一种均一性酸性多糖及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种均一性酸性多糖及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来心脑血管疾病因其高患病率、高致残率和高死亡率的特点在全球医药领域备受关注。动脉粥样硬化(as)正是引起冠状动脉疾病、颈动脉疾病和外周动脉疾病等心血管疾病的主要原因，动脉粥样硬化过程复杂，其具体表现为动脉粥样斑块的脂肪沉积物出现在动脉内层，动脉粥样硬化的潜在发病机制主要包括脂质代谢失衡和免疫反应两部分。高血脂是动脉粥样硬化的主要发病因素，血液中过高含量的胆固醇(tc)、甘油三脂(tg)以及血管壁上过多的脂类易被自由基氧化，形成脂质过氧化物质，这种物质长期在血管壁上沉积后会导致动脉粥样硬化等各种疾病。此外，有研究表明血脂含量高低与脂肪肝的发病率呈正相关，随着生活水平提高，脂肪肝发病率逐年升高，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病，肝外组织的胆固醇(tc)通过高密度脂蛋白(hdl)受体途径到肝内代谢，甘油三脂(tg)组成极低密度脂蛋白(vldl)进入血液，血脂含量过高使肝细胞内脂肪累积，变性，导致肝合成的hdl，vldl减少，进而阻碍脂质以脂蛋白的形态运送出肝，脂质在肝细胞内堆积会引起肝脂肪变性、肿大形成脂肪肝。目前临床上治疗高血脂和动脉粥样硬化的药物主要为西药他汀类，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等，治疗非酒精性脂肪肝时，他汀类药物可作为调脂药物进行治疗脂肪肝，这类药物虽然疗效好，起效快，但容易对肝脏和肾脏造成损伤，并引起肌肉疼痛等其他症状。而中药/天然药物一般具有副作用小、疗效持久、减缓并发症、增强体质等优点，可作为治疗动脉粥样硬化、高血脂、脂肪肝的药物进行进一步研发。
3.研究发现，中药/天然药物的多糖对动脉粥样硬化的治疗、降血脂、治疗酒精性或非酒精性脂肪肝均有较理想的效果。在多糖降血脂、治疗动脉粥样硬化方面，yu等以烟酸肌醇酯为阳性对照，发现孔石莼多糖可以降低血脂，具有预防缺血性心脑血管疾病的潜力[yu,p,zhang,q,li,n,et.al.polysaccharides from ulva pertusa(chlorophyta)and preliminary studies on their antihyperlipidemia activity.journal of applied phycology.2003.15(1):21-27.]。黄荣等将实验小鼠分为正常对照组，阳性给药组，模型组和低中高剂量海带多糖给药组，结果发现海带多糖能降低血脂，并且海带多糖给药组的小鼠体内主动脉内皮脂质沉积显著减少，说明海带多糖同时具有降血脂与预防大鼠动脉粥样硬化的效能[黄荣，王玉琴.2008.海带多糖对实验性大鼠动脉粥样硬化的预防作用。南通大学学报(医学版)28(5):351-353]中，报道在多糖降血脂、治疗脂肪肝方面，黑木耳多糖具有降血脂及防治脂肪肝的功效。于美汇等人经过研究证明黑木耳多糖对高脂血症小鼠具有降血脂作用[于美汇,赵鑫,尹红力等.黑木耳酸性多糖对高血脂症小鼠的降血脂作用.食品科学,2016,37(15):232-236.]。古赛等人研究发现枸杞多糖对大鼠酒精性脂肪肝具有治疗和预防作用，用乙醇灌胃的方法构建大鼠酒精性脂肪肝模型，以戒酒组作为阳性对照，设置枸杞多糖给药组，进行各项血液生化指标的监测，发现枸杞多糖能够明显改善和预防酒精所
致大鼠肝脏脂肪病变[古赛,姜蓉.枸杞多糖防治大鼠酒精性脂肪肝的作用及机制研究[j].中国药房,2007(21):1606-1610.]。这说明天然多糖在动脉粥样硬化、高血脂、脂肪肝的防治中有着较大的应用前景，由以上各类研究可知，多糖对于动脉粥样硬化、降血脂和脂肪肝的治疗具有一定作用，但是不同结构的多糖成分之间性质差异十分明显、活性差异很大。
[0004]
山茱萸作为一种临床常用中药，具有多种活性，可用于治疗眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、内热消渴等，目前，研究表明山茱萸的主要药理作用包括：抗肿瘤、降血糖、保护心肌、保护肝脏等作用。多糖是山茱萸的成分之一，山茱萸多糖近年来的应用也越来越多，但是传统的粗提方法并不能得到高活性的多糖成分，同时，山茱萸多糖类成分的结构也尚不明确，在山茱萸活性均一性多糖分离与结构方面研究报道较少的情况下，本发明的研究成果显得尤为重要。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种均一性酸性多糖及其制备方法和应用，以解决现有山茱萸多糖活性差、且成分不明确的问题。
[0006]
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种均一性酸性多糖，重均分子量为36～42kda，包括以下单糖组分：半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖和甘露糖；其中，半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖和甘露糖的摩尔比为41.33～47.01：17.64～20.44：6.71～10.72：3.79～7.26：3.13～6.10：1.00。
[0007]
本发明的有益效果为：本发明的均一性酸性多糖具有均一性、明确的单糖组成，将其用于预防和治疗动脉粥样硬化、高血脂、脂肪肝及其相关疾病的效果十分显著。
[0008]
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
[0009]
进一步，均一性酸性多糖的糖残基类型为：1,4-吡喃型半乳糖醛酸、端基-呋喃型阿拉伯糖、1,3-呋喃型阿拉伯糖、2,3-呋喃型阿拉伯糖、端基-吡喃型半乳糖、1,3-吡喃型半乳糖、1,6-吡喃型半乳糖、1,2-吡喃型鼠李糖、1,6-吡喃型葡萄糖和吡喃型甘露糖。
[0010]
进一步，1,4-吡喃型半乳糖醛酸：端基-呋喃型阿拉伯糖：1,3-呋喃型阿拉伯糖：2,3-呋喃型阿拉伯糖：端基-吡喃型半乳糖：1,3-吡喃型半乳糖：1,6-吡喃型半乳糖：1,2-吡喃型鼠李糖：1,6-吡喃型葡萄糖：吡喃型甘露糖的摩尔比为：
[0011]
40.23～47.05：5.17～8.02：9.83～11.58：1.43～2.68：1.87～5.61：1.25～5.32：1.79～2.68：3.69～7.16：2.95～6.03：1.00。
[0012]
进一步，均一性酸性多糖的总糖醛酸含量为56～64％。
[0013]
采用上述进一步技术方案的有益效果为：本发明的均一性酸性多糖具有特殊的结构，独有的单糖组成，这种结构的多糖具有特有的活性，且此种均一性酸性多糖相较于山茱萸总多糖、山茱萸中性糖和其他植物多糖在治疗动脉粥样硬化、高血脂、脂肪肝等相关疾病时效果更优。
[0014]
本发明还提供上述均一性酸性多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0015]
(1)脱脂：将山茱萸药材粉碎，加入有机溶剂进行脱脂处理，于60～90℃回流提取2～3h，提取2～3次后，然后干燥，得山茱萸药渣；其中，山茱萸药材和有机溶剂的质量体积比为1：3～8g/ml；
[0016]
(2)碱提取：向山茱萸药渣中加入碱性溶液，于90～100℃回流提取2～3h，过滤，提
取2～3次后，合并滤液，将其减压浓缩为原体积的1/25～1/4，冷却至室温，得提取浓缩液；其中，山茱萸药渣和碱性溶液的质量体积比为1：2～10g/ml，碱性溶液浓度为0.1～0.2mol/l；
[0017]
(3)沉淀析出：在提取浓缩液中加入沉淀溶剂，于0～30℃静置6～48h，析出沉淀后离心，得沉淀；其中，提取浓缩液和沉淀溶剂的体积比为1：2～5；
[0018]
(4)除蛋白：将沉淀用水溶解，将所得水溶液用反复冻融法和sevag法除去沉淀中的蛋白，离心后，保留水相并减压浓缩为原体积的1/10-1/4，得浓缩液一；其中，沉淀和水的体积比为1：2～10；
[0019]
(5)除色素：将浓缩液一用过氧化氢水溶液、活性炭或大孔树脂除色素，然后于60～70℃条件下，减压浓缩为原体积的1/8～1/2，得浓缩液二；
[0020]
(6)分级：将浓缩液二离心，取上清液，上deae-sephadex a-25柱，先用0.2～0.5mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去该部分洗脱液，再用0.7～1.0mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，然后收集此部分洗脱液，减压浓缩为原体积的1/10～1/60，得洗脱浓缩液；
[0021]
(7)纯化：将洗脱浓缩液离心后，取上清液，上sephadex g-100凝胶柱，用水洗脱后收集分子量为36～42kda的洗脱液，浓缩干燥，即制得均一性酸性多糖。
[0022]
进一步，步骤(1)中有机溶剂为70～100vt％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醚或氯仿。
[0023]
进一步，步骤(1)中干燥温度为30～80℃。
[0024]
进一步，步骤(2)中碱性溶液为naoh或koh溶液。
[0025]
进一步，步骤(3)中沉淀溶剂为乙醇或丙酮。
[0026]
进一步，步骤(4)中采用反复冻融法具体为：将浓缩液一置于-10～-25℃条件下冷冻5～12h，再于室温下融化，重复上述操作3～10次。
[0027]
进一步，步骤(4)中sevag法所用的sevag试剂与水溶液体积比为1：4～6，采用sevag法除去沉淀中的蛋白的次数为2～5次。
[0028]
进一步，步骤(5)中用过氧化氢水溶液除色素是向浓缩液一加入过氧化氢水溶液，于60～90℃回流1～2h；其中，过氧化氢水溶液浓度为28～32vt％，浓缩液一与过氧化氢水溶液的体积比为1：1～3。
[0029]
进一步，步骤(5)中用活性炭除色素之前，将活性炭置于100～105℃烘箱中活化2～5h后，冷却，再进行除色素。
[0030]
进一步，步骤(5)中用大孔树脂除色素是向浓缩液一加入大孔树脂，于20℃～35℃吸附12～24h后，过滤，取水溶液。
[0031]
进一步，步骤(6)中减压浓缩的温度为50～65℃。
[0032]
本发明还提供均一性酸性多糖在制备预防和治疗高脂血症、动脉粥样硬化或脂肪肝的药物及保健品方面的应用。
[0033]
本发明还提供一种药物或保健品，包括上述均一性酸性多糖。
[0034]
本发明具有以下有益效果：本发明制备均一性酸性多糖的工艺步骤清晰而准确，前期提取分离出多种山茱萸中性和酸性均一性多糖，然后通过离子交换柱，采用不同的洗脱液分离出酸性均一性多糖，即用0.2～0.5mol/l的nacl溶液洗脱可除去中性糖组分，进而
通过0.7～1.0mol/l的nacl溶液洗脱留下酸性糖组分，经进一步纯化后，收集分子量为36～42kda的部分，即制得均一性酸性多糖。本发明得到了一种高活性的均一性酸性多糖，同时也优化了这种多糖的提取分离工艺，本发明从山茱萸药材中提取得到的是均一的、单糖组成明确、活性(抗动脉粥样硬化、高血脂、脂肪肝)最高均一性酸性多糖，其在预防和治疗动脉粥样硬化、高血脂、脂肪肝及其相关疾病的效果十分显著。
具体实施方式
[0035]
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0036]
实施例1：
[0037]
一种均一性酸性多糖，其制备方法包括以下步骤：
[0038]
称取10kg干燥山茱萸药材，粉碎为粗粉，加入50l无水乙醇，于80℃回流提取3h脱脂，过滤，弃去乙醇提取液，重复提取2次，收集药渣，将乙醇挥发干，于80℃条件下干燥，得山茱萸药渣；再加入60l 0.1mol/l naoh溶液，于90℃回流提取2h，过滤，提取3次后，合并滤液，将其于60℃减压浓缩至10l，冷却至室温，得提取浓缩液；加入30l的无水乙醇，于4℃静置12h后，沉淀析出，离心，收集沉淀；将沉淀用5l水溶解，反复冻融10次，离心，弃去沉淀，再采用sevag法(即v
多糖溶液
：v
氯仿
：v
正丁醇
＝20︰4︰1混合振荡，离心静置分层，取水层)除蛋白3次，离心除去沉淀，保留水溶液，将其减压浓缩至1000ml得浓缩液一；再加入3000ml的30vt％过氧化氢溶液，于80℃回流2h，进行脱色，然后于60℃减压浓缩至1000ml，得浓缩液二；将浓缩液二离心，取上清液，上deae-sephadex a-25(150cm
×
4.5cm，i.d.)柱分离纯化，先用0.3mol/l的nacl溶液洗脱，弃去中性糖组分洗脱液，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现后，再用0.8mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集酸性糖组分洗脱液，于60℃减压浓缩至500ml，得洗脱浓缩液；洗脱浓缩液离心后，取上清液上sephadex g-100(150cm
×
5.5cm，i.d.)凝胶柱，再分离纯化，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集1500ml分子量为36～42kda的洗脱液，减压浓缩至600ml，冷冻干燥后，得到均一性酸性多糖61.82g。
[0039]
实施例2：
[0040]
一种均一性酸性多糖，其制备方法包括以下步骤：
[0041]
称取1kg干燥山茱萸药材，粉碎为粗粉，加入5l 95％的乙醇，于80℃回流提取2h脱脂，过滤，弃去乙醇提取液，重复提取3次，收集药渣，将乙醇挥发干，于60℃条件下干燥，得山茱萸药渣；再加入8l 0.1mol/l naoh溶液，于95℃回流提取3h，过滤，提取3次后，合并滤液，将其于65℃减压浓缩至1200ml，冷却至室温，得提取浓缩液；加入2400ml的95％乙醇，于8℃静置24h后，沉淀析出，离心，收集沉淀；将沉淀用1000ml水溶解，反复冻融10次，离心，弃去沉淀，再采用sevag法(即v
多糖溶液
︰v
氯仿
︰v
正丁醇
＝20︰4︰1混合振荡，离心静置分层，取水层)除蛋白2次，离心除去沉淀，保留水溶液，将其减压浓缩至250ml得浓缩液一；再加入500ml的28vt％过氧化氢溶液，于85℃回流2h，进行脱色，然后于60℃减压浓缩至200ml，得浓缩液二；将浓缩液二离心，取上清液，上deae-sephadex a-25(100cm
×
3.5cm，i.d.)柱分离纯化，先用0.2mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去中性糖组分洗脱液；
再用0.9mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集酸性糖组分洗脱液，于60℃减压浓缩至200ml，得洗脱浓缩液；洗脱浓缩液离心后，取上清液，上sephadex g-100凝胶柱，再分离纯化，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集分子量为36～42kda的洗脱液，减压浓缩至120ml，冷冻干燥后，得到均一性酸性多糖8.76g。
[0042]
实施例3：
[0043]
一种均一性酸性多糖，其制备方法包括以下步骤：
[0044]
称取500g干燥山茱萸药材，粉碎为粗粉，加入1500ml石油醚，于60℃回流提取3h脱脂，过滤，弃去石油醚提取液，重复提取3次，收集药渣，将石油醚挥发干，于40℃条件下干燥，得山茱萸药渣；再加入5l 0.1mol/l naoh溶液，于90℃回流提取2h，过滤，提取3次后，合并滤液，将其于65℃减压浓缩至600ml，冷却至室温，得提取浓缩液；加入1200ml丙酮，于25℃静置12h后，沉淀析出，离心，收集沉淀；将沉淀用600ml水溶解，反复冻融7次，离心，弃去沉淀，采用sevag法(即v
多糖溶液
：v
氯仿
：v
正丁醇
＝20︰4︰1混合振荡，离心静置分层，取水层)除蛋白5次，离心除去沉淀，保留水溶液，将水溶液减压浓缩至150ml得浓缩液一；再加入300ml的30vt％过氧化氢溶液，于60℃回流2h，进行脱色，然后于65℃减压浓缩至100ml，得浓缩液二；将浓缩液二离心10min，取上清液，上deae-sephadex a-25(80cm
×
3.5cm，i.d.)柱分离纯化，先用0.4mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去中性糖组分洗脱液；再用0.7mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集酸性糖组分洗脱液，于60℃减压浓缩至100ml，得洗脱浓缩液；洗脱浓缩液离心后，取上清液，上sephadex g-100(100cm
×
4cm，i.d.)凝胶柱，再分离纯化，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集中间分子量为36～42kda的洗脱液，减压浓缩至50ml，喷雾干燥后，得到均一性酸性多糖2.36g。
[0045]
实施例4：
[0046]
一种均一性酸性多糖，其制备方法包括以下步骤：
[0047]
称取1kg干燥山茱萸药材，粉碎为粗粉，用3l乙醇润湿，再用3l乙醇进行渗漉3h，将乙醇挥发干，收集药渣，于40℃条件下干燥，得山茱萸药渣；再加入6l 0.1mol/l naoh溶液，于100℃回流提取3h，过滤，提取2次后，合并滤液，将其于60℃减压浓缩至1000ml，冷却至室温，得提取浓缩液；加入3000ml丙酮，于4℃静置8h后，沉淀析出，离心，收集沉淀；将沉淀用1000ml水溶解，反复冻融8次，离心，弃去沉淀，再采用sevag法(即v
多糖溶液
：v
氯仿
：v
正丁醇
＝20︰4︰1混合振荡，离心静置分层，取水层)除蛋白2次，离心除去沉淀，将水溶液减压浓缩至200ml得浓缩液一；再加入600g大孔树脂，于30℃恒温水浴中吸附12h，进行脱色，然后过滤，得浓缩液二；将浓缩液二离心，取上清液，上deae-sephadex a-25(100cm
×
3.5cm，i.d.)柱分离纯化，先用0.5mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去中性糖组分洗脱液；再用0.9mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集酸性糖组分洗脱液，于60℃减压浓缩至200ml，得洗脱浓缩液；洗脱浓缩液离心后，取上清液，上sephadex g-100(100cm
×
5cm，i.d.)凝胶柱，再分离纯化，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集分子量为36～42kda的洗脱液，减压浓缩至100ml，冷冻干燥后，得到均一性酸性多糖10.24g。
[0048]
实施例5：
[0049]
一种均一性酸性多糖，其制备方法包括以下步骤：
[0050]
称取1kg干燥山茱萸药材，粉碎为粗粉，加入5l石油醚，于60℃回流提取2h脱脂，过滤，弃去石油醚提取液，重复提取2次，收集药渣，将石油醚挥发干，于30℃条件下干燥，得山茱萸药渣；再加入8l 0.1mol/l koh溶液，于100℃回流提取3h，过滤，提取2次后，合并滤液，将其于65℃减压浓缩至1000ml，冷却至室温，得提取浓缩液；加入3000ml的无水乙醇，于4℃静置16h后，沉淀析出，离心，收集沉淀；将沉淀用800ml水溶解，反复冻融10次，离心，弃去沉淀，再采用sevag法(即v
多糖溶液
︰v
氯仿
︰v
正丁醇
＝20︰4︰1混合振荡，离心静置分层，取水层)除蛋白2次，离心除去沉淀，保留水溶液，将水溶液减压浓缩至150ml得浓缩液；再加入200g活性炭(于102℃烘箱中活化3h后，冷却)，于50℃恒温水浴震荡脱色30min，然后过滤，得滤液；将滤液离心，取上清液，上deae-sephadex a-25(100cm
×
3.5cm，i.d.)柱分离纯化，先用0.5mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去中性糖组分洗脱液；再用0.8mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集酸性糖组分洗脱液，于60℃减压浓缩至200ml，得洗脱浓缩液；洗脱浓缩液离心后，取上清液，上sephadex g-100(100cm
×
5cm，i.d.)凝胶柱，再分离纯化，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集中间分子量为36～42kda的洗脱液，减压浓缩至100ml，冷冻干燥后，得到均一性酸性多糖7.39g。
[0051]
实施例6：
[0052]
一种均一性酸性多糖，其制备方法包括以下步骤：
[0053]
称取5kg干燥山茱萸药材，粉碎为粗粉，加入15l乙酸乙酯，于80℃回流提取2h脱脂，过滤，弃去乙酸乙酯提取液，重复提取2次，收集药渣，将乙酸乙酯发干，于50℃条件下干燥，得山茱萸药渣；再加入20l 0.2mol/l naoh溶液，于90℃回流提取3h，过滤，提取2次后，合并滤液，将其于60℃减压浓缩至3l，冷却至室温，得提取浓缩液；加入9l的无水乙醇，于4℃静置12h后，沉淀析出，离心，收集沉淀；将沉淀用3l水溶解，反复冻融8次，离心，弃去沉淀，再采用sevag法(即v
多糖溶液
︰v
氯仿
︰v
正丁醇
＝20︰4︰1混合振荡，离心静置分层，取水层)除蛋白3次，离心除去沉淀，保留水溶液，将水溶液减压浓缩至500ml得浓缩液一；再加入1000ml的32vt％过氧化氢溶液，于80℃回流2h，进行脱色，然后于60℃减压浓缩至500ml，得浓缩液二；将浓缩液二离心，取上清液，上deae-sephadex a-25(150cm
×
3.5cm，i.d.)柱分离纯化，先用0.3mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去中性糖组分洗脱液；再用0.7mol/l的nacl溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集酸性糖组分洗脱液，于60℃减压浓缩至500ml，得洗脱浓缩液；洗脱浓缩液离心后，取上清液，上sephadex g-100(100cm
×
5cm，i.d.)凝胶柱，再分离纯化，用水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集中间分子量为36～42kda的洗脱液，减压浓缩至400ml，减压干燥后，得到均一性酸性多糖38.16g。
[0054]
对比例1
[0055]
一种山茱萸总多糖，其制备方法包括以下步骤：
[0056]
称取10kg干燥山茱萸药材，粉碎为粗粉，加入50l无水乙醇，于80℃回流提取3h脱脂，过滤，弃去乙醇提取液，重复提取2次，收集药渣，将乙醇挥发干，于80℃条件下干燥，得山茱萸药渣；再加入60l 0.1mol/l naoh溶液，于90℃回流提取2h，过滤，提取3次后，合并滤液，将其于60℃减压浓缩至10l，冷却至室温，得提取浓缩液；加入30l的无水乙醇，于4℃静置12h后，沉淀析出，离心，收集沉淀；将沉淀用5l水溶解，反复冻融10次，再采用sevag法(即v
多糖溶液
︰v
氯仿
︰v
正丁醇
＝20︰4︰1混合振荡，离心静置分层，取水层)除蛋白3次，离心除去沉淀，保
留水溶液，将其减压浓缩至2000ml；再加入4000ml的30vt％过氧化氢溶液，于80℃回流2h，进行脱色，然后于60℃减压浓缩至1000ml，得浓缩液；将浓缩液用水透析去除分子量小于5kd的小分子杂质后，于60℃减压浓缩至200ml，得浓缩液，即总多糖浓缩液；将总多糖浓缩液冷冻干燥后，得到山茱萸总多糖160.39g。
[0057]
效果检测
[0058]
以下通过试验例来进一步阐明本发明制备的均一性酸性多糖的物理化学性质及对疾病的治疗效果。
[0059]
试验例1：均一性酸性多糖的重均分子量测定
[0060]
采用hpsec法测定均一性酸性多糖的重均分子量。色谱柱：tsk-gelg4000pwxl(7.8mm
×
30.0cm，tosoh)；流动相：0.05m na2so4水溶液；进样量：10ul；流速：0.5ml/min；柱温：30℃，检测波长：流动相：0.05m na2so4水溶液，流速：0.5ml/min，进样量：10μl。葡聚糖标准品的配制：用不同分子量的葡聚糖(t-1、t-5、t-12、t-50、t-150和t-410)作为标准品，分别取各10mg置于容量瓶中，加入去超纯水配制成10mg/ml的标准溶液，过0.45um水系的滤膜后备用，进样量为10μl，求得洗脱体积ve。以相同的方法制备半乳糖标准溶液和蓝色葡聚糖溶液并上样测定，从而确定色谱柱的总体积v
t
和空体积v0，根据公式kav＝(v
e-vo)/(v
t-vo)计算各葡聚糖标准品的分配系数值kav，以分配系数值kav和多糖分子量对数值lgm作图，得到分子量测定标准曲线。
[0061]
分别将实施例1-6制备的均一性酸性多糖同上法制备，进样体积为10μl，根据得到的ve值计算分子量大小，最终求得实施例1-6制备的均一性酸性多糖重均分子量分别为4.2
×
104da，3.6
×
104da，3.8
×
104da，4.0
×
104da，3.9
×
104da，4.1
×
104da。
[0062]
试验例2：均一性酸性多糖的总糖醛酸含量的测定
[0063]
总糖醛酸含量测定：采用硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量，以浓度为0mg/l，20mg/l，40mg/l，60mg/l，80mg/l和100mg/l的半乳糖醛酸为标准制作标准曲线。分别称取实施例1～6得到的均一性酸性多糖，配制500mg/l的水溶液，吸取1.0ml样品液于试管中，将试管置于冰浴，向各试管加入6ml浓硫酸，摇匀后，在沸水浴中加热10min后，取出试管，将其冷却至室温，向各试管中加入0.5ml 0.15％咔唑试剂，充分混合，在室温下放置30min，以0mg/l半乳糖醛酸标准溶液管为空白，在530nm波长下测定吸光度，以标准曲线计算实施例1～6得到的均一性酸性多糖的总糖醛酸含量分别为56.16％、52.51％、50.75％、63.99％、50.04％和52.84％。注：以上百分比为重量百分比。
[0064]
试验例3：均一性酸性多糖的单糖组成分析
[0065]
均一性酸性多糖完全酸水解：分别精密称取10mg实施例1～6得到的均一性酸性多糖样品于10ml离心管中，分别加入2.0ml 4mol/l三氟乙酸溶液，用氮气赶除空气后封管，置于100℃水浴条件下充分水解8h，待反应结束冷却至室温后，缓慢滴加4mol/l naoh溶液来除去溶液中多余的三氟乙酸。
[0066]
多糖组分水解样品衍生物的制备：向上述本发明实施例1～6均一性酸性多糖水解的样品中分别加入200μl 0.3mol/l naoh溶液和400μl 0.5mol/l的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)甲醇溶液，混匀后置于80℃水浴30min，取出，冷却到室温后，用0.3mol/l的hcl溶液中和至ph＝7.0，向衍生后的溶液中分别加入2ml蒸馏水和4ml氯仿涡旋萃取，离心，静置分层，弃去下层有机层，上层水相再重复萃取2次，保留水相，分别得到本发明实施例1～6山
茱萸酸性均一性多糖的pmp衍生化样品。
[0067]
hplc分析方法：采用dionexultimate色谱系统测定单糖组成。色谱柱：accliamtm 120c
18
(4.6mm i.d.
×
250mm
×
5μm)、柱温：25℃、流动相：100mm乙酸铵水溶液(ph＝5.0)/四氢呋喃/乙腈(81：2：17)、流速：1.0ml/min、紫外检测器，检测波长250nm、进样体积为10μl。
[0068]
根据单糖的保留时间及峰面积得到的本发明实施例1～6均一性酸性多糖的单糖组成及摩尔比。实施例1制备的均一性酸性多糖的单糖组成和摩尔比为半乳糖醛酸：阿拉伯糖：半乳糖：鼠李糖：葡萄糖：甘露糖＝41.33：17.64：6.71：3.79：3.13：1.00；实施例2制备的均一性酸性多糖的单糖组成和摩尔比为半乳糖醛酸：阿拉伯糖：半乳糖：鼠李糖：葡萄糖：甘露糖＝42.48：18.60：10.72：5.27：3.37：1.00；实施例3制备的均一性酸性多糖的单糖组成和摩尔比为半乳糖醛酸：阿拉伯糖：半乳糖：鼠李糖：葡萄糖：甘露糖＝45.29：20.44：9.26：7.16：6.10：1.00；实施例4制备的均一性酸性多糖的单糖组成和摩尔比为半乳糖醛酸：阿拉伯糖：半乳糖：鼠李糖：葡萄糖：甘露糖＝47.01：17.92：7.87：4.40：3.22：1.00；实施例5制备的均一性酸性多糖的单糖组成和摩尔比为半乳糖醛酸：阿拉伯糖：半乳糖：鼠李糖：葡萄糖：甘露糖＝41.52：17.95：9.97：6.94：5.59：1.00；实施例6制备的均一性酸性多糖的单糖组成和摩尔比为半乳糖醛酸：阿拉伯糖：半乳糖：鼠李糖：葡萄糖：甘露糖＝46.38：19.91：8.45：7.26：4.78：1.00。
[0069]
试验例4：均一性酸性多糖的糖残基组成分析
[0070]
甲基化反应：分别称取20mg本发明实施例1～6均一性酸性多糖于6个50ml圆底烧瓶中，分别加入6ml无水的二甲基亚砜(dmso)中，吹氮气5min后密封，40℃磁力搅拌15h至溶液澄清透明，得到的溶液作为均一性酸性多糖备用。取干燥的naoh 500mg置于100ml带塞圆底烧瓶中，加入10ml dmso，充氮气5min后封管，磁力搅拌过夜使naoh充分溶解，得50mg/ml naoh-dmso混悬液。往制备好的均一性酸性多糖样品溶液中加入6ml naoh-dmso溶液，充氮气5min，封管，磁力搅拌3h后，置于冰浴中，避光充氮气，同时逐滴加入2ml碘甲烷，封管，继续避光反应7min。将反应后的样品放置于25℃水浴中，过夜，再加入6ml去离子水终止反应，将反应产物置于1000da透析袋内，用蒸馏水透析24h后，将透析袋内组分转移至圆底烧瓶中，浓缩，减压蒸干后，充氮气5min加入6ml dmso，进行第二次甲基化，甲基化反应重复三次，最终将反应产物减压浓缩至10ml后，加入适量chcl3萃取4次，取chcl3层，弃去水层，合并萃取液于圆底烧瓶中，加入适量无水na2so4干燥24h。过除去滤na2so4后，将滤液置于60℃水浴锅中水浴挥干chcl3后得到甲基化产物。
[0071]
均一性酸性多糖甲基化反应产物的水解、还原和乙酰化：将以上均一性酸性多糖甲基化产物用1ml 90％的甲酸溶解，充氮气封管，在100℃水浴锅中解聚4h，再加入甲醇混匀，减压蒸干，重复加入甲醇5次，以完全除去残留的甲酸。之后加入2ml 2mol/l tfa后，充氮气封管，在100℃水浴锅中水解8h，再加入甲醇混匀，减压蒸干，以除去残留tfa，重复加入甲醇5次，最后再加入蒸馏水减压蒸干，重复3次加入蒸馏水，减压蒸干以除去残留甲醇。在水解产物中依次加入8ml蒸馏水，60mg nabh4颗粒，室温下磁力搅拌还原24h，再加入半勺阳离子交换树脂(jk008型，氢型)，室温下磁力搅拌2h，用定量滤纸过滤，收集滤液于圆底烧瓶中，加入甲醇混匀，减压蒸干后，置于110℃烘箱中干燥10min。在还原产物中分别加入1ml吡啶，1ml乙酸酐后，在100℃水浴锅中水浴乙酰化2小时，再加入甲醇旋干，以除去乙酸酐，重复加入甲醇5次以完全除去乙酸酐。将乙酰化产物于100℃烘箱中干燥10min，再加入2ml少
许氯仿溶解后，取上清浓缩至100μl左右，用于gc-ms测定。
[0072]
色谱条件：采用gcms-qp2010 ultra(shimadzu，japan)色谱系统，rxi-5sil毛细管柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)柱；采用程序升温，起始温度为45℃，并在这个温度保持5min后，再以10℃/min的速率升温至140℃，于140℃保持5min后，以0.5℃/min的速率升温至170℃，保持1min，最后以15℃/min的速率升温至280℃，保持5min；分流比为50：1；氦气流速为1ml/min；进样口温度为220℃；ei温度为280℃；电子轰击能量为70ev。
[0073]
根据gc-ms分析得到的gc谱图的各个峰的峰保留时间及峰面积、ms图谱结合化合物库进行匹配分析，得到的本发明实施例1～6的酸性山茱萸多糖的糖残基组成及摩尔比。实施例1制备的均一性酸性多糖的糖残基组成和摩尔比为1,4-吡喃型半乳糖醛酸：端基-呋喃型阿拉伯糖：1,3-呋喃型阿拉伯糖：2,3-呋喃型阿拉伯糖：端基-吡喃型半乳糖：1,3-吡喃型半乳糖：1,6-吡喃型半乳糖：1,2-吡喃型鼠李糖：1,6-吡喃型葡萄糖：吡喃型甘露糖＝40.23：5.18：10.07：1.93：3.26：1.25：2.03：3.69：2.95：1.00；实施例2制备的均一性酸性多糖的糖残基组成和摩尔比为1,4-吡喃型半乳糖醛酸：端基-呋喃型阿拉伯糖：1,3-呋喃型阿拉伯糖：2,3-呋喃型阿拉伯糖：端基-吡喃型半乳糖：1,3-吡喃型半乳糖：1,6-吡喃型半乳糖：1,2-吡喃型鼠李糖：1,6-吡喃型葡萄糖：吡喃型甘露糖＝42.29：5.17：11.39：1.74：5.61：2.34：2.68：5.76：3.25：1.00；实施例3制备的均一性酸性多糖的糖残基组成和摩尔比为1,4-吡喃型半乳糖醛酸：端基-呋喃型阿拉伯糖：1,3-呋喃型阿拉伯糖：2,3-呋喃型阿拉伯糖：端基-吡喃型半乳糖：1,3-吡喃型半乳糖：1,6-吡喃型半乳糖：1,2-吡喃型鼠李糖：1,6-吡喃型葡萄糖：吡喃型甘露糖＝45.05：8.02：10.89：1.65：3.98：2.56：2.53：7.11：6.03：1.00；实施例4制备的均一性酸性多糖的糖残基组成和摩尔比为1,4-吡喃型半乳糖醛酸：端基-呋喃型阿拉伯糖：1,3-呋喃型阿拉伯糖：2,3-呋喃型阿拉伯糖：端基-吡喃型半乳糖：1,3-吡喃型半乳糖：1,6-吡喃型半乳糖：1,2-吡喃型鼠李糖：1,6-吡喃型葡萄糖：吡喃型甘露糖＝47.05：6.45：9.83：1.43：3.65：2.07：1.79：4.03：3.21：1.00；实施例5制备的均一性酸性多糖的糖残基组成和摩尔比为1,4-吡喃型半乳糖醛酸：端基-呋喃型阿拉伯糖：1,3-呋喃型阿拉伯糖：2,3-呋喃型阿拉伯糖：端基-吡喃型半乳糖：1,3-吡喃型半乳糖：1,6-吡喃型半乳糖：1,2-吡喃型鼠李糖：1,6-吡喃型葡萄糖：吡喃型甘露糖＝41.44：5.16：11.58：2.08：1.87：5.32：2.10：6.15：5.10：1.00；实施例6制备的均一性酸性多糖的糖残基组成和摩尔比为1,4-吡喃型半乳糖醛酸：端基-呋喃型阿拉伯糖：1,3-呋喃型阿拉伯糖：2,3-呋喃型阿拉伯糖：端基-吡喃型半乳糖：1,3-吡喃型半乳糖：1,6-吡喃型半乳糖：1,2-吡喃型鼠李糖：1,6-吡喃型葡萄糖：吡喃型甘露糖＝46.52：6.57：11.56：2.68：3.70：3.79：2.07：7.16：4.34：1.00。
[0074]
试验例5：均一性酸性多糖对动脉粥样硬化小鼠的治疗作用
[0075]
实验动物：apoe-/-小鼠，雄性，体重18～20g。
[0076]
实验方法：7周龄小鼠适应性饲养一周，随机分为正常组、模型组、100mg/kg均一性酸性多糖组(实施例1制备)、100mg/kg山茱萸总多糖对照组(对比例1制备)、辛伐他汀给药组，每隔一天腹腔内注射对应药物(200mg/kg体重)或生理盐水，饲以高脂饲料(含21％脂肪和0.2％胆固醇)，连续喂养12周。将小鼠造模12周以后处死，之后进行解剖，进行主动脉油红o(oro)染色，将分离出的主动脉纵向切开，在新鲜oro溶液中浸泡3-4小时。用60％异丙醇将整个主动脉分化5-7次，直到动脉粥样硬化斑块为红色且动脉壁为白色，制得切片保留后
在显微镜下观察。同时取得小鼠的主动脉窦制得冰冻切片进行苏木精-伊红(h&e)染色和oro染色置于显微镜下观察。在显微镜下拍照后使用image-pro plus 6.0软件统计oro阳性面积。
[0077]
统计学处理：实验数据采用平均数
±
标准差表示，不同组间采用方差分析进行比较，p《0.05表示有显著性差异。
[0078]
结果：通过用h&e或oro染色分析均一性酸性多糖对apoe-/-小鼠主动脉窦横截面和主动脉内膜上动脉粥样硬化斑块形成的影响来判定药物活性的大小。表1可见，在模型组中，总主动脉内膜的病变面积百分比为23.18％，在给予均一性酸性多糖的组中降低至3.83％(p《0.01)，其他组别中可看出虽有一定效果，但不如均一性酸性多糖的活性显著。通过主动脉窦横截面病变面积来看(表2)，均一性酸性多糖给药组相对于模型组的病变面积降低的最多，优于山茱萸总多糖与阳性药辛伐他汀组。这些结果表明，实施例1的均一性酸性多糖显著减少了动脉粥样硬化小鼠的主动脉粥样硬化斑块面积，并减缓了动脉粥样硬化小鼠的发展，作用显著优于山茱萸总多糖和辛伐他汀。
[0079]
表1动脉粥样硬化小鼠主动脉病变面积占总主动脉的比例(平均数
±
标准差，n＝4)
[0080][0081]
注：与模型组进行对比*p《0.05。
[0082]
表2动脉粥样硬化小鼠主动脉窦病变面积占总主动脉窦的比例(平均数
±
标准差，n＝4)
[0083][0084][0085]
注：与模型组进行对比*p《0.05。
[0086]
试验例6：均一性酸性多糖对小鼠的降血脂作用与防治动脉粥样硬化作用
[0087]
实验动物：apoe-/-小鼠，雄性，体重18-20g。
[0088]
实验方法：7周龄小鼠适应性饲养一周。随机分为正常组、模型组、100mg/kg均一性酸性多糖组(实施例1制备)、100mg/kg山茱萸总多糖组(对比例1制备)、辛伐他汀给药组，每隔一天腹腔内注射对应药物(200mg/kg体重)或生理盐水，饲以高脂饲料(含21％脂肪和0.2％胆固醇)，连续喂养12周。造模12周以后用0.5％戊巴比妥钠麻醉小鼠。从眼眶静脉丛采集血液，用离心机3000r/min离心10min。按照试剂盒说明书逐一测定血清总胆固醇(tc)、低密度脂蛋白醇(ldl-c)、超氧化物歧化酶(sod)和丙二醛(mda)水平。
[0089]
统计学处理：实验数据采用平均数
±
标准差表示，不同组间采用方差分析进行比较，p《0.05表示有显著性差异。
[0090]
结果：表3可见小鼠在经过均一性酸性多糖治疗后，血脂明显降低，其ldl-c、tc水平显著下降，在相同给药剂量下可知，山茱萸总多糖组降低血脂的水平较低，未达到理想治疗效果，辛伐他汀作为阳性药，其功效强大，但与均一性酸性多糖组相比无显著性差异。从sod、mda的变化来看(表4)，均一性酸性多糖可提高sod水平，降低mda水平，而山茱萸总多糖组和辛伐他汀给药组并无提高sod的作用，这两者对于mda的下调作用也不明显。总之相对于山茱萸总多糖与阳性药，此种均一性酸性多糖治疗效果更优。以上数据说明均一性酸性多糖不仅改善了apoe-/-小鼠的脂质代谢紊乱还发挥了抗氧化活性，可用于治疗和预防高血脂和动脉粥样硬化。
[0091]
表3动脉粥样硬化小鼠血液ldl-c、tc测定结果(平均数
±
标准差，n＝4)
[0092][0093]
注：与模型组进行对比*p《0.05。
[0094]
表4动脉粥样硬化小鼠血液sod、mda测定结果(平均数
±
标准差，n＝4)
[0095][0096]
注：与模型组进行对比*p《0.05。
[0097]
试验例7：均一性酸性多糖对raw264.7细胞泡沫化的作用
[0098]
实验细胞：raw 264.7巨噬细胞
[0099]
实验方法：将raw 264.7巨噬细胞(2
×
105个细胞/ml)接种在含有圆形盖玻片的24孔板中，每孔加入470μl细胞悬液，培养4h后细胞贴壁，分为空白对照组，ox-ldl模型组，阳性药组和均一性酸性多糖干预组，每组2个复孔。除空白组外，其他组每孔分别加入20μl ox-ldl(终浓度为50μg/ml)，同时阳性药组给予10μl辛伐他汀(终浓度为1μm)，ox-ldl模型组和空白组补加培养基至相同体积。给药干预组分别给予10μl不同浓度梯度的均一性酸性多糖(实施例1-6)培养液(终浓度为0.3mg/l、1mg/l和3mg/l)，共同培养24h之后，进行oro染色，显微镜拍照后使用image-pro plus 6.0软件对oro阳性区域的百分比进行定量。使用软件origin 2018对数据进行处理分析，使用单因素方差分析(one-way)检验有效性。p《0.05为存在显著性差异。
[0100]
结果：泡沫化细胞的形成是动脉粥样硬化的特征性病理变化，也是动脉粥样硬化发生发展的始动环节。泡沫细胞是动脉粥样硬化体外评价的模型，通过对该模型的研究可以快速筛选出抑制动脉粥样硬化的潜在活性药物。在ox-ldl诱导的条件下分别测定实施例1-6得到的均一性酸性多糖与对比例1得到的山茱萸总多糖不同浓度给药后的情况，如表5所示，当ox-ldl和均一性酸性多糖共同处理24h后，油红oro染色的阳性面积显著减少，此作用显著强于山茱萸总多糖。在0.3-3mg/l的浓度范围内，随着均一性酸性多糖浓度的增大，抑制作用越明显，故均一性酸性多糖剂量依赖性地抑制raw264.7细胞的泡沫化，此外，中、高浓度的均一性酸性多糖处理组的抑制效果明显高于阳性药辛伐他汀组；相同浓度的实施例1-6的均一性酸性多糖抑制泡沫化效果相当。以上结果表明均一性酸性多糖具有稳定地、显著地抑制ox-ldl诱导的raw264.7细胞泡沫化的活性，且均一性酸性多糖相比于山茱萸总多糖的抑制作用更强，抑制巨噬细胞泡沫化是治疗as的有效策略之一，以上数据均说明均一性酸性多糖治疗动脉粥样硬化具有显著作用。
[0101]
表5药物对ox-ldl诱导的raw264.7细胞泡沫化的活性作用(平均数
±
标准差，n＝4)
[0102]
[0103][0104]
注：与模型组进行对比*p《0.05。
[0105]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。