高通量单细胞文库及其制备和使用方法与流程

技术特征：
1.一种用于鉴定包含生物学特征的细胞亚群的方法，所述方法包括：(a)提供单细胞测序文库，其中所述测序文库包含多个经修饰的靶核酸，其中所述经修饰的靶核酸包含至少一个索引序列；(b)通过靶向测序询问所述测序文库，以鉴定作为生物学特征存在于相同的经修饰的靶核酸上的所述索引序列，其中与所述生物学特征相关联的所述索引序列为标记索引序列；(c)改变所述测序文库以获得子文库，其中所述子文库包含与存在于所述测序文库中的不包含标记索引序列的其他经修饰的靶核酸相比，包含所述标记索引序列的所述经修饰的靶核酸的增加的表示；(d)确定包含标记索引序列的所述经修饰的靶核酸的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述单细胞测序文库包含来自多个样品的核酸。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述多个样品包括(i)从不同生物体获得的相同组织的样品、(ii)来自一种生物体的不同组织的样品或(iii)来自不同生物体的不同组织的样品。4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中鉴定多于一种标记索引序列。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述单细胞组合测序文库包含代表所述细胞或细胞核的全基因组或所述基因组的子集的靶核酸。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述基因组的所述子集包含靶核酸，所述靶核酸代表所述细胞或细胞核的转录组、可及性染色质、dna、构象状态或蛋白质。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述改变包括富集包含所述标记索引序列的所述经修饰的靶核酸。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述富集包括基于杂交的方法。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述基于杂交的方法包括杂交捕获、扩增或crispr(d)cas9。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述改变包括耗尽不包含所述标记索引序列的所述经修饰的靶核酸。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述耗尽包括基于杂交的方法。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述基于杂交的方法包括杂交捕获、扩增或crispr(d)cas9。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物学特征包括指示物种类型的核苷酸序列。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述物种类型包括所述细胞的物种。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物学特征包括16s亚基、18s亚基或its非转录区的核苷酸。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物学特征包括指示细胞类别的核苷酸序列。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞类别包括表达模式、表观遗传模式、免疫基因重组或它们的组合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述表观遗传模式包括甲基化标记、甲基化模式、可及性dna或它们的组合。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物学特征包括指示疾病状态或风险的核苷酸序列。20.根据权利要求19所述的方法，其中疾病状态或风险包括与疾病相关的变体dna序列、变体表达模式或变体表观遗传模式。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述变体dna序列包含至少一个单核苷酸多态性。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述变体表达模式包括生物标记的表达。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述变体表观遗传模式包括甲基化标记、甲基化模式。24.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的靶核酸包含至少2个隔室特异性索引序列的连续索引，其中在所述2个索引序列之间存在不大于6个核苷酸。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述连续索引存在于所述经修饰的靶核酸的每一端处。26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述连续索引的长度为至少55个核苷酸。27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述连续索引的一个拷贝存在于所述经修饰的靶核酸上。28.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述连续索引的两个拷贝存在于所述经修饰的靶核酸上。29.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序文库的所述多个经修饰的靶核酸代表至少100,000个不同的细胞或细胞核。30.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供所述单细胞组合测序文库包括：处理样品以产生文库，其中所述样品是从生物体获得的宏基因组学样品。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物体是哺乳动物。32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述宏基因组学样品包括怀疑包含共生或病原微生物的组织。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述微生物是原核的或真核的。34.根据权利要求30、31或33中任一项所述的方法，其中所述宏基因组学样品包括微生物组样品。35.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供所述单细胞组合测序文库包括：处理样品以产生文库，其中所述样品来自生物体。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述生物体是哺乳动物。37.根据权利要求35所述的方法，其中来自所述样品的核酸的主要来源包括rna。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述rna包括mrna。39.根据权利要求35所述的方法，其中来自所述样品的核酸的主要来源包括dna。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述dna包括全细胞基因组dna。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述全细胞基因组dna包含核小体。42.根据权利要求35所述的方法，其中来自所述样品的核酸的主要来源包括无细胞
dna。43.根据权利要求35所述的方法，其中所述样品包括癌细胞。44.根据权利要求1所述的方法，其中所述提供所述单细胞组合测序文库包括用单细胞组合索引方法产生所述文库，所述单细胞组合索引方法选自单细胞核转录组测序、单细胞转录组测序、单细胞转录组和转座子可及性染色质测序、单细胞核的全基因组测序、单细胞核的转座子可及性染色质测序、单细胞表位测序、sci-hic和sci-met。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述提供包括从每个细胞或细胞核提供两个不同的单细胞组合测序文库。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述两个不同的单细胞组合测序文库选自单细胞组合索引方法，所述单细胞组合索引方法选自单细胞核转录组测序、单细胞转录组测序、单细胞转录组和转座子可及性染色质测序、单细胞核的全基因组测序、单细胞核的转座子可及性染色质测序、sci-hic和sci-met。47.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括执行测序程序以确定所述核酸的所述核苷酸序列。48.一种用于制备测序文库的方法，所述测序文库包含来自多个单细胞核或细胞的核酸，所述方法包括：(a)提供多个细胞核或细胞，其中所述细胞核或细胞包含核小体；(b)使所述多个细胞核或细胞与包含转座酶和通用序列的转座体复合物接触，其中所述接触还包括适于将所述通用序列掺入到dna核酸中从而产生包含所述通用序列的双链dna核酸的条件；(d)将所述多个细胞核或细胞分配到第一多个隔室中，其中每个隔室包含所述细胞核或细胞的子集；(e)处理所述细胞核或细胞的每个子集中的dna分子以生成带索引细胞核或细胞，其中所述处理包括向存在于所述细胞核或细胞的每个子集中的dna核酸添加第一隔室特异性索引序列，以产生存在于所述带索引细胞核或细胞中的带索引核酸，其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或它们的组合；以及(g)组合所述带索引细胞核或细胞以生成合并的带索引细胞核或细胞。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述提供包括在多个隔室中提供所述多个细胞核或细胞，其中每个隔室包含所述细胞核或细胞的子集，其中所述接触包括使每个隔室与所述转座体复合物接触，并且其中所述方法还包括在所述接触之后将所述细胞核或细胞组合以生成合并的细胞核或细胞。50.根据权利要求48所述的方法，其中所述提供包括使所述细胞核经受化学处理以生成耗尽核小体的细胞核，同时保持所述分离的细胞核的完整性。51.根据权利要求48所述的方法，所述方法还包括：将包括所述带索引细胞核或细胞的所述合并的带索引细胞核或细胞分配到第二多个隔室中，其中每个隔室包含所述细胞核或细胞的子集；处理所述细胞核或细胞的每个子集中的dna分子以生成带双索引细胞核或细胞，其中所述处理包括向存在于所述细胞核或细胞的每个子集中的dna核酸添加第二隔室
特异性索引序列，以产生存在于所述带索引细胞核或细胞中的带双索引核酸，其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或它们的组合；组合所述带双索引细胞核或细胞以生成合并的带双索引细胞核或细胞。52.根据权利要求51所述的方法，所述方法还包括：将包括所述带双索引细胞核或细胞的所述合并的细胞核或细胞分配到第三多个隔室中，其中每个隔室包含所述细胞核或细胞的子集；处理所述细胞核或细胞的每个子集中的dna分子以生成带三索引细胞核或细胞，其中所述处理包括向存在于所述细胞核或细胞的每个子集中的dna核酸添加第三隔室特异性索引序列，以产生存在于所述带索引细胞核或细胞中的带三索引核酸，其中所述处理包括连接、引物延伸、杂交、扩增或它们的组合；组合所述带三索引细胞核或细胞以生成合并的带三索引细胞核或细胞。53.根据权利要求48、51或52中任一项所述的方法，其中所述分配步骤包括稀释。54.根据权利要求48、51或52中任一项所述的方法，其中所述隔室包括孔、微流体隔室或小滴。55.根据权利要求48所述的方法，其中所述第一多个隔室中的隔室包含50至100,000,000个细胞核或细胞。56.根据权利要求51所述的方法，其中所述第二多个隔室中的隔室包含50至100,000,000个细胞核或细胞。57.根据权利要求52所述的方法，其中所述第三多个隔室中的隔室包含50至100,000,000个细胞核或细胞。58.根据权利要求48所述的方法，其中所述接触包括使每个子集与两个转座体复合物接触，其中一个转座体复合物包含含有第一通用序列的第一转座酶，并且第二转座体复合物包含含有第二通用序列的第二转座酶，其中所述接触还包括适于将所述第一通用序列和所述第二通用序列掺入到dna核酸中从而产生包含所述第一通用序列和所述第二通用序列的双链dna核酸的条件。59.根据权利要求48、49或50中任一项所述的方法，其中所述隔室特异性索引序列的所述添加包括如下的两步过程：将包含通用序列的核苷酸序列添加到所述核酸，然后将所述隔室特异性索引序列添加到所述核酸。60.根据权利要求48所述的方法，所述方法还包括从所述合并的带索引细胞核或细胞获得所述带索引核酸，从而由所述多个细胞核或细胞产生测序文库。61.根据权利要求49所述的方法，所述方法还包括从所述合并的带双索引细胞核或细胞获得所述带双索引核酸，从而由所述多个细胞核或细胞产生测序文库。62.根据权利要求50所述的方法，所述方法还包括从所述合并的带三索引细胞核或细胞获得所述带三索引核酸，从而由所述多个细胞核或细胞产生测序文库。63.根据权利要求60至62中任一项所述的方法，所述方法还包括：提供包含多个扩增位点的表面，其中所述扩增位点包括至少两个具有游离3'端的附接的单链捕获寡核苷酸的群体，以及
在适于产生多个扩增位点的条件下使包含所述扩增位点的所述表面与包含一个、两个或三个索引序列的所述核酸片段接触，所述多个扩增位点各自包括来自包含多个索引的单个片段的扩增子的克隆群体。64.一种制备核酸文库的方法，所述方法包括：(a)提供多个样品，其中每个样品包含多个细胞或细胞核，其中每个样品的所述多个细胞或细胞核存在于一个或多个单独的隔室中；(b)使所述多个细胞核或细胞与包含转座酶和通用序列的转座体复合物接触，前提条件是所述转座体复合物不包含索引序列，其中所述接触还包括适于将所述通用序列掺入到核酸中的条件；(c)将第一索引序列添加到每个单独隔室的所述核酸；(d)组合所述单独隔室的所述细胞或细胞核；(e)将所述细胞或细胞核分配到多个隔室中；以及(f)将第二索引序列添加到所述多个隔室的所述核酸。65.根据权利要求64所述的方法，其中通过连接、引物延伸、杂交、扩增或它们的组合来添加所述第一索引序列、所述第二索引序列或它们的组合。66.根据权利要求64或65所述的方法，其中重复步骤(d)至€以将第三或更多个索引序列添加到所述多个隔室的所述细胞或细胞核。67.根据权利要求64或65中任一项所述的方法，其中所述多个细胞核或细胞是固定的。68.根据权利要求64或65中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(c)或步骤(f)之后带索引核酸的扩增。69.根据权利要求64或65中任一项所述的方法，所述方法还包括步骤(g)：组合所述多个隔室的所述核酸并确定所述核酸的序列。70.根据权利要求64所述的方法，所述方法还包括执行测序程序以确定所述核酸的核苷酸序列。71.一种对单个细胞或细胞核进行测序的方法，所述方法包括：(a)对样品中的每个细胞或细胞核的核酸加唯一索引，从而针对每个细胞或细胞核生成索引文库；(b)使用生物学特征来鉴定来自步骤(a)的一个或多个所关注的带索引文库；(c)富集步骤(b)的所述所关注的带索引文库，从而生成富集文库；以及(d)对来自步骤(c)的所述富集文库进行测序。72.根据权利要求71所述的方法，其中所述文库来源于所述细胞或细胞核的dna、rna或蛋白质。73.根据权利要求71或72中任一项所述的方法，其中所述生物学特征为dna、rna或蛋白质或它们的组合。74.根据权利要求71或72中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述加唯一索引包括将至少两种不同的索引关联到所述细胞或细胞核的所述核酸。75.根据权利要求74所述的方法，其中所述至少两种不同的索引为连续索引。76.根据权利要求71或72中任一项所述的方法，其中所述富集文库通过正向富集生成。77.根据权利要求76所述的方法，其中所述正向富集包括扩增。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述正向富集包含捕获剂。79.根据权利要求76所述的方法，其中所述正向富集包含固体载体。80.根据权利要求76所述的方法，其中所述富集文库通过负向富集生成。81.根据权利要求71或72中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述鉴定所述所关注的带索引文库包括对所述索引进行测序。82.一种对单个细胞或细胞核进行测序的方法，所述方法包括：(a)提供样品，其中所述样品包含多个细胞核或细胞；(b)将第一索引关联到所述样品中每个细胞核或细胞上；(c)将所述样品分成多个隔室；(d)将第二索引关联到所述多个隔室的每个细胞核或细胞上；(e)合并所述多个隔室；(f)对所合并的隔室进行测序；(g)鉴定与生物学特征相关联的第一索引和第二索引的组合；(h)使用来自步骤(g)的所鉴定的第一索引和第二索引的组合富集来自所合并的隔室的所述生物学特征。83.一种试剂盒，所述试剂盒包含：(a)多个转座体复合物，其中每个转座体复合物包含转座酶和转座子序列，其中所述转座子序列未加索引；(b)第一多个索引寡核苷酸，其中所述第一多个索引寡核苷酸包括具有至少两个不同序列的寡核苷酸；以及(c)用于与所述索引寡核苷酸配套使用的连接酶。84.根据权利要求83所述的试剂盒，所述试剂盒还包含第二多个索引寡核苷酸，其中所述第二多个索引寡核苷酸包括具有与所述第一多个索引寡核苷酸不同的序列的寡核苷酸。85.根据权利要求83所述的试剂盒，所述试剂盒还包含第三多个索引寡核苷酸，其中所述第三多个索引寡核苷酸包括具有与所述第一多个索引寡核苷酸和所述第二多个索引寡核苷酸不同的序列的寡核苷酸。

技术总结
本文提供了用于制备包括来自多个单细胞的核酸的测序文库的方法。在一个实施方案中，该测序文库包含代表来自该多个单细胞的染色质可及性的核酸。在一个实施方案中，该核酸包含三个索引序列。在另一个实施方案中，本公开提供了用于表征分离的细胞和细胞核中罕见事件的方法。件的方法。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：华盛顿州大学
技术研发日：2020.12.18
技术公布日：2022/2/6