合分子或含有抗原结合分子的多种融合多肽、或编码它们的序列的核酸、多核苷酸。文库中所含的多种抗原结合分子或含有抗原结合分子的多种融合多肽的序列并非单一的序列，而使序列相互不同的抗原结合分子或含有抗原结合分子的融合多肽。
[0220]
本说明书中，序列相互不同的多种抗原结合分子的记载中的“序列相互不同”这一术语意指文库中的各抗原结合分子的序列相互不同。即，文库中的相互不同的序列的数量反映文库中的序列不同的独立克隆的数量，有时也被视为“文库大小”。通常的噬菌体展示文库为106至10
12
，通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小放大至10
14
。然而，噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体粒子的实际数目通常比文库大小大10至10000倍。该
超过倍数也称为“文库当量数”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能够存在10至10000个。所以，本发明中的“序列相互不同”这一术语意指文库当量数除外的文库中的各抗原结合分子的序列相互不同，更具体意指序列相互不同的抗原结合分子存在106至10
14
个分子、优选107至10
12
个分子、进一步优选108至10
11
、特别优选108至10
10
。
[0221]
此外，本发明的主要由多种抗原结合分子形成的文库这一记载中的术语“多种”，对于例如本发明的抗原结合分子、融合多肽、多核苷酸分子、载体或病毒来说，通常是指这些物质的2种以上的集合。例如，只要某2个以上的物质在特定形态方面相互不同，则表示该物质存在2种以上。作为例子，可举出氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到的突变体氨基酸。例如，当除了柔性残基以外、或除了露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸以外，序列实质上相同、优选相同的本发明的2个以上的抗原结合分子存在时，则本发明的抗原结合分子存在多个。在其他实施例中，当除了编码柔性残基的碱基以外、或除了编码露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸的碱基以外实质上相同、优选相同的序列的本发明的2个以上的多核苷酸分子存在时，则本发明的多核苷酸分子存在多个。
[0222]
进而，本发明的主要由多种抗原结合分子形成的文库的记载中的“主要由...形成”的表述反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而不同的抗原结合分子的数量。具体地，优选表现出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在104个分子。此外，更优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在105个分子的文库中获得。进一步优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在106个分子的文库中获得。特别优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在107个分子的文库中获得。还优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在108个分子的文库中获得。其它表现中，也可适宜地表现为文库中的序列不同的独立克隆的数量中的抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而不同的抗原结合分子的比例。具体地，本发明的抗原结合结构域可以由表现出这种结合活性的抗原结合分子占文库中序列不同的独立克隆的数量的0.1％至80％、优选0.5％至60％、更优选1％至40％、进一步优选2％至20％、特别优选4％至10％的文库中获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也与上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表现。此外，病毒的情形也与上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表现。
[0223]
使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的氨基酸通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可用任意方法制备，例如，在金属离子为钙离子浓度的情形中，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的b细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库导入能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库(能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库、或者在特定位置导入能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的文库等)等。
[0224]
如前所述，作为使抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的氨基酸的例子，例如，在金属离子为钙离子时，只要是形成钙结合模体的氨基酸即可，
不论其种类如何。钙结合模体是本领域技术人员所周知的，并且有详细记载(例如springer等(cell(2000)102,275-277)、kawasaki和kretsinger(protein prof.(1995)2,305-490)、moncrief等(j.mol.evol.(1990)30,522-562)、chauvaux等(biochem.j.(1990)265,261-265)、bairoch和cox(febs lett.(1990)269,454-456)、davis(new biol.(1990)2,410-419)、schaefer等(genomics(1995)25,638～643)、economou等(embo j.(1990)9,349-354)、wurzburg等(structure.(2006)14,6,1049-1058))。即，本发明抗原结合分子中可以含有asgpr,cd23、mbr、dc-sign等c型凝集素等任意的公知钙结合模体。作为这种钙结合模体的优选例子，除了上述之外，还可举出序列编号：4所述的抗原结合结构域中所含的钙结合模体。
[0225]
此外，作为使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件发生变化的氨基酸的例子，也可优选使用具有金属螯合作用的氨基酸。作为具有金属螯合作用的氨基酸的例子，优选可举出例如：丝氨酸(ser(s))、苏氨酸(thr(t))、天冬酰胺(asn(n))、谷氨酰胺(gln(q))、天冬氨酸(asp(d))和谷氨酸(glu(e))等。
[0226]
含有前述氨基酸的抗原结合结构域的位置并不限于特定的位置，只要是使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化，则可以是形成抗原结合结构域的重链可变区或轻链可变区中的任意位置。即，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。此外，在其他形式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的cdr3中含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的cdr3的以kabat编号表示的95位、96位、100a位和/或101位含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0227]
此外，在本发明的一个方式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。此外，在其他形式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的cdr1中含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的cdr1的以kabat编号表示的30位、31位和/或32位含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0228]
此外，在其他形式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的cdr2中含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方式中，提供下述文库，该文库主要由轻链的cdr2的以kabat编号表示的50位含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0229]
进而在其他形式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的cdr3中含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的cdr3的以kabat编号表示的92位含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0230]
此外，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库作为本发明的不同方式来获得，该文库主要由选自上述记载的轻链的cdr1、cdr2和cdr3中的2个或3个cdr含有该氨基酸残
基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。进而，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的以kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位中的任一者以上含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0231]
在特别优选的实施方式中，理想的是抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框架序列具有人的生殖细胞系框架序列。因此，在本发明的一个方式中，若框架序列完全为人的序列，则认为在给予人(例如疾病的治疗)时，本发明的抗原结合分子基本或完全不会引起免疫原性反应。根据上述含义，本发明的“含有生殖细胞系列的序列”意指本发明的框架序列的一部分与任意的人的生殖细胞系框架序列的一部分相同。例如，在本发明的抗原结合分子的重链fr2的序列为多个不同的人的生殖细胞系框架序列的重链fr2序列组合得到的序列时，该抗原结合分子也是本发明的“含有生殖细胞系列的序列”的抗原结合分子。
[0232]
作为框架的例子，优选可举出例如：v-base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中所包括的、现在已知的完全人型框架区域的序列。这些框架区域的序列能够适宜用作本发明的抗原结合分子中所含的生殖细胞系列的序列。生殖细胞系列的序列可基于其相似性来分类(tomlinson等(j.mol.biol.(1992)227,776-798)williams和winter(eur.j.immunol.(1993)23,1456-1461)和cox等(nat.genetics(1994)7,162-168))。可以从分类为7个亚类的vκ、分类为10个亚类的vλ、分类为7个亚类的vh中适宜选择合适的生殖细胞系列的序列。
[0233]
完全人型vh序列并不仅限于下述，优选可举出例如：vh1亚类(例如，vh1-2、vh1-3、vh1-8、vh1-18、vh1-24、vh1-45、vh1-46、vh1-58、vh1-69)、vh2亚类(例如，vh2-5、vh2-26、vh2-70)、vh3亚类(vh3-7、vh3-9、vh3-11、vh3-13、vh3-15、vh3-16、vh3-20、vh3-21、vh3-23、vh3-30、vh3-33、vh3-35、vh3-38、vh3-43、vh3-48、vh3-49、vh3-53、vh3-64、vh3-66、vh3-72、vh3-73、vh3-74)、vh4亚类(vh4-4、vh4-28、vh4-31、vh4-34、vh4-39、vh4-59、vh4-61)、vh5亚类(vh5-51)、vh6亚类(vh6-1)、vh7亚类(vh7-4、vh7-81)的vh序列等。它们也记载于公知文献(matsuda等(j.exp.med.(1998)188,1973-1975))等中，本领域技术人员可以基于它们的序列信息适宜设计本发明的抗原结合分子。也可优选使用它们以外的完全人型框架或框架的次区域(sub-region)。
[0234]
完全人型vk序列并不仅限于下述，优选可举出例如：分类为vk1亚类的a20、a30、l1、l4、l5、l8、l9、l11、l12、l14、l15、l18、l19、l22、l23、l24、o2、o4、o8、o12、o14、o18；分类为vk2亚类的a1、a2、a3、a5、a7、a17、a18、a19、a23、o1、o11；分类为vk3亚类的a11、a27、l2、l6、l10、l16、l20、l25；分类为vk4亚类的b3；分类为vk5亚类的b2(本说明书中也称为vk5-2)；分类为vk6亚类的a10、a14、a26等(kawasaki等(eur.j.immunol.(2001)31,1017-1028)、schable和zachau(biol.chem.hoppe seyler(1993)374,1001-1022)和brensing-kuppers等(gene(1997)191,173-181))。
[0235]
完全人型的vl序列并不仅限于下述，优选可举出例如：分类为vl1亚类的v1-2、v1-3、v1-4、v1-5、v1-7、v1-9、v1-11、v1-13、v1-16、v1-17、v1-18、v1-19、v1-20、v1-22；分类为vl1亚类的v2-1、v2-6、v2-7、v2-8、v2-11、v2-13、v2-14、v2-15、v2-17、v2-19；分类为vl3亚类的v3-2、v3-3、v3-4；分类为vl4亚类的v4-1、v4-2、v4-3、v4-4、v4-6；分类为vl5亚类的v5-1、v5-2、v5-4、v5-6等(kawasaki等(genome res.(1997)7,250-261))。
[0236]
通常这些框架序列根据一个或一个以上氨基酸残基的区别而相互不同。这些框架
序列可以与本发明的“使抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的至少一个氨基酸残基”一起使用。作为与本发明的“使抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的至少一个氨基酸残基”一起使用的完全人型框架的例子，并不仅限于此，另外还可举出：kol、newm、rei、eu、tur、tei、lay、pom等(例如，前述的kabat等(1991)和wu等(j.exp.med.(1970)132,211-250))。
[0237]
本发明并不受特定理论的束缚，认为生殖细胞系的序列的使用有望排除大多数个体中有害免疫反应的一个理由如下所述。通常的免疫反应中产生的亲和性成熟阶段的结果造成免疫球蛋白的可变区频繁地产生体细胞的突变。这些突变主要产生在其序列为超变的cdr的附近，对框架区域的残基也造成影响。这些框架的突变在生殖细胞系的基因中不存在，而成为患者的免疫原性的可能性也小。另一方面，通常的人类种群暴露于生殖细胞系的基因所表达的框架序列的大多数，作为免疫耐受性的结果，预测这些生殖细胞系的框架在患者中的免疫原性低或为非免疫原性。为了使免疫耐受性的可能性最大，编码可变区的基因可以从通常存在的功能性生殖细胞系基因的集合中选择。
[0238]
为了制作本发明的、前述框架序列中含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的氨基酸的抗原结合分子，可以适宜地采用位点特异性突变诱导法(kunkel等(proc.natl.acad.sci.usa(1985)82,488-492))或重叠延伸pcr等公知方法。
[0239]
例如，通过将被选择作为预先含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的至少一个氨基酸残基的框架序列的轻链可变区、与被制作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，由此可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性例子，在离子浓度为钙离子浓度时，可优选举出例如：将序列编号：4(vk5-2)所述的轻链可变区序列和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合而成的文库。
[0240]
此外，也可以进行设计，以使前述被选择作为预先含有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的至少一个氨基酸残基的框架序列的轻链可变区的序列中含有作为该氨基酸残基以外的残基的各种氨基酸。本发明中，这样的残基也被称为柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要根据离子浓度的条件而发生变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方式。即，重链和/或轻链的cdr序列和/或fr序列中可以含有一个或一个以上的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入序列编号：4(vk5-2)所述的轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性例子，可举出表1或表2所述的氨基酸残基。
[0241]
[表1]
[0242]
[表2]
[0243]
本说明书中，柔性残基是指在与公知和/或天然抗体或抗原结合结构域的氨基酸序列进行比较时，具有在该位置上出现的数个不同氨基酸的轻链和重链可变区上的氨基酸为超变的位置上存在的氨基酸残基的改变。超变的位置一般存在于cdr区域。一个方式中，在确定公知和/或天然抗体的超变位置时，kabat,sequences of proteins of immunological interest(national institute of health bethesda md.)(1987年和1991年)所提供的数据是有效的。此外，因特网上的多个数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)中提供有收集的大量人轻链和重链的序列以及其配置，这些序列及其配置的信息对于确定本发明中的超变位置有用。根据本发明，当氨基酸在某位置具有优选约2至约20、优选约3至约19、优选约4至约18、优选5至17、优选6至16、优选7至15、优选8至14、优选9至13、优选10至12个可能的不同的氨基酸残基的多样性时，可以说该位置是超变的。在数个实施方式中，某氨基酸位置可以具有优选至少约2、优选至少约4、优选至少约6、优选至少约8、优选约10、优选约12个可能的不同氨基酸残基的多样性。
[0244]
此外，通过将前述导入有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件
而发生变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，也可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性例子，在离子浓度为钙离子浓度时，优选可举出例如：将序列编号：5(vk1)、序列编号：6(vk2)、序列编号：7(vk3)、序列编号：8(vk4)等生殖细胞系列的特定残基置换为使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的至少一个氨基酸残基而成的轻链可变区序列和制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合而得的文库。作为该氨基酸残基的非限定性例子，例示有轻链的cdr1中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性例子，例示有轻链cdr2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性的其它例子，还例示有轻链cdr3中所含的氨基酸残基。
[0245]
如前所述，作为该氨基酸残基为轻链cdr1中所含的氨基酸残基的非限定性例子，可举出：轻链可变区的cdr1中的以eu编号表示的30位、31位和/或32位的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基为轻链cdr2中所含的氨基酸残基的非限定性例子，可举出：轻链可变区的cdr2中的以kabat编号表示的50位的氨基酸残基。进而，作为该氨基酸残基为轻链cdr3中所含的氨基酸残基的非限定性例子，可举出：轻链可变区的cdr3中的以kabat编号表示的92位的氨基酸残基。此外，这些氨基酸残基只要可形成钙结合模体、和/或使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可将这些氨基酸二种以上组合含有。此外，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白c、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，也可以以含有该结合模体的方式来设计轻链cdr1、cdr2和/或cdr3。例如，为了上述目的，可以适宜使用钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的ef手、蛋白激酶c所含的c2结构域、凝血蛋白因子ix所含的gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的c型凝集素、ldl受体所含的a结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和egf样结构域。
[0246]
在将前述导入有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合时，和前述相同地，也可以进行设计以使该轻链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要根据离子浓度的条件而发生变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方式。即，重链和/或轻链的cdr序列和/或fr序列中可以含有一个或一个以上的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性例子，可举出表1或表2所述的氨基酸残基。
[0247]
作为进行组合的重链可变区的例子，优选可举出随机可变区文库。随机可变区文库的制作方法适宜组合公知的方法。在本发明的非限定性的一个方式中，基于用特定抗原免疫的动物、感染疾病患者或接种疫苗而使血中抗体效价上升的人、癌患者、自身免疫疾病的淋巴细胞来源的抗体基因构建的免疫文库可优选用作随机可变区文库。
[0248]
此外，在本发明的非限定性的一个方式中，将基因组dna中的v基因或重构功能性v基因的cdr序列，用包含适当长度的编码密码子组的序列的合成寡核苷酸组置换而成的合成文库也可优选用作随机可变区文库。此时，由于观察到重链的cdr3的基因序列的多样性，因而也可仅置换cdr3的序列。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的基准是，抗原结合分子的露出于表面的位置的氨基酸残基具有多样性。露出于表面的位置是指，基于抗原结合分子的结构、结构总体和/或模型化结构，判断为可以露出表面和/或可与抗原接
触的位置，通常为其cdr。露出于表面的位置优选使用insightii程序(accelrys)之类的计算机程序，使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标来确定。露出于表面的位置可使用本技术领域公知的算法(例如，lee和richards(j.mol.biol.(1971)55,379-400)、connolly(j.appl.cryst.(1983)16,548-558))来确定。露出于表面的位置的确定可使用由适于蛋白质建模的软件和抗体得到的三维结构信息来进行。作为可用于上述目的的软件，优选可举出sybyl biopolymer module软件(tripos associates)。通常或优选地，在算法需要使用者输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。进而，使用个人电脑用软件的露出于表面的区域和面积的确定方法记载于pacios(comput.chem.(1994)18(4),377-386和j.mol.model.(1995)1,46-53)中。
[0249]
进而，在本发明的一个非限定性方式中，由来源于正常人淋巴细胞的抗体基因构建、且其组成成分由不含偏差的抗体序列即天然序列构成的天然文库也可特别优选用作随机可变区文库(gejima等(human antibodies(2002)11,121-129)和cardoso等(scand.j.immunol.(2000)51,337-344))。本发明中记载的包含天然序列的氨基酸序列是指从上述天然文库中获得的氨基酸序列。
[0250]
本发明的一个方式中，通过将被选择作为预先含有“使抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的至少一个氨基酸残基”的框架序列的重链可变区、和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区组合，可以由含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库获得本发明的抗原结合结构域。作为这样的非限定性例子，在离子浓度为钙离子浓度时，可优选举出例如：将序列编号：9(6rl#9-igg1)或序列编号：10(6kc4-1#85-igg1)所述的重链可变区序列和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区组合而得的文库。此外，也可以通过代替制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区，而从具有生殖细胞系列的序列的轻链可变区中适宜选择来制作。可优选举出例如：将序列编号：9(6rl#9-igg1)或序列编号：10(6kc4-1#85-igg1)所述的重链可变区序列和具有生殖细胞系列的序列的轻链可变区组合而得的文库。
[0251]
此外，也可以进行设计，以使前述被选择作为预先含有“使抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的至少一个氨基酸残基”的框架序列的重链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要根据离子浓度的条件而发生变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方式。即，重链和/或轻链的cdr序列和/或fr序列中可以含有一个或一个以上的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入序列编号：9(6rl#9-igg1)所述的重链可变区序列中的柔性残基的非限定性例子，除了重链cdr1和cdr2的全部氨基酸残基之外，可举出重链cdr3的95位、96位和/或100a位以外的cdr3的氨基酸残基。或者作为导入序列编号：10(6kc4-1#85-igg1)所述的重链可变区序列中的柔性残基的非限定性例子，除了重链cdr1和cdr2的全部氨基酸残基之外，还可举出重链cdr3的95位和/或101位以外的cdr3的氨基酸残基。
[0252]
此外，通过将前述导入有“使抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的至少一个氨基酸残基”的重链可变区和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区或具有生殖细胞系列的序列的轻链可变区组合，也可以制作包含多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性例子，在离子浓度为钙离子浓度时，优选可举出例如：将重链可变区的特定残基置换为使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子
浓度条件而发生变化的至少一个氨基酸残基的重链可变区序列和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区或具有生殖细胞系列的序列的轻链可变区组合而得的文库。作为该氨基酸残基的非限定性例子，例示有重链的cdr1中所含的氨基酸残基。另外，作为该氨基酸残基的非限定性例子，还例示有重链的cdr2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的其它非限定性例子，还例示有重链的cdr3中所含的氨基酸残基。作为该氨基酸残基为重链的cdr3中所含的氨基酸残基的非限定性例子，可举出重链可变区的cdr3中的以kabat编号表示的95位、96位、100a位和/或101位的氨基酸。此外，这些氨基酸残基只要可形成钙结合模体、和/或使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可将这些氨基酸二个以上组合含有。
[0253]
在将前述导入有使抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的至少一个氨基酸残基的重链可变区和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区或具有生殖细胞系列的序列的轻链可变区组合时，与前述相同地，也可以进行设计以使该重链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要根据离子浓度的条件而发生变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方式。即，重链的cdr序列和/或fr序列中可以含有一个或一个以上的柔性残基。此外，作为使抗原结合分子对抗原的结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的氨基酸残基以外的重链可变区的cdr1、cdr2和/或cdr3的氨基酸序列，也可优选使用随机可变区文库。在使用生殖细胞系列的序列作为轻链可变区时，可举出例如序列编号：5(vk1)、序列编号：6(vk2)、序列编号：7(vk3)、序列编号：8(vk4)等生殖细胞系列的序列作为非限定性例子。
[0254]
作为前述使抗原结合分子对抗原的结合活性根据钙离子浓度条件而发生变化的氨基酸，只要形成钙结合模体，则任意的氨基酸均可优选使用，作为这种氨基酸，具体可举出具有供电子性的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，优选可例示丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。
[0255]
氢离子浓度的条件此外，在本发明的一个方式中，离子浓度的条件是指氢离子浓度的条件或ph条件。本发明中，将质子即氢原子的原子核的浓度条件与氢指数(ph)的条件视为相同含义。水溶液中的氢离子的活动量用ah 表示时，则ph定义为-log10ah 。水溶液中的离子强度若(例如与10-3
相比)低，则ah 大致与氢离子强度相等。例如25℃、1个大气压下的水的离子积为kw＝ah aoh＝10-14
，因而对纯水来说，ah ＝aoh＝10-7
。此时的ph＝7为中性，ph小于7的水溶液为酸性、ph大于7的水溶液为碱性。
[0256]
本发明中，使用ph条件来作为离子浓度的条件时，作为ph条件，可举出高氢离子浓度或低ph，即ph酸性范围条件与低氢离子浓度或高ph，即ph中性范围条件。结合活性根据ph条件发生变化是指，高氢离子浓度或低ph(ph酸性范围)和低氢离子浓度或高ph(ph中性范围)的条件的不同导致抗原结合分子对抗原的结合活性发生变化。可举出例如，ph中性范围条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性高于ph酸性范围条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性的情形。此外还可举出，ph酸性范围条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性高于ph中性范围条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性的情形。
[0257]
本说明书中，ph中性范围并不特别限于统一的数值，优选可从ph6.7至ph10.0之间选择。此外，在其它方式中，可以从ph6.7至ph9.5之间选择。此外，在不同的方式中，可以从
ph7.0至ph9.0之间选择，在其它方式中，可以从ph7.0至ph8.0之间选择。特别优选可举出与机体内血浆中(血中)的ph接近的ph7.4。
[0258]
本说明书中，ph酸性范围并不特别限于统一的数值，优选可从ph4.0至ph6.5之间选择。此外，在其它方式中，可以从ph4.5至ph6.5之间选择。此外，在不同的方式中，可以从ph5.0至ph6.5之间选择，在其它方式中，可以从ph5.5至ph6.5之间选择。特别优选可举出与机体内的早期内体内的ph接近的ph5.8。
[0259]
本发明中，抗原结合分子的高氢离子浓度或低ph(ph酸性范围)条件下的抗原结合活性若比低氢离子浓度或高ph(ph中性范围)条件下的抗原结合活性低，则意指抗原结合分子在选自ph4.0至ph6.5之间的ph下的抗原结合活性比在选自ph6.7至ph10.0之间的ph下的抗原结合活性弱。优选意指抗原结合分子在选自ph4.5至ph6.5之间的ph下的抗原结合活性比在选自ph6.7至ph9.5之间的ph下的抗原结合活性弱，更优选意指抗原结合分子在选自ph5.0至ph6.5之间的ph下的抗原结合活性比在选自ph7.0至ph9.0之间的ph下的抗原结合活性弱。此外，优选意指抗原结合分子在选自ph5.5至ph6.5之间的ph下的抗原结合活性比在选自ph7.0至ph8.0之间的ph下的抗原结合活性弱。特别优选意指机体内的早期内体内的ph下的抗原结合活性比机体内的血浆中的ph下的抗原结合活性弱，具体意指抗原结合分子在ph5.8下的抗原结合活性比在ph7.4下的抗原结合活性弱。
[0260]
抗原结合分子对抗原的结合活性根据ph条件而发生变化与否可以使用例如前述结合活性一项中记载的公知测定方法来确定。即，利用该测定方法测定不同ph条件下的结合活性。例如，为了确认与ph酸性范围条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性相比，ph中性范围条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性变高，对ph酸性范围和ph中性范围条件下的抗原结合分子对抗原的结合活性进行比较。
[0261]
进而在本发明中，“高氢离子浓度或低ph，即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph，即ph中性范围条件下的抗原结合活性低”的表述也可以表述为抗原结合分子的低氢离子浓度或高ph，即ph中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低ph，即ph酸性范围条件下的抗原结合活性高。应予说明，本发明中有时也将“高氢离子浓度或低ph，即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph，即ph中性范围条件下的抗原结合活性低”记载为“高氢离子浓度或低ph，即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph，即ph中性范围条件下的抗原结合能力弱”，此外，有时也将“使高氢离子浓度或低ph，即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph，即ph中性范围条件下的抗原结合活性低”记载为“使高氢离子浓度或低ph，即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph，即ph中性范围条件下的抗原结合能力弱”。
[0262]
本领域技术人员可以适宜选择测定抗原结合活性时的氢离子浓度或ph以外的条件，没有特别限定。例如，可以在hepes缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用biacore(ge healthcare)等进行测定。对于抗原结合分子和抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片加载作为分析物的抗原，由此可以评价对可溶型抗原的结合活性，在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片加载作为分析物的抗原结合分子，由此可以对评价膜型抗原的结合活性。
[0263]
本发明的抗原结合分子中，只要高氢离子浓度或低ph、即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph、即ph中性范围条件下的抗原结合活性弱，则高氢离子
浓度或低ph、即ph酸性范围条件下的抗原结合活性与低氢离子浓度或高ph、即ph中性范围条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的高氢离子浓度或低ph、即ph酸性范围条件下的kd(dissociation constant：解离常数)和低氢离子浓度或高ph、即ph中性范围条件下的kd之比kd(ph5.8)/kd(ph7.4)的值为2以上，进一步优选kd(ph5.8)/kd(ph7.4)的值为10以上，进一步优选kd(ph5.8)/kd(ph7.4)的值为40以上。kd(ph5.8)/kd(ph7.4)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以为400、1000、10000等任意的值。
[0264]
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(apparent dissociation constant：表观解离常数)。kd(解离常数)、和表观kd(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用biacore(ge healthcare)、斯卡查德图(scatchard plot)、流式细胞仪等。
[0265]
此外，作为示出本发明的抗原结合分子在高氢离子浓度或低ph、即ph酸性范围条件下的抗原结合活性与低氢离子浓度或高ph、即ph中性范围条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可优选使用例如，解离速度常数kd(dissociation rate constant：解离速度常数)。代替kd(解离常数)而使用kd(解离速度常数)来作为示出结合活性之比的指标时，相对于抗原的高氢离子浓度或低ph、即ph酸性范围条件下的kd(解离速度常数)与低氢离子浓度或高ph、即ph中性范围条件下的kd(解离速度常数)之比kd(ph酸性范围条件下)/kd(ph中性范围条件下)的值优选为2以上、进一步优选为5以上、进一步优选为10以上、更优选为30以上。kd(ph酸性范围条件下)/kd(ph中性范围条件下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。
[0266]
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速度常数)，在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(apparent dissociation rate constant：表观解离速度常数)。kd(解离速度常数)、和表观kd(表观解离速度常数)可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用biacore(ge healthcare)、流式细胞仪等。应予说明本发明中，在测定不同氢离子浓度即ph下的抗原结合分子的抗原结合活性时，氢离子浓度即ph以外的条件优选为相同。
[0267]
例如，作为本发明提供的一个方式的高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体的筛选来获得。
[0268]
(a)获得ph酸性范围条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤、(b)获得ph中性范围条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤、(c)选择ph酸性范围条件下的抗原结合活性比ph中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体的步骤。
[0269]
进而，作为本发明提供的一个方式的高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得。
[0270]
(a)使ph中性范围条件下的抗原结合结构域或抗体或其文库与抗原接触的步骤、(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体置于ph酸性范围条
件的步骤、(c)对在前述步骤(b)中发生解离的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0271]
此外，作为本发明提供的一个方式的高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得。
[0272]
(a)在ph酸性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤、(b)选择在前述步骤(a)中与抗原不结合的抗原结合结构域或抗体的步骤、(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗体在ph中性范围条件下与抗原结合的步骤、(d)对在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0273]
进而，作为本发明提供的一个方式的高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获得。
[0274]
(a)在ph中性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与固定有抗原的柱接触的步骤、(b)将在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗体在ph酸性范围条件从柱洗脱的步骤、(c)对在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0275]
进而，作为本发明提供的一个方式的高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
[0276]
(a)在ph酸性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库通过固定有抗原的柱的步骤、(b)对在前述步骤(a)中不与柱结合而洗脱的抗原结合结构域或抗体进行回收的步骤、(c)使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗体在ph中性范围条件与抗原结合的步骤、(d)对在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0277]
进而，作为本发明提供的一个方式的高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得。
[0278]
(a)在ph中性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤、(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体的步骤、(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域或抗体置于ph酸性范围条件下的步骤、(d)对在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中进行选择的标准的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0279]
应予说明，前述步骤可以重复2次以上。所以，根据本发明可提供通过上述筛选方
法中进一步包括将(a)～(c)或(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的筛选方法而获得的ph酸性范围条件下的抗原结合活性低于ph中性范围条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体。(a)～(c)或(a)～(d)的步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
[0280]
本发明的筛选方法中，高氢离子浓度条件或低ph即ph酸性范围下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是ph为4.0～6.5之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的ph，可举出ph为4.5～6.6之间的抗原结合活性。作为其它的优选ph，可举出ph为5.0～6.5之间的抗原结合活性，进而可举出ph为5.5～6.5之间的抗原结合活性。作为更优选的ph，可举出机体内的早期内体内的ph，具体可举出ph5.8下的抗原结合活性。此外，低氢离子浓度条件或高ph即ph中性范围下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是ph为6.7～10之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的ph，可举出ph为6.7～9.5之间的抗原结合活性。作为其它的优选ph，可举出ph为7.0～9.5之间的抗原结合活性，进而可举出ph为7.0～8.0之间的抗原结合活性。作为更优选的ph，可举出机体内的血浆中的ph，具体可举出ph为7.4下的抗原结合活性。
[0281]
抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜决定。抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可以作为kd(dissociation constant：解离常数)、表观kd(apparent dissociation constant：表观解离常数)、解离速度kd(dissociation rate：解离速度常数)、或表观kd(apparent dissociation：表观解离速度常数)等来进行评价。它们可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用biacore(ge healthcare)、scatchard作图、facs等。
[0282]
本发明中，选择低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体的步骤，与选择高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。
[0283]
只要低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性高，则低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性与高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性为高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。
[0284]
通过前述筛选方法筛选得到的本发明的抗原结合结构域或抗体可以是任意的抗原结合结构域或抗体，例如，可以筛选上述抗原结合结构域或抗体。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域或抗体，也可以筛选氨基酸序列被置换的抗原结合结构域或抗体。
[0285]
通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可用任意方法制备，例如，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的b细胞制作得到的抗体或文库、向这些抗体或文库导入侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库(侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库、在特
定位置导入侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变而成的文库等)等。
[0286]
作为从由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的b细胞制作得到的抗原结合结构域或抗体中获得低氢离子浓度或高ph即ph中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低ph即ph酸性范围条件下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体的方法，优选可举出例如：将如wo2009/125825中所述的抗原结合结构域或抗体中的氨基酸的至少一个置换为侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变的抗原结合分子或抗体、或者在抗原结合结构域或抗体中插入侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的抗原结合分子或抗体。
[0287]
导入侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变的位置没有特别限定，只要与置换或插入前相比，ph酸性范围下的抗原结合活性变得比ph中性范围下的抗原结合活性弱(kd(ph酸性范围)/kd(ph中性范围)的值变大、或kd(ph酸性范围)/kd(ph中性范围)的值变大)，则可以是任意位点。例如，在抗原结合分子为抗体时，优选可举出抗体的可变区或cdr等。本领域技术人员可以适宜确定置换为侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的氨基酸的数目、或插入的氨基酸的数目，可以被侧链的pka为4.0-8.0的1个氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸所置换，可以插入侧链的pka为4.0-8.0的1个氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸，可以被侧链的pka为4.0-8.0的2个以上的多个氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸所置换，可以插入侧链的pka为4.0-8.0的2个以上的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸。另外，除了置换为侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸或插入侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸以外，也可以同时进行其它的氨基酸的缺失、添加、插入和/或置换等。置换为侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸或插入侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸，可以通过本领域技术人员公知的丙氨酸扫描的丙氨酸置换为组氨酸等而成的组氨酸等扫描等方法随机地进行，从随机地导入了侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的置换或插入的突变的抗原结合结构域或抗体中，可以选着与突变前相比kd(ph酸性范围)/kd(ph中性范围)或kd(ph酸性范围)/kd(ph中性范围)的值变大的抗原结合分子。
[0288]
如前所述，作为进行了突变为其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸、并且ph酸性范围下的抗原结合活性比ph中性范围下的抗原结合活性低的抗原结合分子的优选例子，优选可举出例如：突变为其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸后的ph中性范围下的抗原结合活性与突变为其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸前的ph中性范围下的抗原结合活性同等的抗原结合分子。本发明中，突变为其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸后的抗原结合分子具有与突变为其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸前的抗原结合分子同等的抗原结合活性是指，将突变为其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸前的抗原结合分子的抗原结合活性作为100％时，突变为其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸后的抗原结合分子的抗原结合活性为至少10％以上、优选
50％以上、进一步优选80％以上、更优选90％以上。突变为其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸后的ph7.4下的抗原结合活性可以比突变为其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸前的ph7.4下的抗原结合活性变高。通过置换为或插入其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸而使抗原结合分子的抗原结合活性变低时，可以通过抗原结合分子中的1个或多个氨基酸的置换、缺失、添加和/或插入等来使抗原结合活性与其侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的置换或插入前的抗原结合活性同等。本发明中也包括如上述的侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的置换或插入后进行1个或多个氨基酸的置换、缺失、添加和/或插入而使结合活性变得同等的抗原结合分子。
[0289]
进而，抗原结合分子为含有抗体恒定区的物质时，作为ph酸性范围下的抗原结合活性比ph中性范围下的抗原结合活性低的抗原结合分子的优选的其它方式，可举出将抗原结合分子中所含的抗体恒定区进行了改变的方法。作为改变后的抗体恒定区的具体例，优选可举出例如：序列编号：11、12、13、或14所述的恒定区。
[0290]
使抗原结合结构域对抗原的结合活性根据氢离子浓度的条件而发生变化的氨基酸通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可以用任意方法制备，例如，在离子浓度的条件为氢离子浓度的条件或ph条件时，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的b细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库导入侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的突变而得的抗体或文库(侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库或在特定位置导入了侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的突变而成的文库等)等。
[0291]
此外，作为本发明的一个方式，通过将导入有“使抗原结合分子对抗原的结合活性根据氢离子浓度的条件而发生变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，也可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。
[0292]
作为该氨基酸残基的非限定性例子，例示有轻链的cdr1中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性例子，例示有轻链cdr2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性的其它例子，还例示有轻链cdr3中所含的氨基酸残基。
[0293]
如前所述，作为该氨基酸残基为轻链cdr1中所含的氨基酸残基的非限定性例子，可举出：轻链可变区的cdr1中的以kabat编号表示的24位、27位、28位、31位、32位和/或34位的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基为轻链cdr2中所含氨基酸残基的非限定性例子，可举出：轻链可变区的cdr2中的以kabat编号表示的50位、51位、52位、53位、54位、55位和/或56位的氨基酸残基。进而，作为该氨基酸残基为轻链cdr3中所含的氨基酸残基的非限定性例子，可举出：轻链可变区的cdr3中的以kabat编号表示的89位、90位、91位、92位、93位、94位和/或95a位的氨基酸残基。此外，这些氨基酸残基只要可使抗原结合分子对抗原的结合活性根据氢离子浓度的条件而发生变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可以将这些氨基酸二种以上组合含有。
[0294]
在将前述导入有“使抗原结合分子对抗原的结合活性根据氢离子浓度的条件而发生变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合时，和前述相同地，也可以进行设计以使该轻链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要根据氢离子浓度的条件而发生变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方式。即，重链和/或轻链的cdr序列和/或fr序列中可以含有一个或一个以上的柔性残基。例如，作为导入轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性例子，可举出表3或表4所述的氨基酸残基。此外，作为使抗原结合分子对抗原的结合活性根据氢离子浓度的条件而发生变化的氨基酸残基和柔性残基以外的轻链可变区的氨基酸序列，作为非限定性例子优选可使用：vk1(序列编号：5)、vk2(序列编号：6)、vk3(序列编号：7)、vk4(序列编号：8)等生殖细胞系列的序列。
[0295]
[表3](位置表示kabat编号)。
[0296]
[表4](位置表示kabat编号)。
[0297]
作为前述使抗原结合分子对抗原的结合活性根据氢离子浓度的条件而发生变化的氨基酸残基，还可优选使用任意的氨基酸残基，作为这种氨基酸残基，具体可举出侧链的pka为4.0-8.0的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，除了组氨酸或谷氨酸等天然氨基酸之外，优选可例示组氨酸类似物(us2009/0035836)或m-no2-tyr(pka 7.45)、3,5-br2-tyr(pka 7.21)或3,5-i2-tyr(pka 7.38)等非天然氨基酸(bioorg.med.chem.(2003)11(17),3761-2768。此外，作为该氨基酸残基的特别优选的例子，可举出侧链的pka为6.0-7.0的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，优选可例示组氨酸。
[0298]
为了改变抗原结合结构域的氨基酸，可适宜采用位点特异性突变诱导法(kunkel等(proc.natl.acad.sci.usa(1985)82,488-492))或重叠延伸pcr等公知的方法。此外，作为置换为天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸突变方法，还可采用多种公知的方法(annu.rev.biophys.biomol.struct.(2006)35,225-249、proc.natl.acad.sci.u.s.a.(2003)100(11),6353-6357)。还可优选使用例如：包含作为终止密码子之一的uag密码子(琥珀密码子)的互补琥珀抑制物trna上接合有非天然氨基酸而成的trna的无细胞翻译系
统(clover direct(protein express))等。
[0299]
作为进行组合的重链可变区的例子，优选可举出随机可变区文库。随机可变区文库的制作方法适宜组合公知的方法。在本发明的非限定性的一个方式中，基于用特定抗原免疫的动物、感染疾病患者或接种疫苗而使血中抗体效价上升的人、癌患者、自身免疫疾病的淋巴细胞来源的抗体基因构建的免疫文库可优选用作随机可变区文库。
[0300]
此外，在本发明的非限定性的一个方式中，与前述相同地，将基因组dna中的v基因或重构功能性v基因的cdr序列，用包含适当长度的编码密码子组的序列的合成寡核苷酸组置换而成的合成文库也可优选用作随机可变区文库。此时，由于观察到重链的cdr3的基因序列的多样性，因而也可仅置换cdr3的序列。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的基准是，抗原结合分子的露出于表面的位置的氨基酸残基具有多样性。露出于表面的位置是指，基于抗原结合分子的结构、结构总体和/或模型化结构，判断为可以露出于表面和/或可与抗原接触的位置，通常为其cdr。露出于表面的位置优选使用insightii程序(accelrys)之类的计算机程序，使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标来确定。露出于表面的位置可使用本技术领域公知的算法(例如，lee和richards(j.mol.biol.(1971)55,379-400)、connolly(j.appl.cryst.(1983)16,548-558))来确定。露出于表面的位置的确定可使用由适于蛋白质建模的软件和抗体得到的三维结构信息来进行。作为可用于上述目的的软件，优选可举出sybyl biopolymer module软件(tripos associates)。通常或优选地，在算法需要使用者输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。进而，使用个人电脑用软件的露出于表面的区域和面积的确定方法记载于pacios(comput.chem.(1994)18(4),377-386和j.mol.model.(1995)1,46-53)中。
[0301]
进而，在本发明的一个非限定性方式中，由来源于正常人淋巴细胞的抗体基因构建、且其组成成分由不含偏差的抗体序列即天然序列构成的天然文库也可特别优选用作随机可变区文库(gejima等(human antibodies(2002)11,121-129)和cardoso等(scand.j.immunol.(2000)51,337-344))。
[0302]
fcrn与属于免疫球蛋白超级家族的fcγ受体不同，人fcrn在结构上与主要组织相容性复合体(mhc)i类的多肽结构类似，与i类的mhc分子具有22至29％的序列同一性(ghetie等，immunol.today(1997)18(12),592-598)。fcrn表达为异源二聚体，其由与可溶性β或轻链(β2微球蛋白)复合化而成的跨膜α或重链构成。如mhc那样，fcrn的α链包含3个细胞外结构域(α1，α2，α3)，短的细胞质结构域将蛋白质固定于细胞表面。α1和α2结构域与抗体的fc区域中的fcrn结合结构域相互作用(raghavan等(immunity(1994)1,303-315)。
[0303]
fcrn在哺乳动物的母体胎盘或卵黄囊中表达，其参与igg从母体向胎儿的转移。此外，表达有fcrn的啮齿类新生儿的小肠中，fcrn参与母体igg从所摄取的初乳或乳中穿过刷状边缘上皮的移动。fcrn在大量种类的大量的其它组织、以及各种内皮细胞系中表达。其也在人成年血管内皮、肌肉血管系、和肝窦毛细血管中也有表达。fcrn被认为与igg结合，将其再循环至血清中，由此起到维持igg的血浆中浓度的作用。通常，fcrn对igg分子的结合严格地为ph依赖性，最佳结合在小于7.0的ph酸性范围内观察到。
[0304]
以含有序列编号：15所示信号序列的多肽作为前体的人fcrn在机体内(序列编号：16中记载了含有信号序列该多肽)与人β2-微球蛋白形成复合体。如以下参考实施例所示，
与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人fcrn是通过使用通常的重组表达手法来制造的。可以评价本发明的fc区对这种与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人fcrn的结合活性。本发明中，若无特别记载，人fcrn是指能够与本发明的fc区结合的形态，作为例子，可举出人fcrn与人β2-微球蛋白的复合体。
[0305]
fc区fc区包含来源于抗体重链恒定区的氨基酸序列。fc区是以eu编号表示的大约216位氨基酸处作为木瓜蛋白酶酶切位点的铰链区的n末端起、包含该铰链、ch2和ch3结构域的抗体重链恒定区的部分。
[0306]
如前述结合活性一项中所述，对本发明提供的fc区的fcrn、特别是对人fcrn的结合活性可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，对于ph以外的条件，本领域技术人员可以适宜确定。抗原结合分子的抗原结合活性和人fcrn结合活性可以作为kd(dissociation constant：解离常数)、表观kd(apparent dissociation constant：表观解离常数)、解离速度kd(dissociation rate：解离速度)、或表观kd(apparent dissociation：表观解离速度)等来进行评价。它们可通过本领域技术人员公知的方法进行测定。可以使用例如biacore(ge healthcare)、scatchard作图、流式细胞仪等。
[0307]
对于测定本发明的fc区对人fcrn的结合活性时的ph以外的条件，本领域技术人员可以适宜选择，没有特别限定。例如，可以如wo2009125825中所述，在mes缓冲液、37℃的条件下进行测定。此外，本发明的fc区对人fcrn的结合活性的测定可通过本领域技术人员公知的方法来进行，例如，可使用biacore(ge healthcare)等来进行测定。对于本发明的fc区与人fcrn的结合活性的测定，通过使人fcrn或fc区或含有fc区的本发明的抗原结合分子分别作为分析物流过固定有fc区或含有fc区的本发明的抗原结合分子或人fcrn的芯片，可以进行评价。
[0308]
作为本发明的抗原结合分子中所含的fc区具有与fcrn的结合活性的条件的ph中性范围通常意指ph6.7～ph10.0。ph中性范围优选为ph7.0～ph8.0的任意的ph值所示的范围，优选从ph7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、和8.0中选择，特别优选为与机体内的血浆中(血中)的ph接近的ph7.4。ph7.4下的人fcrn结合结构域与人fcrn的结合亲和性低，因而在难以评价该结合亲和性时，可代替ph7.4而采用ph7.0。本发明中，作为具有本发明的抗原结合分子中所含的fc区与fcrn的结合活性的条件的ph酸性范围通常意指ph4.0～ph6.5。优选意指ph5.5～ph6.5，特别优选意指与机体内的早期内体内的ph接近的ph5.8～ph6.0。作为测定条件中使用的温度，人fcrn结合结构域与人fcrn的结合亲和性可以在10℃～50℃的任意温度下进行评价。优选地，为确定人fcrn结合结构域与人fcrn的结合亲和性而采用15℃～40℃的温度。更优选地，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、和35℃中的任一温度的20℃至35℃的任意温度也同样地用于确定人fcrn结合结构域与人fcrn的结合亲和性。25℃的温度是本发明的方式的非限定性的一例。
[0309]
根据the journal of immunology(2009)182:7663-7671，天然型人igg1的人fcrn结合活性在ph酸性范围(ph6.0)下为kd 1.7μm，在ph中性范围下基本不能检测出活性。所以，在优选的方式中，可以筛选在ph酸性范围和ph中性范围下具有人fcrn结合活性的本发明的抗原结合分子，其包含ph酸性范围下的人fcrn结合活性为kd 20μm或较其更强、ph中性范围下的人fcrn结合活性与天然型人igg同等或较其更强的抗原结合分子。在更优选的方
式中，可以筛选本发明的抗原结合分子，其包含ph酸性范围下的人fcrn结合活性为kd 2.0μm或较其更强、ph中性范围下的人fcrn结合活性为kd 40μm或较其更强的抗原结合分子。在进一步更优选的方式中，可以筛选本发明的抗原结合分子，其包含ph酸性范围下的人fcrn结合活性为kd 0.5μm或较其更强、ph中性范围下的人fcrn结合活性为kd 15μm或较其更强的抗原结合分子。上述kd值通过the journal of immunology(2009)182:7663-7671中记载的方法(将抗原结合分子固定于芯片、并流过作为分析物的人fcrn)来确定。
[0310]
本发明中，在ph酸性范围和ph中性范围下具有人fcrn结合活性的fc区是优选的。该结构域只要是预先在ph酸性范围和ph中性范围下就具有人fcrn结合活性的fc区，则可以直接使用。该结构域在ph酸性范围和/或ph中性范围下没有人fcrn结合活性或者该活性弱时，可以通过改变抗原结合分子中的氨基酸来获得具有所期望的人fcrn结合活性的fc区，但通过改变人fc区中的氨基酸也可以适宜地获得在ph酸性范围和/或ph中性范围下具有所期望的人fcrn结合活性的fc区。此外，通过对预先在ph酸性范围和/或ph中性范围下就具有人fcrn结合活性的fc区中的氨基酸进行改变，也可以获得具有所期望的人fcrn结合活性的fc区。这种带来所期望的结合活性的人fc区的氨基酸改变可通过对氨基酸改变前和改变后的ph酸性范围和/或ph中性范围下的人fcrn结合活性进行比较来发现。本领域技术人员使用公知的手法可以适时合适的氨基酸改变。
[0311]
本发明中，fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变为与起始fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。起始fc区的修饰改变体只要在ph酸性范围下可以与人fcrn结合(故起始fc区并不一定需要ph中性范围条件下的人fcrn结合活性)，则任意的fc区均可用作起始结构域。作为起始fc区的例子，优选可举出igg抗体的fc区、即天然型的fc区。此外，将已经施加了改变的fc区作为起始fc区再加以进一步改变而成的改变fc区也可作为本发明的改变fc区适宜使用。起始fc区可以意指多肽本身、含有起始fc区的组合物、或编码起始fc区的氨基酸序列。起始fc区可以包含已在抗体一项中简介了的通过重组产生的公知的igg抗体的fc区。起始fc区的起源没有限定，可以由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，优选可举出选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、和非人灵长类中的生物。在其他方式中，起始fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩、或人中获得。起始fc区优选可由人igg1获得，但并不限于igg的特定亚型。这意味着可以适宜使用人igg1、igg2、igg3、或igg4的fc区来作为起始fc区。同样地，本说明书中也意指可以将来源于前述任意生物的igg的任意种类或亚型的fc区优选用作起始fc区。天然存在的igg的变体或修饰型的例子记载于公知文献(curr.opin.biotechnol.(2009)20(6),685-91、curr.opin.immunol.(2008)20(4),460-470、protein eng.des.sel.(2010)23(4),195-202、wo2009/086320、wo2008/092117、wo2007/041635、和wo2006/105338)中，但并不受其限定。
[0312]
作为改变的例子，包括一个以上的突变，例如，置换为与起始fc区的氨基酸不同的氨基酸残基的突变、或对起始fc区的氨基酸插入一个以上的氨基酸残基或从起始fc区的氨基酸中缺失一个以上的氨基酸等。优选地，改变后的fc区的氨基酸序列中包含含非天然产生的fc区的至少一部分的氨基酸序列。这种变种必然与起始fc区具有小于100％的序列同一性或相似性。在优选的实施方式中，变种具有与起始fc区的氨基酸序列为约75％～小于100％的氨基酸序列同一性或相似性、更优选约80％～小于100％、更优选约85％～小于
100％、更优选约90％～小于100％、最优选约95％～小于100％的同一性或相似性的氨基酸序列。在本发明的非限定的一个方式中，起始fc区和本发明的经改变fc区之间具有至少1个氨基酸的差异。起始fc区和改变fc区的氨基酸的差异也可以通过特别是前述eu编号所指定的氨基酸残基的位置所特定的氨基酸的不同而适宜地指定。
[0313]
为了改变fc区的氨基酸，可适宜采用位点特异性突变诱导法(kunkel等(proc.natl.acad.sci.usa(1985)82,488-492))或重叠延伸pcr等公知的方法。此外，作为置换为天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸突变方法，还可采用多种公知的方法(annu.rev.biophys.biomol.struct.(2006)35,225-249、proc.natl.acad.sci.u.s.a.(2003)100(11),6353-6357)。还可优选使用例如：包含作为终止密码子之一的uag密码子(琥珀密码子)的互补琥珀抑制物trna上接合有非天然氨基酸而成的trna的无细胞翻译系统(clover direct(protein express))等。
[0314]
本发明的抗原结合分子中所含的ph中性范围下具有人fcrn结合活性的fc区可以通过任意的方法获得，具体地，可通过改变用作起始fc区的人igg型免疫球蛋白的氨基酸来获得在ph中性范围下具有人fcrn结合活性的fc区。作为用于改变的优选的igg型免疫球蛋白的fc区，可举出例如人igg(igg1、igg2、igg3、或igg4、和它们的改变体)的fc区。对于改变为其它的氨基酸，只要ph中性范围下具有人fcrn结合活性、或者在中性范围下可提高人fcrn结合活性，则任意位置的氨基酸均可改变。在抗原结合分子含有人igg1的fc区来作为作为人fc区时，优选包含下述改变，该改变带来ph中性范围下的人fcrn结合较人igg1的起始fc区的结合活性增强的效果。作为能实现上述改变的氨基酸，可举出例如，eu编号221位～225位、227位、228位、230位、232位、233位～241位、243位～252位、254位～260位、262位～272位、274位、276位、278位～289位、291位～312位、315位～320位、324位、325位、327位～339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375位～378位、380位、382位、385位～387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426位～438位、440位和442位的位置的氨基酸。更具体地，可举出例如表5所述的氨基酸的改变。通过这些氨基酸的改变，igg型免疫球蛋白的fc区在ph中性范围下对人fcrn的结合被增强。
[0315]
为了在本发明中使用，这些改变之中，适宜选择在ph中性范围下对人fcrn的结合也增强的改变。作为特别优选的fc区改变体的氨基酸，可举出例如以eu编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位和436位的氨基酸。通过将选自这些氨基酸中的至少1个氨基酸置换为其它的氨基酸，可以增强抗原结合分子中所含的fc区在ph中性范围下对人fcrn的结合活性。
[0316]
作为特别优选的改变，可举出例如，fc区的以eu编号表示的237位的氨基酸改变为met、248位的氨基酸改变为ile、250位的氨基酸改变为ala、phe、ile、met、gln、ser、val、trp、或tyr中的任一者、252位的氨基酸改变为phe、trp、或tyr中的任一者、254位的氨基酸改变为thr、255位的氨基酸改变为glu、
256位的氨基酸改变为asp、asn、glu、或gln中的任一者、257位的氨基酸改变为ala、gly、ile、leu、met、asn、ser、thr、或val中的任一者、258位的氨基酸改变为his、265位的氨基酸改变为ala、286位的氨基酸改变为ala或glu中的任一者、289位的氨基酸改变为his、297位的氨基酸改变为ala、303位的氨基酸改变为ala、305位的氨基酸改变为ala、307位的氨基酸改变为ala、asp、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、val、trp、或tyr中的任一者、308位的氨基酸改变为ala、phe、ile、leu、met、pro、gln、或thr中的任一者、309位的氨基酸改变为ala、asp、glu、pro、或arg中的任一者、311位的氨基酸改变为ala、his、或ile中的任一者、312位的氨基酸改变为ala或his中的任一者、314位的氨基酸改变为lys或arg中的任一者、315位的氨基酸改变为ala、asp或his中的任一者、317位的氨基酸改变为ala、332位的氨基酸改变为val、334位的氨基酸改变为leu、360位的氨基酸改变为his、376位的氨基酸改变为ala、380位的氨基酸改变为ala、382位的氨基酸改变为ala、384位的氨基酸改变为ala、385位的氨基酸改变为asp或his中的任一者、386位的氨基酸改变为pro、387位的氨基酸改变为glu、389位的氨基酸改变为ala或ser中的任一者、424位的氨基酸改变为ala、428位的氨基酸改变为ala、asp、phe、gly、his、ile、lys、leu、asn、pro、gln、ser、thr、val、trp、或tyr中的任一者、433位的氨基酸改变为lys、434位的氨基酸改变为ala、phe、his、ser、trp、或tyr中的任一者、和436位的氨基酸改变为his、ile、leu、phe、thr、或val。此外，进行改变的氨基酸的数目没有特别限定，可以仅改变一个位置的氨基酸，也可以改变二个位置以上的氨基酸。作为二个位置以上的氨基酸的改变的组合，可举出例如表6中记载的组合。
[0317]
抗原结合分子本发明中，抗原结合分子以表示包含抗原结合结构域和fc区的分子的最为广义的
形式使用，具体地，只要其显示抗原结合活性，则包括各种分子类型。例如，作为抗原结合结构域与fc区结合的分子的例子，可举出抗体。抗体可包含单一的单克隆抗体(包含激动剂和拮抗剂抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。另外在以抗体片段的形式使用时，优选可举出抗原结合结构域和抗原结合片段(例如，fab、f(ab')2、scfv和fv)。将现有的稳定的α/β桶蛋白结构等立体结构用作scaffold(支架)，仅将其一部分结构进行文库化用于构建抗原结合结构域的scaffold分子也可以包含在本发明的抗原结合分子中。
[0318]
本发明的抗原结合分子可以含有介导对fcrn的结合和对fcγ受体的结合的fc区的至少一部分。例如，在非限定的一个方式中，抗原结合分子可以是抗体或fc融合蛋白。融合蛋白是指包含多肽的嵌合多肽，该多肽含有与具有天然中其无法自然连接的第二氨基酸序列的多肽连接的第一氨基酸序列。例如，融合蛋白可包含：编码fc区的至少一部分(例如，赋予对fcrn的结合的fc区的部分或者赋予对fcγ受体的结合的fc区的部分)的氨基酸序列、和含有例如编码受体的配体结合结构域或配体的受体结合结构域的氨基酸序列的非免疫球蛋白多肽。氨基酸序列可以存在于一起运送至融合蛋白的各个蛋白中、或它们通常可存在于同一蛋白中，参加融合多肽中的新的重组。融合蛋白可通过例如化学合成制得、或者可通过制作肽区域以所期望的关系被编码的多核苷酸并将其表达的基因重组方法制得。
[0319]
本发明的各结构域可通过多肽结合直接直接连接，也可通过接头连接。作为接头，可使用能通过基因工程导入的任意的肽接头、或合成化合物接头(例如，protein engineering(1996)9(3),299-305)中公开的接头等，本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可根据需要适宜选择，优选的长度为5氨基酸以上(上限没有特别限定，通常为30氨基酸以下、优选20氨基酸以下)，特别优选为15氨基酸。
[0320]
例如，肽接头的情形优选可举出：sergly
·
sergly
·
gly
·
serser
·
gly
·
glygly
·
gly
·
gly
·
ser(序列编号：17)ser
·
gly
·
gly
·
gly(序列编号：18)gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列编号：19)ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列编号：20)gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列编号：21)ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
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gly(序列编号：22)gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
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gly
·
ser(序列编号：23)ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列编号：24)(gly
·
gly
·
gly
·
gly
·
ser(序列编号：19))n(ser
·
gly
·
gly
·
gly
·
gly(序列编号：20))n[n为1以上的整数]等。其中，本领域技术人员可根据需要适宜选择肽接头的长度或序列。
[0321]
合成化学物接头(化学交联剂)是肽的交联中通常所用的交联剂，例如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、二琥珀酰亚胺基辛二酸盐(dss)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸盐(bs3)、二
硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸盐)(dsp)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸盐)(dtssp)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸盐)(egs)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸盐)(磺基-egs)、二琥珀酰亚胺基酒石酸盐(dst)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸盐(磺基-dst)、双[2-(琥珀酰亚胺基氧基碳酰氧基)乙基]砜(bsocoes)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺基氧基碳酰氧基)乙基]砜(
スルホ‑
bsocoes)等，这些交联剂有市售。
[0322]
连接各结构域的接头使用多个时，可以全部使用同种类的接头，也可以使用不同种类的接头。
[0323]
此外，除了上述记载所例示的接头之外，还可适宜使用具有例如his标签、ha标签、myc标签、flag标签等肽标签的接头。此外，也可适宜利用氢键、二硫键、共价键、离子性相互作用或通过它们的组合而相互结合的性质。例如，可利用抗体的ch1与cl间的亲和性，或者在异源fc区的缔合时利用来源于前述双特异性抗体的fc区。进而，还可适宜地利用形成于结构域间的二硫键。
[0324]
为了将各结构域用肽键连接，将编码该结构域的多核苷酸框内(in frame)连接。作为将多核苷酸框内连接的方法，公知有限制片段的连接、融合pcr、重叠pcr等，本发明的抗原结合分子的制作中也可以适宜将这些方法单独或组合使用。本发明中，术语“被连接”、“被融合”、“连接”或“融合”可以相互交换使用。这些术语是指通过包括上述化学结合手段或重组手法的所有手段将二个以上的多肽等元素或成分连接以形成一个结构。在二个以上的元素或成分是多肽时，框内融合是指二个以上的阅读框的单元的连接，用于形成以维持该多肽的正确阅读框的方式连接得到的更长的阅读框。二分子的fab用作抗原结合结构域时，该抗原结合结构域和fc区不通过接头而通过肽结合进行框内连接得到的作为本发明的抗原结合分子的抗体可以作为本技术的优选抗原结合分子来使用。
[0325]
fcγ受体fcγ受体(也记载为fcγr)是指可以与igg1、igg2、igg3、igg4单克隆抗体的fc区结合的受体，实质上意指fcγ受体基因所编码的蛋白家族的任一成员。对于人来说，该家族包括：包含同种型fcγria、fcγrib和fcγric的fcγri(cd64)；包含同种型fcγriia(包含异型h131和r131)、fcγriib(包含fcγriib-1和fcγriib-2)和fcγriic的fcγrii(cd32)；和包含同种型fcγriiia(包含异型v158和f158)和fcγriiib(包含异型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)的fcγriii(cd16)、以及任意的未发现的人fcγr类或fcγr同种型或异型，但并不限定于此。fcγr可来源于任意的生物，包括人、小鼠、大鼠、兔和猴，但并不限定于此。小鼠fcγr类中包括：fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)和fcγriii-2(fcγriv、cd16-2)、以及任意的未发现的小鼠fcγr类或fcγr同种型或异型，但并不限定于此。作为这种fcγ受体的优选例子，可举出：人fcγri(cd64)、fcγriia(cd32)、fcγriib(cd32)、fcγriiia(cd16)和/或fcγriiib(cd16)。人fcγri的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于序列编号：25(nm_000566.3)和26(np_000557.1)中；人fcγriia(异型h131)的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于序列编号：27(bc020823.1)和28(aah20823.1)(异型r131是序列编号：28的166位的氨基酸被置换为arg的序列)中；fcγriib的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于序列编号：29(bc146678.1)和30(aai46679.1)中；fcγriiia的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于序列编号：31(bc033678.1)和32(aah33678.1)中；和fcγriiib的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载
于序列编号：33(bc128562.1)和34(aai28563.1)中(括号内示出refseq登录编号)。例如参考实施例27等中在使用异型v158时表述为fcγriiiav，若无特别说明则使用异型f158，但本技术中记载的同种型fcγriiia的异型并不特别限定来解释。fcγ受体对igg1、igg2、igg3、igg4单克隆抗体的fc区是否具有结合活性，可通过、除了上述记载的facs或elisa形式之外，还可通过alpha筛选(amplified luminescent proximity homogeneous assay)或利用了表面等离子共振(spr)现象的biacore法等来确认(proc.natl.acad.sci.usa(2006)103(11),4005-4010)。
[0326]
此外，“fc配体”或“效应器配体”意指与抗体的fc区结合而形成fc/fc配体复合体的、来源于任意生物的分子、优选多肽。fc配体对fc的结合优选诱发1个或1个以上的效应器功能。fc配体包括：fc受体、fcγr、fcαr、fcεr、fcrn、c1q、c3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌的蛋白a、葡萄球菌的蛋白g和病毒的fcγr，但并不限定于此。fc配体还包括作为与fcγr同源的fc受体家族的fc受体同源体(fcrh)(davis et al.,(2002)immunological reviews 190,123-136)。fc配体还可包括与fc结合的未发现的分子。
[0327]
包括fcγria、fcγrib和fcγric的fcγri(cd64)以及包括同种型fcγriiia(含有异型v158和f158)和fcγriiib(含有异型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)的fcγriii(cd16)中，与igg的fc部分结合的α链和具有在细胞内传导活化信号的itam的共有γ链缔合。另一方面，包括同种型fcγriia(含有异型h131和r131)和fcγriic的fcγrii(cd32)自身的细胞质结构域中含有itam。这些受体表达于巨噬细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞等众多免疫细胞中。通过这些受体与igg的fc部分结合而传递的活化信号使得巨噬细胞吞噬能力、炎症性细胞因子的产生、肥大细胞的脱粒、抗原呈递细胞的功能亢进受到促进。如上所述，具有传导活化信号能力的fcγ受体在本发明中也称为活性型fcγ受体。
[0328]
另一方面，fcγriib(包含fcγriib-1和fcγriib-2)自身的细胞质内结构域中含有传递抑制型信号的itim。b细胞中，fcγriib和b细胞受体(bcr)的交联使得来自bcr的活化信号受到抑制，结果bcr的抗体产生受到抑制。巨噬细胞中，fcγriii与fcγriib的交联使得吞噬能力和炎症性细胞因子的产生能力受到抑制。如上所述，具有传导抑制信号能力的fcγ受体在本发明中也称为抑制型fcγ受体。
[0329]
alpha筛选是通过使用供体和受体这2种珠的alpha技术，基于下述原理来实施的。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子发生生物学相互作用，仅在2种珠接近的状态时检测出发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周围的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散至供体珠周围，到达接近的受体珠时，引起珠内的化学发光反应，最终发出光。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不会到达受体珠，因而不会引起化学发光反应。
[0330]
例如，将含有经生物素标记的fc区的抗原结合分子与供体珠结合，将经谷胱甘肽s转移酶(gst)标签化的fcγ受体与受体珠结合。在包含竞争fc区改变体的抗原结合分子的非存在下，具有野生型fc区的多肽复合体和fcγ受体发生相互作用而产生520-620nm的信号。含有未经标签化的fc区改变体的抗原结合分子与具有天然型fc区的抗原结合分子竞争与fcγ受体间的相互作用。通过对反映竞争结果的荧光的减少进行定量，可以确定相对结合亲和性。使用sulfo-nhs-生物素等来将抗体等抗原结合分子生物素化是公知的。作为用gst将fcγ受体标签化的方法，可适宜地采用下述方法：将编码fcγ受体的多核苷酸和编码
gst的多核苷酸进行框内融合而成的融合基因可作用地与载体连接，在保持有该载体的细胞等中进行表达，使用谷胱甘肽柱来进行纯化。所得的信号可以通过使用例如graphpad prism(graphpad社、san diego)等软件，与利用非线性回归分析的单位点竞争(one-site competition)模型拟合而适宜地分析。
[0331]
将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上，若从传感器芯片的背侧接受光以使在金薄膜和玻璃的界面发生全反射，则反射光的一部分会形成反射强度降低的部分(spr信号)。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)加载于传感器芯片的表面，配体和分析物若结合，则固定化配体分子的质量会增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率会发生变化。由于该折射率的变化，spr信号的位置发生偏移(相反，若结合发生解离则信号的位置会返回)。biacore系统将上述偏移的量、即传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据表示(传感图)。由传感图的曲线可求出动力学参数：结合速度常数(ka)和解离速度常数(kd)，由此该常数之比可求出亲和性(kd)。biacore法中还优选使用抑制测定法。抑制测定法的例子记载在proc.natl.acad.sci.usa(2006)103(11),4005-4010中。
[0332]
包含两分子的fcrn和一分子的活性型fcγ受体这四者的异源复合体通过fcrn和igg抗体的结晶学研究，认为fcrn-igg复合体是由一分子的igg对两分子的fcrn而构成，在位于igg的fc区两侧的ch2和ch3结构域的接触面附近，发生二分子的结合(burmeister等(nature(1994)372,336-343)。另一方面，如后述实施例3中所确认，明确了抗体的fc区可以形成包含两分子的fcrn和一分子的活性型fcγ受体这四者的复合体(图48)。该异源复合体的形成是对包含在ph中性范围条件下具有fcrn结合活性的fc区的抗原结合分子的性质进行分析并由所得结果明确的现象。
[0333]
本发明并不受特定原理的束缚，但认为通过包含抗原结合分子中所含的fc区与两分子的fcrn和一分子的活性型fcγ受体这四者的异源复合体的形成，会对在将抗原结合分子给予至机体内时的抗原结合分子在该机体内的药代动力学(血浆中滞留性)、以及相对于被给予抗原结合分子的免疫应答(免疫原性)带来如下所述的影响。如上所述，免疫细胞上除了各种活性型fcγ受体之外还表达有fcrn，抗原结合分子在免疫细胞上形成这种四者复合体则暗示会使对免疫细胞的亲和性提高，进而使细胞内结构域缔合而增强内在化信号，并促进向免疫细胞中的摄入。抗原呈递细胞中也同样，暗示了通过在抗原呈递细胞的细胞膜上形成四者复合体，使得抗原结合分子可以容易地被摄入抗原呈递细胞。通常，被摄入抗原呈递细胞中的抗原结合分子在抗原呈递细胞内的溶酶体中被分解，被呈递至t细胞。结果，由于在抗原呈递细胞的细胞膜上形成上述的四者复合体，抗原呈递细胞对抗原结合分子的摄入得到促进，也有可能使抗原结合分子的血浆中滞留性变差。同样地，也可能诱发免疫应答(变差)。
[0334]
因此，可以认为在将形成这种四者复合体的能力降低的抗原结合分子给予机体时，该抗原结合分子的血浆中滞留性提高，该机体的免疫应答的诱发得到抑制。作为这种抑制包含抗原呈递细胞的免疫细胞上的该复合体的形成的抗原结合分子的优选方式，可举出以下三种。
[0335]
(方式1)包含下述fc区的抗原结合分子，该fc区具有ph中性范围的条件下的fcrn结合活性、且对活性型fcγr的结合活性比天然型fc区对活性型fcγr的结合活性低。
[0336]
方式1的抗原结合分子通过与两分子的fcrn结合而形成三者复合体，但不形成包含活性型fcγr的复合体(图49)。对活性型fcγr的结合活性比天然型fc区对活性型fcγr的结合活性低的fc区可通过如上所述对天然型fc区的氨基酸进行改变来制作。改变fc区对活性型fcγr的结合活性是否比天然型fc区对活性型fcγr的结合活性低可使用前述结合活性一项中所述的方法来适宜实施。
[0337]
作为活性型fcγ受体，优选可举出：包含fcγria、fcγrib和fcγric的fcγri(cd64)、包含fcγriia(包含异型r131和h131)以及同种型fcγriiia(包含异型v158和f158)和fcγriiib(包含异型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)的fcγriii(cd16)。
[0338]
测定本发明的抗原结合分子中所含的fc区和fcγ受体的结合活性的ph条件可适宜采用ph酸性范围或ph中性范围条件。作为测定本发明的抗原结合分子中所含的fc区和fcγ受体的结合活性的条件的ph中性范围，通常意指ph6.7～ph10.0。优选为ph7.0～ph8.0的任意的ph值所示的范围，优选从ph7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、和8.0中选择，特别优选为与机体内的血浆中(血中)的ph接近的ph7.4。本发明中，作为具有本发明的抗原结合分子中所含的fc区与fcγ受体的结合活性的条件的ph酸性范围，通常意指ph4.0～ph6.5。优选意指ph5.5～ph6.5，特别优选意指与机体内的早期内体内的ph接近的ph5.8～ph6.0。作为测定条件中使用的温度，fc区与人fcγ受体的结合亲和性可在10℃～50℃的任意温度下进行评价。优选地，为了确认人fc区与fcγ受体的结合亲和性而采用15℃～40℃的温度。更优选地，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、和35℃中的任一温度的20℃至35℃的任意温度也同样地用于确定fc区与fcγ受体的结合亲和性。25℃的温度是本发明的方式的非限定性的一例。
[0339]
本说明书中，fc区改变体对活性型fcγ受体的结合活性比天然型fc区对活性型fcγ受体的结合活性低是指，fc区改变体的fcγri、fcγriia、fcγriiia和/或fcγriiib中的任一者对人fcγ受体的结合活性比天然型fc区对这些人fcγ受体的结合活性低。例如，是指基于上述分析方法，与包含作为对照的天然型fc区的抗原结合分子的结合活性相比，包含fc区改变体的抗原结合分子的结合活性显示为95％以下、优选90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、特别优选70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下的结合活性。作为天然型fc区，可以使用起始fc区，也可以使用野生型抗体的不同同种型的fc区。
[0340]
此外，天然型对活性型fcγr的结合活性优选为人igg1对fcγ受体的结合活性，为了降低对fcγ受体的结合活性，除了上述改变以外，还可通过对人igg2、人igg3、人igg4改变同种型来实现。此外，除了上述改变以外，通过用大肠杆菌等不添加糖链的宿主来表达包含具有fcγ受体结合活性的fc区的抗原结合分子，也可以降低对fcγ受体的结合活性。
[0341]
作为包含作为对照的fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有igg单克隆抗体的fc区的抗原结合分子。该fc区的结构记载于：序列编号：1(refseq登录编号aac82527.1的n末端添加有a)、2(refseq登录编号aab59393.1的n末端添加有a)、3(refseq登录编号caa27268.1)、4(refseq登录编号aab59394.1的n末端添加有a)中。此外，将含有某特定同种型的抗体的fc区的抗原结合分子用作被检物质时，通过将具有该特定同种型的igg单克隆抗体的fc区的抗原结合分子用作对照，可验证含有该fc区的抗原结合分子对fcγ受体的结
合活性的效果。如上所述，适宜选择包含对fcγ受体的结合活性高得到验证的fc区的抗原结合分子。
[0342]
在本发明的非限定的一个方式中，作为对活性型fcγr的结合活性比天然型fc区对活性型fcγr的结合活性低的fc区的例子，优选可举出前述fc区的氨基酸中以eu编号表示的234、235、236、237、238、239、270、297、298、325、328、和329中的任意一个以上的氨基酸被改变为与天然型fc区不同的氨基酸的fc区，但fc区的改变并不限于上述改变，也可以是例如current opinion in biotechnology(2009)20(6),685-691中记载的脱糖链(n297a,n297q)、igg1-l234a/l235a、igg1-a325a/a330s/p331s、igg1-c226s/c229s、igg1-c226s/c229s/e233p/l234v/l235a、igg1-l234f/l235e/p331s、igg1-s267e/l328f、igg2-v234a/g237a、igg2-h268q/v309l/a330s/a331s、igg4-l235a/g237a/e318a、igg4-l236e等的改变、和wo 2008/092117中记载的g236r/l328r、l235g/g236r、n325a/l328r、n325ll328r等的改变、和eu编号233位、234位、235位、237位的氨基酸的插入、wo 2000/042072中记载的位置的改变。
[0343]
此外，在本发明的非限定的一个方式中，优选可举出下述fc区，其包括前述fc区的以eu编号表示的氨基酸的下述任一者以上的改变：将234位的氨基酸改变为ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、lys、met、phe、pro、ser、thr或trp中的任一者、将235位的氨基酸改变为ala、asn、asp、gln、glu、gly、his、ile、lys、met、pro、ser、thr、val或arg中的任一者、将236位的氨基酸改变为arg、asn、gln、his、leu、lys、met、phe、pro或tyr中的任一者、将237位的氨基酸改变为ala、asn、asp、gln、glu、his、ile、leu、lys、met、pro、ser、thr、val、tyr或arg中的任一者、将238位的氨基酸改变为ala、asn、gln、glu、gly、his、ile、lys、thr、trp或arg中的任一者、将239位的氨基酸改变为gln、his、lys、phe、pro、trp、tyr或arg中的任一者、将265位的氨基酸改变为ala、arg、asn、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、将266位的氨基酸改变为ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、lys、phe、pro、ser、thr、trp或tyr中的任一者、将267位的氨基酸改变为arg、his、lys、phe、pro、trp或tyr中的任一者、将269位的氨基酸改变为ala、arg、asn、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、将270位的氨基酸改变为ala、arg、asn、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、将271位的氨基酸改变为arg、his、phe、ser、thr、trp或tyr中的任一者、将295位的氨基酸改变为arg、asn、asp、gly、his、phe、ser、trp或tyr中的任一者、将296位的氨基酸改变为arg、gly、lys或pro中的任一者、将297位的氨基酸改变为ala、
将298位的氨基酸改变为arg、gly、lys、pro、trp或tyr中的任一者、将300位的氨基酸改变为arg、lys或pro中的任一者、将324位的氨基酸改变为lys或pro中的任一者、将325位的氨基酸改变为ala、arg、gly、his、ile、lys、phe、pro、thr、trptyr、或val中的任一者、将327位的氨基酸改变为arg、gln、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、将328位的氨基酸改变为arg、asn、gly、his、lys或pro中的任一者、将329位的氨基酸改变为asn、asp、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、ser、thr、trp、tyr、val或arg中的任一者、将330位的氨基酸改变为pro或ser中的任一者、将331位的氨基酸改变为arg、gly或lys中的任一者、或将332位的氨基酸改变为arg、lys或pro中的任一者。
[0344]
(方式2)包含下述fc区的抗原结合分子，该fc区具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且对抑制型fcγr的结合活性比对活性型fcγ受体的结合活性高。
[0345]
方式2的抗原结合分子可通过与两分子的fcrn和一分子的抑制型fcγr结合而形成含有它们四者的复合体。然而，由于一分子的抗原结合分子只能与一分子的fcγr结合，因而一分子的抗原结合分子在与抑制型fcγr结合的状态下无法与其它活性型fcγr结合(图50)。进而据报道，在与抑制型fcγr结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子会被再循环至细胞膜上、从而避免细胞内的分解(immunity(2005)23,503-514)。即，可认为具有针对抑制型fcγr的选择结合活性的抗原结合分子无法形成包含作为免疫应答原因的活性型fcγr和两分子的fcrn的异源复合体。
[0346]
作为活性型fcγ受体，优选可举出：包含fcγria、fcγrib和fcγric的fcγri(cd64)、包含fcγriia(包含异型r131和h131)以及同种型fcγriiia(包含异型v158和f158)和fcγriiib(包含异型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)的fcγriii(cd16)。此外，可举出fcγriib(包含fcγriib-1和fcγriib-2)作为抑制型fcγ受体的优选例。
[0347]
本说明书中，对抑制型fcγr的结合活性比对活性型fcγ受体的结合活性高是指，fc区改变体对fcγriib的结合活性比对fcγri、fcγriia、fcγriiia和/或fcγriiib中的任一人fcγ受体的结合活性高。例如，是指基于上述分析方法，包含fc区改变体的抗原结合分子对fcγriib的结合活性显示为对fcγri、fcγriia、fcγriiia和/或fcγriiib中的任一人fcγ受体的结合活性的105％以上、优选110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、特别优选150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％％以上、250％以上、300％以上、350％以上、400％以上、450％以上、500％以上、750％以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上的结合活性。
[0348]
最优选的是对fcγriib的结合活性比对fcγria、fcγriia(包含异型r131和h131)和fcγriiia(包含异型v158和f158)的结合活性都高。fcγria对天然型igg1的亲和性极高，因而认为在机体内大量的内源性igg1使得结合达到饱和，所以认为即使对fcγriib的结合活性比对fcγriia和fcγriiia的高、比对fcγria的低，也可能抑制该复合体的形成。
[0349]
作为包含作为对照的fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有igg单克隆抗体的fc区的抗原结合分子。该fc区的结构记载于：序列编号：11(refseq登录编号aac82527.1的n末端添加有a)、12(refseq登录编号aab59393.1的n末端添加有a)、13(refseq登录编号caa27268.1)、14(refseq登录编号aab59394.1的n末端添加有a)中。此外，将含有某特定同种型的抗体的fc区的抗原结合分子用作被检物质时，通过将具有该特定同种型的igg单克隆抗体的fc区的抗原结合分子用作对照，可验证含有该fc区的抗原结合分子对fcγ受体的结合活性的效果。如上所述，适宜选择包含对fcγ受体的结合活性高得到验证的fc区的抗原结合分子。
[0350]
在本发明的非限定的一个方式中，作为具有针对抑制型fcγr的选择结合活性的fc区的例子，优选可举出前述fc区的氨基酸中以eu编号表示的238或328位氨基酸被改变为与天然型fc区不同的氨基酸的fc区。此外，作为具有针对抑制型fcγ受体的选择结合活性的fc区，可以适宜选择us 2009/0136485中记载的fc区或改变。
[0351]
另外，在本发明的非限定的一个方式中，优选可举出下述fc区，该fc区包含前述fc区的以eu编号表示的氨基酸的下述任一者以上的改变：以eu编号表示的238的氨基酸改变为asp、或328的氨基酸改变为glu。
[0352]
进而，在本发明的非限定的一个方式中，优选可举出下述fc区，该fc区包括下述任一者以上的改变：以eu编号表示的238位为pro置换为asp、和以eu编号表示的237位的氨基酸置换为trp、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为phe、以eu编号表示的267位的氨基酸置换为val、以eu编号表示的267位的氨基酸置换为gln、以eu编号表示的268位的氨基酸置换为asn、以eu编号表示的271位的氨基酸置换为gly、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为leu、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为gln、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为glu、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为met、以eu编号表示的239位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的267位的氨基酸置换为ala、以eu编号表示的234位的氨基酸置换为trp、以eu编号表示的234位的氨基酸置换为tyr、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为ala、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为glu、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为leu、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为met、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为tyr、以eu编号表示的330位的氨基酸置换为lys、以eu编号表示的330位的氨基酸置换为arg、以eu编号表示的233位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的268位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的268位的氨基酸置换为glu、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为ser、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为thr、以eu编号表示的323位的氨基酸置换为ile、以eu编号表示的323位的氨基酸置换为leu、以eu编号表示的323位的氨基酸置换为met、以eu编号表示的296位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为ala、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为asn、以eu编号表示的330位的氨基酸置换为met。
[0353]
(方式3)包含下述fc区的抗原结合分子，其中，构成fc区的二个多肽的一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性，另一方不具有ph中性范围条件下的fcrn结合能力活性。
[0354]
方式3的抗原结合分子能够通过与一分子的fcrn与一分子的fcγr结合而形成三者复合体，但不会形成包含两分子的fcrn和一分子的fcγr的四者的异源复合体(图51)。作
为本方式3的抗原结合分子中所含的、构成fc区的二个多肽的一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、另一多肽不具有ph中性范围条件下的fcrn结合能力活性的fc区，还可适宜使用来源于双特异性抗体(bispecific抗体)的fc区。双特异性抗体是指具有针对不同抗原的特异性的二种抗体。igg型的双特异性抗体可由杂交杂交瘤(quadroma)分泌出，所述杂交杂交瘤通过对产生igg抗体的二种杂交瘤进行融合而得(milstein等(nature(1983)305,537-540)。
[0355]
上述方式3的抗原结合分子通过使用前述抗体一项中记载的重组手法来制造时，可以采用下述方法，其中，将编码构成二种目标fc区的多肽的基因导入细胞，并使它们共表达。然而，制造的fc区成为构成fc区的二个多肽的一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、另一多肽不具有ph中性范围条件下的fcrn结合能力活性的fc区，与构成fc区的二个多肽的双方均具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的fc区，与构成fc区的二个多肽双方均不具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的fc区以2：1：1的分子数比例存在的混合物。难以由3种igg纯化包含目标组合的fc区的抗原结合分子。
[0356]
使用这种重组手法制造方式3的抗原结合分子时，通过对构成fc区的ch3结构域施加适当的氨基酸置换的改变，可以优先分泌出包含异源组合的fc区的抗原结合分子。具体地，该方法是将一重链ch3结构域中存在的氨基酸侧链置换为较大的侧链(knob(“突起”的意思))，将另一重链ch3结构域中存在的氨基酸侧链置换为较小的侧链(hole(“空隙”的意思))，由此使突起可配置于空隙内，引起异种h链形成的促进和同种h链形成的抑制(wo1996027011、ridgway等(protein engineering(1996)9,617-621)、merchant等(nat.biotech.(1998)16,677-681))。
[0357]
此外，通过将多肽的缔合、或由多肽构成的异种多聚体的缔合的控制方法用于构成fc区的二个多肽的缔合来制作双特异性抗体的技术也是已知的。即，通过改变构成fc区的二个多肽内的形成界面的氨基酸残基来抑制构成具有相同序列的fc区的多肽的缔合，并形成序列不同的二个构成fc区的多肽复合体的控制方法可用于制作双特异性抗体(wo2006/106905)。在制造本发明的方式3的抗原结合分子时，也可采用这种方法。
[0358]
作为本发明的非限定的一个方式中的fc区，可适宜使用构成来源于上述双特异性抗体的fc区的二个多肽。更具体地，可适宜使用二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的349位氨基酸为cys、366位氨基酸为trp，另一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的356位氨基酸为cys、366位氨基酸为ser、368位氨基酸为ala、407位氨基酸为val。
[0359]
此外，作为本发明的非限定的一个方式中的fc区，可适宜使用二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的409位氨基酸为asp、另一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的399位氨基酸为lys。上述方式中，409位氨基酸也可以代替asp而为glu、399位氨基酸也可以代替lys而为arg。此外，除了399位氨基酸的lys之外，还可适宜追加asp作为360位氨基酸，或追加asp作为392位氨基酸。
[0360]
作为本发明的另外的非限定的一个方式中的fc区，可适宜使用二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的370位氨基酸为glu、另一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的357位氨基酸为lys。
[0361]
进而，作为本发明的另外的非限定的一个方式中的fc区，可适宜使用二个多肽，其
是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的439位氨基酸为glu、另一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的356位氨基酸为lys。
[0362]
作为本发明的另外的非限定的一个方式中的fc区，可适宜使用组合了上述的以下方式中的任一者：二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的409位氨基酸为asp、370位氨基酸为glu，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的399位氨基酸为lys、357位氨基酸为lys的(本方式中，以eu编号表示的370位氨基酸可以代替glu而为asp、可以代替以eu编号表示的370位氨基酸的glu而为392位氨基酸的asp)；二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的409位氨基酸为asp、439位氨基酸为glu，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的399位氨基酸为lys、356位氨基酸为lys(本方式中，可以代替以eu编号表示的439位氨基酸的glu而为360位氨基酸的asp、以eu编号表示的392位氨基酸的asp或439位氨基酸的asp)；二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的370位氨基酸为glu、439位氨基酸为glu，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的357位氨基酸为lys、356位氨基酸为lys；或者二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的409位氨基酸为asp、370位氨基酸为glu、439位氨基酸为glu，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的399位氨基酸为lys、357位氨基酸为lys、356位氨基酸为lys(本方式中，可以不将以eu编号表示的370位氨基酸置换为glu，进而在不将370位氨基酸置换为glu的基础上，439位氨基酸可以代替glu而为asp、或者439位氨基酸可以代替glu而为392位氨基酸的asp)。
[0363]
进而，在本发明的另外的非限定的一个方式中，可适宜使用二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的356位氨基酸为lys，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的435位氨基酸为arg、439位氨基酸为glu。
[0364]
进而，在本发明的另外的非限定的一个方式中，可适宜使用二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的356位氨基酸为lys、357位氨基酸为lys，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的370位氨基酸为glu、435位氨基酸为arg、439位氨基酸为glu。
[0365]
期待上述方式1～3的抗原结合分子与能够形成四者复合体的抗原结合分子相比，均可使免疫原性降低、还可使血浆中滞留性提高。
[0366]
免疫应答的降低(免疫原性的改善)针对本发明的抗原结合分子的免疫应答是否得到改变，可通过将含有抗原结合分子作为有效成分的药物组合物给予机体，并测定该机体的应答反应来进行评价。作为机体的应答反应，主要可举出细胞免疫(识别与mhc i类结合的抗原结合分子的肽片段的细胞毒性t细胞的诱导)和体液免疫(与抗原结合分子结合的抗体产生的诱导)这二种免疫应答，特别是在蛋白药品的情形中，将针对所给予抗原结合分子的抗体产生称为免疫原性。作为评价免疫原性的方法，有在体内评价抗体产生的方法、和在体外评价免疫细胞的反应的方法这2种。
[0367]
通过测定将抗原结合分子给予机体时的抗体效价，可以评价体内的免疫应答(免疫原性)。例如，测定对小鼠给予a和b的抗原结合分子时的抗体效价，在a抗原结合分子较b的抗体效价高的情形，或者对多个小鼠给予时，在给予了a抗原结合分子的抗体效价上升的个体的出现频率高的情形，判断a比b的免疫原性高。对于抗体效价的测定方法，通过使用利用了本领域技术人员公知的elisa、ecl、spr的相对于给予分子特异性结合的分子的测定方法，可以实施(j.pharm.biomed.anal.(2011)55(5),878-888)。
[0368]
作为在体外评价机体相对于抗原结合分子的免疫应答(免疫原性)的方法，有使从供体分离的人外周血单核细胞(或其分级细胞)与抗原结合分子在体外反应，来测定反应或增殖的辅助t细胞等的细胞数或比例、或者产生的细胞因子的量的方法(clin.immunol.(2010)137(1),5-14、drugs rd.(2008)9(6),385-396)。例如，通过这种体外免疫原性的试验，在评价a和b抗原结合分子时，在a抗原结合分子较b的反应高的情形、或者在用多个供体进行评价时，在a抗原结合分子的反应阳性率高的情形，可判断a较b的免疫原性高。
[0369]
本发明不受特定理论的束缚，但认为具有ph中性范围下的fcrn结合活性的抗原结合分子由于可以在抗原呈递细胞的细胞膜上形成包含两分子的fcrn和一分子的fcγr的四者的异源复合体，因而向抗原呈递细胞中的摄入得到促进，因而变得容易诱导免疫应答。fcγr和fcrn的细胞内结构域中存在磷酸化位点。通常，表达于细胞表面的受体的细胞内结构域的磷酸化由受体的缔合而引起，该磷酸化引起受体的内在化。即使天然型igg1在抗原呈递细胞上形成fcγr/igg1的二者复合体，也不会引起fcγr的细胞内结构域的缔合，但如果具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的igg分子形成包含fcγr/两分子的fcrn/igg这四者的复合体时，认为由于会引起fcγr与fcrn的3个细胞内结构域的缔合，由此可以诱导包含fcγr/两分子的fcrn/igg这四者的异源复合体的内在化。包含fcγr/两分子的fcrn/igg这四者的异源复合体的形成被认为是发生在共表达fcγr和fcrn的抗原呈递细胞上，因此认为抗体分子被摄入抗原呈递细胞中的量增大，结果免疫原性可能变差。认为通过利用本发明中发现的方式1、2、3中的任一方法来抑制抗原呈递细胞上的前述复合体的形成，可以使抗原呈递细胞中的摄入降低，因而可以改善免疫原性。
[0370]
药代动力学的改善本发明不受特定理论的束缚，例如，将包含以ph酸性范围下的抗原结合活性比ph中性范围条件下的抗原结合活性低的方式使抗原结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合结构域、以及在ph中性范围条件下具有对人fcrn的结合活性的fc区的抗原结合分子给予机体时，机体中向细胞中的摄入受到促进使得一分子的抗原结合分子可结合的抗原的数目增加的原因、以及血浆中抗原浓度的消除得到促进的原因，例如，可以如下所述进行说明。
[0371]
例如，在抗原结合分子为与膜抗原结合的抗体，且将该抗体给予机体内时，该抗体与抗原结合后，在与抗原结合的状态下和抗原一起通过内化而被摄入细胞内的内体中。然后，在与抗原结合的状态下转移至溶酶体的抗体与抗原一起被溶酶体分解。内化介导的血浆中的消除被称为抗原依赖性消除，在多数抗体分子中有报道(drug discov today(2006)11(1-2),81-88)。一分子的igg抗体以二价的形式与抗原结合时，一分子的抗体在与二分子抗原结合的状态下被内化，并直接在溶酶体中分解。因此，为通常的抗体时，一分子的igg抗体无法与三分子以上的抗原结合。例如，在具有中和活性的一分子igg抗体的情形中，无法
中和三分子以上的抗原。
[0372]
igg分子的血浆中滞留性较长(消除缓慢)的原因在于人fcrn的作用，所述人fcrn已知为igg分子的补救受体(salvage receptor)。通过胞饮作用摄入内体的igg分子在内体内的酸性条件下与在内体内表达的人fcrn结合。无法与人fcrn结合的igg分子在之后转移到溶酶体内被分解。另一方面，与人fcrn结合的igg分子转移至细胞表面。由于在血浆中的中性条件下igg分子会从人fcrn解离，因而该igg分子被再次循环到血浆中。
[0373]
另外，抗原结合分子为与可溶型抗原结合的抗体时，给予至机体内的抗体与抗原结合，然后抗体在与抗原结合的状态下被摄入细胞内。被摄入细胞内的抗体大多在内体内与fcrn结合后转移至细胞表面。由于在血浆中的中性条件下抗体会从人fcrn解离，因而被释放至细胞外。但是，包含抗原结合活性不根据ph等离子浓度的条件而发生变化的通常的抗原结合结构域的抗体由于在与抗原结合的状态下被释放至细胞外，因而无法再次与抗原结合。所以，与结合于膜抗原的抗体相同，抗原结合活性不根据ph等离子浓度的条件而发生变化的通常的一分子的igg抗体无法与三分子以上的抗原结合。
[0374]
在血浆中的ph中性范围条件下与抗原强结合、在内体内的ph酸性范围条件下从抗原解离的ph依赖性地与抗原结合的抗体(在ph中性范围条件下与抗原结合、在ph酸性范围条件下解离的抗体)、或者在血浆中的高钙离子浓度条件下与抗原强结合、在内体内的低钙离子浓度条件下从抗原解离的钙离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体(在高钙离子浓度条件下与抗原结合、在低钙离子浓度条件下解离的抗体)在内体内可以从抗原解离。ph依赖性地与抗原结合的抗体或钙离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体若在解离抗原后被fcrn再循环至血浆中，则可以再次与抗原结合。因此，一分子的抗体可以反复结合多个抗原分子。此外，与抗原结合分子结合的抗原由于在内体内从抗体解离，因而不会被再循环至血浆中而在溶酶体内被分解。通过对机体给予这样的抗原结合分子，可以使抗原向细胞内的摄取得到促进、使血浆中的抗原浓度降低。
[0375]
通过对在血浆中的ph中性范围条件下与抗原强结合、在内体内的ph酸性范围条件下从抗原解离的ph依赖性地与抗原结合的抗体(在ph中性范围条件下与抗原结合、在ph酸性范围条件下解离的抗体)、或者在血浆中的高钙离子浓度条件下与抗原强结合、在内体内的低钙离子浓度条件下从抗原解离的钙离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体(在高钙离子浓度条件下与抗原结合、在低钙离子浓度条件下解离的抗体)赋予ph中性范围条件下(ph7.4)的人fcrn结合能力，抗原结合分子结合的抗原向细胞内的摄入进一步得到促进。即，通过对机体给予这样的抗原结合分子，可以促进抗原的消除、使血浆中的抗原浓度降低。不具有ph依赖性的抗原结合能力、或钙离子浓度依赖性的抗原结合能力的通常的抗体和其抗体-抗原复合体通过非特异性的胞吞作用而被摄入细胞中，在内体内的酸性条件下与fcrn结合，从而被输送至细胞表面，通过在细胞表面的中性条件下从fcrn解离，而被再循环至血浆中。因此，充分ph依赖性地与抗原结合(在ph中性范围条件下结合、在ph酸性范围条件下解离)的、或充分钙离子浓度依赖性地与抗原结合(在高钙离子浓度条件下结合、在低钙离子浓度条件下解离)的抗体在血浆中与抗原结合、并在内体内将结合的抗原解离时，认为抗原的消除速度会变得与利用非特异性胞吞作用的抗体和其抗体-抗原复合体的向细胞中的摄入速度相等。抗体和抗原间的结合的ph依赖性或钙离子浓度依赖性不充分时，在内体内不从抗体解离的抗原也与抗体一起被再循环至血浆中，但在ph依赖性或钙浓度依赖
性充分时，抗原的消除速度将变得限速利用非特异性胞吞作用的向细胞中的摄入速度。此外，由于fcrn将抗体从内体内输送至细胞表面，因而认为fcrn的一部分也存在于细胞表面。
[0376]
通常，作为抗原结合分子的一个方式的igg型免疫球蛋白在ph中性范围下基本不具有fcrn结合活性。本发明者人认为，在ph中性范围下具有fcrn结合活性的igg型免疫球蛋白可以与存在于细胞表面的fcrn结合，通过与存在于细胞表面的fcrn结合，该igg型免疫球蛋白被fcrn依赖性地摄入细胞中。fcrn介导的向细胞中摄入的速度比利用非特异性胞吞作用的向细胞中摄入的速度快。因此，通过赋予在ph中性范围下与fcrn结合的能力，认为可以进一步加快抗原结合分子的抗原消除速度。即，在ph中性范围下具有fcrn结合能力的抗原结合分子比天然型igg型免疫球蛋白更快地将抗原送至细胞内，在内体内将抗原解离，再次被再循环至细胞表面或血浆中，并在细胞表面或血浆中再次与抗原结合，并通过fcrn被摄入细胞内。通过提高ph中性范围下的fcrn结合能力，可以加快该循环的循环速度，因而从血浆中消除抗原的速度变快。进而，通过使抗原结合分子在ph酸性范围下的抗原结合活性低于ph中性范围下的抗原结合活性，可以进一步提高从血浆中消除抗原的速度。另外，由于该循环的循环速度加快使得其循环的数目增大，因而认为一分子的抗原结合分子可结合的抗原的分子数也变多。本发明的抗原结合分子包含抗原结合结构域和fcrn结合结构域，fcrn结合结构域不会对抗原结合造成影响，此外，考虑到上述机理，它们并不依赖于抗原的种类，因而认为通过使抗原结合分子在ph酸性范围或低钙离子浓度条件等离子浓度条件下的抗原结合活性(结合能力)低于ph中性范围或高钙离子浓度条件等离子浓度条件下的抗原结合活性(结合能力)，和/或使血浆中的ph下的fcrn结合活性增大，可以促进利用抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入、可以加快抗原的消除速度。
[0377]
本发明中，利用抗原结合分子的“抗原向细胞内的摄入”意指抗原通过胞吞作用而被摄入细胞内。另外，本发明中“促进向细胞内的摄入”是指在血浆中与抗原结合的抗原结合分子的摄入细胞内的速度得到促进，和/或被摄入的抗原再循环至血浆中的量减少。此时，具有ph中性范围下的人fcrn结合活性的抗原结合分子、或具有该人fcrn结合活性、同时ph酸性范围下的抗原结合活性比ph中性范围下的抗原结合活性低的抗原结合分子，与不具有ph中性范围下的人fcrn结合活性的抗原结合分子、或ph酸性范围下的抗原结合活性比ph中性范围下的抗原结合活性低的抗原结合分子相比，只要向细胞内摄入的速度得到促进即可。在另一个方式中，本发明的抗原结合分子优选与天然型人igg相比向细胞内摄入的速度得到促进，特别优选与天然型人igg相比得到促进。因此，本发明中，利用抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入得到促进与否可以通过抗原向细胞内摄入的速度是否增大来进行判断。抗原向细胞内摄入的速度可以通过，例如，在含有人fcrn表达细胞的培养液中添加抗原结合分子和抗原并经时性地测定抗原的培养液中浓度的减少、或者经时性地测定摄入表达人fcrn的细胞内的抗原的量来算出。通过利用本发明的抗原结合分子促进抗原向细胞内摄入的速度的方法，例如，通过给予抗原结合分子，可以促进血浆中抗原的消除速度。因此，利用抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入是否得到促进也可以通过测定，例如，血浆中存在的抗原的消除速度是否得到加速、或血浆中的总抗原浓度是否因给予抗原结合分子而降低来确认。
[0378]
本发明中，“天然型的人igg”是指非修饰人igg，并不限于igg的特定亚型。这意味着只要人igg1、igg2、igg3、或igg4在ph酸性范围下可与人fcrn结合，则可以作为“天然型人
igg”使用。优选“天然型人igg”可以是人igg1。
[0379]
本发明中，“血浆中抗原消除能力”是指将抗原结合分子给予至机体内后、或发生了抗原结合分子在机体内的分泌时，使血浆中存在的抗原从血浆中消除的能力。所以，本发明中，“抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增加”可以是指在给予抗原结合分子后，使抗原结合分子在ph中性范围下的人fcrn结合活性增大、或者除了该人fcrn结合活性的增大之外，与使ph酸性范围下的抗原结合活性低于ph中性范围下的抗原结合活性之前相比，抗原从血浆中消除的速度变快。抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增加与否可通过，例如，将可溶型抗原和抗原结合分子给予机体内，并测定给予后的可溶型抗原的血浆中浓度来判断。通过使抗原结合分子的ph中性范围下的人fcrn结合活性增大、或者除了该人fcrn结合活性的增大之外还使ph酸性范围下的抗原结合活性低于ph中性范围下的抗原结合活性，给予可溶型抗原和抗原结合分子后的血浆中的可溶型抗原的浓度降低时，可以判断抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增加。可溶型抗原可以是抗原结合分子结合抗原、或抗原结合分子非结合抗原，其浓度可分别确定为“血浆中抗原结合分子结合抗原浓度”和“血浆中抗原结合分子非结合抗原浓度”(后者与“血浆中游离抗原浓度”同意)。“血浆中总抗原浓度”意指抗原结合分子结合抗原和抗原结合分子非结合抗原的总浓度、或作为抗原结合分子非结合抗原浓度的“血浆中游离抗原浓度”，因而可溶型抗原浓度可确定为“血浆中总抗原浓度”。测定“血浆中总抗原浓度”或“血浆中游离抗原浓度”的各种方法如本说明书中以下记载所述，在本技术领域中是周知的。
[0380]
本发明中，“药代动力学的提高”、“药代动力学的改善”、和“优异的药代动力学”换而言之可以是“血浆中(血中)滞留性的提高”、“血浆中(血中)滞留性的改善”、“优异的血浆中(血中)滞留性”、“血浆中(血中)滞留性延长”，这些语句以相同的含义使用。
[0381]
本发明中“药代动力学改善”不仅包括对人、或小鼠、大鼠、猴、兔、狗等非人动物给予抗原结合分子后直至从血浆中消除为止(例如，直至在细胞内被分解等并且抗原结合分子无法返回血浆中的状态)的时间变长，也包括抗原结合分子在被给予后直至被分解消除为止期间以能够与抗原结合的状态(例如，抗原结合分子未与抗原结合的状态)滞留于血浆中的时间变长。具有天然型fc区的人igg可以与来源于非人动物的fcrn结合。例如，具有天然型fc区的人igg与人fcrn相比可以更强地与小鼠fcrn结合(int.immunol.(2001)13(12),1551-1559)，因而为了确认本发明的抗原结合分子的特性，可优选使用小鼠来进行给药。作为其它的例子，原本的fcrn基因被破坏、且具有并表达与人fcrn基因相关的转基因的小鼠(methods mol.biol.(2010)602,93-104)也可用于进行给药，以确认以下所述的本发明的抗原结合分子的特性。具体地，“药代动力学改善”另外还包括不与抗原结合的抗原结合分子(抗原非结合型抗原结合分子)直至被分解消除的时间变长。抗原结合分子即使存在于血浆中，在该抗原结合分子上已经结合有抗原时，该抗原结合分子无法与新抗原结合。因此，抗原结合分子未与抗原结合的时间越长，则可与新抗原结合的时间越长(可与新抗原结合的机会越多)，可以使抗原在机体内未与抗原结合分子结合的时间减少，可以增长抗原与抗原结合分子结合的时间。只要通过给予抗原结合分子可加速抗原从血浆中的消除，则抗原非结合型抗原结合分子的血浆中浓度增加，此外，抗原与抗原结合分子结合的时间变长。即，本发明中的“抗原结合分子的药代动力学的改善”包括：抗原非结合型抗原结合分子的任一药代动力学参数的改善(血浆中半衰期的增加、平均血浆中滞留时间的增加、血浆中清
除率的降低中的任一者)、或在给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间的延长、或利用抗原结合分子的抗原从血浆中的消除得到加速。可通过测定抗原结合分子或抗原非结合型抗原结合分子的血浆中半衰期、平均血浆中滞留时间、血浆中清除率等中的任一参数(
ファーマコキネティクス
演習
による
理解(南山堂))来进行判断。例如，将抗原结合分子给予小鼠、大鼠、猴、兔、狗、人等后，测定抗原结合分子或抗原非结合型抗原结合分子的血浆中浓度，计算各参数，在血浆中半衰期变长或平均血浆中滞留时间变长的情形等中，可以说抗原结合分子的药代动力学得到改善。这些参数可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如，使用药代动力学分析软件winnonlin(pharsight)，按照附带的说明书进行非房室(noncompartmental)分析，由此可以进行适宜评价。未与抗原结合的抗原结合分子的血浆中浓度的测定可通过本领域技术人员公知的方法来实施，例如，可以使用clin.pharmacol.(2008)48(4),406-417中所测定的方法。
[0382]
本发明中“药代动力学改善”包括：在给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间延长。给予抗原结合分子后抗原与抗原结合分子结合的时间延长与否，可以测定游离抗原的血浆中浓度，通过游离抗原的血浆中浓度、或游离抗原浓度相对于总抗原浓度的比例出现上升为止的时间来判断。
[0383]
未与抗原结合分子结合的游离抗原的血浆中浓度、或游离抗原浓度相对于总抗原浓度的比例可通过本领域技术人员公知的方法来确定。可以采用，例如，pharm.res.(2006)23(1),95-103中使用的方法来确定。另外，抗原在机体内显示某种功能时，抗原与中和抗原功能的抗原结合分子(拮抗剂分子)结合与否也可以通过该抗原的功能是否被中和来进行评价。抗原的功能被中和与否可通过测定反映抗原功能的某种机体内标记物来进行评价。抗原是否与活化抗原功能的抗原结合分子(激动剂分子)结合，可通过测定反映抗原功能的某种机体内标记物来进行评价。
[0384]
游离抗原的血浆中浓度的测定、血浆中游离抗原量相对于血浆中总抗原量的比例的测定、机体内标记物的测定等测定没有特别限定，优选在给予抗原结合分子起经过一定时间后进行。本发明中，“给予抗原结合分子起经过一定时间后”没有特别限定，本领域技术人员可根据经给予的抗原结合分子的性质等适时决定，可举出例如：给予抗原结合分子起经过1日后、给予抗原结合分子起经过3日后、给予抗原结合分子起7日后、给予抗原结合分子起经过14日后、给予抗原结合分子起经过28日后等。本发明中，“血浆中抗原浓度”是包含抗原结合分子结合抗原和抗原结合分子非结合抗原的总浓度，即“血浆中总抗原浓度”、或抗原结合分子非结合抗原浓度，即“血浆中游离抗原浓度”的任一者的概念。
[0385]
与给予以含有天然型fc区作为人fcrn结合结构域的人igg来作为参照抗原结合分子的情形相比，或与不给予本发明的抗原结合分子的情形相比，通过给予本发明的抗原结合分子，血浆中总抗原浓度可降低2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或其以上。
[0386]
抗原/抗原结合分子摩尔比可如下所述进行计算：a值＝各时刻的抗原的摩尔浓度b值＝各时刻的抗原结合分子的摩尔浓度c值＝相对于各时刻的抗原结合分子的摩尔浓度的抗原的摩尔浓度(抗原/抗原结合分子摩尔比)
c＝a/b。
[0387]
c值较小时，相对于抗原结合分子的抗原消除效率显示较高，c值较大时，相对于抗原结合分子的抗原消除效率显示较低。
[0388]
抗原/抗原结合分子摩尔比可如上所述进行计算。
[0389]
与给予含有天然型人igg fc区作为人fcrn结合结构域的参照抗原结合分子的情形相比，通过给予本发明的抗原结合分子，抗原/抗原结合分子摩尔比可以降低2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或其以上。
[0390]
本发明中，优选将天然型人igg1、igg2、igg3、或igg4用作天然型人igg，以用于在人fcrn结合活性或机体内的结合活性方面与抗原结合分子进行比较的参照天然型人igg用途。优选可适宜使用包含与目标抗原结合分子相同的抗原结合结构域和作为人fcrn结合结构域的天然型人igg fc区的参照抗原结合分子。更优选将天然型人igg1用于在人fcrn结合活性或机体内的结合活性方面与抗原结合分子进行比较的参照天然型人igg用途。
[0391]
血浆中总抗原浓度或抗原/抗体摩尔比的减少可以如实施例4、5和12中的记载所述进行评价。更具体地，在抗原结合分子与小鼠对应抗原不发生交差反应时，可以使用人fcrn转基因小鼠品系32或品系276(jackson laboratories,methods mol.biol.(2010)602,93-104)，通过抗原抗体同时注射模型或稳态抗原注入模型中的任一者来进行评价。在抗原结合分子与小鼠对应物(counterpart)发生交差反应时，可以通过向人fcrn转基因小鼠品系32或品系276(jackson laboratories)仅注射抗原结合分子来进行评价。在同时注射模型中，将抗原结合分子和抗原的混合物给予小鼠。在稳态抗原注入模型中，对小鼠植入填充有抗原溶液的注入泵以实现恒定的血浆中抗原浓度，然后对小鼠注射抗原结合分子。将试验抗原结合分子以相同的用量给予。使用本领域技术人员公知的方法在合适的时刻测定血浆中总抗原浓度、血浆中游离抗原浓度、和血浆中抗原结合分子浓度。
[0392]
在给予2天后、4天后、7天后、14天后、28天后、56天后、或84天后测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比，可以评价本发明的长期效果。换而言之，为了评价本发明抗原结合分子的特性，通过在给予抗原结合分子2天后、4天后、7天后、14天后、28天后、56天后、或84天后测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比来确定长期的血浆中抗原浓度。是否通过本发明中记载的抗原结合分子实现血浆中抗原浓度或抗原/抗原结合分子摩尔比的减少，可通过在之前记载的任意1个或多个时刻评价该减少来确定。
[0393]
在给予15分后、1小时后、2小时后、4小时后、8小时后、12小时后、或24小时后测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比，可评价本发明的短期效果。换而言之，为了评价本发明的抗原结合分子的特性，通过在给予抗原结合分子15分后、1小时后、2小时后、4小时后、8小时后、12小时后、或24小时后测定血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度和抗原/抗原结合分子摩尔比来确定短期的血浆中抗原浓度。
[0394]
本发明的抗原结合分子的给予途径可从皮内注射、静脉内注射、玻璃体内注射、皮下注射、腹腔内注射、非口服注射、和肌肉内注射中选择。
[0395]
本发明中，人的抗原结合分子的药代动力学改善是优选的。难以测定人的血浆中滞留性时，可以基于小鼠(例如、正常小鼠、人抗原表达转基因小鼠、人fcrn表达转基因小鼠、等)或猴(例如、食蟹猴等)的血浆中滞留性来预测人的血浆中滞留性。
[0396]
本发明中的“抗原结合分子的药代动力学的改善、血浆中滞留性的提高”意指，将抗原结合分子给予机体时的任一药代动力学参数得到改善(血浆中半衰期的增加、平均血浆中滞留时间的增加、血浆中清除率的降低、生物利用度中的任一者)、或者在给予后的适当时间内的抗原结合分子的血浆中浓度提高。可以通过测定抗原结合分子的血浆中半衰期、平均血浆中滞留时间、血浆中清除率、生物利用度等中任一参数(
ファーマコキネティクス
演習
による
理解(南山堂))来进行判断。例如，对小鼠(正常小鼠和人fcrn转基因小鼠)、大鼠、猴、兔、狗、人等给予了抗原结合分子时，测定抗原结合分子的血浆中浓度，计算各参数，在血浆中半衰期变长或平均血浆中滞留时间变长的情形等中，可以说抗原结合分子的药代动力学改善。这些参数可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如，使用药代动力学分析软件winnonlin(pharsight)，按照附带的说明书进行非房室(noncompartmental)分析，由此可以进行适宜评价。
[0397]
本发明不受特定理论的束缚，但认为具有ph中性范围下的fcrn结合活性的抗原结合分子由于可在抗原呈递细胞的细胞膜上形成包含两分子的fcrn和一分子的fcγr的四者的复合体，因而向抗原呈递细胞中的摄入得到促进，因而血浆中滞留性降低，药代动力学变差。fcγr和fcrn的细胞内结构域中存在磷酸化位点。通常，表达于细胞表面的受体的细胞内结构域的磷酸化由受体的缔合而引起，该磷酸化引起受体的内在化。即使天然型igg1在抗原呈递细胞上形成fcγr/igg1的二者复合体，也不会引起fcγr的细胞内结构域的缔合，但如果具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的igg分子形成包含fcγr/两分子的fcrn/igg这四者的异源复合体时，认为由于会引起fcγr与fcrn的3个细胞内结构域的缔合，由此可以诱导包含fcγr/两分子的fcrn/igg这四者的异源复合体的内在化。包含fcγr/两分子的fcrn/igg这四者的异源复合体的形成被认为是发生在共表达fcγr和fcrn的抗原呈递细胞上，因此认为抗体分子被摄入抗原呈递细胞中的量增大，结果药代动力学可能变差。认为通过利用本发明中发现的方式1、2、3中的任一方法来抑制抗原呈递细胞上的前述复合体的形成，可以使抗原呈递细胞中的摄入降低，因而可以改善药代动力学。
[0398]
结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合分子的制造方法本发明的非限定的一个方式中，将编码结合活性根据如上所述选择的条件而发生变化的抗原结合结构域的多核苷酸分离后，将该多核苷酸插入合适的表达载体。例如，在抗原结合结构域为抗体的可变区时，得到编码该可变区的cdna后，通过识别插入该cdna的两末端的限制酶位点的限制酶将该cdna消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗原结合分子的基因的碱基序列中出现频率低的碱基序列。进而，为了将1拷贝的消化片段以正确方向插入载体，优选插入能提供粘性末端的限制酶。将如上所述经消化的编码抗原结合分子的可变区的cdna插入适当的表达载体，由此可以获得本发明的抗原结合分子的表达载体。此时，编码抗体恒定区(c区域)的基因与编码前述可变区的基因可进行框内融合。
[0399]
为了制造所期望的抗原结合分子，将编码抗原结合分子的多核苷酸以与控制序列可作用地连接的方式插入表达载体。控制序列包含例如，增强子和启动子。此外，可以在氨基末端连接合适的信号序列，以使表达的抗原结合分子分泌至细胞外。例如，作为信号序列，使用具有氨基酸序列mgwsciilflvatatgvhs(序列编号：3)的肽，除此以外也可以连接有适当的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达
编码所期望抗原结合分子的多核苷酸的重组细胞。制造方法依照前述抗体一项中记载的方法，可以由该重组细胞制造本发明的抗原结合分子。
[0400]
在本发明的非限定的一个方式中，将编码结合活性根据如上所述选择的条件而发生变化的抗原结合分子的多核苷酸分离后，将该多核苷酸的改变体插入合适的表达载体。作为这种改变体的一种，优选可举出：将编码通过使用作为随机可变区文库的合成文库或由非人动物制作得到的免疫文库进行筛选得到的本发明抗原结合分子的多核苷酸序列经人源化的改变体。经人源化的抗原结合分子的改变体的制作方法可采用与前述人源化抗体的制作方法相同的方法。
[0401]
此外，作为改变体的其它方式，优选可举出对分离的多核苷酸序列实施了下述改变而得的改变体，该改变使得通过使用作为随机可变区文库的合成文库或天然文库进行筛选得到的本发明抗原结合分子对抗原的结合亲和性增强(亲和性成熟)。这种改变体可通过包含cdr的突变诱导(yang等(j.mol.biol.(1995)254,392-403))、链改组(marks等(bio/technology(1992)10,779-783))、e.coli突变株的使用(low等(j.mol.biol.(1996)250,359-368))、dna改组(patten等(curr.opin.biotechnol.(1997)8,724-733))、噬菌体展示(thompson等(j.mol.biol.(1996)256,77-88))和有性pcr(sexual pcr)(clameri等(nature(1998)391,288-291))的各种亲和性成熟的公知步骤来获得。
[0402]
如上所述，作为通过本发明的制造方法制得的抗原结合分子，可举出包含fc区的抗原结合分子，作为fc区，可使用各种改变体。作为本发明的改变体的一个方式，还优选可举出编码具有重链的抗原结合分子的多核苷酸，该重链中，编码上述fc区的改变体的多核苷酸、与编码结合活性根据如上所述选择的条件而发生变化的抗原结合分子的多核苷酸框内连接。
[0403]
在本发明的非限定的一个方式中，作为fc区，优选可举出例如，序列编号：11所示的igg1(n末端添加有ala的aac82527.1)、序列编号：12所示的igg2(n末端添加有ala的aab59393.1)、序列编号：13所示的igg3(caa27268.1)、序列编号：14所示的igg4(n末端添加有ala的aab59394.1)等抗体的fc恒定区。igg分子的血浆中滞留性较长(从血浆中消除缓慢)的原因在于fcrn特别是人fcrn的作用，所述fcrn已知为igg分子的补救受体。通过胞饮作用摄入内体的igg分子在内体内的酸性条件下与在内体内表达的fcrn特别是人fcrn结合。无法与fcrn特别是人fcrn结合的igg分子会进入溶酶体，并在此处被分解，而与fcrn特别是人fcrn结合的igg分子则转移至细胞表面，在血浆中的中性条件下从fcrn特别是人fcrn解离，由此再次返回到血浆中。
[0404]
由于包含通常fc区的抗体在血浆中的ph中性范围条件下不具有对fcrn特别是对人fcrn的结合活性，因而通常的抗体和抗体-抗原复合体通过非特异性胞吞作用而被摄入细胞中，通过在内体内的ph酸性范围条件下与fcrn特别是人fcrn结合而被输送至细胞表面。由于fcrn特别是人fcrn将抗体从内体内输送至细胞表面，因而认为fcrn特别是人fcrn的一部分也会存在于细胞表面，由于在细胞表面的ph中性范围条件下，抗体从fcrn特别是人fcrn解离，因而抗体被再循环至血浆中。
[0405]
本发明的抗原结合分子中所含的ph中性范围下具有人fcrn结合活性的fc区可以通过任意的方法获得，具体地，可通过改变用作起始fc区的人igg型免疫球蛋白的氨基酸来获得在ph中性范围下具有人fcrn结合活性的fc区。作为用于改变的优选的igg型免疫球蛋
白的fc区，可举出例如人igg(igg1、igg2、igg3、或igg4、和它们的改变体)的fc区。对于改变为其它的氨基酸，只要ph中性范围下具有人fcrn结合活性、或者在中性范围下可提高人fcrn结合活性，则任意位置的氨基酸均可改变。在抗原结合分子含有人igg1的fc区来作为作为人fc区时，优选包含下述改变，该改变带来ph中性范围下的人fcrn结合较人igg1的起始fc区的结合活性增强的效果。作为能实现上述改变的氨基酸，可举出例如，eu编号221位～225位、227位、228位、230位、232位、233位～241位、243位～252位、254位～260位、262位～272位、274位、276位、278位～289位、291位～312位、315位～320位、324位、325位、327位～339位、341位、343位、345位、360位、362位、370位、375位～378位、380位、382位、385位～387位、389位、396位、414位、416位、423位、424位、426位～438位、440位和442位的位置的氨基酸。更具体地，可举出例如表5所述的氨基酸的改变。通过这些氨基酸的改变，igg型免疫球蛋白的fc区在ph中性范围下对人fcrn的结合被增强。
[0406]
为了在本发明中使用，这些改变之中，适宜选择在ph中性范围下对人fcrn的结合也增强的改变。作为特别优选的fc区改变体的氨基酸，可举出例如以eu编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265位、286位、289位、297位、298位、303位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、314位、315位、317位、332位、334位、360位、376位、380位、382位、384位、385位、386位、387位、389位、424位、428位、433位、434位和436位的氨基酸。通过将选自这些氨基酸中的至少1个氨基酸置换为其它的氨基酸，可以增强抗原结合分子中所含的fc区在ph中性范围下对人fcrn的结合活性。
[0407]
作为特别优选的改变，可举出例如下述任一改变：将fc区的以eu编号表示的237位的氨基酸置换为met、248位的氨基酸置换为ile、250位的氨基酸置换为ala、phe、ile、met、gln、ser、val、trp、或tyr中的任一者、252位的氨基酸置换为phe、trp、或tyr中的任一者、254位的氨基酸置换为thr、255位的氨基酸置换为glu、256位的氨基酸置换为asp、asn、glu、或gln中的任一者、257位的氨基酸置换为ala、gly、ile、leu、met、asn、ser、thr、或val中的任一者、258位的氨基酸置换为his、265位的氨基酸置换为ala、286位的氨基酸置换为ala或glu中的任一者、289位的氨基酸置换为his、297位的氨基酸置换为ala、303位的氨基酸置换为ala、305位的氨基酸置换为ala、307位的氨基酸置换为ala、asp、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、val、trp、或tyr中的任一者、308位的氨基酸置换为ala、phe、ile、leu、met、pro、gln、或thr中的任一者、309位的氨基酸置换为ala、asp、glu、pro、或arg中的任一者、311位的氨基酸置换为ala、his、或ile中的任一者、
312位的氨基酸置换为ala或his中的任一者、314位的氨基酸置换为lys或arg中的任一者、315位的氨基酸置换为ala、asp或his中的任一者、317位的氨基酸置换为ala、332位的氨基酸置换为val、334位的氨基酸置换为leu、360位的氨基酸置换为his、376位的氨基酸置换为ala、380位的氨基酸置换为ala、382位的氨基酸置换为ala、384位的氨基酸置换为ala、385位的氨基酸置换为asp或his中的任一者、386位的氨基酸置换为pro、387位的氨基酸置换为glu、389位的氨基酸置换为ala或ser中的任一者、424位的氨基酸置换为ala、428位的氨基酸置换为ala、asp、phe、gly、his、ile、lys、leu、asn、pro、gln、ser、thr、val、trp、或tyr中的任一者、433位的氨基酸置换为lys、434位的氨基酸置换为ala、phe、his、ser、trp、或tyr中的任一者、和436位的氨基酸置换为his、ile、leu、phe、thr、或val。
[0408]
此外，进行改变的氨基酸的数目没有特别限定，可以仅改变一个位置的氨基酸，也可以改变二个位置以上的氨基酸。作为二个位置以上的氨基酸的改变的组合，可举出例如表6中记载的组合。
[0409]
此外，本发明不受特定原理的束缚，但提供下述抗原结合分子的制造方法，该抗原结合分子除了上述改变之外，还包含fc区的改变，以使不会形成包含抗原结合分子中所含的fc区与两分子的fcrn和活性型fcγ受体这四者的异源复合体。作为这种抗原结合分子的优选方式，可举出以下三种。
[0410]
(方式1)包含fc区的抗原结合分子，该fc区具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且对活性型fcγr的结合活性比天然型fc区对活性型fcγr的结合活性低方式1的抗原结合分子通过与两分子的fcrn结合而形成三者复合体，但不会形成包含活性型fcγr的复合体(图49)。对活性型fcγr的结合活性比天然型fc区对活性型fcγr的结合活性低的fc区可通过如上所述改变天然型fc区的氨基酸来制作。改变fc区对活性型fcγr的结合活性是否比天然型fc区对活性型fcγr的结合活性低可使用前述结合活性一项中所述的方法来适宜实施。
[0411]
本说明书中，fc区改变体对活性型fcγ受体的结合活性比天然型fc区对活性型fcγ受体的结合活性低是指，fc区改变体的fcγria、fcγriia、fcγriiia和/或fcγriiib中的任一者对人fcγ受体的结合活性比天然型fc区对这些人fcγ受体的结合活性低。例如，是指基于上述分析方法，与包含作为对照的天然型fc区的抗原结合分子的结合活性相比，
包含fc区改变体的抗原结合分子的结合活性显示为95％以下、优选90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、特别优选70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下的结合活性。作为天然型fc区，可以使用起始fc区，也可以使用野生型抗体的不同同种型的fc区。
[0412]
作为包含作为对照的fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有igg单克隆抗体的fc区的抗原结合分子。该fc区的结构记载于：序列编号：11(refseq登录编号aac82527.1的n末端添加有a)、12(refseq登录编号aab59393.1的n末端添加有a)、13(refseq登录编号caa27268.1)、14(refseq登录编号aab59394.1的n末端添加有a)中。此外，将含有某特定同种型的抗体的fc区的抗原结合分子用作被检物质时，通过将具有该特定同种型的igg单克隆抗体的fc区的抗原结合分子用作对照，可验证含有该fc区的抗原结合分子对fcγ受体的结合活性的效果。如上所述，适宜选择包含对fcγ受体的结合活性高得到验证的fc区的抗原结合分子。
[0413]
在本发明的非限定的一个方式中，作为对活性型fcγr的结合活性比天然型fc区对活性型fcγr的结合活性低的fc区的例子，优选可举出前述fc区的氨基酸中以eu编号表示的234位、235位、236位、237位、238位、239位、270位、297位、298位、325位和329位中的任意一个以上的氨基酸被改变为与天然型fc区不同的氨基酸的fc区，但fc区的改变并不限于上述改变，也可以是例如current opinion in biotechnology(2009)20(6),685-691中记载的脱糖链(n297a,n297q)、igg1-l234a/l235a、igg1-a325a/a330s/p331s、igg1-c226s/c229s、igg1-c226s/c229s/e233p/l234v/l235a、igg1-l234f/l235e/p331s、igg1-s267e/l328f、igg2-v234a/g237a、igg2-h268q/v309l/a330s/a331s、igg4-l235a/g237a/e318a、igg4-l236e等的改变、和wo 2008/092117中记载的g236r/l328r、l235g/g236r、n325a/l328r、n325ll328r等的改变、和eu编号233位、234位、235位、237位的氨基酸的插入、wo 2000/042072中记载的位置的改变。
[0414]
另外，在本发明的非限定的一个方式中，优选可举出下述fc区，其包括前述fc区的以eu编号表示的氨基酸的下述任一者以上的改变：将234位的氨基酸改变为ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、lys、met、phe、pro、ser、thr或trp中的任一者、将235位的氨基酸改变为ala、asn、asp、gln、glu、gly、his、ile、lys、met、pro、ser、thr、val或arg中的任一者、将236位的氨基酸改变为arg、asn、gln、his、leu、lys、met、phe、pro或tyr中的任一者、将237位的氨基酸改变为ala、asn、asp、gln、glu、his、ile、leu、lys、met、pro、ser、thr、val、tyr或arg中的任一者、将238位的氨基酸改变为ala、asn、gln、glu、gly、his、ile、lys、thr、trp或arg中的任一者、将239位的氨基酸改变为gln、his、lys、phe、pro、trp、tyr或arg中的任一者、将265位的氨基酸改变为ala、arg、asn、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、
将266位的氨基酸改变为ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、lys、phe、pro、ser、thr、trp或tyr中的任一者、将267位的氨基酸改变为arg、his、lys、phe、pro、trp或tyr中的任一者、将269位的氨基酸改变为ala、arg、asn、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、将270位的氨基酸改变为ala、arg、asn、gln、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者将271位的氨基酸改变为arg、his、phe、ser、thr、trp或tyr中的任一者、将295位的氨基酸改变为arg、asn、asp、gly、his、phe、ser、trp或tyr中的任一者、将296位的氨基酸改变为arg、gly、lys或pro中的任一者、将297位的氨基酸改变为ala、将298位的氨基酸改变为arg、gly、lys、pro、trp或tyr中的任一者、将300位的氨基酸改变为arg、lys或pro中的任一者、将324位的氨基酸改变为lys或pro中的任一者、将325位的氨基酸改变为ala、arg、gly、his、ile、lys、phe、pro、thr、trptyr、或val中的任一者、将327位的氨基酸改变为arg、gln、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr或val中的任一者、将328位的氨基酸改变为arg、asn、gly、his、lys或pro中的任一者、将329位的氨基酸改变为asn、asp、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、ser、thr、trp、tyr、val或arg中的任一者、将330位的氨基酸改变为pro或ser中的任一者、将331位的氨基酸改变为arg、gly或lys中的任一者、或将332位的氨基酸改变为arg、lys或pro中的任一者。
[0415]
(方式2)包含fc区的抗原结合分子，该fc区具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且对抑制型fcγr的结合活性比对活性型fcγ受体的结合活性高方式2的抗原结合分子通过与两分子的fcrn和一分子的抑制型fcγr结合，可以形成包含上述四者的复合体。然而，由于一分子的抗原结合分子只能与一分子的fcγr结合，因而一分子的抗原结合分子在与抑制型fcγr结合的状态下无法与其它活性型fcγr结合(图50)。进而据报道，在与抑制型fcγr结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子会被再循环至细胞膜上、从而避免细胞内的分解(immunity(2005)23,503-514)。即，可认为具有针对抑制型fcγr的选择结合活性的抗原结合分子无法形成包含作为免疫应答原因的活性型fcγr和两分子的fcrn的异源复合体。
[0416]
本说明书中，对抑制型fcγr的结合活性比对活性型fcγ受体的结合活性高是指，fc区改变体对fcγriib的结合活性比对fcγri、fcγriia、fcγriiia和/或fcγriiib中的任一人fcγ受体的结合活性高。例如，是指基于上述分析方法，包含fc区改变体的抗原结合分子对fcγriib的结合活性显示为对fcγri、fcγriia、fcγriiia和/或fcγriiib中的任一人fcγ受体的结合活性的105％以上、优选110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、特别优选150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％％以上、
250％以上、300％以上、350％以上、400％以上、450％以上、500％以上、750％以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上的结合活性。
[0417]
作为包含作为对照的fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有igg单克隆抗体的fc区的抗原结合分子。该fc区的结构记载于：序列编号：11(refseq登录编号aac82527.1的n末端添加有a)、12(refseq登录编号aab59393.1的n末端添加有a)、13(refseq登录编号caa27268.1)、14(refseq登录编号aab59394.1的n末端添加有a)中。此外，将含有某特定同种型的抗体的fc区的抗原结合分子用作被检物质时，通过将具有该特定同种型的igg单克隆抗体的fc区的抗原结合分子用作对照，可验证含有该fc区的抗原结合分子对fcγ受体的结合活性的效果。如上所述，适宜选择包含对fcγ受体的结合活性高得到验证的fc区的抗原结合分子。
[0418]
在本发明的非限定的一个方式中，作为具有针对抑制型fcγr的选择结合活性的fc区的例子，优选可举出前述fc区的氨基酸中以eu编号表示的238或328位氨基酸被改变为与天然型fc区不同的氨基酸的fc区。此外，作为具有针对抑制型fcγ受体的选择结合活性的fc区，可以适宜选择us 2009/0136485中记载的fc区或改变。
[0419]
另外，在本发明的非限定的一个方式中，优选可举出下述fc区，该fc区包含前述fc区的以eu编号表示的氨基酸的下述任一者以上的改变：以eu编号表示的238的氨基酸改变为asp、或328的氨基酸改变为glu。
[0420]
进而，在本发明的非限定的一个方式中，优选可举出下述fc区，该fc区包含以eu编号表示的238位的pro置换为asp的置换、以及下述中任一者以上的置换：以eu编号表示的237位的氨基酸置换为trp、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为phe、以eu编号表示的267位的氨基酸置换为val、以eu编号表示的267位的氨基酸置换为gln、以eu编号表示的268位的氨基酸置换为asn、以eu编号表示的271位的氨基酸置换为gly、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为leu、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为gln、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为glu、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为met、以eu编号表示的239位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的267位的氨基酸置换为ala、以eu编号表示的234位的氨基酸置换为trp、以eu编号表示的234位的氨基酸置换为tyr、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为ala、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为glu、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为leu、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为met、以eu编号表示的237位的氨基酸置换为tyr、以eu编号表示的330位的氨基酸置换为lys、以eu编号表示的330位的氨基酸置换为arg、以eu编号表示的233位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的268位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的268位的氨基酸置换为glu、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为ser、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为thr、以eu编号表示的323位的氨基酸置换为ile、以eu编号表示的323位的氨基酸置换为leu、以eu编号表示的323位的氨基酸置换为met、以eu编号表示的296位的氨基酸置换为asp、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为ala、以eu编号表示的326位的氨基酸置换为asn、以eu编号表示的330位的氨基酸置换为met。
[0421]
(方式3)包含fc区的抗原结合分子，其中，构成fc区的二个多肽的一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且另一方不具有ph中性范围条件下的fcrn结合能力活性
方式3的抗原结合分子可以通过与一分子的fcrn和一分子的fcγr结合而形成三者复合体，但不会形成包含两分子的fcrn和一分子的fcγr的四者的异源复合体(图51)。作为本方式3的抗原结合分子中所含的、构成fc区的二个多肽的一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、另一多肽不具有ph中性范围条件下的fcrn结合能力活性的fc区，还可适宜使用来源于双特异性抗体(bispecific抗体)的fc区。双特异性抗体是指具有针对不同抗原的特异性的二种抗体。igg型的双特异性抗体可由杂交杂交瘤(quadroma)分泌出，所述杂交杂交瘤通过对产生igg抗体的二种杂交瘤进行融合而得(milstein等(nature(1983)305,537-540)。
[0422]
上述方式3的抗原结合分子通过使用前述抗体一项中记载的重组手法来制造时，可以采用下述方法，其中，将编码构成二种目标fc区的多肽的基因导入细胞，并使它们共表达。然而，制造的fc区成为构成fc区的二个多肽的一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、另一多肽不具有ph中性范围条件下的fcrn结合能力活性的fc区，与构成fc区的二个多肽的双方均具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的fc区，与构成fc区的二个多肽双方均不具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的fc区以2：1：1的分子数比例存在的混合物。难以由3种igg纯化包含目标组合的fc区的抗原结合分子。
[0423]
使用这种重组手法制造方式3的抗原结合分子时，通过对构成fc区的ch3结构域施加适当的氨基酸置换的改变，可以优先分泌出包含异源组合的fc区的抗原结合分子。具体地，该方法是将一重链ch3结构域中存在的氨基酸侧链置换为较大的侧链(knob(“突起”的意思))，将另一重链ch3结构域中存在的氨基酸侧链置换为较小的侧链(hole(“空隙”的意思))，由此使突起可配置于空隙内，引起异种h链形成的促进和同种h链形成的抑制(wo1996027011、ridgway等(protein engineering(1996)9,617-621)、merchant等(nat.biotech.(1998)16,677-681))。
[0424]
此外，通过将多肽的缔合、或由多肽构成的异种多聚体的缔合的控制方法用于构成fc区的二个多肽的缔合来制作双特异性抗体的技术也是已知的。即，通过改变构成fc区的二个多肽内的形成界面的氨基酸残基来抑制构成具有相同序列的fc区的多肽的缔合，并形成序列不同的二个构成fc区的多肽复合体的控制方法可用于制作双特异性抗体(wo2006/106905)。在制造本发明的方式3的抗原结合分子时，也可采用这种方法。
[0425]
作为本发明的非限定的一个方式中的fc区，可适宜使用构成来源于上述双特异性抗体的fc区的二个多肽。更具体地，可适宜使用二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的349位氨基酸为cys、366位氨基酸为trp，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的356位氨基酸为cys、366位氨基酸为ser、368位氨基酸为ala、407位氨基酸为val。
[0426]
此外，作为本发明的非限定的一个方式中的fc区，可适宜使用二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的409位氨基酸为asp、另一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的399位氨基酸为lys。上述方式中，409位氨基酸也可以代替asp而为glu、399位氨基酸也可以代替lys而为arg。此外，除了399位氨基酸的lys之外，还可适宜追加asp作为360位氨基酸，或追加asp作为392位氨基酸。
[0427]
作为本发明的另外的非限定的一个方式中的fc区，可适宜使用二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的370位氨基酸为
glu、另一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的357位氨基酸为lys。
[0428]
进而，作为本发明的另外的非限定的一个方式中的fc区，可适宜使用二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的439位氨基酸为glu、另一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的356位氨基酸为lys。
[0429]
作为本发明的另一非限定的一个方式中的fc区，可适宜使用上述组合而成的以下方式中的任一者：二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的409位的氨基酸为asp、370位的氨基酸为glu，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的399位的氨基酸为lys、357位的氨基酸为lys(本方式中，以eu编号表示的370位的氨基酸可以代替glu而为asp，可以代替以eu编号表示的370位的氨基酸的glu而为392位的氨基酸的asp)；二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的409位的氨基酸为asp、439位的氨基酸为glu，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的399位的氨基酸为lys、356位的氨基酸为lys(本方式中，可以代替以eu编号表示的439位的氨基酸的glu而为360位的氨基酸的asp、以eu编号表示的392位的氨基酸的asp或439位的氨基酸的asp)；二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的370位的氨基酸为glu、439位的氨基酸为glu，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的357位的氨基酸为lys、356位的氨基酸为lys；或二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的409位的氨基酸为asp、370位的氨基酸为glu、439位的氨基酸为glu，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的399位的氨基酸为lys、357位的氨基酸为lys、356位的氨基酸为lys(本方式中，可以不将以eu编号表示的370位的氨基酸置换为glu，进而，在不将370位的氨基酸置换为glu的基础上，可以代替439位的氨基酸的glu而为asp、或代替439位的氨基酸的glu而为392位的氨基酸的asp)。
[0430]
进而，在本发明的另外的非限定的一个方式中，可适宜使用二个多肽，其是构成fc区的二个多肽，其特征在于，一个多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的356位氨基酸为lys，另一多肽的氨基酸序列中以eu编号表示的435位氨基酸为arg、439位氨基酸为glu。
[0431]
期待上述方式1～3的抗原结合分子与能够形成四者复合体的抗原结合分子相比，均可使免疫原性降低、还可使血浆中滞留性提高。
[0432]
为了改变fc区的氨基酸，可适宜采用位点特异性突变诱导法(kunkel等(proc.natl.acad.sci.usa(1985)82,488-492))或重叠延伸pcr等公知的方法。此外，作为置换为天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸突变方法，还可采用多种公知的方法(annu.rev.biophys.biomol.struct.(2006)35,225-249、proc.natl.acad.sci.u.s.a.(2003)100(11),6353-6357)。还可优选使用例如：包含作为终止密码子之一的uag密码子(琥珀密码子)的互补琥珀抑制物trna上接合有非天然氨基酸而成的trna的无细胞翻译系统(clover direct(protein express))等。
[0433]
作为本发明的改变体的一个方式，还制作编码具有重链的抗原结合分子的多核苷酸，该重链中，编码施加了如上所述氨基酸突变的fc区的改变体的多核苷酸、与编码结合活
性根据如上所述选择的条件而发生变化的抗原结合分子的多核苷酸框内连接。
[0434]
根据本发明，提供抗原结合分子的制造方法，其包括从导入有载体的细胞的培养液中回收抗原结合分子，所述载体中，编码fc区的多核苷酸与编码结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合结构域的多核苷酸可作用地框内连接。此外，还提供抗原结合分子的制造方法，其包括从导入有载体的细胞的培养液中回收抗原结合分子，所述载体中，载体中预先可作用地连接的编码fc区的多核苷酸、与编码结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合结构域的多核苷酸可作用可地连接。
[0435]
药物组合物若对可溶型抗原给予现有的中和抗体，则预测提供抗原与抗体的结合，血浆中的持续性提高。抗体通常具有长的半衰期(1周～3周)，而抗原通常具有短的半衰期(1天以下)。因此，在血浆中与抗体结合的抗原，与抗原单独存在时相比，变得具有显著更长的半衰期。结果，提高给予现有的中和抗体，引起血浆中抗原浓度的上升。这样的事例对于各种目标为可溶型抗原的中和抗体已有报道，若列举一例，则有il-6(j.immunotoxicol.(2005)3,131-139)、β-淀粉样蛋白(mabs(2010)2(5),1-13)、mcp-1(arthritis&rheumatism(2006)54,2387-2392)、铁调素(aaps j.(2010)4,646-657)、sil-6receptor(blood(2008)112(10),3959-64)等。据报道，通过给予现有的中和抗体，有从基线至大约10倍～1000倍左右(上升的程度根据抗原而不同)的血浆中总抗原浓度的上升。这里，血浆中总抗原浓度意指作为存在于血浆中的抗原的总量的浓度，即以抗体结合型和抗体非结合型的抗原浓度之和的形式表示。对于这种以可溶型抗原为目标的抗体药物，引起血浆中总抗原浓度的上升并不优选。其原因是，为了中和可溶型抗原，至少需要高于血浆中总抗原浓度的血浆中抗体浓度。即，对于血浆中总抗原浓度上升10倍～1000倍，作为用于对其进行中和的血浆中抗体浓度(即抗体给予量)，意味着需要相比于血浆中总抗原浓度未发生上升时的10倍～1000倍。另一方面，与现有的中和抗体相比，若可将血浆中总抗原浓度降低10倍～1000倍，则也可以将抗体的给予量降低至相同程度。这样，可以使可溶型抗原从血浆中消除、使血浆中总抗原浓度降低的抗体与现有的中和抗体相比，有用性显著更高。
[0436]
本发明不受特定理论的束缚，例如，将包含以ph酸性范围下的抗原结合活性比ph中性范围条件下的抗原结合活性低的方式使抗原结合活性根据离子浓度的条件而发生变化的抗原结合结构域、以及另外的在ph中性范围条件下具有人fcrn结合活性的抗体恒定区等fcrn结合结构域的抗原结合分子给予机体时，机体中向细胞中的摄入受到促进使得1分子的抗原结合分子可结合的抗原的数目增加的原因、以及血浆中抗原浓度的消除得到促进的原因，例如，可以如下所述进行说明。
[0437]
例如，在将与膜抗原结合的抗体给予机体内时，该抗体与抗原结合后，在与抗原结合的状态下和抗原一起通过内化而被摄入细胞内的内体中。然后，在与抗原结合的状态下转移至溶酶体的抗体与抗原一起被溶酶体分解。内化介导的血浆中的消除被称为抗原依赖性消除，在多数抗体分子中有报道(drug discov today(2006)11(1-2),81-88)。1分子的igg抗体以2价的形式与抗原结合时，1分子的抗体在与2分子抗原结合的状态下被内化，并直接在溶酶体中分解。因此，为通常的抗体时，1分子的igg抗体无法与3分子以上的抗原结合。例如，在具有中和活性的1分子igg抗体的情形中，无法中和3分子以上的抗原。
[0438]
igg分子的血浆中滞留性较长(消除缓慢)的原因在于人fcrn的作用，所述人fcrn
已知为igg分子的补救受体(salvage receptor)。通过胞饮作用摄入内体的igg分子在内体内的酸性条件下与在内体内表达的人fcrn结合。无法与人fcrn结合的igg分子在之后转移到溶酶体内被分解。另一方面，与人fcrn结合的igg分子转移至细胞表面。由于在血浆中的中性条件下igg分子会从人fcrn解离，因而该igg分子被再次循环到血浆中。
[0439]
另外，抗原结合分子为与可溶型抗原结合的抗体时，给予至机体内的抗体与抗原结合，然后抗体在与抗原结合的状态下被摄入细胞内。被摄入细胞内的抗体大多在内体内与fcrn结合后转移至细胞表面。由于在血浆中的中性条件下抗体会从人fcrn解离，因而被释放至细胞外。但是，包含抗原结合活性不根据ph等离子浓度的条件而发生变化的通常的抗原结合结构域的抗体由于在与抗原结合的状态下被释放至细胞外，因而无法再次与抗原结合。所以，与结合于膜抗原的抗体相同，抗原结合活性不根据ph等离子浓度的条件而发生变化的通常的一分子的igg抗体无法与三分子以上的抗原结合。
[0440]
在血浆中的ph中性范围条件下与抗原强结合、在内体内的ph酸性范围条件下从抗原解离的ph依赖性地与抗原结合的抗体(在ph中性范围条件下与抗原结合、在ph酸性范围条件下解离的抗体)、或者在血浆中的高钙离子浓度条件下与抗原强结合、在内体内的低钙离子浓度条件下从抗原解离的钙离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体(在高钙离子浓度条件下与抗原结合、在低钙离子浓度条件下解离的抗体)在内体内可以从抗原解离。ph依赖性地与抗原结合的抗体或钙离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体若在解离抗原后被fcrn再循环至血浆中，则可以再次与抗原结合。因此，一分子的抗体可以反复结合多个抗原分子。此外，与抗原结合分子结合的抗原由于在内体内从抗体解离，因而不会被再循环至血浆中而在溶酶体内被分解。通过对机体给予这样的抗原结合分子，可以使抗原向细胞内的摄取得到促进、使血浆中的抗原浓度降低。
[0441]
通过对在血浆中的ph中性范围条件下与抗原强结合、在内体内的ph酸性范围条件下从抗原解离的ph依赖性地与抗原结合的抗体(在ph中性范围条件下与抗原结合、在ph酸性范围条件下解离的抗体)、或者在血浆中的高钙离子浓度条件下与抗原强结合、在内体内的低钙离子浓度条件下从抗原解离的钙离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体(在高钙离子浓度条件下与抗原结合、在低钙离子浓度条件下解离的抗体)赋予ph中性范围条件下(ph7.4)的人fcrn结合能力，抗原结合分子结合的抗原向细胞内的摄入进一步得到促进。即，通过对机体给予这样的抗原结合分子，可以促进抗原的消除、使血浆中的抗原浓度降低。不具有ph依赖性的抗原结合能力、或钙离子浓度依赖性的抗原结合能力的通常的抗体和其抗体-抗原复合体通过非特异性的胞吞作用而被摄入细胞中，在内体内的酸性条件下与fcrn结合，从而被输送至细胞表面，通过在细胞表面的中性条件下从fcrn解离，而被再循环至血浆中。因此，充分ph依赖性地与抗原结合(在ph中性范围条件下结合、在ph酸性范围条件下解离)的、或充分钙离子浓度依赖性地与抗原结合(在高钙离子浓度条件下结合、在低钙离子浓度条件下解离)的抗体在血浆中与抗原结合、并在内体内将结合的抗原解离时，认为抗原的消除速度会变得与利用非特异性胞吞作用的抗体和其抗体-抗原复合体的向细胞中的摄入速度相等。抗体和抗原间的结合的ph依赖性或钙离子浓度依赖性不充分时，在内体内不从抗体解离的抗原也与抗体一起被再循环至血浆中，但在ph依赖性或钙浓度依赖性充分时，抗原的消除速度将变得限速利用非特异性胞吞作用的向细胞中的摄入速度。此外，由于fcrn将抗体从内体内输送至细胞表面，因而认为fcrn的一部分也存在于细胞表面。
[0442]
通常，作为抗原结合分子的一个方式的igg型免疫球蛋白在ph中性范围下基本不具有fcrn结合活性。本发明者人认为，在ph中性范围下具有fcrn结合活性的igg型免疫球蛋白可以与存在于细胞表面的fcrn结合，通过与存在于细胞表面的fcrn结合，该igg型免疫球蛋白被fcrn依赖性地摄入细胞中。fcrn介导的向细胞中摄入的速度比利用非特异性胞吞作用的向细胞中摄入的速度快。因此，通过赋予在ph中性范围下与fcrn结合的能力，认为可以进一步加快抗原结合分子的抗原消除速度。即，在ph中性范围下具有fcrn结合能力的抗原结合分子比天然型igg型免疫球蛋白更快地将抗原送至细胞内，在内体内将抗原解离，再次被再循环至细胞表面或血浆中，并在细胞表面或血浆中再次与抗原结合，并通过fcrn被摄入细胞内。通过提高ph中性范围下的fcrn结合能力，可以加快该循环的循环速度，因而从血浆中消除抗原的速度变快。进而，通过使抗原结合分子在ph酸性范围下的抗原结合活性低于ph中性范围下的抗原结合活性，可以进一步提高从血浆中消除抗原的速度。另外，由于该循环的循环速度加快使得其循环的数目增大，因而认为一分子的抗原结合分子可结合的抗原的分子数也变多。本发明的抗原结合分子包含抗原结合结构域和fcrn结合结构域，fcrn结合结构域不会对抗原结合造成影响，此外，考虑到上述机理，它们并不依赖于抗原的种类，因而认为通过使抗原结合分子在ph酸性范围或低钙离子浓度条件等离子浓度条件下的抗原结合活性(结合能力)低于ph中性范围或高钙离子浓度条件等离子浓度条件下的抗原结合活性(结合能力)，和/或使血浆中的ph下的fcrn结合活性增大，可以促进利用抗原结合分子的抗原向细胞内的摄入、可以加快抗原的消除速度。所以认为本发明的抗原结合分子在降低抗原带来的副作用、提高抗体的给予量、改善抗体在机体内的药代动力学等方面，与现有的治疗用抗体相比发挥了更优异的效果。
[0443]
图1示出通过给予与现有的中和抗体相比中性ph下对fcrn的结合增强了的ph依赖性抗原结合抗体，来从血浆中消除可溶型抗原的机制。不具有ph依赖性抗原结合能力的现有中和抗体在血浆中与可溶型抗原结合后，通过与细胞的非特异性相互作用而被缓慢摄入。被摄入细胞内的中和抗体和可溶型抗原的复合体转移到酸性的内体中，被fcrn再循环至血浆中。另一方面，增强了中性条件下的fcrn结合的ph依赖性抗原结合抗体在血浆中与可溶型抗原结合后，被快速摄入细胞膜上表达fcrn的细胞中。这里，与ph依赖性抗原结合抗体结合的可溶型抗原在酸性的内体中由于ph依赖性结合能力而从抗体解离。然后，从抗体解离的可溶型抗原转移至溶酶体，由于蛋白分解活性而受到分解。另一方面，将可溶型抗原解离了的抗体被fcrn再循环至细胞膜上，被再次释放至血浆中。如此经再循环而游离的抗体可以与其它的可溶型抗原再次结合。通过反复进行这种fcrn介导的向细胞内的摄入、可溶型抗原的解离和分解、抗体的再循环等的循环，这种增强了中性条件下的fcrn结合的ph依赖性抗原结合抗体可以使大量的可溶型抗原转移至溶酶体，使血浆中总抗原浓度降低。
[0444]
即，本发明还涉及包含本发明的抗原结合分子、由本发明的改变方法制作的抗原结合分子、或由本发明的制造方法制造的抗原结合分子的药物组合物。通过给予本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造的抗原结合分子，与通常的抗原结合分子相比，由于使血浆中的抗原浓度降低的作用高，而且被给予的机体的免疫应答和该机体中的药代动力学等得到改变，因而作为药物组合物有用。本发明的药物组合物中可含有药学上可接受的载体。
[0445]
本发明中，药物组合物通常是指用于疾病的治疗或预防、或检查
·
诊断的药剂。
[0446]
本发明的药物组合物可使用本领域技术人员公知的方法来进行制剂化。例如，可以以水或其以外的药学上可接受的液体的无菌性溶液、或悬浮液剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可以适宜组合药理学上可接受的载体或介质、具体地、适宜组合灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等，以通常所认可的制药实践所要求的单位用量形态进行混和，由此进行制剂。设定这些制剂中的有效成分量，以便可得到指示范围的适当容量。
[0447]
用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水之类的载体按照通常的制剂实践来进行配制。作为注射用水溶液，可举出例如生理盐水、含有葡萄糖或其它佐剂(例如d-山梨糖醇、d-甘露糖、d-甘露醇、氯化钠)的等渗液。可以与适当的溶解助剂、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇酯80(tm)、hco-50等)并用。
[0448]
油性液可举出芝麻油、大豆油，还可以并用苯甲酸苄酯和/或苯甲醇作为溶解助剂。另外，还可以与缓冲剂(例如、磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如、盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如、苯甲醇和苯酚)、抗氧化剂配合。所制备的注射液通常填充于适当的安瓿中。
[0449]
本发明的药物组合物优选通过非口服给药来给予给予例如注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、经皮给予型的组合物。通过例如静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等可全身或局部给予。
[0450]
给予方法可根据患者的年龄、症状而适宜选择。含有抗原结合分子的药物组合物的给予量可设定为例如对于一次给药体重每1kg为0.0001mg至1000mg的范围。或者，可设定例如每个患者为0.001～100000mg的给予量，本发明并受上述数值的限制。给予量和给予方法根据患者的体重、年龄、症状等而改变，本领域技术人员可以考虑这些条件设定适当的给予量和给予方法。
[0451]
另外，本发明还提供至少含有本发明的抗原结合分子的、用于本发明的方法的试剂盒。该试剂盒中还可以包装有药学上可接受的载体、介质、记载有使用方法的说明书等。
[0452]
另外本发明还涉及含有本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子作为有效成分的、抗原结合分子的药代动力学改善剂或抗原结合分子的免疫原性降低剂。
[0453]
另外本发明还涉及包括将本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造的抗原结合分子给予对象(被测者)的步骤的免疫炎症性疾病的治疗方法。
[0454]
另外本发明还涉及本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子在制造抗原结合分子的药代动力学改善剂或抗原结合分子的免疫原性降低剂中的用途。
[0455]
另外本发明还涉及用于在本发明的方法中使用的、本发明的抗原结合分子或由本发明的制造方法制造得到的抗原结合分子。
[0456]
应予说明，本发明所记载的氨基酸序列中所含的氨基酸有时也会在翻译后受到修饰(例如，n末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰基化而修饰成为焦谷氨酸是本领域技术人员熟知的修饰)，这种氨基酸经翻译后修饰的情形自然也包含在本发明所记载的氨基酸序列中。
[0457]
应予说明，本说明书中引用的全部现有技术文献作为参考并入本说明书中。实施例
[0458]
以下通过实施例具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例所限制。
[0459]
〔实施例1〕增强中性条件下的人fcrn结合对ph依赖性人il-6受体结合人抗体的血浆中滞留性和免疫原性的影响为了消除来自血浆中的可溶型抗原，与fcrn相互作用的抗体等抗原结合分子的fc区(nat.rev.immunol.(2007)7(9),715-25)等fcrn结合结构域具有ph中性范围下的fcrn结合活性是重要的。如参考实施例5所示，研究了fcrn结合结构域的具有ph中性范围下的fcrn结合活性的fcrn结合结构域突变(氨基酸置换)体。对创建为fc突变体的f1～f600在ph中性范围下的fcrn结合活性进行评价，确认了通过增强ph中性范围下的fcrn结合活性，来自血浆中的抗原的消除得到加速。为了将这种fc突变体开发为医药品，优选不仅药理学性质(fcrn的结合增强引起抗原从血浆中的消除加速等)优异，而且还优选抗原结合分子的稳定性和纯度、抗原结合分子在机体内的血浆中滞留性优异、免疫原性低。
[0460]
已知由于在中性条件下与fcrn结合，抗体的血浆中滞留性变差。若中性条件下与fcrn结合，则即使在内体内的酸性条件下与fcrn结合而返回到细胞表面上，在中性条件下的血浆中，igg抗体也不会从fcrn解离，此时igg抗体未被再循环至血浆中，因而反而会损害血浆中滞留性。例如，将通过对igg1导入氨基酸置换而在中性条件下(ph7.4)观察到对小鼠fcrn的结合的抗体给予小鼠时，据报道抗体的血浆中滞留性变差(非专利文献10)。但另一方面，在对食蟹猴给予观察到中性条件下(ph7.4)对人fcrn的结合的抗体时，据报道抗体的血浆中滞留性没有发生改善，血浆中滞留性未观察到变化(非专利文献10、11和12)。
[0461]
此外，据报道fcrn表达于抗原呈递细胞并参与抗原呈递。虽然不是抗原结合分子，但在评价对髓磷脂碱性蛋白(mbp)融合了小鼠igg1的fc区的蛋白(以下mbp-fc)的免疫原性进行评价的报告中，mbp-fc特异性地反应的t细胞在mbp-fc的存在下通过培养而发生活化、增殖。这里，已知通过向mbp-fc的fc区添加使对fcrn的结合增强的突变，就体外来说，使得表达于抗原呈递细胞的fcrn介导的向抗原呈递细胞中的摄入增大，由此使t细胞的活化得到增强。然而，由于施加使fcrn结合增强的改变会使血浆中滞留性变差，因而据报道t细胞在体内的活化反而减弱(非专利文献43)。
[0462]
这样，无法充分考察增强中性条件下的fcrn结合对抗原结合分子的血浆中滞留性和免疫原性造成的影响。将抗原结合分子开发为医药品时，优选抗原结合分子的血浆中滞留性长，还优选免疫原性低。
[0463]
(1-1)人il-6受体结合人抗体的制作因此，为了对包含具有ph中性范围条件下的人fcrn结合的fcrn结合结构域的抗原结合分子的血浆中滞留性进行评价、以及对该抗原结合分子的免疫原性进行评价，作为具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性的人il-6受体结合人抗体，通过参考实施例1和参考实施例2所示的方法制作了：由vh3-igg1(序列编号：35)和vl3-ck(序列编号：36)形成的fv4-igg1、由vh3-igg1-f1(序列编号：37)和vl3-ck形成的fv4-igg1-f1、由vh3-igg1-f157(序列编号：38)和vl3-ck形成的fv4-igg1-f157、由vh3-igg1-f20(序列编号：39)和vl3-ck形成的fv4-igg1-f20、由vh3-igg1-f21(序列编号：40)和vl3-ck形成的fv4-igg1-f21。
[0464]
(1-2)小鼠fcrn结合的动力学分析通过参考实施例2所示的方法制作含有vh3-igg1或vh3-igg1-f1作为重链、含有l(wt)-ck(序列编号：41)作为轻链的抗体，如下所述对小鼠fcrn结合活性进行评价。
[0465]
使用biacore t100(ge healthcare)，进行小鼠fcrn和抗体的动力学分析。在传感
器芯片cm4(ge healthcare)上，以胺偶联法将适当量的蛋白l(actigen)固定化，并在其上捕获目标抗体。接着，注入fcrn稀释液和流动缓冲液(作为参照溶液)，使小鼠fcrn与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。流动缓冲液使用50mmol/l磷酸钠、150mmol/lnacl、0.05％(w/v)tween20、ph7.4，fcrn的稀释也使用各缓冲液。传感器芯片的再生使用10mmol/l甘氨酸-hcl,ph1.5。测定均在25℃下实施。由测定所得的传感图算出作为动力学参数的结合速度常数ka(1/ms)、和解离速度常数kd(1/s)，基于它们计算各抗体对小鼠fcrn的kd(m)。各参数的计算中使用了biacore t100 evaluation software(ge healthcare)。
[0466]
结果，未检测出igg1的kd(m)，而制作的igg1-f1的kd(m)为1.06e-06(m)。显示制作的igg1-f1在ph中性范围(ph7.4)条件下的小鼠fcrn结合活性增强。
[0467]
(1-3)使用正常小鼠的体内pk试验使用具有制作的ph依赖性人il-6受体结合人抗体fv4-igg1和fv4-igg1-f1的正常小鼠，通过下述方法实施pk试验。在正常小鼠(c57bl/6j小鼠、charles river japan)的尾静脉或背部皮下以1mg/kg单次给予抗人il-6受体抗体。在抗人il-6受体抗体的给予后5分、7小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天的时刻进行采血。将采集的血液立即在4℃、15000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
[0468]
(1-4)利用elisa法测定血浆中抗人il-6受体抗体浓度小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体浓度用elisa法测定。首先，将抗人igg(γ-链特异性)f(ab')2fragment of antibody(sigma)分配于nunc-immuno plate,maxisoup(nalge nunc international)，在4℃静置1晩，由此制作抗人igg固定化板。制备含有血浆中浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/ml的抗人il-6受体抗体的校准曲线试样以及经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样。在这些校准曲线试样和血浆测定试样100μl中加入20ng/ml的可溶型人il-6受体200μl，将所得混合液在室温静置1小时。然后将各孔中分配有该混合液的抗人igg固定化板进一步在室温静置1小时。然后，与生物素化抗人il-6r抗体(r&d)在室温反应1小时，进而与链霉亲和素-polyhrp80(stereospecific detection technologies)在室温反应1小时，使用tmb one component hrp microwell substrate(biofx laboratories)作为底物来进行反应液的显色反应。通过添加1n-硫酸(showa chemical)来终止反应，用酶标仪测定各孔反应液的450nm吸光度。小鼠血浆中的抗体浓度是使用分析软件softmax pro(molecular devices)，根据校准曲线的吸光度算出。
[0469]
将ph依赖性人il-6受体结合人抗体静脉内或皮下给予正常小鼠后的血浆中的ph依赖性人il-6受体结合抗体浓度示于图2。图2的结果示出，与静脉内给予的fv4-igg1相比，静脉内给予增强了中性条件下的小鼠fcrn结合的fv4-igg1-f1时的血浆中滞留性变差。另一方面，皮下给予的fv4-igg1显示与静脉内给予时同等的血浆中滞留性，但在皮下给予fv4-igg1-f1的情形中，从给予7天后观察到被认为是小鼠抗fv4-igg1-f1抗体的产生所致的剧烈血浆中浓度的降低，在给予后第14天时在血浆中未检测到fv4-igg1-f1。由该结果确认，通过增强抗原结合分子在中性条件下的fcrn结合，血浆中滞留性和免疫原性变差。
[0470]
〔实施例2〕制作具有ph中性范围条件下的小鼠fcrn结合活性的人il-6受体结合小鼠抗体通过以下方法制作具有ph中性范围条件下的小鼠fcrn结合活性的小鼠抗体。
[0471]
(2-1)制作人il-6受体结合小鼠抗体作为小鼠抗体的可变区，使用了对人il-6r具有结合能力的小鼠抗体小鼠pm-1(sato k,et al.cancer res.(1993)53(4),851-856)的氨基酸序列。以下，将小鼠pm-1的重链可变区记为mpm1h(序列编号：42)、轻链可变区记为mpm1l(序列编号：43)。
[0472]
此外，作为重链恒定区使用天然型小鼠igg1(序列编号：44，以下记为migg1)，作为轻链恒定区使用天然型小鼠kappa(序列编号：45，以下记为mk1)。
[0473]
按照参考实施例1的方法，制作具有重链mpm1h-migg1(序列编号：46)和轻链mpm1l-mk1(序列编号：47)的碱基序列的表达载体。此外，按照参考实施例2的方法，制作包含mpm1h-migg1和mpm1l-mk1的人il-6r结合小鼠抗体mpm1-migg1。
[0474]
(2-2)制作在ph中性范围条件下具有小鼠fcrn结合能力的mpm1抗体制作的mpm1-migg1是包含天然型小鼠fc区的小鼠抗体，不具有ph中性范围条件下的小鼠fcrn结合活性。因此，为了赋予ph中性范围条件下的小鼠fcrn结合活性，对mpm1-migg1的重链恒定区导入氨基酸改变。
[0475]
具体地，制作施加了下述置换的mpm1h-migg1-mf3(序列编号：48)：mpm1h-migg1的以eu编号表示的252位的thr置换为tyr的氨基酸置换、以eu编号表示的256位的thr置换为glu的氨基酸置换、以eu编号表示的433位的his置换为lys的氨基酸置换、以eu编号表示的434位的asn置换为phe的氨基酸置换。
[0476]
同样地，制作施加了下述置换的mpm1h-migg1-mf14(序列编号：49)：mpm1h-migg1的以eu编号表示的252位的thr置换为tyr的氨基酸置换、以eu编号表示的256位的thr置换为glu的氨基酸置换、以eu编号表示的433位的his置换为lys的氨基酸置换。
[0477]
进而，制作施加了下述置换的mpm1h-migg1-mf38(序列编号：50)：mpm1h-migg1的以eu编号表示的252位的thr置换为tyr的氨基酸置换、以eu编号表示的256位的thr置换为glu的氨基酸置换、以eu编号表示的434位的asn置换为trp的氨基酸置换。
[0478]
使用参考实施例2的方法，制作包含mpm1h-migg1-mf3和mpm1l-mk1的mpm1-migg1-mf3来作为具有ph中性范围条件下的小鼠fcrn结合的小鼠igg1抗体。
[0479]
(2-3)通过biacore确认小鼠fcrn结合活性制作含有mpm1-migg1或mpm1-migg1-mf3的重链和、l(wt)-ck(序列编号：41)的轻链的抗体，测定这些抗体在ph7.0下的小鼠fcrn结合活性(解离常数kd)。结果示于以下表5。
[0480]
[表5]变体名mfcrn kd(m)氨基酸置换migg1未检出 migg1-mf31.6e-09t252y/t256e/h433k/n434f。
[0481]
〔实施例3〕具有fc区的抗原结合分子对fcrn和fcγr的结合实验实施例1中确认到，通过增强抗原结合分子在中性条件下的fcrn结合，血浆中滞留性和免疫原性变差。天然型igg1由于在中性区域不具有对人fcrn的结合活性，因而认为通过赋予中性条件下的对fcrn的结合，血浆中滞留性和免疫原性变差。
[0482]
(3-1)fcrn结合结构域和fcγr结合结构域抗体的fc区中存在针对fcrn的结合结构域和针对fcγr的结合结构域。已报道，针
对fcrn的结合结构域存在于fc区的2处，2分子的fcrn可以同时与1分子抗体的fc区结合(nature(1994)372(6504)，379-383)。另一方面，针对fcγr的结合结构域也存在于fc区的2处，但认为2分子的fcγr不能同时结合。这是因为，第1分子的fcγr与fc区结合而产生的fc区的结构变化导致无法结合第2分子的fcγr(j.biol.chem.(2001)276(19)，16469-16477)。
[0483]
如上所述，活性型fcγr表达在树突细胞或nk细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、脂肪细胞等许多免疫细胞的细胞膜上。进而，据报道fcrn在人中在树突细胞、巨噬细胞、单核细胞等抗原呈递细胞等免疫细胞中表达(j.immunol.(2001)166(5)，3266-3276)。通常的天然型igg1在ph中性范围下无法与fcrn结合，而只和fcγr结合，因而天然型igg1通过形成fcγr/igg1的二者复合体而与抗原呈递细胞结合。fcγr和fcrn的细胞内结构域中存在磷酸化位点。通常，表达于细胞表面的受体的细胞内结构域的磷酸化由受体的缔合而引起，该磷酸化引起受体的内在化。天然型igg1即使在抗原呈递细胞上形成fcγr/igg1的二者复合体，也不会引起fcγr的细胞内结构域的缔合，但具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的igg分子若形成包含fcγr/两分子的fcrn/igg的四者的复合体时，则会发生fcγr和fcrn的3个细胞内结构域的缔合，因而认为这可能诱导包含fcγr/两分子的fcrn/igg的四者的异源复合体的内在化。包含fcγr/两分子的fcrn/igg的四者的异源复合体的形成被认为是发生在共表达fcγr和fcrn的抗原呈递细胞上，因此认为将抗体分子摄入抗原呈递细胞中的血浆中滞留性变差，进而免疫原性可能变差。
[0484]
然而，迄今为止尚未报道包含具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的fc区等fcrn结合结构域的抗原结合分子是以何种形式与共表达fcγr和fcrn的抗原呈递细胞等免疫细胞结合的研究。
[0485]
可以形成fcγr/两分子的fcrn/igg的四者复合体与否，可通过包含具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的fc区的抗原结合分子是否可以同时与fcγr和fcrn结合来判断。因此，按照下述方法实施抗原结合分子所含的fc区与fcrn和fcγr的同时结合实验。
[0486]
(3-2)使用biacore评价与fcrn和fcγr的同时结合使用biacore t100或t200(ge healthcare)，评价人或小鼠fcrn和人或小鼠fcγrs是否同时与抗原结合分子结合。将被测对象的抗原结合分子捕获于传感器芯片cm4(ge healthcare)上通过胺偶联法固定化的人或小鼠fcrn上。接着，注入人或小鼠fcγrs的稀释液以及作为空白使用的流动缓冲液，使与传感器芯片上的fcrn结合的抗原结合分子和人或小鼠fcγrs相互作用。作为流动缓冲液，使用50mmol/l磷酸钠、150mmol/l nacl、0.05％(w/v)tween20、ph7.4，fcγrs的稀释也使用该缓冲液。传感器芯片的再生使用10mmol/l trsi-hcl、ph9.5。结合的测定均在25℃下实施。
[0487]
(3-3)人igg、人fcrn、人fcγr或小鼠fcγr的同时结合实验对作为在ph中性范围的条件下具有人fcrn结合能力的人抗体的实施例1中制作的fv4-igg1-f157与人fcrn结合的同时是否还与各种人fcγr或各种小鼠fcγr结合进行评价。
[0488]
结果显示，fv4-igg1-f157在与人fcrn结合的同时还可以与人fcγria、fcγriia(r)、fcγriia(h)、fcγriib、fcγriiia(f)结合(图3、4、5、6、7)。此外，fv4-igg1-f157同样显示在与人fcrn结合的同时还可与小鼠fcγri、fcγriib、fcγriii、fcγriv结合。(图8、
9、10、11)以上事实显示，具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性的人抗体在与人fcrn结合的同时还可以与人fcγria、fcγriia(r)、fcγriia(h)、fcγriib、fcγriiia(f)或小鼠fcγri、fcγriib、fcγriii、fcγriv等各种人fcγr和各种小鼠fcγr结合。
[0489]
(3-4)人igg、小鼠fcrn、小鼠fcγr的同时结合实验对作为在ph中性范围的条件下具有小鼠fcrn结合活性的人抗体的实施例1中制作的fv4-igg1-f20是否在与小鼠fcrn结合的同时还与各种小鼠fcγr结合进行评价。
[0490]
结果显示，fv4-igg1-f20在与小鼠fcrn结合的同时，还可以与小鼠fcγri、fcγriib、fcγriii、fcγriv结合(图12)。
[0491]
(3-5)小鼠igg、小鼠fcrn、小鼠fcγr
の
同时结合实验对作为在ph中性范围的条件下具有小鼠fcrn结合能力的小鼠抗体的实施例2中所制作的mpm1-migg1-mf3是否在与小鼠fcrn结合的同时还与各种小鼠fcγr结合进行评价。
[0492]
结果显示，mpm1-migg1-mf3在与小鼠fcrn结合的同时还可以与小鼠fcγriib和fcγriii结合(图13)。未确认到与小鼠fcγri和iv结合的结果，从小鼠igg1抗体不具有小鼠fcγri和iv结合能力的报道(j.immunol.(2011)187(4),1754-1763))来判断，是妥当的结果。
[0493]
这些实施显示，具有ph中性范围条件下的小鼠fcrn结合活性的人抗体和小鼠抗体在与小鼠fcrn结合的同时还可以与各种小鼠fcγr结合。
[0494]
以上事实显示，虽然人和小鼠igg的fc区中存在fcrn结合区和fcγr结合区，但它们不会相互干涉，可以形成包含一分子的fc和两分子的fcrn、一分子的fcγr的四者的异源复合体。
[0495]
抗体的fc区可以形成这种异源复合体的性质迄今为止尚未被报道，这是首次阐明。如上所述，抗原呈递细胞上表达有各种活性型fcγr和fcrn，抗原结合分子在抗原呈递细胞上形成这种四者复合体则暗示会使对抗原呈递细胞的亲和性提高，进而使细胞内结构域缔合而增强内在化信号，并促进向抗原呈递细胞中的摄入。通常，被摄入抗原呈递细胞中的抗原结合分子在抗原呈递细胞内的溶酶体中被分解，被呈递至t细胞。
[0496]
即，认为具有ph中性范围下的fcrn结合活性的抗原结合分子通过形成包含一分子的活性型fcγr和两分子的fcrn的四者的异源复合体，向抗原呈递细胞中的摄入增大，血浆中滞留性变差，进而免疫原性变差。
[0497]
因此，对具有ph中性范围下的fcrn结合活性的抗原结合分子导入突变，制作形成这种四者复合体的能力降低的抗原结合分子，并将该抗原结合分子给予机体时，可以提高该抗原结合分子的血浆中滞留性，另外还可以抑制该机体的免疫应答的诱发(即，可降低免疫原性)。作为不形成这种复合体而被摄入细胞内的抗原结合分子的优选方式，可举出以下三种。
[0498]
(方式1)具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且对活性型fcγr的结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的抗原结合分子方式1的抗原结合分子通过与2分子的fcrn结合而形成包含三者的复合体，但不形成包含活性型fcγr的复合体。
[0499]
(方式2)具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且具有对抑制性fcγr的选择结合活性的抗原结合分子方式2的抗原结合分子通过与两分子的fcrn和一分子的抑制性fcγ
r结合而可形成包含上述四者的复合体。然而，一分子的抗原结合分子只能与一分子的fcγr结合，因而一分子的抗原结合分子在与抑制性fcγr结合的状态下无法与其它的活性型fcγr结合。进而据报道，在与抑制性fcγr结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子会被再循环至细胞膜上、从而避免细胞内的分解(immunity(2005)23,503-514)。即，可认为具有针对抑制性fcγr的选择结合活性的抗原结合分子不能形成包含作为免疫应答原因的活性型fcγr的复合体。
[0500]
(方式3)构成fcrn结合结构域的二个多肽的仅一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且另一方不具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的抗原结合分子方式3的抗原结合分子可通过与一分子的fcrn和一分子的fcγr结合而形成三者复合体，但不会形成包含两分子的fcrn和一分子的fcγr的四者的异源复合体。
[0501]
期待上述方式1～3的抗原结合分子与能够形成包含两分子的fcrn和一分子的fcγr的四者的复合体的抗原结合分子相比，均可使血浆滞留性提高、使免疫原性降低。
[0502]
〔实施例4〕具有ph中性范围下的人fcrn结合活性、与人和小鼠fcγr的结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的人抗体的血浆中滞留性的评价(4-1)对人fcγr的结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低、且ph依赖性地与人il-6受体结合的抗体的制作在实施例3中所示的三个方式中，方式1的抗原结合分子，即，具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且对活性型fcγr的结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的抗原结合分子如下所述进行制作。
[0503]
实施例1中制作的fv4-igg1-f21和fv4-igg1-f157是具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性、且ph依赖性地与人il-6受体结合的抗体。通过将它们的氨基酸序列的、以eu编号表示的239位的ser置换为lys的氨基酸置换，制作使小鼠fcγr结合降低的改变体。具体地，制作vh3-igg1-f21的氨基酸序列的以eu编号表示的239位的ser被置换为lys的vh3-igg1-f140(序列编号：51)。此外，还制作vh3-igg1-f157位氨基酸序列的以eu编号表示的239位的ser被置换为lys的vh3-igg1-f424(序列编号：52)。
[0504]
使用参考实施例2的方法，制作包含这些重链和vl3-ck的轻链的、fv4-igg1-f140和fv4-igg1-f424。
[0505]
(4-2)对人fcrn和小鼠fcγr的结合活性的确认含有制作的vh3-igg1-f21、vh3-igg1-f140、vh3-igg1-f157、或vh3-igg1-f424作为重链，含有l(wt)-ck作为轻链的抗体的ph7.0下的人fcrn结合活性(解离常数kd)和ph7.4下的小鼠fcγr结合活性使用下述方法测定。
[0506]
(4-3)人fcrn结合的动力学分析使用biacore t100或t200(ge healthcare)，进行人fcrn和前述抗体的结合的动力学分析。在以上用胺偶联法适量固定化有蛋白l(actigen)的传感器芯片cm4(ge healthcare)上，捕获被测对象的抗体。接着，注入人fcrn的稀释液和作为空白使用的流动缓冲液，使捕获于传感器芯片上的抗体与人fcrn相互作用。作为流动缓冲液，使用50mmol/l磷酸钠、150mmol/l nacl、0.05％(w/v)tween20、ph7.0或ph7.4，人fcrn的稀释也使用各缓冲液。传感器芯片的再生使用10mmol/l甘氨酸-hcl，ph1.5。结合的测定均在25℃下实施。由测定所得的传感图算出作为动力学参数的结合速度常数ka(1/ms)、和解离速度常数kd(1/
s)，基于它们来计算各抗体对人fcrn的kd(m)。各参数的计算中使用了biacore t100或t200 evaluation software(ge healthcare)。
[0507]
其结果示于以下表6。
[0508]
[表6]变体名kd(m)氨基酸置换igg1-f213.0e-08
m252y/v308p/n434yigg1-f1403.6e-08
s239k/m252y/v308p/n434y gg1-f1571.5e-07
p257a/v308p/m428l/n434yigg1-f4249.4e-08
s239k/p257a/v308p/m428l/n434y使用以下的方法，实施ph7.4下的小鼠fcγr结合活性的测定。
[0509]
(4-4)小鼠fcγr结合活性的评价使用biacore t100或t200(ge healthcare)，评价小鼠fcγri、fcγrii、fcγriii、fcγriv(r&d sytems、sino biological)(以下，称为小鼠fcγrs)和抗体的结合活性。在传感器芯片cm4(ge healthcare)上用胺偶联法固定化适量的蛋白l(actigen)，并在其上捕获被测对象的抗体。接着，注入小鼠fcγrs的稀释液和作为空白使用的流动缓冲液，使与捕获于传感器芯片上的抗体相互作用。作为流动缓冲液，使用20mmol/l aces、150mmol/l nacl、0.05％(w/v)tween20、ph7.4，小鼠fcγrs的稀释也使用该缓冲液。传感器芯片的再生中使用10mmol/l甘氨酸-hcl、ph1.5。测定均在25℃下实施。
[0510]
对小鼠fcγrs的结合活性可通过对小鼠fcγrs的相对结合活性来表示。使抗体捕获于蛋白l上，将捕获该抗体前后的传感图的变化量作为x1。接着，使该抗体与小鼠fcγrs相互作用，将表示为该作用前后的传感图变化量(δa1)的小鼠fcγrs的结合活性除以各抗体的捕获量(x)，从将所得值乘以1500倍而得的值中，减去表示为使捕获于蛋白l的抗体与流动缓冲液相互作用前后的传感图变化量(δa2)的小鼠fcγrs的结合活性，将所得值除以各抗体的捕获量(x)，将所得值乘以1500倍，将所得值(y)作为小鼠fcγrs的结合活性(式1)。
[0511]
〔式1〕小鼠fcγrs的结合活性(y)＝(δa1-δa2)/x
×
1500其结果示于以下表7。
[0512]
[表7]
[0513]
根据表2和表3的结果显示，fv4-igg1-f140和fv4-igg1-f424与fv4-igg1-f21和fv4-igg1-f157相比，在不影响人fcrn结合活性的情形下，对小鼠fcγr的结合降低。
[0514]
(4-5)使用人fcrn转基因小鼠的体内pk试验通过下述方法实施将制作的fv4-igg1-f140、fv4-igg1-f424、fv4-igg1-f21和fv4-igg1-f157给予人fcrn转基因小鼠时的pk试验。
[0515]
在人fcrn转基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrn tg品系32 / 小鼠、jackson laboratories、methods mol.biol.(2010)602,93-104)的尾静脉单次给予1mg/kg的抗人il-6受体抗体。在抗人il-6受体抗体的给予后15分、7小时、1天、2天、3天、4天、7天、14天、21天、28天的时刻进行采血。将采集的血液立即在4℃、15000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
[0516]
(4-6)利用elisa法测定血浆中抗人il-6受体抗体浓度小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体浓度用elisa法测定。首先，将抗人igg(γ-链特异性)f(ab')2fragment of antibody(sigma)分配于nunc-immuno plate,maxisoup(nalge nunc international)，在4℃静置1晩，由此制作抗人igg固定化板。制备含有血浆中浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/ml的抗人il-6受体抗体的校准曲线试样以及经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样。在这些校准曲线试样和血浆测定试样100μl中加入20ng/ml的可溶型人il-6受体200μl，将所得混合液在室温静置1小时。然后将各孔中分配有该混合液的抗人igg固定化板进一步在室温静置1小时。然后，与生物素化抗人il-6rantibody(r&d)在室温反应1小时，进而与链霉亲和素-polyhrp80(stereospecific detection technologies)在室温反应1小时，使用tmb one component hrp microwell substrate(biofx laboratories)作为底物来进行反应液的显色反应。通过添加1n-硫酸(showa chemical)来终止反应，用酶标仪测定各孔反应液的450nm吸光度。小鼠血浆中的抗体浓度是使用分析软件softmax pro(molecular devices)，根据校准曲线的吸光度算出。
[0517]
将ph依赖性人il-6受体结合抗体静脉内给予人fcrn转基因小鼠后的、血浆中的ph依赖性人il-6受体结合抗体浓度示于图14。
[0518]
由图14的结果确认，与fv4-igg1-f21相比，小鼠fcγr结合低的fv4-igg1-f140与fv4-igg1-f21相比，血浆中滞留性提高。同样确认到，与fv4-igg1-f157相比，小鼠fcγr结合低的fv4-igg1-f424与fv4-igg1-f157相比，血浆中滞留性延长。
[0519]
上述事实示出，具有下述fcγr结合结构域的抗体比具有通常的fcγr结合结构域的抗体的血浆中滞留性高，所述fcγr结合结构域具有ph中性范围条件下的人fcrn结合、且对fcγr的结合比通常的fcγr结合结构域低。
[0520]
本发明不受特定理论的束缚，作为观察到抗原结合分子的这种血浆中滞留性的提高的原因，认为是，该抗原结合分子具有具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性、且fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域低的fcγr结合结构域，因而实施例3中记载的四者复合体的形成受到阻碍。即，认为在抗原呈递细胞的细胞膜上形成四者复合体的fv4-igg1-f21和fv4-igg1-f157变得容易摄入抗原呈递细胞中。另一方面，对于属于实施例3所示的方式1的在抗原呈递细胞的细胞膜上不形成四者复合体的fv4-igg1-f140和fv4-igg1-f424来说，认为向抗原呈递细胞中的摄入受到阻碍。这里，认为抗原结合分子向例如血管内皮细胞等不表达活性型fcγr的细胞中的摄入主要是非特异性的摄入或细胞膜上的fcrn介导的摄入，没有fcγr结合活性的降低所致的影响。即，上述观察的血浆中滞留性的提高被认为是选择性地抑制向含有抗原呈递细胞的免疫细胞中的摄入的缘故。
[0521]
〔实施例5〕具有ph中性范围下的人fcrn结合活性、且不具有小鼠fcγr结合活性的人抗体的血浆中滞留性评价(5-1)不具有人和小鼠fcγr结合活性的ph依赖性地与人il-6受体结合的人抗体的制作为了制作不具有人和小鼠fcγr结合活性的ph依赖性地与人il-6受体结合的人抗体，如下所述进行抗体制作。
[0522]
通过将vh3-igg1的氨基酸序列的以eu编号表示的235位的leu置换为arg的氨基酸置换和将239位的ser置换为lys的氨基酸置换，制作不具有人和小鼠fcγr结合活性的vh3-igg1-f760(序列编号：53)。
[0523]
同样地，通过将vh3-igg1-f11(序列编号：54)、vh3-igg1-f890(序列编号：55)和vh3-igg1-f947(序列编号：56)的各氨基酸序列的、以eu编号表示的235位的leu置换为arg的氨基酸置换和将239位的ser置换为lys的氨基酸置换，制作不具有人和小鼠fcγr结合活性的vh3-igg1-f821(序列编号：57)、vh3-igg1-f939(序列编号：58)和vh3-igg1-f1009(序列编号：59)。
[0524]
使用参考实施例2的方法，制作含有这些重链和vl3-ck轻链的fv4-igg1、fv4-igg1-f11、fv4-igg1-f890、fv4-igg1-f947、fv4-igg1-f760、fv4-igg1-f821、fv4-igg1-f939和fv4-igg1-f1009。
[0525]
(5-2)人fcrn和小鼠fcγr结合活性的确认用参考实施例2的方法制作的含有vh3-igg1、vh3-igg1-f11、vh3-igg1-f890、vh3-igg1-f947、vh3-igg1-f760、vh3-igg1-f821、vh3-igg1-f939或vh3-igg1-f1009作为重链、含有l(wt)-ck作为轻链的抗体的ph7.0下的人fcrn结合活性(解离常数kd)用实施例4的方法来测定。测定结果示于以下表8。
[0526]
[表8]
[0527]
与实施例4的方法相同地，测定含有vh3-igg1、vh3-igg1-f11、vh3-igg1-f890、vh3-igg1-f947、vh3-igg1-f760、vh3-igg1-f821、vh3-igg1-f939或vh3-igg1-f1009作为重链、含有l(wt)-ck作为轻链的抗体的ph7.4下的小鼠fcγr结合活性。测定结果示于以下表9。
[0528]
[表9]
[0529]
表4和表5的结果示出，fv4-igg1-f760、fv4-igg1-f821、fv4-igg1-f939和fv4-igg1-f1009与fv4-igg1、fv4-igg1-f11、fv4-igg1-f890和fv4-igg1-f947相比，对小鼠fcγr的结合降低，而不影响对人fcrn的结合活性。
[0530]
(5-3)使用人fcrn转基因小鼠的体内pk试验通过下述方法实施将制作的fv4-igg1和fv4-igg1-f760给予人fcrn转基因小鼠时的pk试验。
[0531]
在人fcrn转基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrn tg品系32 / 小鼠、jackson laboratories、methods mol.biol.(2010)602,93-104)的尾静脉单次给予1mg/kg的抗人il-6受体抗体。在抗人il-6受体抗体的给予后15分、7小时、1天、2天、3天、4天、7天、14天、21天、28天的时刻进行采血。将采集的血液立即在4℃、15000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
[0532]
小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体浓度与实施例4的方法相同地用elisa法测定。其结果示于图15。使fv4-igg1对小鼠fcγr的结合活性降低了的fv4-igg1-f760与fv4-igg1-f11相比，显示基本同等的血浆中滞留性，未观察到使fcγr结合活性降低所致的血浆滞留性的提高效果。
[0533]
(5-4)使用人fcrn转基因小鼠的体内pk试验通过下述方法实施将制作的fv4-igg1-f11、fv4-igg1-f890、fv4-igg1-f947、fv4-igg1-f821、fv4-igg1-f939和fv4-igg1-f1009给予人fcrn转基因小鼠时的pk试验。
[0534]
在人fcrn转基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrn tg品系32 / 小鼠、jackson laboratories、methods mol.biol.(2010)602,93-104)的背部皮下单次给予1mg/kg的抗人il-6受体抗体。在抗人il-6受体抗体的给予后15分、7小时、1天、2天、3天、4天、7天、14天、21天、28天的时刻进行采血。将采集的血液立即在4℃、15000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
[0535]
小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体浓度与实施例4的方法相同地用elisa法测定。其结果示于图16。使fv4-igg1-f11的小鼠fcγr结合活性降低了的fv4-igg1-f821与fv4-igg1-f11相比，显示出大致同等的血浆中滞留性。另一方面，使fv4-igg1-f890的小鼠fcγr结合活性降低了的fv4-igg1-f939与fv4-igg1-f890相比，确认到血浆中滞留性的提高。同样地，使fv4-igg1-f947的小鼠fcγr结合活性降低了的fv4-igg1-f1009与fv4-igg1-f947
相比，确认到血浆中滞留性的提高。
[0536]
另一方面，对于fv4-igg1和igg1-f760两者，未确认到血浆中滞留性的不同，认为不具有ph中性范围下的fcrn结合活性的fv4-igg1可在免疫细胞上形成与fcγr的二者复合体，但不能形成四者复合体，因而通过fcγr结合活性的降低未确认到血浆中滞留性的提高。即，相对于具有ph中性范围下的fcrn结合活性的抗原结合分子，使fcγr结合活性降低，抑制四者复合体的形成，由此可以说首次确认到血浆中滞留性的提高。由上述事实认为，四者复合体的形成对血浆中滞留性的变差起着重要作用。
[0537]
(5-5)不具有人和小鼠fcγr结合活性的ph依赖性地与人il-6受体结合的人抗体的制作通过将vh3-igg1-f947(序列编号：56)的氨基酸序列的、以eu编号表示的234位的leu置换为ala的氨基酸置换和将235位的leu置换为ala的氨基酸置换，制作人和小鼠fcγr结合活性降低的vh3-igg1-f1326(序列编号：155)。
[0538]
使用参考实施例2的方法制作含有vh3-igg1-f1326重链和vl3-ck轻链的fv4-igg1-f1326。
[0539]
(5-6)人fcrn和小鼠fcγr结合活性的确认用参考实施例2的方法制作的含有vh3-igg1-f1326作为重链、含有l(wt)-ck作为轻链的抗体的ph7.0下的人fcrn结合活性(解离常数kd)用实施例4的方法来测定。此外，与实施例4的方法相同地，测定ph7.4下的小鼠fcγr结合活性。测定结果示于以下表10。
[0540]
[表10]
[0541]
表10的结果示出，fv4-igg1-f1326与fv4-igg1-f947相比，对小鼠fcγr的结合降低，而不影响对人fcrn的结合活性。
[0542]
使用(5-7)人fcrn转基因小鼠的体内pk试验以与实施例5-4的方法相同地实施将制作的fv4-igg1-f1326给予人fcrn转基因小鼠时的pk试验。小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体浓度与实施例4的方法相同地用elisa法测定。其结果与实施例5-4中所得的fv4-igg1-f947的结果合并示于图54。使fv4-igg1-f947的小鼠fcγr结合活性降低了的fv4-igg1-f1326与fv4-igg1-f947相比，确认到血浆中滞留性的提高。
[0543]
以上事实显示，对于增强了中性条件下的人fcrn结合的人抗体，通过使小鼠fcγr结合活性降低，抑制四者复合体的形成，可以提高在人fcrn转基因小鼠中的血浆中滞留性。这里，为了通过使小鼠fcγr结合活性降低而显示血浆中滞留性提高的效果，优选ph7.0下的对人fcrn的亲和性(kd)比310nm高，更优选为110nm以下。
[0544]
结果，与实施例4同样地，通过对抗原结合分子赋予方式1的性质而确认到血浆中滞留性的提高。这里观察到的血浆中滞留性的提高被认为其原因在于选择性地抑制向包含
抗原呈递细胞的免疫细胞中的摄入的缘故，其结果是可期待还能够抑制免疫应答的诱发。
[0545]
〔实施例6〕具有ph中性范围下的小鼠fcrn结合、且不具有小鼠fcγr结合活性的小鼠抗体的血浆中滞留性的评价(6-1)制作不具有小鼠fcγr结合活性的与人il-6受体结合的小鼠抗体在实施例4和5中，包含在ph中性范围条件下具有对人fcrn的结合活性、且对小鼠fcγr的结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的抗原结合分子显示在人fcrn转基因小鼠的血浆中滞留性提高。同样地，对包含在ph中性范围条件下具有小鼠fcrn结合活性、且小鼠fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的抗原结合分子在正常小鼠的血浆中滞留性提高与否进行了研究。
[0546]
通过将实施例2中制作的mpm1h-migg1-mf38的氨基酸序列的以eu编号表示的235位的pro置换为lys的氨基酸置换和将239位的ser置换为lys的氨基酸置换，制作mpm1h-migg1-mf40(序列编号：60)，通过将mpm1h-migg1-mf14的氨基酸序列的以eu编号表示的235位的pro置换为lys的氨基酸置换和将239位的ser置换为lys的氨基酸置换，制作mpm1h-migg1-mf39(序列编号：61)。
[0547]
(6-2)小鼠fcrn和小鼠fcγr结合活性的确认使用实施例2的方法，测定ph7.0下的小鼠fcrn结合活性(解离常数kd)。其结果示于以下表11。
[0548]
[表11]变体名kd(m)氨基酸置换migg1nd mf142.8e-08t252y/t256e/h433kmf384.0e-09t252y/t256e/n434wmf392.1e-08p235k/s239k/t252y/t256e/h433kmf403.2e-09p235k/s239k/t252y/t256e/n434w。
[0549]
使用实施例4的方法，测定ph7.4下的小鼠fcγr结合活性。其结果示于以下表12。
[0550]
[表12]
[0551]
(6-3)使用正常小鼠的体内pk试验通过下述方法实施将制作的mpm1-migg1-mf14、mpm1-migg1-mf38、mpm1-migg1-mf39、mpm1-m1gg1-mf40给予正常小鼠时的pk试验。
[0552]
在正常小鼠(c57bl/6j小鼠、charles river japan)的背部皮下单次给予1mg/kg
的抗人il-6受体抗体。在抗人il-6受体抗体的给予后5分、7小时、1天、2天、4天、7天、14天的时刻进行采血。将采集的血液立即在4℃、15000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
[0553]
(6-4)利用elisa法测定血浆中抗人il-6受体小鼠抗体浓度小鼠血浆中的抗人il-6受体小鼠抗体浓度通过elisa法进行测定。首先，将可溶型人il-6受体分配于nunc-immuno plate,maxisoup(nalge nunc international)中，在4℃静置1晩，由此制得可溶型人il-6受体固定化板。制备含有血浆中浓度为1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020μg/ml的抗人il-6受体小鼠抗体的校准曲线试样和经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样。将各孔中分配有这些校准曲线试样和血浆测定试样100μl的可溶型人il-6受体固定化板在室温静置2小时。然后，在室温和抗小鼠igg过氧化酶抗体(anti-mouse igg-peroxidase antibodysigma)反应1小时，进而和链霉亲和素-polyhrp80(stereospecific detection technologies)在室温反应1小时，使用tmb one component hrp microwell substrate(biofx laboratories)作为底物来进行反应液的显色反应。通过添加1n-硫酸(showa chemical)来终止反应，用酶标仪测定各孔反应液的450nm吸光度。小鼠血浆中的抗体浓度是使用分析软件softmax pro(molecular devices)，根据校准曲线的吸光度算出。用该方法测定的静脉内给予后的正常小鼠的血浆中抗体浓度的变化示于图17。
[0554]
由图17的结果确认到，不具有对小鼠fcγr的结合的mpm1-migg1-mf40与mpm1-migg1-mf38相比，血浆中滞留性提高。此外，不具有对小鼠fcγr的结合的mpm1-migg1-mf39与mpm1-migg1-mf14相比，确认到血浆中滞留性提高。
[0555]
以上事实显示，包含在ph中性范围条件下具有小鼠fcrn结合、且不具有小鼠fcγr结合活性的fcγr结合结构域的抗体与具有通常fcγr结合结构域的抗体相比，在正常小鼠中的血浆中滞留性高。
[0556]
结果，与实施例4和5同样地，相对于抗原结合分子，确认到具有方式1的性质的抗原结合分子的血浆中滞留性高。本发明不受特定理论的束缚，这里观察到的血浆中滞留性的提高被认为是选择性地抑制向抗原呈递细胞等免疫细胞中的摄入的缘故，其结果可期待能够抑制免疫应答的诱发。
[0557]
〔实施例7〕包含具有ph中性范围下的人fcrn结合、且人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的人源化抗体(抗人il-6受体抗体)的体外免疫原性的评价为了评价方式1的抗原结合分子，即，包含具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且活性型fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的抗原结合结构域的抗原结合分子在人中的免疫原性，通过下述方法评价针对该抗原结合分子的体外t细胞应答。
[0558]
(7-1)对人fcrn的结合活性的确认实施例4中测定的、vh3/l(wt)-igg1、vh3/l(wt)-igg1-f21和vh3/l(wt)-igg1-f140在ph中性范围条件下(ph7.0)的人fcrn结合常数(kd)示于以下表13。
[0559]
[表13]变体名kd(m)氨基酸置换igg1未检出 igg1-f213.0e-08m252y/v308p/n434y
igg1-f1403.6e-08s239k/m252y/v308p/n434y。
[0560]
(7-2)人fcγr结合活性的评价使用以下方法来测定vh3/l(wt)-igg1、vh3/l(wt)-igg1-f21、vh3/l(wt)-igg1-f140在ph7.4下的人fcγr结合活性。
[0561]
使用biacore t100或t200(ge healthcare)，评价人fcγria、fcγriia(h)、fcγriia(r)、fcγriib、fcγriiia(f)(以下，称为人fcγrs)和抗体的结合活性。在传感器芯片cm4(ge healthcare)上以胺偶联法固定化适当量的蛋白l(actigen)，并使被测对象的抗体捕获于其上。接着，注入人fcγrs的稀释液和用作空白的流动缓冲液，使与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。作为流动缓冲液，使用20mmol/l aces、150mmol/lnacl、0.05％(w/v)tween20、ph7.4，人fcγrs的稀释中也使用该缓冲液。传感器芯片的再生中使用10mmol/l甘氨酸-hcl、ph1.5。测定均在25℃下实施。
[0562]
人fcγrs结合活性由对人fcγrs的相对结合活性来表示。使抗体捕获于蛋白l上，将捕获该抗体前后的传感图的变化量作为x1。接着，使该抗体与人fcγrs相互作用，将表示为该作用前后的传感图变化量(δa1)的人fcγrs结合活性除以各抗体的捕获量(x)，从将所得值乘以1500倍而得的值中，减去表示为使捕获于蛋白l的抗体与流动缓冲液相互作用前后的传感图变化量(δa2)的人fcγrs结合活性，将所得值除以各抗体的捕获量(x)，将所得值乘以1500倍而得的值(y)作为人fcγrs结合活性(式2)。
[0563]
〔式2〕人fcγrs的结合活性(y)＝(δa1-δa2)/x
×
1500其结果示于以下表14。
[0564]
[表14]
[0565]
表14的结果显示，fv4-igg1-f140与fv4-igg1-f21相比，对各种人fcγr的结合降低，而对人fcrn的结合活性没有影响。
[0566]
(7-3)使用人pbmc的体外免疫原性试验使用实施例1中制作的fv4-igg1-f21、fv4-igg1-f140，如下所述实施体外免疫原性试验。
[0567]
外周血单核细胞(pbmc)由采集自正常人志愿者的血液分离。通过ficoll(ge healthcare)密度离心分离从血液分离得到pbmc，从该pbmc中，使用dynabeads cd8(invitrogen)，按照附带的标准操作流程，由磁铁除去cd8
t细胞。接着，使用dynabeads cd25(invitrogen)，按照附带的标准操作流程，由磁铁除去cd25
hi
t细胞。
[0568]
增殖试验如下所述实施。除去了cd8
和cd25
hi
t细胞、且重悬于含有2
×
106/ml的3％灭活人血清的aimv培养基(invitrogen)的各供体的pbmc加入平底24孔板，每1孔加入2
×
106细胞。在37℃、5％co2的条件下培养2小时后，以终浓度为10、30、100、300μg/ml的方式添加各被测物质，将细胞培养8天。在培养6、7和8天时，对转移至圆底96孔板的培养中的细胞悬浮液150μl加入brdu(脱氧尿嘧啶)，进一步对该细胞进行24小时培养。摄入与brdu一起进行培养的细胞的核内的brdu，使用brdu flow kit(bd bioscience)依照附带的标准操作流程进行染色，同时表面抗原(cd3、cd4和cd19)被抗cd3、cd4和cd19抗体(bd bioscience)所染色。接着，通过bd facs calibur或bd facs cantii(bd)检测brdu阳性cd4
t细胞的比例。在培养6、7和8天，计算被检物质的10、30、100、300μg/ml的各终浓度下的brdu阳性cd4
t细胞的比例，计算它们的平均值。
[0569]
结果示于图18。图18中示出了，cd4t
细胞对除去了cd8
和cd25
hi
t细胞的5人的人供体pbmc中的fv4-igg1-f21、fv4-igg1-f140的增殖应答。首先，相比于阴性对照，未观察到加入被检物质所带来的供体a、b和d的pbmc中的cd4t
细胞的增殖应答的增加。认为这些供体根本不会引起针对被检物质的免疫应答。另一方面，作为阴性对照，观察到了加入被检物质带来的供体c和e的pbmc中的cd4t
细胞的增殖应答。作为应注意的方面，可举出：对于供体c、e的任一者，与fv4-igg1-f21相比，cd4t
细胞针对fv4-igg1-f140的增殖应答降低的倾向。如上所述，fv4-igg1-f140与fv4-igg1-f21相比，对人fcγr的结合活性低，且具有方式1的性质。以上结果暗示，可以抑制针对包含具有ph中性范围条件下的fcrn结合、且人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的抗原结合结构域的抗原结合分子的免疫原性。
[0570]
〔实施例8〕包含具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性、且人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的抗原结合结构域的人源化抗体(抗人a33抗体)的体外免疫原性评价(8-1)ha33-igg1的制作如实施例7所示，由于人pbmc针对fv4-igg1-f21的免疫应答性本来就低，因而暗示它们不适于用来评价针对包含fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的抗原结合结构域的fv4-igg1-f140的免疫应答的抑制。因此，在体外免疫原性评价体系中，为了提高免疫原性降低效果的检测能力，制作针对a33抗原的人源化igg1抗体，即人源化a33抗体(ha33-igg1)。
[0571]
ha33-igg1在临床试验中在33-73％的被测者中被确认到抗抗体的产生(hwang等(methods(2005)36,3-10)和walle等(expert opin.bio.ther.(2007)7(3),405-418))。由于ha33-igg1的该高免疫原性是可变区序列所带来的，因而、相对于使ha33-igg1的ph中性范围下的fcrn结合活性增强了的分子，认为容易检测通过使fcγr结合活性降低、抑制四者复合体形成而实现的免疫原性降低效果。
[0572]
作为人源化a33抗体的重链可变区的ha33h(序列编号：62)和作为轻链可变区的ha33l(序列编号：63)的氨基酸序列可以由公知信息(british journal of cancer(1995)72,1364-1372)获得。此外，使用作为重链恒定区的天然型人igg1(序列编号：11、以下记为igg1)、作为轻链恒定区的天然型人kappa(序列编号：64、以下记为k0)。
[0573]
依照参考实施例1的方法，制作包含重链ha33h-igg1和轻链ha33l-k0的碱基序列的表达载体。此外，抑制参考实施例2的方法，制作包含重链ha33h-igg1和轻链ha33l-k0的人源化a33抗体，即，ha33-igg1。
[0574]
(8-2)具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性的a33结合抗体的制作制作的ha33-igg1由于是具有天然型人fc区的人抗体，因而不具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性。因此，为了赋予ph中性范围条件下的人fcrn结合能力，在ha33-igg1的重链恒定区导入氨基酸改变。
[0575]
具体地，通过将ha33-igg1的重链恒定区即ha33h-igg1的以eu编号表示的252位氨基酸从met置换为tyr、将以eu编号表示的308位氨基酸从val置换为pro、将以eu编号表示的434位氨基酸从asn置换为tyr，制作ha33h-igg1-f21(序列编号：65)。使用参考实施例2的方法，作为具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性的a33结合抗体，制作含有ha33h-igg1-f21作为重链、含有ha33l-k0作为轻链的ha33-igg1-f21。
[0576]
(8-3)制作包含ph中性范围条件下的人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的a33结合抗体为了降低ha33-igg1-f21的人fcγr结合活性，将ha33h-igg1-f21的氨基酸序列的以eu编号表示的239位的ser置换为lys，从而制作ha33h-igg1-f140(序列编号：66)。
[0577]
(8-4)通过体外t-细胞试验评价各种a33结合抗体的免疫原性使用与实施例7同样的方法，对制作的ha33-igg1-f21、ha33-igg1-f140进行免疫原性的评价。应予说明，作为供体的正常人志愿者与分离实施例7中所用pbmc的正常人志愿者并非是同一个体。即，实施例7中的供体a和本试验中的供体a是不同个体的正常人志愿者。
[0578]
试验结果示于图19。图19中，对具有ph中性范围下的人fcrn结合的ha33-igg1-f21、和进一步含有人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的ha33-igg1-f140的结果进行比较。与阴性对照相比，未观察到从供体c、d和f分离的pbmc对ha33-igg1-f21的反应，因而供体c、d和f被认为是对ha33-igg1-f21不引起免疫应答的供体。对于从这以外的7名供体(供体a、b、e、g、h、i和j)中分离的pbmc，观察到针对ha33-igg1-f21的免疫应答与阴性对照相比更高，ha33-igg1-f21在体外如期待那样显示出高免疫原性。另一方面，针对包含人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的ha33-igg1-f140，从上述全部7名供体(供体a、b、e、g、h、i和j)中分离的pbmc的免疫应答与针对ha33-igg1-f21的免疫应答相比，观察到降低的效果。此外，从供体e和j分离的pbmc对ha33-igg1-f140的免疫应答与阴性对照为相同程度，由此认为，对于具有ph中性范围下的人fcrn结合活性的抗原结合分子中，通过使人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低而抑制四者复合体的形成，可以降低免疫原性。
[0579]
〔实施例9〕具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性、且不具有人fcγr结合活性的人源化抗体(抗人a33抗体)的体外免疫原性评价(9-1)在ph中性范围条件下对人fcrn具有强结合活性的a33结合抗体的制作针对ha33h-igg1，将以eu编号表示的252位的氨基酸从met置换为tyr、将以eu编号表示的286位的氨基酸从asn置换为glu、将以eu编号表示的307位的氨基酸从thr置换为gln、将以eu编号表示的311位的氨基酸从gln置换为ala、将以eu编号表示的434位的氨基酸从asn置换为tyr，由此利用参考实施例1的方法制作ha33h-igg1-f698(序列编号：67)。作为在ph中性范围条件下对人fcrn具有强结合活性的人a33结合抗体，制作含有ha33h-igg1-f698作为重链、含有ha33l-k0作为轻链的ha33-igg1-f698。
[0580]
(9-2)制作包含ph中性范围条件下的人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的抗原结合结构域的a33结合抗体制作将ha33h-f698的以eu编号表示的239位的ser置换为lys、且包含人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的抗原结合结构域的ha33h-igg1-f699(序列编号：68)。
[0581]
使用实施例4的方法，测定vh3/l(wt)-igg1、vh3/l(wt)-igg1-f698和vh3/l(wt)-igg1-f699在ph7.0下的人fcrn结合活性。进而，使用实施例7的方法，测定vh3/l(wt)-igg1、vh3/l(wt)-igg1-f698和vh3/l(wt)-igg1-f699在ph7.4下的人fcγr结合活性。其结果一并示于以下表15。
[0582]
[表15]
[0583]
如表15所示，含有各种人fcγr的结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的抗原结合结构域的、以eu编号表示的239位的ser置换为lys的vh3/l(wt)-igg1-f699虽然对hfcgriia(r)、hfcgriia(h)、hfcgriib、hfcgriiia(f)的结合降低，但具有对hfcgri的结合活性。
[0584]
(9-3)通过体外t-细胞试验评价各种a33结合抗体的免疫原性使用与实施例7相同的方法，评价针对制作的ha33-igg1-f698、ha33-igg1-f699的免疫原性。应予说明，作为供体的正常人志愿者与实施例7和8中使用的分离出pbmc的正常人志愿者并非同一个体。即，实施例7和实施例8的供体a与本试验中的供体a是不同个体的正常人志愿者。
[0585]
试验结果示于图20。图20中，对具有ph中性范围条件下的人fcrn强结合活性的ha33-igg1-f698、和进一步含有人fcγr结合活性比天然型fcγr结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的ha33-igg1-f699的结果进行比较。与阴性对照相比，未观察到从供体g和i分离的pbmc对ha33-igg1-f698的反应，因而供体g和i被认为是对ha33-igg1-f698不引起免疫应答的供体。对于从这以外的7名供体(供体a、b、c、d、e、f和h)中分离的pbmc，观察到针对ha33-igg1-f698的免疫应答与阴性对照相比更高，与前述ha33-igg1-f21同样地在体外显示高免疫原性。另一方面，针对包含人fcγr结合活性比天然型fcγr结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的ha33-igg1-f699，从5名供体(供体a、b、c、d和f)中分离的pbmc的免疫应答与针对ha33-igg1-f698的免疫应答相比，观察到降低的效果。特别确认到，从供体c和f中分离的pbmc对ha33-igg1-f699的免疫应答与阴性对照为相同程度。由于不仅对ha33-igg1-f21，而且对具有更强人fcrn结合活性的ha33-igg1-f698也确认到免疫原性降低效果，因而显示具有ph中性范围下的人fcrn结合活性的抗原结合分子，可通过使人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低而抑制四者复合体的形成，由此降低免疫原性。
[0586]
(9-4)制作不具有ph中性范围条件下的人fcγria结合活性的a33结合抗体如(9-3)中所述，通过将ha33-igg1-f698的以eu编号表示的239位的ser置换为lys，各种人fcγr结合活性降低的ha33-igg1-f699对hfcgriia(r)、hfcgriia(h)、hfcgriib、hfcgriiia(f)的结合虽然显著降低，但仍残留对hfcgri的结合。
[0587]
因此，为了制作包含对包括hfcgria在内的全部人fcγr不具有结合的fcγr结合结构域的a33结合抗体，制作将ha33h-igg1-f698(序列编号：67)的以eu编号表示的235位的leu置换为arg、将以eu编号表示的239位的ser置换为lys的ha33h-igg1-f763(序列编号：69)。
[0588]
使用实施例4的方法，测定vh3/l(wt)-igg1、vh3/l(wt)-igg1-f698、vh3/l(wt)-igg1-f763在ph中性范围条件下(ph7.0)的人fcrn结合常数(kd)。此外，通过实施例7中记载的方法，评价vh3/l(wt)-igg1、vh3/l(wt)-igg1-f698、vh3/l(wt)-igg1-f763对人fcγr的结合活性。其结果一并示于以下表16。
[0589]
[表16][表16]
[0590]
如表16所示，将以eu编号表示的235位的leu置换为arg、将以eu编号表示的239位的ser置换为lys而得的igg1-f763显示对包括hfcγria在内的全部人fcγr的结合活性降低。
[0591]
(9-5)通过体外t-细胞试验评价各种a33结合抗体的免疫原性使用与实施例7同样的方法，对制作的ha33-igg1-f698、ha33-igg1-f763的免疫原性进行评价。应予说明，和以上同样，作为供体的正常人志愿者与前述实施例中所用的分离出pbmc的正常人志愿者并不同一个体。即，前述实施例中的供体a和本试验中的供体a是不同个体的正常人志愿者。
[0592]
试验结果示于图21。图21中，对具有ph中性范围条件下的人fcrn强结合活性的ha33-igg1-f698、和进一步含有人fcγr结合活性比天然型fcγr结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的ha33-igg1-f763的结果进行比较。与阴性对照相比，未观察到从供体b、e、f和k分离的pbmc对ha33-igg1-f698的反应，因而供体b、e、f和k被认为是对ha33-igg1-f698不引起免疫应答的供体。对于从这以外的7名供体(供体a、c、d、g、h、i、和j)分离的pbmc，观察到针对ha33-igg1-f698的免疫应答与阴性对照相比更高。另一方面，针对包含人fcγr结合活性比天然型fcγr结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的ha33-igg1-f763，从4名供体(供体a、c、d和h)中分离的pbmc的免疫应答与针对ha33-igg1-f698的免疫应答相比，观察到降低的效果。上述4名供体中，特别是从供体c、d和h中分离的pbmc对ha33-igg1-f763的免疫应答与阴性对照为相同程度，在通过使fcγr结合降低而降低pbmc的免疫应答的4名供体中，实际上有3名能够完全抑制pbmc的免疫应答。由此认为，包含人fcγr结合活性低的fcγr结合结构域的抗原结合分子是降低了免疫原性的极其有效的分子。
[0593]
由实施例7、8和9的结果确认，与能在抗原呈递细胞上形成四者复合体的抗原结合
分子相比，针对通过降低对活性型fcγr的结合而抑制了四者复合体形成的抗原结合分子(方式1)的免疫应答，在许多供体中受到抑制。以上结果显示，在抗原呈递细胞上形成四者复合体对于抗原结合分子的免疫应答来说是重要的，不形成该复合体的抗原结合分子在许多供体中可以降低免疫原性。
[0594]
〔实施例10〕具有ph中性范围下的人fcrn结合活性、且不具有小鼠fcγr结合活性的人源化抗体的体内免疫原性评价在实施例7、8和9中，包含具有ph中性范围下的人fcrn结合活性、且fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的fcγr结合结构域的抗原结合分子，与fcγr结合活性未被降低的抗原结合分子相比，在体外实验中显示免疫原性降低。为了确认在体内也显示该效果，实施了下述试验。
[0595]
(10-1)人fcrn转基因小鼠的体内免疫原性试验使用实施例5中所得的小鼠血浆，通过下述方法评价针对fv4-igg1-f11、fv4-igg1-f890、fv4-igg1-f947、fv4-igg1-f821、fv4-igg1-f939、fv4-igg1-f1009的抗体产生。
[0596]
(10-2)通过电化学发光法测定血浆中抗给予样本(anti-administered specimen)抗体测定用电化学发光法测定小鼠的血浆中抗给予样本抗体。首先，将给予样本分配于uncoated multi-array plate(meso scale discovery)，在4℃静置1晩，由此制作给予样本固定化板。制备稀释至50倍的小鼠血浆测定试样，分配于给予样本固定化板，在4℃反应1晩。然后，与用sulfo-tag nhs ester(meso scale discovery)进行了钌标记的抗小鼠igg(完整分子)(sigma)在室温反应1小时，分配读数缓冲液t(
×
4)(meso scale discovery)，立即用sector pr 400(meso scale discovery)进行测定。对于每个测定体系，将未给予抗体的5个个体的血浆作为阴性对照样品进行测定，使用这5个个体的血浆测定得到的数值的平均值(mean)加上使用5个个体的血浆测定得到的数值的标准偏差(sd)的1.645倍，将所得数值(x)用作阳性判定基准(式3)。在任一采血日即使显示出1次高于阳性判定基准的反应的个体，也判定为对被检物质的抗体产生应答为阳性。
[0597]
〔式3〕抗体产生的阳性判定基准(x)＝mean 1.645
×
sd。
[0598]
(10-3)通过降低对fcγr的结合活性所致的体内免疫原性的抑制效果其结果示于图22至图27。图22中示出，将fv4-igg1-f11给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的、针对fv4-igg1-f11产生的小鼠抗体的抗体效价。在给予后任一采血日，3只小鼠中的1只小鼠(#3)中，针对fv4-igg1-f11的小鼠抗体的产生均显示为阳性(阳性率1/3)。另一方面，图23中示出，将fv4-igg1-f821给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的、针对fv4-igg1-f821产生的小鼠抗体的抗体效价。在给予后任一采血日，3只小鼠全部中，针对fv4-igg1-f821的小鼠抗体的产生均显示为阴性(阳性率0/3)。
[0599]
图24a和作为其放大图的图24b中示出，将fv4-igg1-f890给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的、针对fv4-igg1-f890而产生的小鼠抗体的抗体效价。在给予起21天后和28天后的时刻，在3只小鼠中的2只小鼠(#1、#3)中，针对fv4-igg1-f890的小鼠抗体的产生显示为阳性(阳性率2/3)。另一方面，图25中示出，将fv4-igg1-f939给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的、针对fv4-igg1-f939产
生的小鼠抗体的抗体效价。在给予后任一采血日，3只小鼠全部中，针对fv4-igg1-f939的小鼠抗体的产生均显示为阴性(阳性率0/3)。
[0600]
图26中示出，将fv4-igg1-f947给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的、针对fv4-igg1-f947产生的小鼠抗体的抗体效价。在给予起14天后的时刻，在3只小鼠中的2只小鼠(#1、#3)中，针对fv4-igg1-f947的小鼠抗体的产生显示为阳性(阳性率2/3)。另一方面，图27中示出，将fv4-igg1-f1009给予人fcrn转基因小鼠起3天后、7天后、14天后、21天后和28天后的、针对fv4-igg1-f1009产生的小鼠抗体的抗体效价。在给予起7天以后的采血日，在3只小鼠中的2只小鼠(#4、#5)中，针对fv4-igg1-f1009的小鼠抗体的产生显示为阳性(阳性率2/3)。
[0601]
如实施例5中所示，相对于fv4-igg1-f11，降低了对各种小鼠fcγr的结合的是fv4-igg1-f821，同样地，相对于fv4-igg1-f890，降低了对各种小鼠fcγr的结合的是fv4-igg1-f939，同样地，相对于fv4-igg1-f947，降低了对各种小鼠fcγr的结合的是fv4-igg1-f1009。
[0602]
显示出相对于fv4-igg1-f11和fv4-igg1-f890，通过降低对各种小鼠fcγr的结合，可以使机体内的免疫原性显著降低。另一方面，相对于fv4-igg1-f947，降低对各种小鼠fcγr的结合，并未显示出使机体内的免疫原性降低的效果。
[0603]
并不受特定理论的束缚，作为观察到这种免疫原性抑制效果的原因，也可以如下所述进行说明。
[0604]
如实施例3中所述，认为相对于ph中性范围条件下具有fcrn结合活性的抗原结合分子，通过使fcγr结合活性降低，可以抑制抗原呈递细胞的细胞膜上的四者复合体的形成。认为通过抑制四者复合体的形成，抗原结合分子向抗原呈递细胞中的摄入也受到抑制，结果针对抗原结合分子的免疫原性的诱导受到抑制。对于fv4-igg1-f11和fv4-igg1-f890，认为通过降低fcγr结合活性，免疫原性的诱导以上述方式受到抑制。
[0605]
另一方面，对于fv4-igg1-f947，未显示出使fcγr结合活性降低所致的免疫原性抑制效果。虽然并不受特定理论的束缚，但作为其原因，也可以如下所述进行讨论。
[0606]
如图16所示，fv4-igg1-f947和fv4-igg1-f1009从血浆中的消除非常快。这里，认为fv4-igg1-f1009对小鼠fcγr的结合活性降低，抗原呈递细胞上的四者复合体的形成受到抑制。因此，认为fv4-igg1-f1009仅与表达于血管内皮细胞或造血细胞等的细胞膜上的fcrn结合，从而被摄入细胞内。这里，一部分抗原呈递细胞的细胞膜上也表达有fcrn，因而fv4-igg1-f1009即使仅与fcrn结合，也可以摄入抗原呈递细胞中。即，fv4-igg1-f1009从血浆中的急速消除中，一部分可能被摄入抗原呈递细胞。
[0607]
进而，fv4-igg1-f1009为人抗体，对于小鼠而言完全为异种蛋白。即，认为小鼠具有对fv4-igg1-f1009特异性应答的大量t细胞群体。即使是少量被摄入抗原呈递细胞中的fv4-igg1-f1009，在细胞内受到加工后也可被呈递至t细胞，但由于小鼠具有对fv4-igg1-f1009特异性应答的大量t细胞群体，因而认为对fv4-igg1-f1009的免疫应答容易被诱导。实际上，如参考实施例4所示，对小鼠给予作为异种蛋白的人可溶型il-6受体时，人可溶型il-6受体在短时间内消除，对人可溶型il-6受体的免疫应答受到诱导。尽管人可溶型il-6受体不具有ph中性范围下的fcrn和fcγr结合活性，但免疫原性得到诱导的原因认为是人可溶型il-6受体的消除快，摄入抗原呈递细胞中的量多的缘故。
[0608]
即，在抗原结合分子为异种蛋白(将人蛋白给予小鼠)时，与抗原结合分子为同种蛋白(将小鼠蛋白给予小鼠)时相比，认为通过抑制抗原呈递细胞上的四者复合体的形成而抑制免疫应答也是更为困难的。
[0609]
实际上，在抗原结合分子为抗体时，给予人的抗体是人源化抗体或人抗体，因而会发生针对同种蛋白的免疫应答。因此，实施例11中，对于四者复合体的形成抑制是否与免疫原性的降低有关，通过对小鼠给予小鼠抗体来进行评价。
[0610]
〔实施例11〕具有ph中性范围条件下的小鼠fcrn结合活性、且不具有小鼠fcγr结合活性的小鼠抗体的体内免疫原性评价(11-1)正常小鼠的体内免疫原性试验为了证实抗原结合分子为同种蛋白(将小鼠抗体给予小鼠)时的、抑制抗原呈递细胞上的四者复合体的形成所致的免疫原性抑制效果，实施如下所述的试验。
[0611]
使用实施例6中所得的小鼠血浆，用以下的方法评价对mpm1-migg1-mf38、mpm1-migg1-mf40、mpm1-migg1-mf14、mpm1-migg1-mf39的抗体产生。
[0612]
(11-2)通过电化学发光法测定血浆中抗给予样本(anti-administered specimen)抗体测定用电化学发光法测定小鼠的血浆中抗给予样本抗体。向multi-array 96孔板分配给予样本，在室温反应1hr。将板洗涤后，制备经50倍稀释的小鼠血浆测定试样，在室温反应2hr并进行洗涤，然后分配用sulfo-tag nhs ester(meso scale discovery)进行了钌标记的给予样本，在4℃反应一晩。第二天将板洗涤后，分配读数缓冲液t(
×
4)(meso scale discovery)，立即用sector pr 2400reader(meso scale discovery)进行测定。对于每个测定体系，将未给予抗体的5个个体的血浆作为阴性对照样品进行测定，使用这5个个体的血浆测定得到的数值的平均值(mean)加上使用5个个体的血浆测定得到的数值的标准偏差(sd)的1.645倍，将所得数值(x)用作阳性判定基准(式3)。在任一采血日即使显示出1次高于阳性判定基准的反应的个体，也判定为对被检物质的抗体产生应答为阳性。
[0613]
〔式3〕抗体产生的阳性判定基准(x)＝mean 1.645
×
sd。
[0614]
(11-3)通过降低对fcγr的结合活性所致的体内免疫原性的抑制效果其结果示于图28至图31。图28中示出将mpm1-migg1-mf14给予正常小鼠起14天后、21天后和28天后的、针对mpm1-migg1-mf14产生的小鼠抗体的抗体效价。在给予起21天后的时刻，全部3只小鼠中，针对mpm1-migg1-mf14的小鼠抗体的产生均显示阳性(阳性率3/3)。另一方面，图29中示出将mpm1-migg1-mf39给予正常小鼠起14天后、21天后和28天后的、针对mpm1-migg1-mf39所产生的小鼠抗体的抗体效价。在给予后任一采血日，全部3只小鼠中，针对mpm1-migg1-mf39的小鼠抗体的产生显示为阴性(阳性率0/3)。
[0615]
图30中示出将mpm1-migg1-mf38给予正常小鼠起14天后、21天后和28天后的、针对mpm1-migg1-mf38所产生的小鼠抗体的抗体效价。在给予起28天后的时刻，3只小鼠中的2只小鼠(#1、#2)中，针对mpm1-migg1-mf38的小鼠抗体的产生显示为阳性(阳性率2/3)。另一方面，图31中示出将mpm1-migg1-mf40给予正常小鼠起14天后、21天后和28天后的、针对mpm1-migg1-mf40所产生的小鼠抗体的抗体效价。在给予后任一采血日，全部3只小鼠中，针对mpm1-migg1-mf40的小鼠抗体的产生显示为阴性(阳性率0/3)。
[0616]
如实施例6中所示，相对于mpm1-migg1-mf38，降低了对各种小鼠fcγr的结合的是mpm1-migg1-mf40，同样地，相对于mpm1-migg1-mf14，降低了对各种小鼠fcγr的结合的是mpm1-migg1-mf39。
[0617]
由这些结果确认，即使将作为同种蛋白的小鼠抗体mpm1-migg1-mf38和mpm1-migg1-mf14给予正常小鼠，也确认到针对给予抗体的抗体产生，确认到免疫应答。认为其原因如实施例1、2所示，是通过增强ph中性范围下的fcrn结合活性、在抗原呈递细胞上形成四者复合体，向抗原呈递细胞中的摄入得到促进的缘故。
[0618]
表明相对于这种具有ph中性范围下的人fcrn结合活性的抗原结合分子，通过降低对各种小鼠fcγr的结合而抑制四者复合体的形成，由此可以降低机体内的免疫原性。
[0619]
以上事实显示，在体外和体内两方面中，通过使具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的抗原结合分子的fcγr结合活性降低，可以极其有效地降低该抗原结合分子的免疫原性。换而言之，具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且对活性型fcγr的结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的抗原结合分子(即，实施例3中记载的方式1的抗原结合分子)与具有和天然型fcγr结合结构域相同程度的结合活性的抗原结合分子(即，实施例3中记载的可形成四者复合体的抗原结合分子)相比，免疫原性表现出显著降低。
[0620]
〔实施例12〕具有ph中性范围下的人fcrn结合活性、且人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的人抗体的制作和评价(12-1)具有ph中性范围下的人fcrn结合活性、且人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的人igg1抗体的制作和评价在本发明的非限定的一个方式中，作为对活性型fcγr的结合活性比天然型fc区对活性型fcγr的结合活性低的fc区的例子，优选可举出：将前述fc区的氨基酸中以eu编号表示的234位、235位、236位、237位、238位、239位、270位、297位、298位、325位和329位中的任意一个以上的氨基酸改变为与天然型fc区不同的氨基酸的fc区，但fc区的改变并不限于上述改变，也可以是例如：current opinion in biotechnology(2009)20(6),685-691中记载的脱糖链(n297a,n297q)、igg1-l234a/l235a、igg1-a325a/a330s/p331s、igg1-c226s/c229s、igg1-c226s/c229s/e233p/l234v/l235a、igg1-l234f/l235e/p331s、igg1-s267e/l328f、igg2-v234a/g237a、igg2-h268q/v309l/a330s/a331s、igg4-l235a/g237a/e318a、igg4-l236e等的改变、和wo 2008/092117中记载的g236r/l328r、l235g/g236r、n325a/l328r、n325ll328r等的改变、和eu编号233位、234位、235位、237位的氨基酸的插入、wo 2000/042072中记载的位置的改变。
[0621]
实施例5中制作的fv4-igg1-f890和fv4-igg1-f947是具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性、且ph依赖性地与人il-6受体结合的抗体。向这些氨基酸序列中导入氨基酸置换、制作使对人fcγr的结合降低的各种改变体(表17)。具体地，制作：将vh3-igg1-f890的氨基酸序列的以eu编号表示的235位的leu置换为lys、将239位的ser置换为lys的vh3-igg1-f938(序列编号：156)、将vh3-igg1-f890的氨基酸序列的以eu编号表示的237位的gly置换为lys、将239位的ser置换为lys的vh3-igg1-f1315(序列编号：157)、将vh3-igg1-f890的氨基酸序列的以eu编号表示的237位的gly置换为arg、将239位的ser置换为lys的vh3-igg1-f1316(序列编号：158)、
将vh3-igg1-f890的氨基酸序列的以eu编号表示的239位的ser置换为lys、将329位的pro置换为lys的vh3-igg1-f1317(序列编号：159)、将vh3-igg1-f890的氨基酸序列的以eu编号表示的239位的ser置换为lys、将329位的pro置换为arg的vh3-igg1-f1318(序列编号：160)、将vh3-igg1-f890的氨基酸序列的以eu编号表示的234位的leu置换为a1a、将235位的leu置换为ala的vh3-igg1-f1324(序列编号：161)、将vh3-igg1-f890的氨基酸序列的以eu编号表示的234位的leu置换为ala、将235位的leu置换为ala、将297位的asn置换为ala的vh3-igg1-f1325(序列编号：162)、将vh3-igg1-f890的氨基酸序列的以eu编号表示的235位的leu置换为arg、将236位的gly置换为arg、将239位的ser置换为lys的vh3-igg1-f1333(序列编号：163)、将vh3-igg1-f890的氨基酸序列的以eu编号表示的236位的gly置换为arg、将328位的leu置换为arg的vh3-igg1-f1356(序列编号：164)、将vh3-igg1-f947的氨基酸序列的以eu编号表示的234位的leu置换为ala、将235位的leu置换为ala的vh3-igg1-f1326(序列编号：155)、将vh3-igg1-f947的氨基酸序列的以eu编号表示的234位的leu置换为ala、将235位的leu置换为ala、将297位的asn置换为ala的vh3-igg1-f1327(序列编号：165)。
[0622]
[表17]
变体名氨基酸置换g1d f890m252y/n434y/y436vf938l235k/s239k/m252y/n434y/y436vf939l235r/s239k/m252y/n434y/y436vf1315g237k/s239k/m252y/n434y/y436vf1316g237r/s239k/m252y/n434y/y436vf1317s239k/m252y/p329k/n434y/y436vf1318s239k/m252y/p329r/n434y/y436vf1324l234a/l235a/m252y/n434y/y436vf1325l234a/l235a/m252y/n297a/n434y/y436vf1333l235r/g236r/s239k/m252y/n434y/y4366vf1356g236r/m252y/l328r/n434y/y436vf947t250v/m252y/t307q/v308p/q311a/n434y/y436vf1009l235r/s239k/t250v/m252y/t307q/v308p/q311a/n434y/y436vf1326l234a/l235a/t250v/m252y/t307q/v308p/q311a/n434y/y436vf1327l234a/l235a/t250v/m252y/n297a/t307q/v308p/q311a/n434y/y436v
。
[0623]
(12-2)对人fcrn和人fcγr的结合活性的确认含有(12-1)中制作的各氨基酸序列作为重链、含有l(wt)-ck作为轻链的抗体的ph7.0下的人fcrn结合活性(解离常数kd)使用实施例4的方法来测定。此外，ph7.4下的人fcγr结合活性使用实施例7的方法来测定。测定结果示于以下表18。
[0624]
[表18]
[0625]
表18的结果表明，用于使对各种人fcγr的结合活性与天然型fcγr结合结构域的结合活性相比降低而导入的氨基酸改变没有特别限定，可以通过各种氨基酸改变来实现。
[0626]
(12-3)抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合抗体的制作为了寻找与天然型igg1相比对fcgr的结合降低的改变，综合地分析了在igg1的fc区中被认为是fcγr结合位点的氨基酸残基的改变体对各fcγr的结合。作为抗体h链，使用wo2009/041062中公开的改善了血浆中动力学的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体即含gph7的cdr的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的可变区(序列编号：74)。同样地，作为抗体l链，共同使用wo2009/041062中公开的改善了血浆中动力学的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的gpl16-k0(序列编号：75)。此外，作为抗体h链恒定区，使用在igg1的c末端的gly和lys缺失而成的g1d中导入k439e突变而成的b3(序列编号：76)。以下，该h链称为gph7-b3(序列编号：77)、l链称为gpl16-k0(序列编号：75)。
[0627]
(12-4)对各种fcγr的结合的动力学分析首先，以gph7-b3/gpl16-k0为对照，为了验证综合性分析的妥当性，对gph7-b3/gpl16-k0和gph7-g1d/gpl16-k0对各fcgr的结合能力进行比较(表19)。由参考实施例2的方法表达、纯化的两抗体对各人fcγr(fcγria、fcγriia h型、fcγriia r型、fcγriib、fcγriiiaf型)的结合通过以下方法进行评价。
[0628]
使用biacore t100(ge
へルスケア
)、biacore t200(ge
へルスケア
)、biacore a100、biacore4000，分析各改变抗体与上述制备的fcγ受体的相互作用。作为流动缓冲液使用hbs-ep (ge
へルスケア
)，在25℃下进行测定。使用在s系列传感器芯片cm5(ge
へルスケア
)或s系列传感器芯片cm4(ge
ꢀへルスケア
)上通过胺偶联法将抗原肽、proteina(thermo scientific)、protein a/g(thermo scientific)、蛋白l(actigen或biovision)固定化而成的芯片、或者使用将s系列传感器芯片sa(certified)(ge
へルスケア
)和预先生物素化的抗原肽相互作用而成的固定化芯片。在这些传感器芯片上捕获目标抗体，并与用流动缓冲液稀释的fcγ受体相互作用，测定抗体结合量。该结合量在抗体间进行比较。其中，fcγ受体的结合量依赖于捕获的抗体的量，因而对各抗体的捕获量除以fcγ受体的结
合量而得的修正值进行比较。通过与10mm甘氨酸-hcl、ph1.5反应，对传感器芯片上捕获的抗体进行洗涤，由此经再生的传感器芯片可以反复使用。
[0629]
基于与各fcγr的相互作用分析结果，按照以下的方法分析结合的强度。将gph7-b3/gpl16-k0的fcγr结合量的值除以gph7-g1d/gpl16-k0的fcγr结合量的值，将该值进一步乘以100倍而得的值表示为对各fcγr的相对结合活性的指标。根据表19所示的结果，gph7-b3/gpl16-k0对各fcgr的结合与gph7-g1d/gpl16-k0对各fcgr的结合为相同程度，因而判断可在以下的讨论中将gph7-b3/gpl16-k0用作对照。
[0630]
[表19]改变体名fcγriafcγriiarfcγriiahfcγriibfcγriiiafgph7-g1d/gpl16-k0100100100100100gph7-b3/gpl16-k010994928888。
[0631]
(12-5)fc突变体的制作和评价接着，在gph7-b3的氨基酸序列中，将被认为与fcγr结合相关的氨基酸和其附近的氨基酸(以eu编号表示的234位至239位、265位至271位、295位、296位、298位、300位、324位至337位)分别置换为除了原来的氨基酸和cys之外的18种氨基酸。将这些fc突变体称为b3变体。由参考实施例2的方法表达、纯化的b3变体对各fcγr(fcγria、fcγriia h型、fcγriia r型、fcγriib、fcγriiiaf型)的结合通过(12-4)的方法进行综合性评价。
[0632]
根据与各fcγr的相互作用的分析结果，按照以下的方法来评价结合的强度。将来源于各b3变体的抗体的fcγr结合量的值，除以未向b3导入突变的作为比较对象的抗体(以eu编号表示的234位至239位、265位至271位、295位、296位、298位、300位、324位至337位具有人天然型igg1的序列的抗体)的fcγr结合量的值。将该值进一步乘以100倍而得的值作为针对各fcγr的相对结合活性的指标来表示。
[0633]
从分析的改变体中使对全部fcgr的结合均降低的改变示于表21。与导入改变前的抗体(gph7-b3/gpl16-k0)进行比较，认为表20中所示的236种改变是降低至少一种fcgr结合的改变，在导入天然型igg1时也同样地是具有降低至少一种fcgr结合的效果的改变。
[0634]
因此，用于使各种人fcγr结合活性低于天然型fcγr结合结构域的结合活性而导入的氨基酸改变没有特别限定，表明通过导入至少一处表20所示的氨基酸改变即可实现。此外，这里导入的氨基酸改变可以是1处，也可以是多处的组合。
[0635]
[表20]
[0636]
(12-6)具有ph中性范围下的人fcrn结合活性、且人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的人igg2和人igg4抗体的制作和评价使用人igg2或人igg4，如下所述制作具有ph中性范围下的人fcrn的结合活性、且人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的fc区。
[0637]
作为具有人igg2作为恒定区的人il-6受体结合抗体，通过参考实施例2所示的方法制作含有vh3-igg2(序列编号：166)作为重链，含有l(wt)-ck(序列编号：41)作为轻链的抗体。同样地，作为具有人igg4作为恒定区的人il-6受体结合抗体，通过参考实施例2所示的方法制作含有vh3-igg4(序列编号：167)作为重链，含有l(wt)-ck(序列编号：41)作为轻链的抗体。
[0638]
为了对vh3-igg2和vh3-igg4赋予ph中性范围条件下的人fcrn结合活性，向各自的恒定区中导入氨基酸改变。具体地，制作相对于vh3-igg2和vh3-igg4，将以eu编号表示的252位的met置换为tyr、将434位的asn置换为tyr、将436位的tyr置换为val而成的vh3-igg2-f890(序列编号：168)和vh3-igg4-f890(序列编号：169)。
[0639]
为了使vh3-igg2-f890和vh3-igg4-f890对人fcγr的结合降低，向各自的恒定区中导入氨基酸改变。具体地，制作相对于vh3-igg2-f890，将以eu编号表示的235位的ala置换为arg、将239位的ser置换为lys而成的vh3-igg2-f939(序列编号：170)。此外，还制作相对于vh3-igg4-f890、将以eu编号表示的235位的leu置换为arg、将239位的ser置换为lys而成的vh3-igg4-f939(序列编号：171)。
[0640]
通过参考实施例2所示的方法制作含有制作的vh3-igg2-f890、vh3-igg4-f890、vh3-igg2-f939或vh3-igg4-f939作为重链、含有l(wt)-ck(序列编号：41)作为轻链的抗体。
[0641]
(12-7)具有ph中性范围下的人fcrn结合活性、且人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的人igg2和人igg4抗体的评价(12-6)中所制作的抗体(表21)的ph7.0下的人fcrn结合活性(解离常数kd)使用实施例4的方法来测定。此外，ph7.4下的人fcγr结合活性使用实施例7的方法来测定。测定结果示于以下表22。
[0642]
[表21]
[0643]
[表22]
[0644]
表22结果表明，作为具有ph中性范围下的人fcrn结合活性、且人fcγr结合活性比天然型fcγr结合结构域的结合活性低的fc区，对人igg1没有特别限定，通过使用人igg2或人igg4也可以实现。
[0645]
〔实施例13〕构成fcrn结合结构域的二个多肽的仅一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合的抗原结合分子的制作和评价实施例3中作为方式3所示的构成fcrn结合结构域的二个多肽的仅一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合、另一方不具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的抗原结合分子的制作如下所述进行。
[0646]
(13-1)构成fcrn结合结构域的二个多肽的仅一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、另一方不具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的抗原结合分子的制作首先，作为具有ph中性范围条件下的fcrn结合的抗人il-6r抗体的重链，通过参考实施例1的方法制作vh3-igg1-f947(序列编号：70)。此外，作为在ph酸性范围和ph中性范围两个条件下均不具有fcrn结合活性的抗原结合分子，对vh3-igg1施加将以eu编号表示的253位的ile置换为ala的氨基酸置换来制作vh3-igg1-f46(序列编号：71)。
[0647]
作为用于以高纯度获得抗体的异源二聚体的方法，已知使用下述fc区的方法，其中，抗体中的一个fc区的以eu编号表示的356位的asp被置换为lys、和以eu编号表示的357位的glu被置换为lys，另一个fc区的以eu编号表示的370位的lys被置换为glu、以eu编号表示的435位的his被置换为arg、和以eu编号表示的439位的lys被置换为glu(wo2006/106905)。
[0648]
制作vh3-igg1-f947的以eu编号表示的356位的asp被置换为lys、和以eu编号表示的357位的glu被置换为lys的vh3-igg1-fa6a(序列编号：72)(以下，称为重链a)。此外，制作vh3-igg1-f46的以eu编号表示的370位的lys被置换为glu、以eu编号表示的435位的his被
置换为arg、和以eu编号表示的439位的lys被置换为glu的vh3-igg1-fb4a(序列编号：73)(以下，称为重链b)(表23)。
[0649]
[表23]
[0650]
以参考实施例2的方法为参考，作为重链质粒，通过加入各自等量的vh3-igg1-fa6a和vh3-igg1-fb4a，制作具有作为重链的vh3-igg1-fa6a和vh3-igg1-fb4a，具有作为轻链的vl3-ck的fv4-igg1-fa6a/fb4a。
[0651]
(13-2)构成fcrn结合结构域的二个多肽的仅一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、另一方不具有中性范围条件下的fcrn结合活性的抗原结合分子的pk试验通过下述方法实施将fv4-igg1-f947和fv4-igg1-fa6a/fb4a给予人fcrn转基因小鼠时的pk试验。
[0652]
在人fcrn转基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrn tg品系32 / 小鼠、jackson laboratories、methods mol.biol.(2010)602,93-104)的背部皮下单次给予1mg/kg的抗人il-6受体抗体。在抗人il-6受体抗体的给予后15分、7小时、1天、2天、3天、4天、7天的时刻进行采血。将采集的血液立即在4℃、15000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
[0653]
小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体浓度与实施例4的方法相同地用elisa法测定。其结果示于图32。与相对于人fcrn可以经由2处结合区与2分子fcrn结合的fv4-igg1-f947相比，相对于人fcrn可以经由1处结合区仅与1分子fcrn结合的fv4-igg1-fa6a/fb4a显示出高的血浆中浓度变化。
[0654]
如上所述，igg的fc区中存在2个fcrn结合区，但具有2个fcrn结合区中的单侧的fcrn结合区缺失的fc的分子，与具有天然型fc的分子相比，据报道从血浆中的消除快(scand j immunol 1994；40:457-465.)。即，已知具有在ph酸性范围条件下与fcrn结合的2个结合区的igg与具有1个fcrn结合区的igg相比，血浆中滞留性提高。由此，摄入细胞内的igg通过在内体内与fcrn结合而再次循环至血浆中，但由于天然型igg可经由2个fcrn结合区与2分子fcrn结合，因而认为以高的结合能力与fcrn结合，其大部分被再循环。另一方面，只有1个fcrn结合区的igg在内体内的fcrn结合能力低，不能充分被再循环，因而认为从血浆中的消除快。
[0655]
因此，如图32所示，对在ph中性范围条件下具有1个fcrn结合区的fv4-igg1-fa6a/fb4a，观察到的血浆中滞留性提高的现象与天然型igg的情形相反，因而完全是预想之外的。
[0656]
本发明不受特定理论束缚，但作为观察到这种高的血浆中浓度变化的原因，可举出将抗体给予小鼠皮下时的皮下吸收率增加来作为原因。
[0657]
通常认为，皮下给予的抗体经淋巴系统吸收，并转移至血浆中(j.pharm.sci.(2000)89(3),297-310.)。由于淋巴系统中存在大量的免疫细胞，因而认为皮下给予的抗体
暴露于大量的免疫细胞，然后转移至血浆中。通常，皮下给予抗体药品时，与静脉内给予的情形相比，已知免疫原性提高，作为其一个原因，认为是皮下给予的抗体在淋巴系统中暴露于大量免疫细胞的缘故。实际上，如实施例1中所示，fv4-igg1-f1在皮下给予时确认到fv4-igg1-f1从血浆中急速地消除，暗示了针对fv4-igg1-f1的小鼠抗体的产生。另一方面，在静脉内给予时，未确认到fv4-igg1-f1从血浆中的急速消除，暗示了针对fv4-igg1-f1的小鼠抗体没有产生。
[0658]
即，皮下给予的抗体在其吸收过程中，若被摄入存在于淋巴系统的免疫细胞中，则引起生物利用度(bioavailablity)的降低，同时可成为免疫原性的原因。
[0659]
然而，实施例3中作为方式3所示的、构成fcrn结合结构域的二个多肽的仅一方具有ph中性范围条件下的fcrn结合、另一方不具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性的抗原结合分子在被皮下给予时，认为即使在其吸收过程中被暴露于淋巴系统中存在的免疫细胞，也不会在免疫细胞的细胞膜上形成四者复合体。因此，通过抑制向存在于淋巴系统中的免疫细胞中的摄入，引起生物利用度(bioavailablity)的上升，结果也可认为引起了血浆中浓度的上升。
[0660]
这样，这种通过使皮下给予的抗体的生物利用度(bioavailablity)上升而使血浆中浓度上升的方法、或使免疫原性降低的方法，并不限于实施例3中作为方式3所示的抗原结合分子，认为只要是在免疫细胞的细胞膜上不形成四者复合体的抗原结合分子，则均可使用。即，认为方式1、2、3的任一抗原结合分子与可形成四者复合体的抗原结合分子相比，均可在使皮下给予时的生物利用度(bioavailablity)上升的同时使血浆中滞留性提高，进而使免疫原性降低。
[0661]
在血浆中滞留的抗原结合分子的一部分被认为常常会转移至淋巴系统中。此外，血液中也存在有免疫细胞。因此，本发明的适应并不限于特定的给予途径，若举出被期待特别容易发挥效果的例子，则作为一例，可举出：抗原结合分子的吸收过程中被认为是经由淋巴系统的给予途径的皮下给予。
[0662]
〔实施例14〕具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性、且具有抑制型fcγr选择结合活性的抗体的制作此外，通过对中性条件下的fcrn结合增强了的抗原结合分子使用带来抑制型fcγriib选择结合活性的增强的改变，可以制作实施例3所示方式2的抗原结合分子。即，具有中性条件下的fcrn结合活性、进而导入了带来抑制型fcγriib选择结合活性的增强的改变的抗原结合分子，可以形成2分子的fcrn和1分子的fcγr介导的四者复合体。但是，由于该改变的效果带来抑制性fcγr选择结合，因而活性型fcγr结合活性降低。作为其结果，认为在抗原呈递细胞上优先形成包含抑制型fcγr的四者复合体。如上所述，认为免疫原性由包含活性型fcγr的四者复合体的形成所引起，通过如此形成包含抑制型fcγr的四者复合体，认为可以抑制免疫应答。
[0663]
因此，为了发现带来抑制型fcγriib选择结合活性增强的氨基酸突变，实施了如下所示的研究。
[0664]
(14-1)fc改变体的fcγr结合的综合分析导入与天然型igg1相比而使fc介导的对活性型fcγr、特别是对fcγriia的h型和r型的任一基因多型的结合减少且使fcγriib结合增强的突变而成的多个igg1抗体改变体对各fcγr的结合活性进行了综合分析。
[0665]
抗体h链使用wo2009/041062中公开的血浆中动力学改善了的作为抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的包含gph7的cdr的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的可变区(序列编号：74)。同样地，对于抗体l链，在与不同h链的组合中共同地使用wo2009/041062中公开的血浆中动力学改善了的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的gpl16-k0(序列编号：75)。此外，作为抗体h链恒定区，使用在igg1的c末端的gly和lys缺失而成的g1d中导入k439e突变而成的b3(序列编号：76)。以下，将该h链称为gph7-b3(序列编号：77)、将l链称为gpl16-k0(序列编号：75)。
[0666]
相对于gph7-b3，将被认为与fcγr的结合相关的氨基酸和其附近的氨基酸(以eu编号表示的234位至239位、265位至271位、295位、296位、298位、300位、324位至337位)分别置换为除了改变前的氨基酸和cys之外的18种氨基酸。这些fc改变体称为b3变体。由参考实施例2的方法表达和纯化的b3变体对各fcγr(fcγria、fcγriia(h)、fcγriia(r)、fcγriib、fcγriiia)的结合活性根据实施例9中记载的方法进行综合评价。
[0667]
对于各fcγr，依照以下的方法作图。将来源于各b3变体的抗体与各fcγr的结合量的值除以未向b3导入任何突变的对照抗体(以eu编号表示的234位至239位、265位至271位、295位、296位、298位、300位、324位至337位具有人天然型igg1的序列的抗体)的值。将该值进一步乘以100，将所得值表示为对各fcγr的结合的值。横轴表示各突变体对fcγriib的结合，纵轴表示各突变体对各活性型fcγr即fcγria、fcγriia(h)、fcγriia(r)、fcγriiia的值(图33、34、35、36)。
[0668]
结果，如图33～36中标记所示，在全部改变中，突变a(以eu编号表示的238位的pro置换为asp的改变)和突变b(以eu编号表示的328位的leu置换为glu的改变)与天然型igg1相比，表现出具有显著增强对fcγriib的结合，显著抑制对fcγriia的两个类型的结合的效果。
[0669]
(14-2)fcγriib选择结合改变体的spr分析对(14-1)中发现的以eu编号表示的238位的pro置换为asp的改变体对各fcγr的结合进行更详细的分析。
[0670]
使用il6r-g1d(序列编号：79)来作为igg1的h链，该il6r-g1d包含wo2009/125825中公开的作为针对人白介素6受体的抗体可变区的il6r-h的可变区(序列编号：78)来作为抗体h链可变区、和将人igg1的c末端的gly和lys除去的g1d恒定区来作为抗体h链恒定区。制作将il6r-g1d的以eu编号表示的238位的pro改变为asp的il6r-g1d_v1(序列编号：80)。接着，制作将il6r-g1d的以eu编号表示的328位的leu改变为glu的il6r-g1d_v2(序列编号：81)。此外，为了进行比较，制作作为公知突变(mol.immunol.(2008)45,3926-3933)的以eu编号表示的267位的ser置换为glu、和以eu编号表示的328位的leu置换为phe的il6r-g1d的改变体il6r-g1d_v3(序列编号：82)。作为抗体l链，托珠单抗(tocilizumab)的l链il6r-l(序列编号：83)被共通地用在与上述重链的组合中。依照参考实施例2的方法，将抗体表达、纯化。包含il6r-g1d、il6r-g1d_v1、il6r-g1d_v2、il6r-g1d_v3作为作为抗体h链的抗体在以下分别称为igg1、igg1-v1、igg1-v2、igg1-v3。
[0671]
接着，使用biacore t100(ge healthcare)对这些抗体和fcγr的相互作用进行动力学分析。作为流动缓冲液，使用hbs-ep (ge healthcare)，该相互作用在25℃温度下进行测定。使用通过胺偶联法固定化有protein a的s系列传感器芯片cm5(ge healthcare)。使捕获目标抗体的芯片与经流动缓冲液稀释的各fcγr作用，由此测定各fcγr对抗体的结
合。测定后，与10mm甘氨酸-hcl、ph1.5进行反应，由此洗涤捕获于芯片的抗体。如此再生的芯片可重复使用。使用biacore evaluation software，将测定结果用1:1朗缪耳结合模型(langmuir binding model)进行整体拟合，根据由此算出的结合速度常数ka(l/mol/s)、解离速度常数kd(1/s)，计算解离常数kd(mol/l)。
[0672]
igg1-v1和igg1-v2对fcγriia(h)或fcγriiia的结合微弱，因而无法通过使用biacore evaluation software将测定结果用上述的1:1朗缪耳结合模型进行整体拟合来计算kd。对于igg1-v1和igg1-v2对fcγriia(h)或fcγriiia的相互作用，利用biacore t100 software handbook br1006-48 edition ae中记载的以下1:1结合模型式子来计算kd。
[0673]
1:1结合模型中相互作用的分子在biacore上的行为可通过下式4来表示。
[0674]
〔式4〕req＝c
×
rmax/(kd c) ri上述〔式4〕中的各项的含义如下所示：req(ru):稳态结合水平(steady state binding levels)c(m):分析物浓度(analyte concentration)c:concentrationrmax(ru):分析物的表面结合能力(analyte binding capacity of the surface)ri(ru):试样中的体积折射率贡献(bulk refractive index contribution in the sample)kd(m):平衡解离常数(equilibrium dissociation constant)。
[0675]
若将该式4变形，则kd可以以下式5的形式来表示。
[0676]
〔式5〕kd＝c
×
rmax/(req-ri)-c。
[0677]
通过向该式代入rmax、ri、c的值，可以计算kd。本次的测定条件中，代入ri＝0、c＝2μmol/l。rmax使用如下得到的值，即，将igg1对各fcγr的相互作用分析结果用1∶1朗缪耳结合模型进行整体拟合时所得的rmax值除以igg1的捕获量，在乘以igg1-v1、igg1-v2的捕获量而得的值。
[0678]
在本次测定条件中，igg1-v1、igg1-v2对fcγriia(h)的结合分别为约2.5、10ru，igg1-v1、igg1-v2对fcγriiia的结合分别为约2.5、5ru。分析igg1对fcγriia(h)的相互作用时的、igg1-v1、igg1-v2抗体在传感器芯片上的捕获量为469.2、444.2ru，分析igg1对fcγriiia的相互作用时的、igg1-v1、igg1-v2抗体在传感器芯片上的捕获量为470.8、447.1ru。此外，将igg1对fcγriia h型、fcγriiia的相互作用分析结果用1∶1朗缪耳结合模型进行整体拟合时所得的rmax分别为69.8、63.8ru，抗体在传感器芯片上的捕获量为452、454.5ru。使用这些值，igg1-v1、igg1-v2对fcγriia(h)的rmax分别算出为72.5、68.6ru，igg1-v1、igg1-v2对fcγriiia的rmax分别算出为66.0、62.7ru。将这些值代入式5的式子中，算出igg1-v1、igg1-v2对fcγriia(h)和fcγriiia的kd。
[0679]
〔式5〕kd＝c
×
rmax/(req-ri)-c。
[0680]
igg1、igg1-v1、igg1-v2、igg1-v3对各fcγr的kd值示于表24(各抗体对各fcγr的kd值)，而igg1对各fcγr的kd值除以igg1-v1、igg1-v2、igg1-v3对各fcγr的kd值而得的igg1-v1、igg1-v2、igg1-v3的相对kd值示于表25(各抗体对各fcγr的相对kd值)。
[0681]
[表24] igg1igg1-v1igg1-v2iggl-v3fcγr1a3.4e-107.3e-094.6e-101.9e-10fcγriia(r)1.2e-061.2e-052.9e-062.3e-09fcγriia(h)7.7e-075.6e-05＊1.2e-05＊1.5e-06fcγriib5.3e-061.1e-062.3e-061.3e-08fcγriiia3.1e-065.1e-05＊2.3e-05＊8.8e-06上述表24中，*表示由于未充分观察到fcγr对igg的结合而用式5的式子算出的kd。
[0682]
〔式5〕kd＝c
×
rmax/(req-ri)-c。
[0683]
[表25] igg1-v1igg1-v2igg1-v3fcγria0.0470.741.8fcγriia(r)0.100.41522fcγriia(h)0.0140.06240.51fcγriib4.82.3408fcγriiia0.0610.140.35。
[0684]
如表25所示，与igg1相比，igg1-v1对fcγria的亲和性降低至0.047倍，对fcγr iia(r)的亲和性降低至0.10倍，对fcγriia(h)的亲和性降低至0.014倍，对fcγriiia的亲和性降低至0.061倍。另一方面，对fcγriib的亲和性提高了4.8倍。
[0685]
此外如表25所示，与igg1相比，igg1-v2对fcγria的亲和性降低至0.74倍，对fcγriia(r)的亲和性降低至0.41倍，对fcγriia(h)的亲和性降低至0.064倍，对fcγriiia的亲和性降低至0.14倍。另一方面，对fcγriib的亲和性提高了2.3倍。
[0686]
即，由该结果表明，以eu编号表示的238位的pro被置换为asp的igg1-v1和以eu编号表示的328位的leu被置换为glu的igg1-v2对包含fcγriia的两基因多型的全部活性型fcγr的结合减少，而对作为抑制型fcγr的fcγriib的结合增加。具有这种性质的改变体迄今尚无报道，此外还如图33～36所示极其稀有。以eu编号表示的238位的pro被置换为asp的改变体或以eu编号表示的328位的leu被置换为glu的改变体对于开发免疫炎症性疾病等的治疗药极其有用。
[0687]
此外，如表25所示，igg1-v3确实提高了对fcγriib的结合408倍，对fcγriia(h)的结合减少至0.51倍，但另一方面，对fcγriia(r)的结合也提高522倍。即，igg1-v1和igg1-v2对fcγriia(r)和fcγriia(h)这两者的结合受到抑制，且对fcγriib的结合提高，由此认为与igg1-v3相比，是更为选择性结合fcγriib的改变体。即，以eu编号表示的238位的pro被置换为asp的改变体或以eu编号表示的328位的leu被置换为glu的改变体对于开发
免疫炎症性疾病等的治疗药极其有用。
[0688]
(14-3)对fcγriib的选择结合的改变与其它的fc区的氨基酸置换的组合的效果(14-2)中，对于人天然型igg1的以eu编号表示的238位的pro被置换为asp的改变体或以eu编号表示的328位的leu被置换为glu的改变体，观察到对fcγria、fcγriiia和fcγriia的任一基因多型的fc介导的结合均减少、且对fcγriib的结合提高。因此，通过对以eu编号表示的238位的pro被置换为asp的改变体或以eu编号表示的328位的leu被置换为glu的改变体进一步导入氨基酸置换，创造出对fcγri、fcγriia(h)、fcγriia(r)、fcγriiia中的任一者的结合进一步降低、或者对fcγriib的结合进一步提高的fc改变体。
[0689]
(14-4)制作具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性、且人fcγriib选择结合活性增强的抗体为了增强vh3-igg1和vh3-igg1-f11对人fcγriib的选择结合活性，通过以下方法制作抗体。用参考实施例1的方法对vh3-igg1导入用于将以eu编号表示的238位的pro置换为asp的氨基酸置换，制作vh3-igg1-f648(序列编号：84)。同样地，用参考实施例1的方法对vh3-igg1-f11导入用于将以eu编号表示的238位的pro置换为asp的氨基酸置换，制作vh3-igg1-f652(序列编号：85)。
[0690]
(14-5)具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性、且人fcγriib选择结合活性增强的抗体的评价用参考实施例2的方法来制作含有vh3-igg1、vh3-igg1-f648、vh3-igg1-f11、或vh3-igg1-f652作为重链，含有l(wt)-ck作为轻链的抗体。
[0691]
使用biacore t100(ge healthcare)来分析这些抗体与fcγriia(r)和fcγriib的相互作用。作为流动缓冲液，使用20mm aces,150mm nacl,0.05％tween20,ph7.4，在25℃温度下进行测定。使用通过胺偶联法固定化有蛋白l的s系列传感器芯片cm4(ge healthcare)。使捕获目标抗体的芯片与经流动缓冲液稀释的各fcγr作用，测定各fcγr对抗体的相互作用。测定后，与10mm甘氨酸-hcl、ph1.5反应，对捕获于芯片的抗体进行洗涤，如此再生的芯片可重复使用。
[0692]
测定结果使用biacore evaluation software进行分析。使抗体捕获于蛋白l上，将捕获该抗体前后的传感图的变化量作为x1。接着，使该抗体与人fcγrs相互作用，将表示为该作用前后的传感图变化量(δa1)的人fcγrs结合活性除以各抗体的捕获量(x)，从将所得值乘以1500倍而得的值中，减去表示为使捕获于蛋白l的抗体与流动缓冲液相互作用前后的传感图变化量(δa2)的人fcγrs结合活性，将所得值除以各抗体的捕获量(x)，将所得值乘以1500倍而得的值(y)作为人fcγrs结合活性(式1)。
[0693]
〔式1〕小鼠fcγrs的结合活性(y)＝(δa1-δa2)/x
×
1500。
[0694]
结果示于以下表26。确认到通过导入将以eu编号表示的238位的pro置换为asp的突变而增强人fcγriib选择结合活性的效果，即使是在导入具有ph中性范围条件下的人fcrn结合活性的抗体中时，也同等地观察到。
[0695]
[表26]
[0696]
这里得到的igg1-f652是具有ph中性范围条件下的fcrn结合活性、且带来抑制性fcγriib选择结合活性的增强的抗体。即，相当于实施例3所示的方式2的抗原结合分子。即，igg1-f652可以形成2分子的fcrn和1分子的fcγr介导的四者复合体，但由于带来抑制性fcγr选择结合活性的增强，因而活性型fcγr结合活性降低。作为其结果，认为在抗原呈递细胞上优先形成包含抑制型fcγr的四者复合体。如上所述，认为免疫原性由包含活性型fcγr的四者复合体的形成所引起，通过如此形成包含抑制型fcγr的四者复合体，认为可以抑制免疫应答。
[0697]
〔参考实施例1〕氨基酸经置换的igg抗体的表达载体的构建使用quikchange site-directed mutagenesis kit(stratagene)，将通过所附说明书记载的方法制作的包含突变体的质粒片段插入动物细胞表达载体，由此制作目标h链表达载体和l链表达载体。所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定。
[0698]
〔参考实施例2〕igg抗体的表达和纯化抗体的表达使用以下方法来进行。将来源于人胎儿肾癌细胞的hek293h细胞株(invitrogen)悬浮于含有10％胎牛血清(invitrogen)的dmem培养基(invitrogen)中，以5～6
×
105细胞/ml的细胞密度向黏附细胞用培养皿(直径10cm,corning)的各皿中各接种10ml，在co2培养箱(37℃、5％co2)内培养一昼夜后，吸除培养基，添加cho-s-sfm-ii(invitrogen)培养基6.9ml。将制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。回收所得培养上清后，进行离心分离(约2000g、5分钟、室温)除去细胞，进而通过0.22μm过滤器millex(r)-gv(millipore)进行灭菌，得到培养上清。使用rprotein asepharosetm fast flow(amersham biosciences)，通过本领域技术人员公知的方法，从所得培养上清中进行纯化。纯化抗体浓度使用分光光度计测定280nm下的吸光度。通过protein science 1995；4:2411-2423中记载的方法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得的值计算抗体浓度。
[0699]
〔参考实施例3〕可溶型人il-6受体(hsil-6r)的制备作为抗原的人il-6受体的重组人il-6受体如下所述制备。通过本领域技术人员公知的方法构建包含j.immunol.(1994)152,4958-4968中报道的n末端侧1位至357位的氨基酸序列的可溶型人il-6受体(以下，也称为hsil-6r)的稳定表达cho细胞株。通过培养该cho细胞株来使可溶型人il-6受体表达。通过blue sepharose 6ff柱色谱、凝胶过滤柱色谱这两个步骤，从所得的该cho细胞株的培养上清中纯化可溶型人il-6受体。将最终步骤中作为主峰洗脱出的级分作为最终纯化品使用。
[0700]
〔参考实施例4〕正常小鼠中的可溶型人il-6受体和人抗体的pk试验为了评价正常小鼠中的可溶型人il-6受体和人抗体的血浆中滞留性和免疫原性，如下所述实施试验。
[0701]
(4-1)正常小鼠中的可溶型人il-6受体的血浆中滞留性和免疫原性评价
为了评价正常小鼠中的可溶型人il-6受体的血浆中滞留性和免疫原性，实施以下试验。
[0702]
在正常小鼠(c57bl/6j小鼠、charles river japan)的尾静脉单次给予50μg/kg的可溶型人il-6受体(参考实施例3中制作)。在可溶型人il-6受体的给予后15分、7小时、1天、2天、3天、4天、7天、14天、21天时进行采血。将采集的血液立即在4℃、15000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。可溶型人il-6受体的血浆中浓度和小鼠抗可溶型人il-6受体抗体的抗体效价用以下方法测定。
[0703]
小鼠的血浆中可溶型人il-6受体浓度通过电化学发光法测定。将配制为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/ml的可溶型人il-6受体校准曲线试样和经50倍以上稀释的小鼠血浆测定试样，与用sulfo-tag nhs ester(meso scale discovery)进行了钌标记的单克隆抗人il-6r抗体(r&d)和生物素化抗人il-6r抗体(r&d)和托珠单抗混合，由此在37℃下反应1晩。托珠单抗的终浓度配制为333μg/ml。然后，将反应液分配至ma400 pr链霉亲和素板(meso scale discovery)中。进而在室温反应1小时，将反应液洗涤后，分配读数缓冲液t(
×
4)(meso scale discovery)。然后立即用sector pr 400reader(meso scale discovery)进行测定。可溶型人il-6受体浓度是使用分析软件softmax pro(molecular devices)，根据校准曲线的响应算出。
[0704]
小鼠血浆中的小鼠抗人il-6受体抗体的抗体效价通过电化学发光法进行测定。首先，将人il-6受体分配于ma100 pr未包被板(meso scale discovery)中，通过在4℃静置1晩，制得人il-6受体固定化板。将分配有经50倍稀释的小鼠血浆测定试样的人il-6受体固定化板在4℃静置1晩。然后，与用sulfo-tag nhs ester(meso scale discovery)进行了钌标记的抗-小鼠igg(完整分子)(sigma-aldrich)在室温反应1小时，并洗涤该板。向板中分配读数缓冲液t(
×
4)(meso scale discovery)后，立即用sector pr 400reader(meso scale discovery)进行测定。
[0705]
其结果示于图37。该结果表明，小鼠血浆中的可溶型人il-6受体快递地消除。此外，在给予了可溶型人il-6受体的3只小鼠中，#1和#3这2只中，观察到血浆中的小鼠抗可溶型人il-6受体抗体的抗体效价的上升。这2只小鼠中，作为引起针对可溶型人il-6受体的免疫应答的结果，暗示产生了小鼠抗体。
[0706]
(4-2)可溶型人il-6受体的稳态模型中的免疫原性评价为了评价针对可溶型人il-6受体的小鼠抗体的产生对可溶型人il-6受体的血浆中浓度的影响，实施以下试验。
[0707]
作为将可溶型人il-6受体的血浆中浓度维持于稳态(约20ng/ml)的模型，构建以下试验模型。在正常小鼠(c57bl/6j小鼠、charles river japan)的背部皮下植入填充有可溶型人il-6受体的注入泵(mini-osmotic pump model2004、alzet)，由此制作血浆中可溶型人il-6受体浓度维持于稳态的动物模型。
[0708]
试验用2组(各组n＝4)来实施。对于模仿免疫耐受性的组的小鼠，为了抑制针对可溶型人il-6受体的小鼠抗体的产生，将单克隆抗-小鼠cd4抗体(r&d)以20mg/kg单次给予其尾静脉，然后，10天1次同样地进行给予(以下，称为抗小鼠cd4抗体给予组)。将另一组作为对照组，即，作为未给予单克隆抗-小鼠cd4抗体的抗小鼠cd4抗体非给予组来使用。然后，将
填充有92.8μg/ml可溶型人il-6受体的注入泵植入小鼠背部皮下。将植入注入泵后起经时性地采集的血液在采集后立即在4℃、15000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。可溶型人il-6受体(hsil-6r)的血浆中浓度通过与参考实施例4-1同样的方法进行测定。
[0709]
通过该方法测定的正常小鼠中的各个体的血浆中可溶型人il-6受体浓度变化示于图38。
[0710]
结果，在抗小鼠cd4抗体非给予组的全部小鼠中，在注入泵植入小鼠背部皮下14天后，确认到血浆中可溶型人il-6受体浓度的降低。另一方面，为了抑制针对可溶型人il-6受体的小鼠抗体的产生而给予了抗小鼠cd4抗体的组的全部小鼠中，未观察到血浆中可溶型人il-6受体浓度的降低。
[0711]
(4-1)和(4-2)的结果表明以下3点。即，表明：(1)将可溶型人il-6受体给予小鼠后的、从血浆中的消除非常快；(2)对小鼠来说是异种蛋白的可溶型人il-6受体在给予小鼠时具有免疫原性，引起针对可溶型人il-6受体的小鼠抗体的产生；(3)在引起针对可溶型人il-6受体的小鼠抗体的产生时，可溶型人il-6受体的消除更快，在可溶型人il-6受体的血浆中浓度维持恒定的模型中也引起血浆中浓度的降低这3点。
[0712]
(4-3)正常小鼠中的人抗体的血浆中滞留性和免疫原性评价为了评价正常小鼠中的人抗体的血浆中滞留性和免疫原性，实施以下的试验。
[0713]
在正常小鼠(c57bl/6j小鼠、charles river japan)的尾静脉单次给予1mg/kg的抗人il-6受体抗体fv4-igg1。在抗人il-6受体抗体的给予后15分、7小时、1天、2天、3天、4天、7天、14天、21天的时刻进行采血。将采集的血液立即在4℃、15000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
[0714]
小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体浓度用elisa法进行测定。首先，将抗人igg(γ-链特异性)f(ab')2fragment of antibody(sigma)分配于nunc-immuno plate,maxisoup(nalge nunc international)，在4℃静置1晩，由此制作抗人igg固定化板。制备含有血浆中浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125μg/ml的抗人il-6受体抗体的校准曲线试样以及经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样。在这些校准曲线试样和血浆测定试样100μl中加入20ng/ml的可溶型人il-6受体200μl，将所得混合液在室温静置1小时。然后将各孔中分配有该混合液的抗人igg固定化板进一步在室温静置1小时。然后，与生物素化抗人il-6r antibody(r&d)在室温反应1小时，进而与链霉亲和素-polyhrp80(stereospecific detection technologies)在室温反应1小时，使用tmb one component hrp microwell substrate(biofx laboratories)作为底物来进行反应液的显色反应。通过添加1n-硫酸(showa chemical)来终止反应，用酶标仪测定各孔反应液的450nm吸光度。小鼠血浆中的抗体浓度是使用分析软件softmax pro(molecular devices)，根据校准曲线的吸光度算出。
[0715]
其结果示于图39。将人抗体单次给予小鼠时的人抗体的血浆中滞留性比单次给予可溶型人il-6受体时的可溶型人il-6受体的血浆中滞留性(图37)显著更高，表明即使在给予后21天也维持高血浆中浓度。认为其原因在于，摄入细胞内的人抗体在内体内与小鼠fcrn结合而被再次再循环至血浆中所致的。另一方面，认为摄入细胞内的可溶型人il-6受
体由于不具有从内体内再循环的的通路，因而被从血浆中快速消除。
[0716]
进而，在给予了人抗体的全部3只小鼠例子中，未确认到可溶型人il-6受体在稳态模型(图38)中可见的血浆中浓度的降低。即，暗示与人il-6受体不同，没有针对人抗体的小鼠抗体的产生。
[0717]
由(4-1)、(4-2)和(4-3)的结果，可以做出如下考虑。首先，对于小鼠来说，人可溶型il-6受体和人抗体的任一者均为异种蛋白，因而认为小鼠具有对它们进行特异性应答的大量t细胞群体。
[0718]
对小鼠给予作为异种蛋白的人可溶型il-6受体时，人可溶型il-6受体在短时间内从血浆中消除，而且确认到针对人可溶型il-6受体的免疫应答。这里，人可溶型il-6受体从血浆中消除快速暗示大量人可溶型il-6受体在短时间内被摄入抗原呈递细胞、在细胞内受到加工后、将对人可溶型il-6受体特异性地应答的t细胞活化。作为其结果，认为引起针对人可溶型il-6受体的免疫应答(即针对人可溶型il-6受体的小鼠抗体的产生)。
[0719]
另一方面，对小鼠给予作为异种蛋白的人抗体时，人抗体的血浆中滞留性比人可溶型il-6受体显著延长，未引起针对人抗体的免疫应答。血浆中滞留性长意指，被摄入抗原呈递细胞且在细胞内受到加工的人抗体仅存在非常少量。因此，小鼠即使具有对人抗体特异性地应答的t细胞群体，也不引起抗原呈递所致的t细胞的活化，作为结果，认为不引起针对人抗体的免疫应答(即针对人抗体的小鼠抗体的产生)。
[0720]
〔参考实施例5〕中性ph下的人fcrn结合亲和性增大的各种抗体fc改变体的制作及其评价(5-1)中性ph下的人fcrn结合亲和性增大的各种抗体fc改变体的制作及其结合活性评价为了增大ph中性范围下的人fcrn结合亲和性，将各种突变导入vh3-igg1(序列编号：35)中，进行评价。分别含有所制作的重链和轻链l(wt)-ck(序列编号：41)的改变体(igg1-f1至igg1-f1052)依照参考实施例2中记载的方法进行表达和纯化。
[0721]
抗体和人fcrn的结合依照实施例4中记载的方法进行分析。即，使用biacore的中性条件下(ph7.0)的改变体对人fcrn的结合活性示于表27-1～27-32。
[0722]
[表27-1]
表27-2是表27-1的续表。
[0723]
[表27-2]
表27-3是表27-2的续表。
[0724]
[表27-3]
表27-4是表27-3的续表。
[0725]
[表27-4]
表27-5是表27-4的续表。
[0726]
[表27-5]
表27-6是表27-5的续表。
[0727]
[表27-6]
表27-7是表27-6的续表。
[0728]
[表27-7]
表27-8是表27-7的续表。
[0729]
[表27-8]
表27-9是表27-8的续表。
[0730]
[表27-9]
表27-10是表27-9的续表。
[0731]
[表27-10]
表27-11是表27-10的续表。
[0732]
[表27-11]
表27-12是表27-11的续表。
[0733]
[表27-12]
表27-13是表27-12的续表。
[0734]
[表27-13]
表27-14是表27-13的续表。
[0735]
[表27-14]
表27-15是表27-14的续表。
[0736]
[表27-15]
表27-16是表27-15的续表。
[0737]
[表27-16]
表27-17是表27-16的续表。
[0738]
[表27-17]
表27-18是表27-17的续表。
[0739]
[表27-18]
表27-19是表27-18的续表。
[0740]
[表27-19]
表27-20是表27-19的续表。
[0741]
[表27-20]
表27-21是表27-20的续表。
[0742]
[表27-21]
表27-22是表27-21的续表。
[0743]
[表27-22]
表27-23是表27-22的续表。
[0744]
[表27-23]
表27-24是表27-23的续表。
[0745]
[表27-24]
表27-25是表27-24的续表。
[0746]
[表27-25]
表27-26是表27-25的续表。
[0747]
[表27-26]
表27-27是表27-26的续表。
[0748]
[表27-27]
表27-28是表27-27的续表。
[0749]
[表27-28]
表27-29是表27-28的续表。
[0750]
[表27-29]
表27-30是表27-29的续表。
[0751]
[表27-30]
表27-31是表27-30的续表。
[0752]
[表27-31]
表27-32是表27-31的续表。
[0753]
[表27-32]
。
[0754]
(5-2)增强了ph中性范围条件下的人fcrn结合的ph依赖性人il-6受体结合抗体的体内试验使用实施例5-1中制备的赋予了中性条件下的人fcrn结合能力的重链，制作具有中性条件下的人fcrn结合能力的ph依赖性人il-6受体结合抗体，进行体内抗原消除效果的研究。具体地，通过参考实施例2中记载的本领域技术人员公知的方法表达并纯化：包含vh3-igg1(序列编号：35)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1、包含vh3-igg1-f1(序列编号：37)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1-v2、包含vh3-igg1-f14(序列编号：86)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1-f14、包含vh3-igg1-f20(序列编号：39)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1-f20、包含vh3-igg1-f21(序列编号：40)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1-f21、包含vh3-igg1-f25(序列编号：87)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1-f25、包含vh3-igg1-f29(序列编号：88)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1-f29、包含vh3-igg1-f35(序列编号：89)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1-f35、包含vh3-igg1-f48(序列编号：90)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1-f48、包含vh3-igg1-f93(序列编号：91)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1-f93、包含vh3-igg1-f94(序列编号：92)和vl3-ck(序列编号：36)的fv4-igg1-f94。
[0755]
对于制备的ph依赖性人il-6受体结合抗体，使用人fcrn转基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrn tg品系276 / 小鼠、jackson laboratories、methods mol biol.2010；602:93-104.)的体内试验如下所述实施。
[0756]
对人fcrn转基因小鼠(b6.mfcrn-/-.hfcrn tg品系276 / 小鼠、jackson laboratories、methods mol biol.2010；602:93-104.)和正常小鼠(c57bl/6j小鼠、
charles river japan)单独给予hsil-6r(可溶型人il-6受体：参考例3中制备)或同时给予可溶型人il-6受体和抗人il-6受体抗体，然后评价可溶型人il-6受体和抗人il-6受体抗体在机体内的药代动力学。将可溶型人il-6受体溶液(5μg/ml)或可溶型人il-6受体和抗人il-6受体抗体的混合溶液(分别为5μg/ml、0.1mg/ml)从尾静脉以10ml/kg单次给予。此时，相对于可溶型人il-6受体，由于抗人il-6受体抗体充分量或过量地存在，因而认为可溶型人il-6受体基本与全部抗体结合。在给予15分后、7小时后、1天后、2天后、3天后、4天后、7天后、14天后、21天后、28天后采集血液。将采集的血液立即在4℃、15000rpm下进行15分钟离心分离，得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存于设定为-20℃以下的冰箱中。
[0757]
(5-3)通过电化学发光法测定血浆中可溶型人il-6受体浓度小鼠的血浆中可溶型人il-6受体浓度用电化学发光法测定。将配制为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/ml的可溶型人il-6受体校准曲线试样和经50倍以上稀释的小鼠血浆测定试样，与用sulfo-tag nhs ester(meso scale discovery)进行了钌标记的单克隆抗人il-6r抗体(r&d)和生物素化抗人il-6r抗体(r&d)和托珠单抗混合，由此在37℃下反应1晩。托珠单抗的终浓度配制为333μg/ml。然后，将反应液分配至ma400 pr链霉亲和素板(meso scale discovery)中。进而在室温反应1小时，将反应液洗涤后，分配读数缓冲液t(
×
4)(meso scale discovery)。然后立即用sector pr 400reader(meso scale discovery)进行测定。可溶型人il-6受体浓度是使用分析软件softmax pro(molecular devices)，根据校准曲线的响应算出。
[0758]
所得的静脉内给予后人fcrn转基因小鼠中的血浆中可溶型人il-6受体浓度变化示于图40。试验结果表明，增强了中性条件下的人fcrn结合的ph依赖性人il-6受体结合抗体，与基本不具有中性条件下的人fcrn结合能力的fv4-igg1相比，血浆中可溶型人il-6受体浓度随时间经过均保持较低。其中，若列举显示特别显著效果的例子，则和fv4-igg1-f14同时给予的可溶型人il-6受体的1天后的血浆中浓度相比于和fv4-igg1同时给予的可溶型人il-6受体的1天后的血浆中浓度，表现出约54倍降低。此外，与fv4-igg1-f21同时给予的可溶型人il-6受体的7小时后的血浆中浓度，相比于和fv4-igg1同时给予的可溶型人il-6受体的7小时后的血浆中浓度，表现出约24倍降低。进而，和fv4-igg1-f25同时给予的可溶型人il-6受体的7小时后的血浆中浓度为检测限(1.56ng/ml)以下，相比于和fv4-igg1同时给予的可溶型人il-6受体的7小时后的血浆中浓度，认为可以实现200倍以上的显著的抗原浓度的降低。
[0759]
上述事实表明，为了增强抗原消除效果，非常有效的是使ph依赖性抗原结合抗体在中性条件下的人fcrn结合增强。此外，为了增强抗原消除效果而导入的、使中性条件下的人fcrn结合增强的氨基酸改变的种类包括表16中记载的改变，但并不特别限定，认为即使导入任意的改变，也可以增强体内的抗原消除效果。
[0760]
〔参考实施例6〕从使用噬菌体展示技术的人抗体文库获得ca依赖性地与il-6受体结合的抗体(6-1)天然人抗体噬菌体展示文库的制作将由人pbmc制作的poly a rna、或市售的人poly a rna等作为模板，按照本领域技术人员公知的方法，构建由展示相互不同的人抗体序列的fab结构域的多个噬菌体构成的人抗体噬菌体展示文库。
[0761]
(6-2)通过珠淘选从文库获得ca依赖性地与抗原结合的抗体片段从构建的天然人抗体噬菌体展示文库中进行的最初的挑选如下实施：仅浓缩具有抗原(il-6受体)结合能力的抗体片段、或以ca浓度依赖性抗原(il-6受体)结合能力为指标的抗体片段的浓缩。以ca浓度依赖性抗原(il-6受体)结合能力为指标的抗体片段的浓缩如下实施：使用会螯合ca离子的edta，从在ca离子存在下与il-6受体结合的噬菌体文库中洗脱噬菌体。作为抗原，使用经生物素标记的il-6受体。
[0762]
由携带构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5m nacl/10％peg，并将由此沉淀的噬菌体的群体用tbs稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中添加bsa和cacl2，以使终浓度为4％bsa和1.2mm钙离子浓度。作为淘选方法，参考了作为常规方法的使用固定化于磁珠的抗原的淘选方法(j.immunol.methods.(2008)332(1-2),2-9、j.immunol.methods.(2001)247(1-2),191-203、biotechnol.prog.(2002)18(2)212-20、mol.cell proteomics(2003)2(2),61-9)。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(sera-mag speedbeads neutravidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(dynabeads m-280streptavidin)。
[0763]
具体地，制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入用bsa封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温下结合15分钟。将珠用1ml的1.2mm cacl2/tbs(含有1.2mm cacl2的tbs)洗涤1次。然后，在浓缩具有il-6受体结合能力的抗体片段时，通过利用常规方法的洗脱，在以ca浓度依赖性的il-6受体结合能力作为指标来浓缩抗体片段时，通过由悬浮于2mm edta/tbs(含有2mm edta的tbs)中的珠的洗脱，来回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(od600为0.4-0.7)的10ml大肠杆菌菌株tg1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm
×
225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
[0764]
第2次以后的淘选中，以ca依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，由此使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。加入用bsa封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1ml的1.2mm cacl2/tbst和1.2mm cacl2/tbs洗涤。然后将加入有0.1ml的2mm edta/tbs的珠在室温悬浮后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(od600为0.4-0.7)的10ml大肠杆菌菌株tg1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm
×
225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。以ca依赖性结合能力为指标的淘选重复进行数次。
[0765]
(6-3)基于噬菌体elisa的评价通过由上述的方法得到的大肠杆菌的单克隆，按照常法(methods mol.biol.(2002)178,133-145)，回收含有噬菌体的培养上清。
[0766]
在含有噬菌体的培养上清中加热bsa和cacl2，以使终浓度为4％bsa和1.2mm钙离子浓度，按照以下步骤供于elisa。将streptawell 96微量滴定板(roche)用含有生物素标记抗原的100μl pbs包被一晩。用pbst洗涤该板的各孔，由此将抗原除去后，将该孔用250μl的4％bsa-tbs封闭1小时以上。在除去了4％bsa-tbs的各孔中，加入制备的培养上清，将该
板在37℃静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的抗原结合。在用1.2mm cacl2/tbst进行了洗涤的各孔中，加入1.2mm cacl2/tbs或1mm edta/tbs，将该板在37℃静置30分钟，进行孵育。在用1.2mm cacl2/tbst进行洗涤后，将通过终浓度4％的bsa和离子化钙浓度为1.2mm的tbs进行了稀释的hrp结合抗m13抗体(amersham pharmacia biotech)添加至各孔中，将板孵育1小时。用1.2mm cacl2/tbst洗涤后，添加tmb single溶液(zymed)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而停止后，通过450nm的吸光度测定该显色。
[0767]
作为上述噬菌体elisa的结果，将被判断具有ca依赖性抗原结合能力的抗体片段作为模板，利用特异性引物进行扩增，并对所扩增的基因的碱基序列进行分析。
[0768]
(6-4)抗体的表达和纯化将噬菌体elisa的结果判断为具有ca依赖性抗原结合能力的克隆导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下的方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的freestyle 293-f细胞株(invitrogen)悬浮于freestyle 293expression medium培养基(invitrogen)中，以1.33
×
106细胞/ml的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3ml。将制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。在co2培养箱(37度、8％co2、90rpm)中进行4天培养。使用rprotein asepharosetm fast flow(amersham biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述中所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过pace法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(protein science(1995)4,2411-2423)。
[0769]
〔参考实施例7〕获得的抗体对人il-6受体的ca依赖性结合能力的评价为了判断参考实施例6中获得的抗体6rl#9-igg1(重链(序列编号：9上连接有来源于igg1的恒定区序列)、轻链(序列编号：93))、和fh4-igg1(重链(序列编号：94)、轻链(序列编号：95))对人il-6受体的结合活性是否为ca依赖性，使用biacore t100(ge healthcare)来进行这些抗体和人il-6受体的抗原抗体反应的动力学分析。作为对人il-6受体不具有ca依赖性结合活性的对照抗体，使用wo2009/125825中记载的h54/l28-igg1(重链可变区(序列编号：96)、轻链可变区(序列编号：97))。作为高钙离子浓度和低钙离子浓度条件，分别在2mm和3μm的钙离子浓度的溶液中进行抗原抗体反应的动力学分析。在用胺偶联法固定化有适当量的蛋白a(invitrogen)的传感器芯片cm4(ge healthcare)上，捕获目标抗体。流动缓冲液使用10mm aces、150mm nacl、0.05％(w/v)tween20、2mm cacl2(ph7.4)或10mm aces、150mm nacl、0.05％(w/v)tween20、3μmol/l cacl2(ph7.4)这2种缓冲液。人il-6受体的稀释中也使用各缓冲液。测定均在37℃下实施。
[0770]
在使用了h54l28-igg1抗体的抗原抗体反应的动力学分析之际，以流速20μl/min注入il-6受体的稀释液和作为空白的流动缓冲液3分钟，由此使捕获于传感器芯片上的h54l28-igg1抗体与il-6受体发生相互作用。然后，以流速20μl/min加载10分钟流动缓冲液，观察到il-6受体的解离后，以流速30μl/min注入10mm甘氨酸-hcl(ph1.5)30秒钟，由此将传感器芯片再生。根据测定所得的传感图，计算作为动力学参数的结合速度常数ka(1/ms)、和解离速度常数kd(1/s)。使用这些值，计算h54l28-igg1抗体对人il-6受体的解离常数kd(m)。各参数的计算中使用了biacore t100evaluation software(ge healthcare)。
[0771]
在使用了fh4-igg1抗体和6rl#9-igg1抗体的抗原抗体反应的动力学分析之际，以流速5μl/min注入il-6受体的稀释液和作为空白的流动缓冲液15分钟，由此使捕获于传感
器芯片上的fh4-igg1抗体或6rl#9-igg1抗体与il-6受体发生相互作用。然后，以流速30μl/min注入10mm甘氨酸-hcl(ph1.5)30秒钟，由此将传感器芯片再生。根据测定所得的传感图，使用稳态亲和性模型计算解离常数kd(m)。各参数的计算中使用了biacore t100evaluation software(ge healthcare)。
[0772]
通过该方法确定的2mm cacl2存在下的各抗体与il-6受体的解离常数kd示于表28。
[0773]
[表28]抗体h54/l28-igg1fh4-igg16rl#9-igg1kd(m)1.9e-95.9e-72.6e-7。
[0774]
对于ca浓度为3μm的条件下的h54/l28-igg1抗体的kd，可以用与2mm ca浓度存在下相同的方法来计算。ca浓度为3μm的条件下，fh4-igg1抗体和6rl#9-igg1抗体基本未观察到对il-6受体的结合，因而难以通过上述方法来计算kd。但通过使用实施例13中记载的式5(biacore t100 software handbook，br-1006-48，ae 01/2007)，可以预测ca浓度为3μm的条件下的这些抗体的kd。
[0775]
使用了实施例13中记载的式3的、ca浓度为3μmol/l时的各抗体与il-6受体的解离常数kd的预测估算结果示于表29。表29中的req、rmax、ri、c是基于测定结果估计的值。
[0776]
[表29]抗体h54/l28-igg1fh4-igg16rl#9-igg1req(ru) 510rmax(ru) 3972ri(ru) 00c(m) 5e-065e-06kd(m)2.2e-93.4e-053.1e-05。
[0777]
由上述结果预测：对于fh4-igg1抗体和6rl#9-igg1抗体，通过将缓冲液中的cacl2浓度从2mm减少至3μm，对il-6受体的kd将分别上升约60倍、约120倍(亲和性降低60倍、120倍以上)。
[0778]
表30中概括了h54/l28-igg1、fh4-igg1、6rl#9-igg1这3种抗体在2mm cacl2存在下和3μm cacl2存在下的kd值、和kd值的ca依赖性。
[0779]
[表30]抗体h54/l28-igg1fh4-igg16rl#9-igg1kd(m)(2mm cacl2)1.9e-95.9e-72.6e-7kd(m)(3μm cacl2)2.2e-93.4e-5以上3.1e-5以上ca依赖性约1倍约60倍以上约120倍以上。
[0780]
未观察到ca浓度的不同所致的h54/l28-igg1抗体对il-6受体的结合的不同。另一方面，在低浓度的ca条件下，观察到fh4-igg1抗体和6rl#9-igg1抗体对il-6受体的结合的显著减弱(表30)。
[0781]
〔参考实施例8〕所得抗体的钙离子结合评价接着，作为抗体的钙离子结合的评价指标，通过差示扫描型热量测定(dsc)测定了热变性中间温度(tm值)(microcal vp-capillary dsc、microcal)。热变性中间温度(tm值)是稳定性的指标，钙离子结合而使蛋白质稳定化时，热变性中间温度(tm值)与未结合钙离子时相比变高(j.biol.chem.(2008)283，37，25140-25149)。通过评价对应于抗体溶液中钙离子浓度变化的抗体tm值的变化，对抗体的钙离子结合活性进行评价。将经纯化的抗体供于以20mm tris-hcl、150mm nacl、2mm cacl2(ph7.4)或20mm tris-hcl、150mm nacl，3μm cacl2(ph7.4)的溶液作为外液的透析(easysep、tomy)处理。将使用可用于透析的溶液制备为大致0.1mg/ml的抗体溶液作为被测物质，从20℃至115℃以240℃/hr的升温速度进行dsc测定。基于所得dsc的变性曲线，计算各抗体的fab结构域的热变性中间温度(tm值)，将其示于表31。
[0782]
[表31]
[0783]
由表31的结果表明：显示钙依赖性结合能力的fh4-igg1抗体和6rl#9-igg1抗体的fab的tm值根据钙离子浓度的变化而发生改变，未显示钙依赖性结合能力的h54/l28-igg1抗体的fab的tm值未根据钙离子浓度的变化而发生改变。fh4-igg1抗体和6rl#9-igg1抗体的fab的tm值的改变表明：钙离子与这些抗体结合，fab部分发生稳定化。上述结果表明，钙离子与fh4-igg1抗体和6rl#9-igg1抗体结合，而h54/l28-igg1抗体未与钙离子结合。
[0784]
〔参考实施例9〕通过x射线晶体结构分析鉴定6rl#9抗体的钙离子结合位点(9-1)x射线晶体结构分析如参考实施例8所示，热变性温度tm值的测定暗示了6rl#9抗体与钙离子结合。但是，6rl#9抗体的哪个位点与钙离子结合却无法预测，因而通过使用x射线晶体结构分析的方法来确定与钙离子相互作用的6rl#9抗体的序列中的残基。
[0785]
(9-2)6rl#9抗体的表达和纯化对用于x射线晶体结构分析而表达的6rl#9抗体进行纯化。具体地，将以可以分别表达6rl#9抗体的重链(序列编号：9上连接有来源于igg1的恒定区序列)和轻链(序列编号：93)的方式制备的动物表达用质粒瞬时地导入动物细胞。在以最终细胞密度为1
×
106细胞/ml的方式悬浮于freestyle 293expression medium培养基(invitrogen)中的800ml来源于人胎儿肾细胞的freestyle 293-f细胞株(invitrogen)中，通过脂质体转染法导入制备的质粒。将导入了质粒的细胞在co2培养箱(37℃、8％co2、90rpm)中培养5天。根据使用了rprotein a sepharosetm fast flow(amersham biosciences)的本领域技术人员公知的方法，从如上所述得到的培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过pace法算出吸光系数，使用该吸光系数由测定值计算抗体浓度
suite)来进行。最终得到直至分辨率的衍射强度数据。本结晶属于空间群p212121，晶格常数α＝90
°
、β＝90
°
、γ＝90
°
。
[0790]
(9-7)6rl#9抗体的fab片段在ca非存在下的结晶的x射线衍射数据的测定将浸渍于含有35％peg4000的100mm hepes缓冲液(ph7.5)的溶液中的、6rl#9抗体的fab片段的在ca非存在下得到的一个单晶，使用带有微小尼龙环的针除去外液，从而将该单晶在液氮中冷冻。使用高能量加速器研究机构的放射光线设施photon factory的光束线bl-5a，测定前述冷冻结晶的x射线衍射数据。应予说明，测定中通过时常将冷冻结晶置于-178℃的氮气流中而维持冷冻状态。使用安装于光束线上的ccd探测器quantum210r(adsc)，将结晶以每次1
°
进行旋转的同时，收集总计180幅衍射图像。晶格常数的确定、衍射斑的索引(diffraction spot indexing)、和衍射数据的处理通过程序xia2(ccp4software suite)、xds package(walfgang kabsch)以及scala(ccp4 software suite)来进行。最终得到直至分辨率的衍射强度数据。本结晶属于空间群p212121，晶格常数的衍射强度数据。本结晶属于空间群p212121，晶格常数α＝90
°
、β＝90
°
、γ＝90
°
，与ca存在下的结晶是同型。
[0791]
(9-8)6rl#9抗体的fab片段在ca存在下的结晶的结构解析通过使用程序phaser(ccp4 software suite)的分子置换法，确定6rl#9抗体的fab片段在ca存在下的结晶的结构。基于所得晶格的大小和6rl#9抗体的fab片段的分子量，预测非对称单元中的分子数目是一个。基于一级序列上的同源性，将从pdb代码:1za6的结构坐标中取出的a链112-220位和b链116-218位的氨基酸残基部分作为cl和ch1区的考察用模型分子。接着，将从pdb代码:1za6的结构坐标中取出的b链1-115位的氨基酸残基部分作为vh区的考察用模型分子。最后，将从pdb代码2a9m的结构坐标中取出的轻链3-147位的氨基酸残基作为vl区的考察用模型分子。按照该顺序，由旋转函数和平移函数确定各考察用模型分子的晶格内的取向和位置，由此得到6rl#9抗体的fab片段的一级结构模型。通过进行相对于该一级结构模型使vh、vl、ch1、cl的各结构域运动的刚体精密化(rigid body refinement)，相对于的反射数据的晶体学可信度因子r值为46.9％、自由r值为48.6％。进而，通过使用程序refmac5(ccp4 software suite)的结构精密化、和参照以使用实验性确定的结构因子fo和由模型计算得到的结构因子fc和相位计算得到的2fo-fc、fo-fc为系数的电子密度图的同时重复模型修正而在程序coot(paul emsley)上进行，由此进行模型的精密化。最后，基于以2fo-fc、fo-fc为系数的电子密度图，将ca离子和水分子整合至模型中，由此使用程序refmac5(ccp4 software suite)进行精密化。通过使用分辨率的21020个反射数据，最终相对于3440原子的模型的晶体学可信度因子r值为20.0％、自由r值为27.9％。
[0792]
(9-9)6rl#9抗体的fab片段在ca非存在下的结晶的x射线衍射数据的测定6rl#9抗体的fab片段在ca非存在下的结晶的结构使用作为同型的ca存在下结晶的结构来确定。从6rl#9抗体的fab片段在ca存在下的结晶的结构坐标中除去水分子和ca离子分子，进行使vh、vl、ch1、cl的各结构域运动的刚体精密化。相对于的反射数据的晶体学可信度因子r值为30.3％、自由r值为31.7％。进而，通过使用程序refmac5(ccp4 software suite)的结构精密化、和参照以使用实验性确定的结构因子fo和由模型计算得到的结构因子fc和相位计算得到的2fo-fc、fo-fc为系数的电子密度图的同时重复模型修
正而在程序coot(paul emsley)上进行，由此进行模型的精密化。最后，基于以2fo-fc、fo-fc为系数的电子密度图，将水分子整合至模型中，由此使用程序refmac5(ccp4software suite)进行精密化。通过使用分辨率的18357个反射数据，最终相对于3351原子的模型的晶体学可信度因子r值为20.9％、自由r值为27.7％。
[0793]
(9-10)6rl#9抗体的fab片段在ca存在或非存在下的结晶的x射线衍射数据的比较对6rl#9抗体的fab片段在ca存在下的结晶和ca非存在下的结晶的结构进行比较时，在重链cdr3观察到大的变化。通过x射线晶体结构分析确定的6rl#9抗体的fab片段的重链cdr3的结构示于图41。具体地，在ca存在下的6rl#9抗体的fab片段的结晶中，重链cdr3环部分的中心部分存在有钙离子。认为钙离子与重链cdr3的95位、96位和100a位(kabat编号)发生相互作用。认为在ca存在下，对于与抗原结合重要的重链cdr3环通过与钙结合而稳定化，成为最适于与抗原结合的结构。钙与抗体的重链cdr3结合的实例迄今尚未有报道，钙与抗体的重链cdr3结合的结构是新结构。
[0794]
由6rl#9抗体的fab片段的结构表明的存在于重链cdr3中的钙结合模体也能够成为ca文库设计的新要素。例如，可考虑含有6rl#9抗体的重链cdr3、且在包括轻链的其它cdr中含有柔性残基的文库。
[0795]
〔参考实施例10〕从使用噬菌体展示技术的人抗体文库获得ca依赖性地与il-6结合的抗体(10-1)天然人抗体噬菌体展示文库的制作将由人pbmc制作的poly a rna、或市售的人poly a rna等作为模板，按照本领域技术人员公知的方法，构建由展示相互不同的人抗体序列的fab结构域的多个噬菌体构成的人抗体噬菌体展示文库。
[0796]
(10-2)通过珠淘选从文库获得ca依赖性地与抗原结合的抗体片段从构建的天然人抗体噬菌体展示文库的最初的挑选如下实施：仅浓缩对抗原(il-6)具有结合能力的抗体片段。抗原使用生物素标记的il-6。
[0797]
由携带有构建的噬菌体展示用噬粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5m nacl/10％peg，并将由此沉淀的噬菌体的群体用tbs稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，向噬菌体文库液中添加bsa和cacl2以使终浓度为4％bsa和1.2mm钙离子浓度。作为淘选方法，参考了作为常规方法的使用固定化于磁珠的抗原的淘选方法(j.immunol.methods.(2008)332(1-2),2-9、j.immunol.methods.(2001)247(1-2),191-203、biotechnol.prog.(2002)18(2)212-20、mol.cell proteomics(2003)2(2),61-9)。作为磁珠，使用涂布有中和亲和素的珠(sera-mag speedbeads neutravidin-coated)或涂布有链霉亲和素的珠(dynabeads m-280streptavidin)。
[0798]
具体地，制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入用bsa封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温下结合15分钟。珠用1.2mm cacl2/tbst(含有1.2mm cacl2的tbst)洗涤3次后，进一步用1ml的1.2mm cacl2/tbs(含有1.2mm cacl2的tbs)洗涤2次。然后，加入有0.5ml的1mg/ml胰蛋白酶的珠在室温下悬浮15分钟后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(od600为0.4-0.5)的10ml大肠杆菌菌株tg1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种
于225mm
×
225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
[0799]
第2次以后的淘选中，以ca依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，由此使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。加入用bsa封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1ml的1.2mm cacl2/tbst与1.2mm cacl2/tbs洗涤。然后将加入有0.1ml的2mm edta/tbs的珠在室温悬浮后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。回收的噬菌体溶液中加入100mg/ml胰蛋白酶5μl，由此将未展示fab的噬菌体的piii蛋白质(来源于辅助噬菌体的piii蛋白质)切断，未展示fab的噬菌体丧失对大肠杆菌的感染能力。从经胰蛋白酶処理的噬菌体溶液回收的噬菌体添加至对数生长期(od600为0.4-0.7)的10ml大肠杆菌菌株tg1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm
×
225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。以ca依赖性结合能力为指标的淘选重复3次。
[0800]
(10-3)基于噬菌体elisa的评价通过由上述的方法得到的大肠杆菌的单克隆，按照常法(methods mol.biol.(2002)178,133-145)，回收含有噬菌体的培养上清。
[0801]
含有以终浓度4％bsa和1.2mm钙离子浓度的方式加入有bsa和cacl2的噬菌体的培养上清通过以下步骤供于elisa。将streptawell 96微量滴定板(roche)用含有生物素标记抗原的100μl的pbs包被一夜。将该板的各孔用pbst洗涤从而除去抗原后，将该孔用250μl的4％bsa-tbs进行1小时以上的封闭。在除去了4％bsa-tbs的各孔中，加入制备的培养上清，将该板在37℃静置1小时，由此使噬菌体展示抗体与各孔中存在的抗原结合。在用1.2mm cacl2/tbst进行了洗涤的各孔中，加入1.2mm cacl2/tbs或1mm edta/tbs，将该板在37℃静置30分钟，进行孵育。在用1.2mm cacl2/tbst进行洗涤后，将通过终浓度4％的bsa和离子化钙浓度为1.2mm的tbs进行了稀释的hrp结合抗m13抗体(amersham pharmacia biotech)添加至各孔中，将板孵育1小时。用1.2mm cacl2/tbst洗涤后，添加tmb single溶液(zymed)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而停止后，通过450nm的吸光度测定该显色。
[0802]
使用分离的96个克隆进行噬菌体elisa，由此得到对il-6具有ca依赖性结合能力的6kc4-1#85抗体。作为上述噬菌体elisa的结果，将被判断具有ca依赖性抗原结合能力的抗体片段作为模板，利用特异性引物进行扩增，并对所扩增的基因的碱基序列进行分析。6kc4-1#85抗体的重链可变区的序列记载于序列编号：10，轻链可变区的序列记载于序列编号：98。编码6kc4-1#85抗体的重链可变区(序列编号：10)的多核苷酸通过pcr法，与编码来源于igg1的序列的多核苷酸连接，将连接得到的dna片段整合至动物细胞表达用载体中，构建表达序列编号：99所示重链的载体。编码6kc4-1#85抗体的轻链可变区(序列编号：98)的多核苷酸通过pcr法，与编码天然型kappa链的恒定区(序列编号：100)的多核苷酸连接，将编码序列编号：101所示序列的dna片段整合至动物细胞表达用载体中。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。
[0803]
(10-4)抗体的表达和纯化将噬菌体elisa的结果判断为对抗原具有ca依赖性结合能力的克隆6kc4-1#85导
入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下的方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的freestyle293-f细胞株(invitrogen)悬浮于freestyle 293expression medium培养基(invitrogen)中，以1.33
×
106细胞/ml的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3ml。将制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。在co2培养箱(37度、8％co2、90rpm)中进行4天培养。使用rprotein a sepharosetm fast flow(amersham biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述中所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过pace法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(protein science(1995)4,2411-2423)。
[0804]
〔参考实施例11〕6kc4-1#85抗体的钙离子结合评价(11-1)6kc4-1#85抗体的钙离子结合评价评价从人抗体文库获得的钙依赖性抗原结合抗体6kc4-1#85抗体是否与钙结合。在离子化钙浓度不同的条件下，测定的tm值是否发生变化通过参考实施例6中所述的方法来评价。
[0805]
6kc4-1#85抗体的fab结构域的tm值示于表32。如表32所示，6kc4-1#85抗体的fab结构域的tm值根据钙离子浓度而发生变化，因而可知6kc4-1#85抗体与钙结合。
[0806]
[表32]
[0807]
(11-2)6kc4-1#85抗体的钙离子结合位点的鉴定参考实施例11的(11-1)中表明6kc4-1#85抗体与钙离子结合，但6kc4-1#85不具有由hvk5-2序列的研究所明确的钙结合模体。因此，为了鉴定钙离子是与6kc4-1#85抗体的哪个残基进行钙离子结合，将存在于6kc4-1#85抗体的cdr中的asp(d)残基置换为无法参与钙离子的结合或螯合的ala(a)残基，制得改变重链(6_h1-11(序列编号：102)、6_h1-12(序列编号：103)、6_h1-13(序列编号：104)、6_h1-14(序列编号：105)、6_h1-15(序列编号：106))或改变轻链(6_l1-5(序列编号：107)和6_l1-6(序列编号：108))。从导入了含有改变抗体基因的表达载体的动物细胞的培养液中，按照参考实施例6所述的方法纯化改变抗体。纯化的改变抗体的钙结合按照参考实施例6所述的方法进行测定。测定结果示于表33。如表33所示，通过将6kc4-1#85抗体的重链cdr3的95位或101位(kabat编号)置换为ala残基，6kc4-1#85抗体丧失钙结合能力，因而认为该残基对于和钙结合是重要的。由6kc4-1#85抗体的改变抗体的钙结合性所表明的6kc4-1#85抗体的重链cdr3的环根部附近存在的钙结合模体也可以成为参考实施例9中所述ca文库的设计中的新要素。即，除了参考实施例20等中列举具体例的在轻链可变区中导入有钙结合模体的文库之外，例如，可考虑含有6kc4-1#85抗体的重链cdr3中存在的钙结合模体、且在其它氨基酸残基中含有柔性残基的文库。
[0808]
[表33]
[0809]
〔参考实施例12〕使用正常小鼠的ca依赖性结合抗体对抗原的血浆中滞留性的影响的评价(12-1)使用正常小鼠的体内试验对于正常小鼠(c57bl/6j小鼠、charles river japan)，单独给予hsil-6r(可溶型人il-6受体：参考实施例3中制作)或同时给予可溶型人il-6受体和抗人il-6受体抗体，然后评价可溶型人il-6受体和抗人il-6受体抗体的体内动力学。将可溶型人il-6受体溶液(5μg/ml)、或者可溶型人il-6受体与抗人il-6受体抗体的混合溶液在尾静脉以10ml/kg单次给予。作为抗人il-6受体抗体，使用前述的h54/l28-igg1、6rl#9-igg1、fh4-igg1。
[0810]
混合溶液中的可溶型人il-6受体浓度均为5μg/ml，但抗人il-6受体抗体浓度根据每个抗体而不同，h54/l28-igg1为0.1mg/ml、6rl#9-igg1和fh4-igg1为10mg/ml，此时，相对于可溶型人il-6受体，由于抗人il-6受体抗体充分量或过量地存在，因而认为可溶型人il-6受体大部分与抗体结合。在给予后15分、7小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天时进行采血。将采集的血液立即在4℃、12000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
[0811]
(12-2)通过elisa法测定正常小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体浓度小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体浓度通过elisa法测定。首先，将抗人igg(γ-链特异性)f(ab')2fragment of antibody(sigma)分配于nunc-immuno plate,maxisoup
(nalge nunc international)，在4℃静置1晩，由此制作抗人igg固定化板。将血浆中浓度为0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/ml的校准曲线试样和经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样各自分配于抗人igg固定化板中，将该板在25℃孵育1小时。然后，与生物素化抗人il-6r抗体(r&d)在25℃反应1小时后，与链霉亲和素-polyhrp80(stereospecific detection technologies)在25℃反应0.5小时。使用tmb one component hrp microwell substrate(biofx laboratories)作为底物，进行显色反应。通过1n-硫酸(showa chemical)将显色反应终止后，使用酶标仪测定显色液在450nm下的吸光度。使用分析软件softmax pro(molecular devices)，以校准曲线的吸光度为基准，算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的h54/l28-igg1、6rl#9-igg1、fh4-igg1的血浆中抗体浓度的变化示于图42。
[0812]
(12-3)通过电化学发光法测定血浆中的可溶型人il-6受体浓度小鼠的血浆中可溶型人il-6受体浓度通过电化学发光法测定。将调整为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/ml的可溶型人il-6受体校准曲线试样和经50倍以上稀释的小鼠血浆测定试样、与用sulfo-tag nhs ester(meso scale discovery)进行了钌标记的单克隆抗人il-6r抗体(r&d)和生物素化抗人il-6r抗体(r&d)以及托珠单抗(重链序列编号：109、轻链序列编号：83)溶液的混合液在4℃下反应1晩。为了使样品中的游离ca浓度降低，使样品中基本全部的可溶型人il-6受体从6rl#9-igg1或fh4-igg1解离，并成为与添加的托珠单抗结合的状态，此时的试验缓冲液中含有10mm edta。然后，将该反应液分配于ma400 pr 链霉亲和素板(meso scale discovery)中。进而将在25℃反应1小时的板的各孔洗涤后，在各孔中分配读数缓冲液t(
×
4)(meso scale discovery)。立即使用sector pr 400reader(meso scale discovery)对反应液进行测定。可溶型人il-6受体浓度是使用分析软件softmax pro(molecular devices)，根据校准曲线的响应算出。通过前述方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的血浆中可溶型人il-6受体的浓度变化示于图43。
[0813]
结果，可溶型人il-6受体单独给予显示出非常快的消除，与之相对，同时给予可溶型人il-6受体和没有ca依赖性结合的普通抗体h54/l28-igg1时，可溶型人il-6受体的消除大幅变慢。与之相对，同时给予可溶型人il-6受体和具有100倍以上的ca依赖性结合的6rl#9-igg1或fh4-igg1时，可溶型人il-6受体的消除大幅加速。与同时给予h54/l28-igg1时相比，同时给予6rl#9-igg1和fh4-igg1的情形中，一天后的血浆中的可溶型人il-6受体浓度分别降低39倍和2倍。由此确认，钙依赖性结合抗体可以加速抗原从血浆中的消除。
[0814]
〔参考实施例13〕ca依赖性抗原结合抗体的抗原消除加速效果的提高研究(抗体制作)(13-1)关于igg抗体对fcrn的结合igg抗体通过与fcrn结合而具有较长的血浆中滞留性。igg和fcrn的结合仅在酸性条件下(ph6.0)被观察到，而在中性条件下(ph7.4)基本观察不到该结合。igg抗体被非特异性地摄入细胞，但通过在内体内的酸性条件下与内体内的fcrn结合而返回到细胞表面上，在血浆中的中性条件下从fcrn解离。向igg的fc区导入突变而丧失在酸性条件下与fcrn的结合时，变得无法从内体内再循环至血浆中，因而抗体的血浆中滞留性显著受损。
[0815]
作为改善igg抗体的血浆中滞留性的方法，报道有提高酸性条件下对fcrn的结合的方法。通过向igg抗体的fc区导入氨基酸置换来使酸性条件下的fcrn结合提高，igg抗体
从内体内再循环至血浆中的效率上升。结果igg抗体的血浆中滞留性改善。认为导入氨基酸置换时重要的是不能提高中性条件下的对fcrn的结合。中性条件下与fcrn结合的igg抗体即使可在内体内的酸性条件下通过与fcrn结合而返回至细胞表面上，在中性条件下的血浆中，igg抗体也不会从fcrn解离而不会被再循环至血浆中，因此认为反而会损害igg抗体的血浆中滞留性。
[0816]
例如，如dall'acqua等(j.immunol.(2002)169(9),5171-5180)中所记载，据报道通过导入给予小鼠的氨基酸置换，在中性条件下(ph7.4)确认到对小鼠fcrn的结合的igg1抗体的血浆中滞留性变差。此外，如yeung等(j.immunol.(2009)182(12),7663-7671)、datta-mannan等(j.biol.chem.(2007)282(3),1709-1717)、dall'acqua等(j.immunol.(2002)169(9),5171-5180)中所记载，通过导入氨基酸置换而使酸性条件下(ph6.0)的人fcrn结合提高的igg1抗体改变体同时还确认到中性条件下(ph7.4)对人fcrn的结合。据报道，给予食蟹猴的该抗体的血浆中滞留性未改善，未确认到血浆中滞留性的变化。因此，在提高抗体功能的抗体工程技术中，人们着眼于通过在不使中性条件下(ph7.4)的人fcrn结合增加的情形下使酸性条件下的人fcrn结合增加，来改善抗体的血浆中滞留性。即，通过向其fc区导入氨基酸置换而增加了中性条件下(ph7.4)的人fcrn结合的igg1抗体的优点迄今为止尚无报道。
[0817]
ca依赖性地与抗原结合的抗体会加速可溶型抗原的消除，一个抗体分子具有多次反复与可溶型抗原结合的效果，因而极其有用。作为进一步提高该抗原消除加速效果的方法，验证了增强中性条件下(ph7.4)的fcrn结合的方法。
[0818]
(13-2)具有中性条件下的fcrn结合活性的ca依赖性人il-6受体结合抗体的制备通过向具有钙依赖性抗原结合能力的fh4-igg1、6rl#9-igg1、以及用作对照的不具有钙依赖性抗原结合能力的h54/l28-igg1的fc区导入氨基酸突变，制作具有中性条件下(ph7.4)的fcrn结合的改变体。氨基酸突变的导入通过使用pcr的本领域技术人员公知的方法来进行。具体地，制作相对于igg1的重链恒定区将以eu编号表示的434位的氨基酸asn置换为trp的fh4-n434w(重链序列编号：110、轻链序列编号：95)、6rl#9-n434w(重链序列编号：111、轻链序列编号：93)与h54/l28-n434w(重链序列编号：112、轻链序列编号：97)。使用quikchange site-directed mutagenesis kit(stratagene)，利用所附说明书记载的方法，作为插入有编码该氨基酸经置换的突变体的多核苷酸的动物细胞表达载体。抗体的表达、纯化、浓度测定按照参考实施例6中记载的方法来实施。
[0819]
〔参考实施例14〕使用正常小鼠的ca依赖性结合抗体的消除加速效果的评价(14-1)使用正常小鼠的体内试验对正常小鼠(c57bl/6j小鼠、charles river japan)单独给予hsil-6r(可溶型人il-6受体：参考实施例3中制作)、或同时给予可溶型人il-6受体和抗人il-6受体抗体后的可溶型人il-6受体和抗人il-6受体抗体的体内动力学进行评价。将可溶型人il-6受体溶液(5μg/ml)、或者可溶型人il-6受体与抗人il-6受体抗体的混合溶液在尾静脉以10ml/kg单次给予。作为抗人il-6受体抗体，使用了上述h54/l28-n434w、6rl#9-n434w、fh4-n434w。
[0820]
混合溶液中的可溶型人il-6受体浓度均为5μg/ml，抗人il-6受体抗体的浓度根据每个抗体而不同，h54/l28-n434w制备为0.042mg/ml、6rl#9-n434w制备为0.55mg/ml、fh4-n434w制备为1mg/ml。此时，相对于可溶型人il-6受体，由于抗人il-6受体抗体充分量或过
量存在，因而认为可溶型人il-6受体的大部分与抗体结合。在给予后15分、7小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天时进行采血。将采集的血液立即在4℃、12000rpm下进行15分钟离心分离，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
[0821]
(14-2)通过elisa法测定正常小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体的浓度测定小鼠血浆中的抗人il-6受体抗体浓度通过与参考实施例12同样的elisa法来测定。通过该方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的h54/l28-n434w、6rl#9-n434w、fh4-n434w抗体的血浆中抗体浓度的变化示于图44。
[0822]
(14-3)通过电化学发光法测定血浆中可溶型人il-6受体浓度小鼠的血浆中可溶型人il-6受体浓度用电化学发光法测定。将配制为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/ml的可溶型人il-6受体校准曲线试样和经50倍以上稀释的小鼠血浆测定试样、与用sulfo-tag nhs ester(meso scale discovery)进行了钌标记的单克隆抗人il-6r抗体(r&d)和生物素化抗人il-6r抗体(r&d)的混合液在4℃下反应1晩。为了使样品中的游离ca浓度降低，使样品中基本全部的可溶型人il-6受体从6rl#9-n434w或fh4-n434w解离，并成为以游离体存在的状态，此时的试验缓冲液含有10mm edta。然后，将该反应液分配于ma400 pr链霉亲和素板(meso scale discovery)中。进而将在25℃反应1小时的板的各孔洗涤后，在各孔中分配读数缓冲液t(
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4)(meso scale discovery)。立即使用sector pr 400reader(meso scale discovery)对反应液进行测定。可溶型人il-6受体浓度是使用分析软件softmax pro(molecular devices)，根据校准曲线的响应算出。通过前述方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的血浆中可溶型人il-6受体的浓度变化示于图45。
[0823]
结果，在同时给予具有ph7.4下的fcrn结合活性而不具有针对可溶型人il-6受体的ca依赖性结合活性的h54/l28-n434w抗体时，与单独给予可溶型人il-6受体的情形相比，可溶型人il-6受体的消除大幅变慢。与之相对，同时给予对可溶型人il-6受体具有100倍以上的ca依赖性结合、且具有ph7.4下的fcrn结合的6rl#9-n434w抗体或fh4-n434w抗体时，与单独给予可溶型人il-6受体的情形相比，可溶型人il-6受体的消除加速。与单独给予可溶型人il-6受体的情形相比，同时给予6rl#9-n434w抗体或fh4-n434w抗体时，给予后一天的血浆中可溶型人il-6受体浓度分别降低3倍和8倍。结果确认到，通过对钙依赖性地与抗原结合的抗体赋予ph7.4下的fcrn结合活性，可以进一步加速抗原从血浆中的消除。
[0824]
与对可溶型人il-6受体不具有ca依赖性结合的h54/l28-igg1抗体相比，对可溶型人il-6受体具有100倍以上的ca依赖性结合活性的6rl#9-igg1抗体或fh4-igg1抗体被确认到使可溶型人il-6受体的消除增大的效果。对可溶型人il-6受体具有100倍以上的ca依赖性结合、且具有ph7.4下的fcrn结合的6rl#9-n434w抗体或fh4-n434w抗体被确认到与单独给予可溶型人il-6受体相比更为加速可溶型人il-6受体的消除。这些数据暗示，与ph依赖性地与抗原结合的抗体相同地，ca依赖性地与抗原结合的抗体也在内体内将抗原解离。
[0825]
〔参考实施例15〕与钙离子结合的人生殖细胞系列序列的考察(15-1)钙依赖性地与抗原结合的抗体钙依赖性地与抗原结合的抗体(钙依赖性抗原结合抗体)是根据钙的浓度而改变与抗原的相互作用的抗体。由于认为钙依赖性抗原结合抗体是经由钙离子与抗原结合，因而形成抗原侧的表位的氨基酸是、能够螯合钙离子的带负电荷的氨基酸或能够成为氢键受
体的氨基酸。根据这种形成表位的氨基酸的性质，变得可以靶向通过导入组氨酸而制作的ph依赖性地与抗原结合的结合分子以外的表位。认为通过使用兼具钙依赖性和ph依赖性抗原结合性质的抗原结合分子，可以制作能够分别靶向具有广阔性质的各种表位的抗原结合分子。因此认为，只要构建含有钙结合模体的分子的集合(ca文库)、并由该分子的群体获得抗原结合分子，则可有效地获得钙依赖性抗原结合抗体。
[0826]
(15-2)人生殖细胞系列序列的获得作为含有钙结合模体的分子的集合的例子，可考虑该分子为抗体的例子。换而言之，可考虑含有钙结合模体的抗体文库为ca文库的情形。
[0827]
迄今为止尚未报道用含有人生殖细胞系列序列的抗体与钙离子结合。因此，为了判断含有人生殖细胞系列序列的抗体是否与钙离子结合，以由human fetal spreen poly rna(clontech)制备的cdna为模板，克隆了含有人生殖细胞系列序列的抗体的生殖细胞系列的序列。将克隆的dna片段插入动物细胞表达载体。所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定，其序列编号示于表34。编码序列编号：5(vk1)、序列编号：6(vk2)、序列编号：7(vk3)、序列编号：8(vk4)以及序列编号：4(vk5)的多核苷酸通过pcr法，与编码天然型kappa链的恒定区(序列编号：100)的多核苷酸连接，将连接得到的dna片段整合至动物细胞表达用载体中。此外，编码序列编号：113(vk1)、序列编号：114(vk2)、序列编号：115(vk3)、序列编号：116(vk4)以及序列编号：117(vk5)的多核苷酸，通过pcr法与编码序列编号：11所示的igg1的c末端2氨基酸缺失的多肽的多核苷酸连接，将连接得到的dna片段整合至动物细胞表达用载体中。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。
[0828]
[表34]轻链生殖细胞系列序列重链(可变区)序列编号轻链可变区序列编号vk11135vk21146vk31157vk41168vk51174。
[0829]
(15-3)抗体的表达和纯化将获得的5种插入了含有人生殖细胞系列序列的dna片段的动物细胞表达载体导入动物细胞。抗体的表达使用以下的方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的freestyle 293-f细胞株(invitrogen)悬浮于freestyle 293expression medium培养基(invitrogen)中，以1.33
×
106细胞/ml的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3ml。将制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。在co2培养箱(37度、8％co2、90rpm)中进行4天培养。使用rprotein a sepharosetm fast flow(amersham biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述中所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过pace法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(protein science(1995)4，2411-2423)。
[0830]
(15-4)含有人生殖细胞系列序列的抗体的钙离子结合适性的评价
对纯化的抗体的钙离子结合活性进行评价。作为评价钙离子对抗体的结合的指标，通过差示扫描型热量测定(dsc)测定了热变性中间温度(tm值)(microcal vp-capillary dsc、microcal)。热变性中间温度(tm值)是稳定性的指标，钙离子结合而使蛋白质稳定化时，热变性中间温度(tm值)与未结合钙离子时相比变高(j.biol.chem.(2008)283，37，25140-25149)。通过评价对应于抗体溶液中钙离子浓度变化的抗体tm值的变化，对抗体的钙离子结合活性进行评价。将经纯化的抗体供于以20mm tris-hcl、150mm nacl、2mm cacl2(ph7.4)或20mm tris-hcl、150mm nacl，3μm cacl2(ph7.4)的溶液作为外液的透析(easysep、tomy)处理。将使用可用于透析的溶液制备为大致0.1mg/ml的抗体溶液作为被测物质，从20℃至115℃以240℃/hr的升温速度进行dsc测定。基于所得dsc的变性曲线，计算各抗体的fab结构域的热变性中间温度(tm值)，将其示于表35。
[0831]
[表35]
[0832]
结果，含有vk1、vk2、vk3、vk4序列的抗体的fab结构域的tm值未根据含有该fab结构域的溶液中的钙离子浓度而发生改变。而含有vk5序列的抗体的fab结构域的tm值却根据含有该fab结构域的抗体溶液中的钙离子浓度而发生了改变，结果表明vk5序列与钙离子结合。
[0833]
〔参考实施例16〕人vk5(hvk5)序列的评价(16-1)hvk5序列kabat数据库中作为hvk5序列仅登录有hvk5-2序列。以下，hvk5和hvk5-2以同义地使用。wo2010/136598中，hvk5-2序列在生殖细胞系列序列中的存在比被记载为0.4％。在其它报道中，hvk5-2序列在生殖细胞系列序列中的存在比也记载为0～0.06％(j.mol.biol.(2000)296,57-86、proc.natl.acad.sci.(2009)106,48,20216-20221)。如上所述，hvk5-2序列是在生殖细胞系列序列中出现频率低的序列，因而认为从由人生殖细胞系列序列构成的抗体文库或从由对表达人抗体的小鼠进行免疫而得的b细胞来获得与钙结合的抗体是非效率的。因此，虽然可考虑设计含有人hvk5-2序列的ca文库的可能性，但hvk5-2序列的物性没有报道，该可能性的实现是未知的。
[0834]
(16-2)糖链非添加型hvk5-2序列的构建、表达和纯化hvk5-2序列具有在20位(kabat编号)的氨基酸添加n型糖链的序列。蛋白质中添加的糖链存在异源性，因而从物质的同源性观点出发，期望不添加糖链。因此，制作将20位(kabat编号)的asn(n)残基置换为thr(t)残基的改变体hvk5-2_l65(序列编号：118)。氨基
酸的置换通过使用quikchange site-directed mutagenesis kit(stratagene)的本领域技术人员公知的方法进行。将编码改变体hvk5-2_l65的dna整合至动物表达用载体中。整合有所制作改变体hvk5-2_l65的dna的动物表达用载体，与按作为重链表达cim_h(序列编号：117)的方式整合得到的动物表达用载体一起，通过参考实施例6中记载的方法一同导入动物细胞中。导入的动物细胞中表达的含有hvk5-2_l65和cim_h的抗体通过参考实施例6所述的方法进行纯化。
[0835]
(16-3)含有糖链非添加型hvk5-2序列的抗体的物性评价获得的含有改变序列hvk5-2_l65的抗体与含有改变之前的hvk5-2序列的抗体相比，其异源性减少与否使用离子交换色谱法进行分析。离子交换色谱法的方法示于表36。分析结果表明，如图46所示糖链添加位点被改变的hvk5-2_l65与原本的hvk5-2序列相比，异源性减少。
[0836]
[表36]
[0837]
接着，含有抗体hvk5-2_l65序列的抗体与钙离子结合与否通过使用参考实施例15中记载的方法来评价。结果，如表37所示，含有糖链添加位点被改变的hvk5-2_l65的抗体的fab结构域的tm值也根据抗体溶液中的钙离子浓度的变化而发生改变。即，表明含有糖链添加位点被改变的hvk5-2_l65的抗体的fab结构域与钙离子结合。
[0838]
[表37]
[0839]
〔参考实施例17〕钙离子与含有hvk5-2序列的cdr序列的抗体分子的结合活性的评价(17-1)含有hvk5-2序列的cdr序列的改变抗体的制作、表达和纯化hvk5-2_l65序列是存在于人vk5-2序列的框架中的糖链添加位点的氨基酸被改变了的序列。参考实施例16表明即使改变糖链添加位点也结合钙离子，但从免疫原性观点出发，通常期望框架序列是生殖细胞系列的序列。因此，研究了是否可以在维持该抗体的钙离子结合活性的同时，将抗体的框架序列置换为不添加糖链的生殖细胞系列序列的框架序
列。
[0840]
编码化学合成的hvk5-2序列的框架序列被改变为hvk1、hvk2、hvk3和hvk4序列的序列(分别为cavk1(序列编号：119)、cavk2(序列编号：120)、cavk3(序列编号：121)、cavk4(序列编号：122)多核苷酸通过pcr法，与编码天然型kappa链的恒定区(序列编号：100)的多核苷酸连接，将连接得到的dna片段整合至动物细胞表达用载体中。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。如上所述制作的各质粒、与整合有编码重链cimh(序列编号：117)的多核苷酸的质粒一起通过参考实施例6所述的_方法导入动物细胞。从如上所述导入的动物细胞的培养液中纯化表达的所期望的抗体分子。
[0841]
(17-2)含有hvk5-2序列的cdr序列的改变抗体的钙离子结合活性的评价钙离子与含有hvk5-2序列以外的生殖细胞系列序列(hvk1、hvk2、hvk3、hvk4)的框架序列和hvk5-2序列的cdr序列的改变抗体结合与否，通过实施例6所述的方法进行评价。评价结果示于表38。表明各改变抗体的fab结构域的tm值根据抗体溶液中的钙离子浓度变化而发生改变。所以，表明含有hvk5-2序列的框架序列以外的框架序列的抗体也与钙离子结合。
[0842]
[表38]
[0843]
进而，以含有hvk5-2序列以外的生殖细胞系列序列(hvk1、hvk2、hvk3、hvk4)的框架序列和hvk5-2序列的cdr序列的方式进行改变的各抗体的fab结构域的热稳定性的指标，即热变性温度(tm值)与含有改变前的hvk5-2序列的抗体的fab结构域的tm值相比，显示有所增加。由该结果发现：含有hvk1、hvk2、hvk3、hvk4的框架序列和hvk5-2序列的cdr序列的抗体不仅具有与钙离子结合的性质，而且在热稳定性的观点上也是优异的分子。
[0844]
〔参考实施例18〕人生殖细胞系列hvk5-2序列中存在的钙离子结合位点的鉴定(18-1)hvk5-2序列的cdr序列中的突变位点的设计如参考实施例17所述，含有将hvk5-2序列的cdr部分导入其它生殖细胞系列的框架序列中而得的轻链的抗体也显示与钙离子结合。该结果暗示hvk5-2中存在的钙离子结合位点存在于cdr中。作为与钙离子结合、即、螯合钙离子的氨基酸，可举出带负电的氨基酸或能够成为氢键受体的氨基酸。因此，评价含有hvk5-2序列的cdr序列中存在的asp(d)残基或glu(e)残基被置换为ala(a)残基的突变hvk5-2序列的抗体是否与钙离子结合。
[0845]
(18-2)hvk5-2序列的ala置换体的制作以及抗体的表达和纯化
制作含有轻链的抗体分子，该轻链中，hvk5-2序列的cdr序列中存在的asp和/或glu残基被改变为ala残基。如参考实施例16所述，不添加糖链的改变体hvk5-2_l65维持了钙离子结合，因而从钙离子结合性的观点出发，认为与hvk5-2序列等同。本实施例中，以hvk5-2_l65为模板序列进行氨基酸置换。制作的改变体示于表39。氨基酸的置换通过quikchange site-directed mutagenesis kit(stratagene)、pcr或in fusion advantage pcr cloning kit(takara)等本领域技术人员公知的方法来进行，构建氨基酸被置换的改变轻链的表达载体。
[0846]
[表39]
[0847]
所得表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定。将制得的改变轻链的表达载体，与重链cim_h(序列编号：117)的表达载体一起瞬时地导入来源于人胎儿肾癌细胞的hek293h细胞株(invitrogen)、或freestyle293细胞(invitrogen)中，由此表达抗体。从所得培养上清中，使用rprotein a sepharosetm fast flow(ge
ヘルスケア
)，通过本领域技术人员公知方法纯化出抗体。使用分光光度计，测定纯化得到的抗体溶液的280nm下的吸光度。通过pace法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(protein science(1995)4,2411-2423)。
[0848]
(18-3)含有hvk5-2序列的ala置换体的抗体的钙离子结合活性评价所得纯化抗体是否与钙离子结合通过参考实施例15中记载的方法进行判定。其结果示于表40。通过将hvk5-2序列的cdr序列中存在的asp或glu残基置换为无法参与钙离子的结合或螯合的ala残基，存在其fab结构域的tm值不会根据抗体溶液的钙离子浓度变化而改变的抗体。tm值不因ala置换而变化的置换位点(32位和92位(kabat编号))显示对于钙离子和抗体的结合特别重要。
[0849]
[表40]
[0850]
〔参考实施例19〕包含具有钙离子结合模体的hvk1序列的抗体的钙离子结合活性的评价(19-1)具有钙离子结合模体的hvk1序列的制作以及抗体的表达和纯化参考实施例18中记载的ala置换体的钙结合活性的结果表明，hvk5-2序列的cdr序列中，asp或glu残基对于钙结合是重要的。因此，评价仅将30位、31位、32位、50位和92位(kabat编号)的残基导入其它生殖细胞系列的可变区序列是否也能够与钙离子结合。具体地，将人生殖细胞系序列hvk1序列的30位、31位、32位、50位和92位(kabat编号)的残基置换为hvk5-2序列的30位、31位、32位、50位和92位(kabat编号)的残基，制作改变体lfvk1_ca(序列编号：131)。即，判断含有仅导入了hvk5-2序列中的上述5个残基的hvk1序列的抗体能否与钙结合。改变体制作与参考实施例17相同地进行。使所得轻链改变体lfvk1_ca和含有轻链hvk1序列的lfvk1(序列编号：132)与重链cim_h(序列编号：117)一起表达。抗体的表达和纯化通过与参考实施例18相同的方法实施。
[0851]
(19-2)含有具有钙离子结合模体的人hvk1序列的抗体的钙离子结合活性的评价如上所述得到的纯化抗体是否与钙离子结合通过参考实施例15所述的方法来判断。其结果示于表41。含有具有hvk1序列的lfvk1的抗体的fab结构域的tm值未根据抗体溶液中的钙浓度变化而改变，而含有lfvk1_ca的抗体序列的、tm值根据抗体溶液中的钙浓度变化而改变1℃以上，因而表明含有lfvk1_ca的抗体与钙结合。上述结果表明，钙离子的结合中，hvk5-2的全部cdr序列并不是必须的，仅构建lfvk1_ca序列时导入的残基即足够。
[0852]
[表41]
[0853]
〔参考实施例20〕设计可变区导入有钙离子结合模体的抗体分子的群体(ca文库)以便可高效地获得ca浓度依赖性地与抗原结合的结合抗体
作为钙结合模体，优选可举出例如：hvk5-2序列和其cdr序列、以及残基30位、31位、32位、50位、92位(kabat编号)。另外，与钙结合的蛋白所具有的ef手模体(钙调蛋白等)或c型凝集素(asgpr等)也相当于钙结合模体。
[0854]
ca文库由重链可变区和轻链可变区构成。重链可变区使用人抗体序列，轻链可变区导入有钙结合模体。作为导入有钙结合模体的轻链可变区的模板序列，选择hvk1序列。包含向hvk1序列中导入作为钙结合模体之一的hvk5-2的cdr序列而成的lfvk1_ca序列的抗体，如参考实施例19所示，显示与钙离子结合。使多个氨基酸在模板序列中出现，以提高构成文库的抗原结合分子的多样性。对于使多个氨基酸出现的位置，选择与抗原相互作用的可能性高的露出于可变区的表面的位置。具体地，选择30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位和96位(kabat编号)来作为这种柔性残基。
[0855]
接着，设定出现的氨基酸残基的种类及其出现频率。对登录于kabat数据库(kabat,e.a.et al.:'sequences of proteins of immunological interest',vol.91,1991,nih publication)的hvk1和hvk3的序列中的柔性残基的氨基酸的出现频率进行分析。基于分析结果，从在各位置出现频率高的氨基酸中选择要在ca文库出现的氨基酸的种类。此时，为了避免氨基酸的性质有偏向，也选择在分析结果中判定为出现频率少的的氨基酸。此外，选择的氨基酸的出现频率参考kabat数据库的分析结果进行设定。
[0856]
通过考虑如上所述设定的氨基酸和出现频率，作为ca文库，设计含有钙结合模体、且重视了在该模体以外的各残基处含有多个氨基酸的序列多样性的ca文库。表1和2中示出ca文库的详细设计(各表中的位置表示eu编号)。此外，对于表1和2中记载的氨基酸的出现频率，在以kabat编号表示的92位为asn(n)时，94位可以不为ser(s)而为leu(l)。
[0857]
〔参考实施例21〕ca文库的制作以由人pbmc制得的poly a rna、或市售的人poly a rna等作为模板，通过pcr法扩增抗体重链可变区的基因文库。对于抗体轻链可变区部分，如参考实施例20所述，设计维持钙结合模体并提高了可钙浓度依赖性地与抗原结合的抗体的出现频率的抗体可变区轻链部分。此外，柔性残基中，作为导入有钙结合模体的残基以外的氨基酸残基，参考天然人抗体中的氨基酸出现频率的信息((kabat,e.a.et al.:'sequences of proteins of immunological interest',vol.91,1991,nih publication)，设计了使天然人抗体的序列中出现频率高的氨基酸均等分布的抗体轻链可变区的文库。将如此制作的抗体重链可变区的基因文库和抗体轻链可变区的基因文库的组合插入噬粒载体，构建展示由人抗体序列构成的fab结构域的人抗体噬菌体展示文库(methods mol biol.(2002)178,87-100)。在构建上述文库时，使用了连接噬粒的fab和噬菌体piii蛋白的接头部分、以及在辅助噬菌体piii蛋白基因的n2结构域和ct结构域之间插入有胰蛋白酶切断序列的噬菌体展示文库的序列。对从导入有抗体基因文库的大肠杆菌分离得到的抗体基因部分的序列进行确认，得到290种克隆的序列信息。设计的氨基酸分布和确认得到的序列中氨基酸的分布示于图52。构建了包含与设计的氨基酸分布对应的多种序列的文库。
[0858]
〔参考实施例22〕ca文库中所含分子的钙离子结合活性的评价(22-1)ca文库中所含分子的钙离子结合活性如参考实施例14所示，显示与钙离子结合的hvk5-2序列是在生殖细胞系列序列中出现频率低的序列，因而认为从由人生殖细胞系列序列构成的抗体文库或从由对表达人抗
体的小鼠进行免疫而得的b细胞来获得与钙结合的抗体是非效率的。因此，在参考实施例21中构建了ca文库。对构建的ca文库中是否存在显示钙结合的克隆进行评价。
[0859]
(22-2)抗体的表达和纯化将ca文库中所含的克隆导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的freestyle 293-f细胞株(invitrogen)在freestyle 293expression medium培养基(invitrogen)中悬浮，以1.33
×
106细胞/ml的细胞密度接种于6孔板的各孔各3ml。将制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。在co2培养箱(37度、8％co2、90rpm)中进行4天培养。使用rprotein a sepharosetm fast flow(amersham biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述中所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过pace法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(protein science(1995)4,2411-2423)。
[0860]
(22-3)钙离子对所得抗体的结合评价如上所述得到的纯化抗体是否与钙离子结合，通过参考实施例6中记载的方法来判定。其结果示于表42。ca文库中所含的多个抗体的fab结构域的tm根据钙离子浓度而发生改变，显示含有与钙离子结合的分子。
[0861]
[表42]
[0862]
〔参考实施例23〕ph依赖性结合抗体文库的设计(23-1)ph依赖性结合抗体的获得方法wo2009/125825中，通过向抗原结合分子导入组氨酸，公开了性质在ph中性区域和ph酸性区域下发生变化的ph依赖性抗原结合抗体。公开的ph依赖性结合抗体通过将所期望的抗原结合分子的氨基酸序列的一部置换为组氨酸的改变来获得。为了不用预先获得欲改
变的对象抗原结合分子而更有效地获得ph依赖性结合抗体，考虑从将组氨酸导入可变区(更优选为可能与抗原结合相关的位置)的抗原结合分子的群体(称为his文库)中获得与所期望的抗原结合的抗原结合分子的方法。从his文库得到的抗原结合分子与从普通抗体文库得到的相比，组氨酸高频率地出现，因而认为可有效地获得具有所期望性质的抗原结合分子。
[0863]
(23-2)以能够有效地获得ph依赖性地与抗原结合的结合抗体的方式，设计将组氨酸残基导入可变区的抗体分子的群体(his文库)首先，在his文库中选择导入组氨酸的位置。wo2009/125825中公开了，通过将il-6受体抗体、il-6抗体和il-31受体抗体的序列中的氨基酸残基置换为组氨酸，来制作ph依赖性抗原结合抗体。进而，通过将抗原结合分子的氨基酸序列置换为组氨酸，制作了具有ph依赖性抗原结合能力的、抗蛋白溶菌酶抗体(febs letter 11483,309,1,85-88)和抗铁调素抗体(wo2009/139822)。在il-6受体抗体、il-6抗体、il-31受体抗体、蛋白溶菌酶抗体和铁调素抗体中导入组氨酸的位置示于表43。表43所示的位置可被列举为能够控制抗原和抗体的结合的候补位置。进而，除了表43中所示的位置以外，认为与抗原接触的可能性高的位置也适合作为导入组氨酸的位置。
[0864]
[表43]
[0865]
在由重链可变区和轻链可变区构成的his文库中，重链可变区使用人抗体序列，轻链可变区中导入有组氨酸。作为在his文库中导入组氨酸的位置，选择上述列举的位置以及可能参与抗原结合的位置、即轻链的30位、32位、50位、53位、91位、92位和93位(kabat编号，kabat ea et al.1991.sequence of proteins of immunological interest.nih)。另外，作为导入组氨酸的轻链可变区的模板序列，选择vk1序列。使多个氨基酸在模板序列中出现，以提高构成文库的抗原结合分子的多样性。对于使多个氨基酸出现的位置，选择与抗原相互作用的可能性高的露出于可变区的表面的位置。具体地，选择轻链的30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位和96位(kabat编号，kabat ea et al.1991.sequence of proteins of immunological interest.nih)来作为这种柔性残基。
[0866]
接着，设定出现的氨基酸残基的种类及其出现频率。对登录于kabat数据库(kabat,e.a.et al.:'sequences of proteins of immunological interest',vol.91,1991,nih publication)的hvk1和hvk3的序列中的柔性残基的氨基酸的出现频率进行分析。基于分析结果，从在各位置出现频率高的氨基酸中选择要在his文库出现的氨基酸的种
类。此时，为了避免氨基酸的性质有偏向，也选择在分析结果中判定为出现频率少的的氨基酸。此外，选择的氨基酸的出现频率参考kabat数据库的分析结果进行设定。
[0867]
通过考虑如上所述设定的氨基酸和出现频率，作为his文库，设计了以各cdr中必须包含1个组氨酸的方式固定的his文库1与较his文库1更重视序列多样性的his文库2。his文库1和his文库2的详细设计示于表3和表4(各表中的位置表示kabat编号)。此外，对于表3和表4中记载的氨基酸的出现频率，在以kabat编号表示的92位为asn(n)时，94位可以排除ser(s)。
[0868]
〔参考实施例24〕制作用于获得ph依赖性地与抗原结合的抗体的人抗体噬菌体展示文库(his文库1)以由人pbmc制得的poly a rna、或市售的人poly a rna等作为模板，通过pcr法扩增抗体重链可变区的基因文库。设计为实施例1中记载的his文库1的抗体轻链可变区的基因文库使用pcr法进行扩增。将如此制作的抗体重链可变区的基因文库和抗体轻链可变区的基因文库的组合插入噬粒载体，构建展示由人抗体序列构成的fab结构域的人抗体噬菌体展示文库。作为构建方法，参考了(methods mol biol.(2002)178,87-100)。在构建上述文库时，使用了连接噬粒的fab和噬菌体piii蛋白的接头部分、以及在辅助噬菌体piii蛋白基因的n2结构域和ct结构域之间插入有胰蛋白酶切断序列的噬菌体展示文库的序列。对从导入有抗体基因文库的大肠杆菌分离得到的抗体基因部分的序列进行确认，得到132个克隆的序列信息。设计的氨基酸分布和确认得到的序列中氨基酸的分布示于图53。构建了包含与设计的氨基酸分布对应的多种序列的文库。
[0869]
〔参考实施例25〕制作用于获得ph依赖性地与抗原结合的抗体的人抗体噬菌体展示文库(his文库2)以由人pbmc制得的poly a rna、或市售的人poly a rna等作为模板，通过pcr法扩增抗体重链可变区的基因文库。如参考实施例23所述，为了使具有ph依赖性抗原结合能力的抗体的出现频率提高，设计抗体可变区的轻链部分中成为抗原接触位点的可能性高的部位的组氨酸残基的出现频率提高的抗体可变区轻链部分。此外，柔性残基中，作为导入有组氨酸的残基以外的氨基酸残基，设计使由天然人抗体中的氨基酸出现频率的信息确定的出现频率高的氨基酸均等分布的抗体轻链可变区的文库。合成如上所述设计的抗体轻链可变区的基因文库。文库的合成还可以委托商业性受托公司等来制作。将如此制作的抗体重链可变区的基因文库和抗体轻链可变区的基因文库的组合插入噬粒载体，根据公知的方法(methods mol biol.(2002)178,87-100)构建展示由人抗体序列构成的fab结构域的人抗体噬菌体展示文库。根据参考实施例24中记载的方法，对从导入有抗体基因文库的大肠杆菌中分离的抗体基因部分的序列进行确认。
[0870]
〔参考实施例26〕fcγriib选择结合改变和其它fc区的氨基酸置换的组合的效果通过对实施例14中观察到的对fcγriib的选择性提高的以eu编号表示的238位的pro置换为asp的改变体进行改变，尝试进一步增强对fcγriib的选择性。
[0871]
首先，相对于导入了il6r-g1d的以eu编号表示的238位的pro置换为asp的改变的il6r-g1d-v1(序列编号：80)，导入实施例14中记载的增强对fcγriib的选择性的以eu编号表示的328位的leu置换为glu的置换，制得改变体il6r-g1d-v4(序列编号：172)。与用作l链的il6r-l(序列编号：83)组合表达的il6r-g1d-v4，按照与参考实施例2同样的方法来制备。
这里得到的具有来源于il6r-g1d-v4的氨基酸序列作为抗体h链的抗体记为igg1-v4。按照与实施例14同样的方法评价的igg1、igg1-v1、igg1-v2、igg1-v4对fcγriib的结合活性示于表44。表中的改变表示对il6r-g1d导入的改变。
[0872]
[表44]
[0873]
表44的结果表明，l328e的fcγriib结合活性与igg1相比提高2.3倍，因而若与相同的与igg1相比fcγriib结合活性提高4.8倍的p238d组合，则期待fcγriib结合活性的提高程度更为增大，但实际上组合这些改变而成的改变体的fcγriib结合活性与igg1相比却降低至0.47倍。该结果是由各改变的效果所无法预测的效果。
[0874]
同样地，相对于在il6r-g1d中导入了以eu编号表示的238位的pro置换为asp的改变的il6r-g1d-v1(序列编号：80)，按照参考实施例2的方法，导入实施例14中记载的提高fcγriib结合活性的将以eu编号表示的267位的ser置换为glu的置换和将以eu编号表示的328位的leu置换为phe的置换，由此制备改变体il6r-g1d-v5(序列编号：173)。这里得到的具有来源于il6r-g1d-v5的氨基酸序列作为抗体h链的抗体记为igg1-v5。按照实施例14的方法评价的igg1、igg1-v1、igg1-v3、igg1-v5对fcγriib的结合活性示于表45。
[0875]
相对于p238d改变体，导入了实施例14中具有针对fcγriib的增强效果的改变(s267e/l328f)。导入该改变前后的fcγriib结合活性的变化示于表45。
[0876]
[表45]
[0877]
表45的结果表面，s267e/l328f的fcγriib结合活性与igg1相比提高408倍，因而若与相同的与igg1相比fcγriib结合活性提高4.8倍的p238d组合，则期待fcγriib结合活性的提高程度进一步增大，但实际上，与上述例子相同地，组合这些改变而成的改变体的fcγriib结合活性与igg1相比却只提高12倍左右。该结果也是由各改变的效果所无法预测的效果。
[0878]
这些结果表明，虽然以eu编号表示的238位的pro置换为asp的置换单独时会使fcγriib结合活性提高，但与其它提高fcγriib结合活性的改变组合时却不发挥其效果。作为其原因之一，认为是，关系到fc和fcγr的相互作用的界面结构由于导入以eu编号表示的238位的pro置换为asp的置换而发生改变，从而不能反映在天然型抗体中观察到的改变的
效果。因此认为，将包含以eu编号表示的238位的pro置换为asp的置换的fc作为模板来创造fcγriib选择性更优异的fc，由于无法应用由天然型抗体所得的改变的效果信息，因而极其困难。
[0879]
〔参考实施例27〕除了p238d改变之外还导入了铰链部分的改变的改变体对fcγriib的结合的综合分析如参考实施例26所示，相对于将人天然型igg1中以eu编号表示的238位的pro置换为asp而成的fc，即使组合根据天然型抗体的分析预测为进一步提高fcγriib结合的其它改变，也得不到期待的组合效果。因此，相对于将以eu编号表示的238位的pro置换为asp而成的改变fc综合地导入改变，由此尝试寻找进一步增强fcγriib结合的改变体。制作导入有将用作抗体h链的il6r-g1d(序列编号：79)的以eu编号表示的252位的met置换为tyr的改变、将以eu编号表示的434位的asn置换为tyr的改变的il6r-f11(序列编号：174)。进而，制作对il6r-f11导入将以eu编号表示的238位的pro置换为asp的改变的il6r-f652(序列编号：175)。分别制备含有将il6r-f652中以eu编号表示的238位的残基附近的区域(以eu编号表示的234位至237位、239位)分别置换为除了原本的氨基酸和半胱氨酸之外的18种氨基酸而成的抗体h链序列的表达质粒。共同使用il6r-l(序列编号：83)来作为抗体l链。这些改变体通过与参考实施例2同样的方法进行表达、纯化。这些fc突变体称为pd变体。通过与实施例14同样的方法对各pd变体与fcγriia r型和fcγriib的相互作用进行综合评价。
[0880]
按照以下的方法，制作示出与各fcγr的相互作用分析结果的图。将各pd变体对各fcγr的结合量的值除以作为对照的突变导入前的抗体(以eu编号表示的238位的pro置换为asp的突变即il6r-f652/il6r-l)对各fcγr的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各pd变体对各fcγr的相对结合活性的值来表示。横轴表示各pd变体对fcγriib的相对结合活性的值，纵轴表示各pd变体对fcγriia r型的相对结合活性的值(图55)。
[0881]
结果发现，11种改变体对fcγriib的结合与导入该各改变前的抗体相比增强，具有维持或增强对fcγriia r型的结合的效果。将上述11种改变体对fcγriib和fcγriia r的结合活性的总结结果示于表46。应予说明，表中的序列编号表示评价的改变体的h链的序列编号，此外，改变表示对il6r-f11(序列编号：174)导入的改变。
[0882]
[表46]
[0883]
对导入有p238d的改变体将前述11种改变进一步组合并导入而成的改变体的相对
fcγriib结合活性的值、以及对不含p238d的fc导入该改变而成的改变体的相对fcγriib结合活性的值示于图56。若将上述11种改变进一步导入至p238d改变中，则与导入前相比，fcγriib结合量增强。另一方面，将除了g237f、g237w、和s239d的8种改变导入实施例14中所用的不含p238d的改变体(gph7-b3/gpl16-k0)时，显示降低fcγriib结合的效果。参考实施例26与该结果表明，难以基于导入至天然型igg1的改变的效果，来预测向包含p238d改变的改变体组合并导入相同改变时的效果。换而言之，本次发现的8种改变是若不进行向包含p238d改变的改变体组合并导入相同改变的本研究则不可能发现的改变。
[0884]
表46示出的改变体对fcγria、fcγriiar、fcγriiah、fcγriib、fcγriiiav的kd值通过与实施例14同样的方法来测定，结果示于表47。应予说明，表中的序列编号表示评价的改变体的h链的序列编号，此外，改变表示对il6r-f11(序列编号：174)导入的改变。其中，对于作为制作il6r-f11时的模板的il6r-g1d/il6r-l，以*来表示。此外，表中的kd(iiar)/kd(iib)和kd(iiah)/kd(iib)分别表示各改变体对fcγriiar的kd值除以各改变体对fcγriib的kd值而得的值、各改变体对fcγriiah的kd值除以各改变体对fcγriib的kd值而得的值。亲本多肽的kd(iib)/改变多肽的kd(iib)是指亲本多肽对fcγriib的kd值除以各改变体对fcγriib的kd值而得的值。除此之外，各改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强一方的kd值/亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强一方的kd值示于表47。这里，亲本多肽是指具有il6r-f11(序列编号：27)作为h链的改变体。应予说明，由于判断fcγr对igg的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表47中用灰色涂覆的单元是利用实施例14中记载的式子算出的值。
[0885]
〔式5〕kd＝c
×
rmax/(req-ri)-c。
[0886]
如表47所示，任意的改变体与il6r-f11相比，fcγriib亲和性均提高，该提高的幅度为1.9倍至5.0倍。各改变体对fcγriiar的kd值/各改变体对fcγriib的kd值之比、和各改变体对fcγriiah的kd值/各改变体对fcγriib的kd值之比表示相对于fcγriiar和fcγriiah结合活性的相对fcγriib结合活性。即，该值是表示各改变体对fcγriib的结合选择性的大小的值，该值越大则对fcγriib的结合选择性越高。亲本多肽il6r-f11/il6r-l对fcγriiar的kd值/对fcγriib的kd值之比、和对fcγriiah的kd值/对fcγriib的kd值之比均为0.7，因而表47中任一改变体与亲本多肽相比，对fcγriib的结合选择性均提高。改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的kd值/亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的kd值若为1以上，则表示该改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合等同于或低于亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合。本次所得的改变体中，该值为0.7至5.0，因而可以说本次所得的改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合与亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合相比，是等同的或较其降低。由上述结果可知，对本次所得的改变体来说，与亲本多肽相比，维持或降低了对fcγriia r型和h型的结合活性，同时增强了对fcγriib的结合活性，对fcγriib的选择性提高。此外，与il6r-f11相比，任意改变体对fcγria和fcγriiiav的亲和性均降低。
[0887]
[表47]
[0888]
〔参考实施例28〕含有p238d的fc与fcγriib胞外区的复合体的x射线晶体结构分
析如以上参考实施例27所示，即使对含有p238d的fc导入根据天然型igg1抗体的分析预测为提高fcγriib结合活性或提高fcγriib选择性的改变，fcγriib结合活性也被发现减弱，其原因被认为是fc和fcγriib的相互作用界面的结构由于导入p238d而发生改变的缘故。因此，为了探寻该现象的原因，通过x射线晶体结构分析来阐明具有p238d突变的igg1的fc(以下，记为fc(p238d))和fcγriib胞外区的复合体的立体结构，通过对天然型igg1的fc(以下，记为fc(wt))和fcγriib胞外区的复合体的立体结构进行对比，比较它们的结合模式。应予说明，关于fc和fcγr胞外区的复合体的立体结构已有多个报道，已经分析了fc(wt)/fcγriiib胞外区复合体(nature,2000,400,267-273；j.biol.chem.2011,276,16469-16477)、fc(wt)/fcγriiia胞外区复合体(proc.natl.acad.sci.usa,2011,108,12669-126674)、和fc(wt)/fcγriia胞外区复合体(j.imunol.2011,187,3208-3217)的立体结构。迄今为止，fc(wt)/fcγriib胞外区复合体的立体结构尚未被分析，对于与fc(wt)的复合体的立体结构已知的fcγriia和fcγriib来说，在胞外区中，氨基酸序列的93％一致，具有非常高的同源性，因而通过基于fc(wt)/fcγriia胞外区复合体的晶体结构的建模来推测fc(wt)/fcγriib胞外区复合体的立体结构。
[0889]
对于fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体，通过x射线晶体结构分析以分辨率来确定立体结构。该分析结果的结构示于图57。fcγriib胞外区以夹在2个fc ch2结构域之间的方式结合，这与迄今为止分析的fc(wt)和fcγriiia、fcγriiib、fcγriia的各胞外区的复合体的立体结构类似。
[0890]
接着为了详细比较，相比对fcγriib胞外区以及fc ch2结构域a，通过基于cα原子间距离的最小二乘法使fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构和fc(wt)/fcγriib胞外区复合体的模型结构重合(图58)。此时，可知fc ch2结构域b彼此的重叠程度并不良好，在该部分存在立体结构差异。进而，使用fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构以及fc(wt)/fcγriib胞外区复合体的模型结构，通过对提取的在fcγriib胞外区和fc ch2结构域b之间其距离为 以下的原子对进行比较，以对fcγriib和fc(wt)ch2结构域b之间的原子间相互作用与fcγriib和fc(p238d)ch2结构域b之间的原子间相互作用进行比较。如表48所示，fc(p238d)和fc(wt)中，fc ch2结构域b和fcγriib之间的原子间相互作用不一致。
[0891]
[表48]
[0892]
进而，以fc ch2结构域a以及fc ch2结构域b各自单独通过基于cα原子间距离的最小二乘法，将fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的x射线晶体结构与fc(wt)/fcγriib胞外区复合体的模型结构重合，由此对p238d附近的详细结构进行比较。可知，作为fc(p238d)突变导入位置的以eu编号表示的238位的氨基酸残基的位置与fc(wt)不同，与之相伴，铰链区之后的238位的氨基酸残基附近的环结构在fc(p238d)和fc(wt)中也发生变化(图59)。原本在fc(wt)中以eu编号表示的238位的pro位于fc的内侧，与238位附近的残基形成疏水性核心。但以eu编号表示的238位的pro改变为带有电荷的非常亲水性的asp时，改变的asp残基直接存在于疏水性核心中在去溶剂化方面是能量上不利的。因此，认为在fc(p238d)中，为了消除该能量上的不利，以eu编号表示的238位的氨基酸残基会改变为向溶剂侧取向的形式，从而带来238位的氨基酸残基附近的环结构的变化。进而，该环与通过s-s键交联的铰链区在距离上并不远，因而该结构变化并不限于局部变化，还会影响fc ch2结构域a与结构域b的相对配置，结果推测会对fcγriib和fc ch2结构域b之间的原子间相互作用带来改变。因此认为，即使向已具有p238d改变的fc中组合在天然型igg中提高fcγriib选择性、结合
活性的改变，也得不到预测的效果。
[0893]
此外，p238d的导入导致的结构变化的结果是，在fc ch2结构域a中，在与导入突变的p238d邻接的以eu编号表示的237位的gly的主链和fcγriib的160位的tyr之间观察到了氢键(图60)。相当于该tyr160的残基在fcγriia中为phe，在与fcγriia结合时，不会形成该氢键。若同时考虑到160位的氨基酸是在与fc的相互作用界面处的fcγriia与fcγriib之间的少数不同之一，则推测fcγriib所特有的该氢键的有无将导致fc(p238d)对fcγriib的结合活性的提高、对fcγriia的结合活性的降低，并成为选择性提高的原因。此外，对于fc ch2结构域b，在以eu编号表示的270位的asp和fcγriib的131位的arg之间观察到静电相互作用(图61)。作为fcγriia的异型之一的fcγriia h型中，与fcγriib的131位的arg对应的残基是his，该静电相互作用无法形成。由此可以说明，与fcγriia r型相比，fcγriia h型中fc(p238d)结合活性降低的原因。根据上述基于x射线晶体结构分析结果的考察表明，p238d的导入造成的其附近的环结构的改变和与之相伴的结构域配置的相对改变使得形成在天然型igg和fcγr的结合中观察不到的新的相互作用，有可能与p238d改变体的fcγriib选择结合状况(profile)相关。
[0894]
[fc(p238d)的表达纯化]含有p238d改变的fc的制备如下所述进行。首先，将hil6r-igg1-v1(序列编号：80)的以eu编号表示的220位的cys置换为ser，将以eu编号表示的236位的glu至其c末端用pcr进行克隆，将所得基因序列fc(p238d)通过与参考实施例1和2中记载的方法相同的方法来进行表达载体的制作、表达、纯化。应予说明，以eu编号表示的220位的cys在通常的igg1中会与l链的cys形成二硫键，在仅制备fc时不会共表达l链，因而为了避免形成不需要的二硫键，将该cys残基置换为ser。
[0895]
[fcγriib胞外区的表达纯化]fcγriib胞外区按照实施例14的方法来制备。
[0896]
[fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的纯化]向用于在结晶化中使用而获得的fcγriib胞外区样品2mg中，加入作为谷胱甘肽s-转移酶融合蛋白的通过大肠杆菌表达纯化得到的endo f1(protein science 1996,5,2617-2622)0.29mg，在0.1m bis-tris ph6.5的缓冲条件下，在室温静置3天，由此将与fcγriib胞外区的asn直接结合的n-乙酰葡糖胺以外的n型糖链切断。接着，将由5000mwco的超滤膜浓缩的实施了糖链切断处理的fcγriib胞外区样品，通过用20mm heps ph7.5,0.05mnacl进行了平衡的凝胶过滤柱色谱(superdex200 10/300)进行纯化。进而，在所得糖链切断fcγriib胞外区级分中混合以摩尔比计fcγriib胞外区稍微过量的fc(p238d)。将由10000mwco的超滤膜浓缩的前述混合液使用以20mm heps ph7.5、0.05m nacl进行了平衡的凝胶过滤柱色谱(superdex200 10/300)进行纯化，由此得到fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的样品。
[0897]
[fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的结晶化]使用由10000mwco的超滤膜浓缩至约10mg/ml的前述fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的试样，通过坐滴气相扩散法(sitting drop vapor diffusion method)将该复合体结晶化。结晶化使用hydra ii plus one(matrix)，相对于100mm bis-tris ph6.5、17％peg3350、0.2m乙酸铵、和2.7％(w/v)d-半乳糖的贮液，将贮液：结晶化样品以0.2μl：0.2μl
进行混合，制作晶滴。经密封(sealing)的该晶滴在20℃静置，由此得到薄板状的结晶。
[0898]
[由fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体结晶测定x射线衍射数据]将所得的fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的一个单晶浸渍于100mm bis-tris ph6.5、20％peg3350、乙酸铵、2.7％(w/v)d-半乳糖、乙二醇22.5％(v/v)的溶液中。将使用带有微小尼龙环的针除去溶液的单晶在液氮中冷冻。通过高能加速器研究机构的放射光线设施photon factorybl-1a来测定该结晶的x射线衍射数据。应予说明，测定中通过不时置于-178℃的氮气流中来维持冷冻状态，通过光束线上设置的ccd探测器quantum 270(adsc)，将结晶以每次0.8
°
进行旋转的同时，收集总计225幅x射线衍射图像。基于所得衍射图像的晶格常数的确定、衍射斑的索引、以及衍射数据的处理中，使用程序xia2(ccp4 software suite)、xds package(walfgang kabsch)以及scala(ccp4 software suite)，最终得到直至分辨率的该结晶的衍射强度数据。本结晶属于空间群p21，晶格常数，晶格常数α＝90
°
、β＝100.70
°
、γ＝90
°
。
[0899]
[fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的x射线晶体结构分析]fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构确定通过使用程序phaser(ccp4 software suite)的分子置换法来进行。根据所得晶格的大小和fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的分子量，预测非对称单元中的复合体的数目为一个。从fc(wt)/fcγriiia胞外区复合体的晶体结构即pdb代码:3sgj的结构坐标中，将a链239-340位以及b链239-340位的氨基酸残基部分作为不同的坐标(separate coordinate)取出，分别设定为fc ch2结构域的考察用模型。同样地从pdb代码:3sgj的结构坐标中，将a链341-444位和b链341-443位的氨基酸残基部分作为一个坐标取出，设定为fc ch3结构域的考察用模型。最后，从fcγriib胞外区的晶体结构即pdb代码:2fcb的结构坐标中，将a链6-178位的氨基酸残基部分取出，设定为fcγriib胞外区的考察用模型。依照fc ch3结构域、fcγriib胞外区、fc ch2结构域的顺序，由旋转函数和平移函数确定各考察用模型的晶格内的取向和位置，由此得到fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体晶体结构的初始模型。相对于所得的初始模型，进行使2个fc ch2结构域、2个fc ch3结构域以及fcγriib胞外区运动的刚体精密化，此时，相对于 的衍射强度数据，结晶学可信度因子r值为40.4％、自由r值为41.9％。进而，使用程序refmac5(ccp4 software suite)的结构精密化、和参照以基于实验性确定的结构因子fo和由模型计算得到的结构因子fc以及由模型计算得到的位相进行计算得到的2fo-fc、fo-fc为系数的电子密度图的模型修正，通过程序coot(paul emsley)来进行。通过重复上述操作来进行模型的精密化。最后，基于以2fo-fc、fo-fc为系数的电子密度图，将水分子整合至模型，通过进行精密化，最终使用分辨率的24291个衍射强度数据，相对于含有4846个非氢原子的模型，结晶学可信度因子r值为23.7％、自由r值为27.6％。
[0900]
[制作fc(wt)/fcγriib胞外区复合体的模型结构]以fc(wt)/fcγriia胞外区复合体的晶体结构，即pdb代码:3ry6的结构坐标为基础，使用程序disovery studio 3.1(accelrys)的build mutants功能，以与fcγriib的氨基酸序列一致的方式，向结构坐标中的fcγriia导入突变。此时，将优化水平(optimization level)设为高(high)，将切割半径(cut radius)设为4.5，使之产生5个模型，采用其中能量评分最好的模型，设定为fc(wt)/fcγriib胞外区复合体的模型结构。
[0901]
〔参考实施例29〕基于晶体结构来确定改变位置的fc改变体的fcγr结合的分析基于参考实施例28中所得的fc(p238d)和fcγriib胞外区的复合体的x射线晶体结构分析结果，向以eu编号表示的238位的pro被置换为asp的改变fc中被预测会影响与fcγriib的相互作用的位点(以eu编号表示的233位、240位、241位、263位、265位、266位、267位、268位、271位、273位、295位、296位、298位、300位、323位、325位、326位、327位、328位、330位、332位、334位的残基)综合性地导入改变来构建改变体，由此研究是否可以得到除了p238d改变之外进一步增强fcγriib结合的改变的组合。
[0902]
相对于实施例14中制作的il6r-g1d(序列编号：79)，将以eu编号表示的439位的lys置换为glu，制得il6r-b3(序列编号：187)。接着，制作il6r-b3的以eu编号表示的238位的pro被置换为asp的il6r-bf648。作为抗体l链，共同使用il6r-l(序列编号：83)。依照与参考实施例2同样的方法，将表达的这些抗体的改变体纯化。通过实施例14的方法，综合性地评价这些抗体改变体对各fcγr(fcγria、fcγriia h型、fcγriia r型、fcγriib、fcγriiia v型)的结合。
[0903]
按照以下的方法，制作示出与各fcγr的相互作用分析结果的图。将各改变体对各fcγr的结合量的值除以作为对照的突变导入前的抗体(以eu编号表示的238位的pro置换为asp的突变即il6r-bf648/il6r-l)对各fcγr的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各改变体对各fcγr的相对结合活性的值来表示。横轴表示各改变体对fcγriib的相对结合活性的值、纵轴表示各改变体对fcγriia r型的相对结合活性的值(图62)。
[0904]
结果如图62所示，发现在全部改变中有24种改变体与导入改变前的抗体相比维持或增强了fcγriib结合。这些改变体对各fcγr的结合示于表49。应予说明，表中的改变表示对il6r-b3(序列编号：187)导入的改变。其中，对于作为制作il6r-b3时的模板的il6r-g1d/il6r-l，以*来表示。
[0905]
[表49]
[0906]
表49示出的改变体对fcγria,fcγriiar,fcγriiah,fcγriib,fcγriiia v型的kd值通过实施例14的方法测定，结果总结于表50。表中的改变表示对il6r-b3(序列编号：187)导入的改变。其中，对于作为制作il6r-b3时的模板的il6r-g1d/il6r-l，以*来表示。此外，表中的kd(iiar)/kd(iib)和kd(iiah)/kd(iib)分别表示各改变体对fcγriiar的kd值
除以各改变体对fcγriib的kd值而得的值、各改变体对fcγriiah的kd值除以各改变体对fcγriib的kd值而得的值。亲本多肽的kd(iib)/改变多肽的kd(iib)是指亲本多肽对fcγriib的kd值除以各改变体对fcγriib的kd值而得的值。除此之外，各改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强一方的kd值/亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强一方的kd值示于表50。这里，亲本多肽是指具有il6r-b3(序列编号：187)作为h链的改变体。应予说明，由于判断fcγr对igg的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表50中用灰色涂覆的单元是利用实施例14中记载的式子算出的值。
[0907]
〔式5〕kd＝c
×
rmax/(req-ri)-c。
[0908]
根据表50，任意的改变体与il6r-b3相比，fcγriib亲和性均提高，该提高的幅度为2.1倍至9.7倍。各改变体对fcγriiar的kd值/各改变体对fcγriib的kd值之比、和各改变体对fcγriiah的kd值/各改变体对fcγriib的kd值之比表示相对于fcγriiar和fcγriiah结合活性的相对fcγriib结合活性。即，该值是表示各改变体对fcγriib的结合选择性的大小的值，该值越大则对fcγriib的结合选择性越高。亲本多肽il6r-b3/il6r-l对fcγriiar的kd值/对fcγriib的kd值之比、和对fcγriiah的kd值/对fcγriib的kd值之比分别为0.3、0.2，因而表50中任一改变体与亲本多肽相比，对fcγriib的结合选择性均提高。改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的kd值/亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的kd值若为1以上，则表示该改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合等同于或低于亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合。本次所得的改变体中，该值为4.6至34.0，因而可以说本次所得的改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合与亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合相比是降低的。由上述结果可知，对本次所得的改变体来说，与亲本多肽相比，维持或降低了对fcγriia r型和h型的结合活性，同时增强了对fcγriib的结合活性，提高了对fcγriib的选择性。此外，与il6r-b3相比，任意改变体对fcγria和fcγriiiav的亲和性均降低。
[0909]
[表50]
[0910]
对于所得组合改变体之中有希望的改变体，由晶体结构考察引起其效果的因素。
图63示出了fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的晶体结构。其中，将位于左侧的h链作为fc链a、将位于右侧的h链作为fc链b。这里，可知fc链a中的以eu编号表示的233位的位点位于fcγriib的113位lys的附近。但是在本晶体结构中，e233的侧链处于运动性极高的状态，其电子密度无法良好地观察。因此，将以eu编号表示的233位的glu置换为asp的改变由于将侧链缩短1个碳程度而使侧链的自由度变小，作为其结果，与fcγriib的113位的lys的相互作用形成时的熵损失降低，结果推测有助于结合自由能的提高。
[0911]
图64相同地示出了fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体的结构中以eu编号表示的330位的位点附近的环境。由该图可知，fc(p238d)的fc链a的以eu编号表示的330位的位点附近是由fcγriib的85位的ser、86位的glu、163位的lys等构成的亲水性环境。因此，将以eu编号表示的330位的ala置换为lys或置换为arg的改变推测有助于与fcγriib的85位的ser或86位的glu的相互作用强化。
[0912]
图65中示出了使fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体和fc(wt)/fcγriiia胞外区复合体的晶体结构，相对于fc chain b而通过基于cα原子间距离的最小二乘法进行重合，示出了以eu编号表示的271位pro的结构。上述两结构虽然极为一致，但在以eu编号表示的271位的pro的位点却是不同的立体结构。此外，在fc(p238d)/fcγriib胞外区复合体晶体结构中，结合考虑其周边的电子密度弱时，则在fc(p238d)/fcγriib中，以eu编号表示的271位为pro使得对结构上造成大负荷，由此暗示该环结构可能得不到最佳结构。因此推测，将以eu编号表示的271位的pro置换为gly的改变通过对该环结构赋予柔软性、并减轻获得最适于与fcγriib相互作用的结构时的能量阻碍，由此有助于结合增强。
[0913]
〔实施例30〕通过与p238d组合而增强fcγriib结合的改变的组合效果的验证在参考实施例27和29中所得的改变中，验证了观察到增强fcγriib结合的效果或维持fcγriib结合、抑制其它fcγr结合的效果的改变彼此组合所引起的效果。
[0914]
与参考实施例29的方法相同地，将选自表46和49中的特别优异的改变导入抗体h链il6r-bf648。作为抗体l链，共同使用il6r-l，按照与参考实施例2同样的方法将表达的抗体纯化。通过与实施例14同样的方法，综合性地评价对各fcγr(fcγria、fcγriia h型、fcγriia r型、fcγriib、fcγriiia v型)的结合。
[0915]
按照以下方法，对于与各fcγr的相互作用分析结果，计算相对结合活性。将各改变体对各fcγr的结合量的值除以作为对照的突变导入前的抗体(以eu编号表示的238位的pro置换为asp的il6r-bf648/il6r-l)对各fcγr的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各改变体对各fcγr的相对结合活性的值来表示(表51)。
[0916]
应予说明，表中的改变表示对il6r-b3(序列编号：187)导入的改变。其中，对于作为制作il6r-b3时的模板的il6r-g1d/il6r-l，以*来表示。
[0917]
[表51]
[0918]
表51示出的改变体对fcγria,fcγriiar,fcγriiah,fcγriib,fcγriiia v型
的kd值通过实施例14的方法测定，结果总结于表52-1和52-2。表中的改变表示对il6r-b3(序列编号：187)导入的改变。其中，对于作为制作il6r-b3时的模板的il6r-g1d/il6r-l，以*来表示。此外，表中的kd(iiar)/kd(iib)和kd(iiah)/kd(iib)分别表示各改变体对fcγriiar的kd值除以各改变体对fcγriib的kd值而得的值、各改变体对fcγriiah的kd值除以各改变体对fcγriib的kd值而得的值。亲本多肽的kd(iib)/改变多肽的kd(iib)是指亲本多肽对fcγriib的kd值除以各改变体对fcγriib的kd值而得的值。除此之外，各改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强一方的kd值/亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强一方的kd值示于表52-1和52-2。这里，亲本多肽是指具有il6r-b3(序列编号：187)作为h链的改变体。应予说明，由于判断fcγr对igg的结合微弱，不可能在动力学分析中进行正确分析，因而表52-1和52-2中用灰色涂覆的单元是利用实施例14中记载的式子算出的值。
[0919]
〔式5〕kd＝c
×
rmax/(req-ri)-c。
[0920]
根据表52-1和52-2，任意的改变体与il6r-b3相比，fcγriib亲和性均提高，该提高的幅度为3.0倍至99.0倍。各改变体对fcγriiar的kd值/各改变体对fcγriib的kd值之比、和各改变体对fcγriiah的kd值/各改变体对fcγriib的kd值之比表示相对于fcγriiar和fcγriiah结合活性的相对fcγriib结合活性。即，该值是表示各改变体对fcγriib的结合选择性的大小的值，该值越大则对fcγriib的结合选择性越高。亲本多肽il6r-b3/il6r-l对fcγriiar的kd值/对fcγriib的kd值之比、和对fcγriiah的kd值/对fcγriib的kd值之比分别为0.3、0.2，因而表52-1和52-2中任一改变体与亲本多肽相比，对fcγriib的结合选择性均提高。改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的kd值/亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的kd值若为1以上，则表示该改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合等同于或低于亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合。本次所得的改变体中，该值为0.7至29.9，因而可以说本次所得的改变体对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合与亲本多肽对fcγriiar和fcγriiah的结合活性中较强的一方的结合相比，是等同的或较其降低。由上述结果可知，对本次所得的改变体来说，与亲本多肽相比，维持或降低了对fcγriia r型和h型的结合活性，同时增强了对fcγriib的结合活性，提高了对fcγriib的选择性。此外，与il6r-b3相比，任意改变体对fcγria和fcγriiiav的亲和性均降低。
[0921]
[表52-1]
表52-2是表52-1的续表。
[0922]
[表52-2]
产业实用性
根据本发明，提供改善抗原结合分子的药代动力学的方法、或降低抗原结合分子的免疫原性的方法。根据本发明，与通常的抗体相比，可以在不引起机体中不良状况的情形下利用抗体进行治疗。
再多了解一些
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