生物标志物在预测慢性粒细胞白血病患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感性中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及生物标志物在预测慢性粒细胞白血病患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感性中的应用。


背景技术：

2.慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia,cml),又称慢性粒细胞白血病，简称慢粒，是一种发生在多能造血干细胞上的恶性骨髓增殖性疾病，约占所有白血病的15％。
3.酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase omhibitor,tki)的广泛应用显著地改善了慢性髓系白血病患者的缓解率及长期生存。但仍有小部分患者由于药物不耐受和(或)耐药而出现病情进展和难治复发，例如伊马替尼是治疗慢性粒细胞白血病的有效药物，大约有20％到30％的患者对伊马替尼耐药。因此，cml患者对酪氨酸激酶抑制剂的耐药机制是目前cml临床治疗中的难点和研究热点。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供预测慢性粒细胞白血病患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的生物标志物，改进临床诊断风险分层，在tkis治疗时代能够更准确地早期识别对tkis耐药的病人。
5.为达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.本发明提供了一种标志物，所述的标志物包括s100a9、vegfc和/或osbpl2。
7.如本文中在诸如“a和/或b”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括a和b两者；a或b；a(单独)；以及b(单独)。同样地，在诸如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
8.术语“生物标志物”、“标志物”是指以可用于预测个体的疾病状态的不同浓度存在于个体中的生物分子。生物标志物可包括，但不限于，核酸、蛋白质及其变体和片段。生物标志物可以是包含编码该生物标志物的全部或部分核酸序列或这类序列的互补体的dna。可用于本发明的生物标志物核酸被认为包括包含任何目的核酸序列的全部或部分序列的dna和rna。
9.在本发明中，生物标志物例如s100a9(geneid：6280)、vegfc(geneid：7424)、osbpl2(geneid：9885)，包括gene及其编码的蛋白及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的生物标志物，以及源自细胞中加工的任何形式的生物标志物。该术语涵盖生物标志物的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。
10.本发明还提供了一种试剂，所述的试剂包括能够检测样本中前面所述的标志物表达水平的试剂。
11.如本文所用，术语“样本”是指从如本文所述的目的来源获得或衍生的生物样本。在一些实施方案中，目的来源包含生物体，诸如动物或人。在一些实施方案中，生物样本包含生物组织或液体。在一些实施方案中，生物样本可以是或包含骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样本；含有细胞的体液；游离漂浮核酸；痰液；唾液；尿液；脑脊液腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；皮肤拭子；口服拭子；鼻拭子；洗涤物(washings)或灌洗物，诸如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物；吸出物；刮屑；骨髓标本；组织活检标本；手术标本；粪便，其他体液，分泌物和/或排泄物；和/或其中的细胞等。在一些实施方案中，生物样本是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样本是通过任何合适的手段直接从目的来源获得的“初级样本”。例如，在一些实施方案中，通过选自以下的方法获得初级生物样本：活组织检查(例如，细针抽吸或组织活组织检查)、手术组织、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)的收集等。在一些实施方案中，如从上下文将显而易见的，术语“样本”是指通过加工(例如，通过去除初级样本的一种或多种组分和/或通过向初级样本添加一种或多种试剂)获得的制剂。例如，使用半透膜过滤。这类“经处理的样本”可以包含例如从样本中提取的或通过对初级样本进行诸如mrna的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化等技术而获得的核酸或蛋白质。
12.作为一种优选的实施方式，所述的样本为细胞，更为优选的，所述的细胞为cd34 细胞。
13.进一步，所述的试剂包括通过数字成像技术、蛋白免疫技术、染料技术、核酸测序技术、核酸杂交技术、色谱技术、质谱技术来测量生物标志物表达水平的试剂。
14.作为一种可选择的实施方案，可以使用高级测序方法检测基因的表达水平。例如，可以使用illumina检测生物标志物。下一代测序(例如，sequencing-by-synthesis或truseq方法，其使用例如hiseq、hiscan、genomeanalyzer或miseq系统)。生物标志物也可以使用离子流测序或其他合适的半导体测序方法来进行检测。
15.作为一种可选择的实施方案，可以使用质谱法使用rnase图谱(mapping)对生物标志物进行定量。在通过ms或串联ms(ms/ms)方法对分离的rna进行分析之前，可以用具有高特异性的rna内切核酸酶(rnase)(例如，rnase t1，其在所有未修饰的鸟苷残基的3'侧切割)对分离的rna进行酶促消化。开发的第一种方法使用直接与esi-ms偶联的反相hplc对核酸内切酶消化物进行在线色谱分离。转录后修饰的存在可以通过与基于rna序列预期的那些的质量偏移来揭示。然后可以分离质量/电荷值异常的离子用于串联ms测序，从而定位转录后修饰的核苷的序列位置。
16.基质辅助激光解吸/电离质谱法(maldi-ms)也已被用作获得关于转录后修饰的核苷的信息的分析方法。基于maldi的方法可以通过分离步骤与基于esi的方法区分。在maldi-ms中，质谱仪用于分离生物标志物。
17.进一步，所述的试剂包括：
18.与所述生物标志物基因特异性结合的引物或探针；
19.与所述生物标志物蛋白特异性结合的抗体、肽、适配体或化合物。
20.本文所使用的术语“引物”是指具有短游离3'-羟基的核酸序列，是可以与互补模板形成碱基对并充当模板链复制的起点的短核酸。在适当的缓冲溶液和温度下，在存在用于聚合的试剂(即dna聚合酶或逆转录酶)和四种不同的核苷三磷酸的情况下，引物可以引
发dna合成。可以根据本领域已知的技术适当地选择pcr条件以及正义和反义引物的长度。
21.本文所使用的术语“探针”是指对应于可以特异性结合mrna的几个碱基至数百个碱基的核酸片段(例如rna或dna)，并且可以通过标签来确认特定mrna的存在与否以及表达水平。探针可以以寡核苷酸探针、单链dna探针、双链dna探针或rna探针的形式制备。可以根据本领域已知的技术适当地选择合适的探针和杂交条件。
22.本文所使用的术语“抗体”是本领域众所周知的，是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白。本发明中的抗体是指与本发明的生物标志物蛋白特异性结合的抗体，可以根据本领域中的常规方法来制造抗体。抗体的形式包括多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段(诸如fab、fab'、f(ab')2和fv片段)、单链fv(scfv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性。
23.本文所使用的术语“肽”具有与靶物质高度结合的能力，并且在热处理/化学处理期间不会发生变性。而且，由于其尺寸小，可以通过将其附接到其它蛋白上而用作融合蛋白。具体而言，因为可以特异性地附接到高分子蛋白链上，它可以用作诊断试剂盒和药物递送物质。
24.本文所使用的术语“适配体”是指一种由特定类型的单链核酸(dna、rna或修饰的核酸)组成的多核苷酸，所述单链核酸自身具有稳定的三级结构，并且具有能够以高亲和力和特异性与靶分子结合的特性。如上所述，由于适配体可以像抗体那样特异性结合抗原性物质，但比蛋白更稳定并具有简单的结构，并且是由易于合成的多核苷酸组成，因此可以代替抗体来使用。
25.如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子(即结合分子与靶分子)之间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。两分子之间的结合亲和力可用kd值描述。kd值是指由kd(特定的结合分子-靶分子相互作用的解离速率；亦称为koff)与ka(特定结合分子-靶分子相互作用的缔合速率；亦称为kon)之比得到的解离常数，或者指表示为摩尔浓度(m)的kd/ka。kd值越小，两分子结合越紧密，亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5
m，例如小于大约10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m或10-10
m或更小的亲和力(kd)结合该抗原。kd值可通过本领域熟知的方法确定，例如使用表面等离子体共振术(spr)在biacore仪中测定。
26.本发明还提供了如下任一项所述的应用：
27.(1)前面所述的标志物在构建预测慢性粒细胞白血病患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的系统中的应用；
28.(2)前面所述的试剂在制备预测慢性粒细胞白血病患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的产品中的应用。
29.进一步，所述的酪氨酸激酶抑制剂包括bcr/abl酪氨酸激酶抑制剂、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂、血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。优选为bcr/abl酪氨酸激酶抑制剂。
30.更为优选的，所述的bcr/abl酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、azd9291，优选为伊马替尼。
31.进一步，所述的产品包括试剂盒、芯片。
32.进一步，所述的试剂盒还包括cd34 细胞免疫磁珠。
33.进一步，所述的试剂盒还包括骨髓单个核细胞分离试剂。
34.进一步，所述的芯片包括基因芯片、蛋白质芯片。
35.所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测所述生物标志物基因转录水平的针对生物标志物基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的所述生物标志物编码蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括所述生物标志物基因在内的多个基因的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括所述生物标志物编码蛋白在内的多个蛋白质的表达水平。
36.进一步，所述的系统包括：
37.1)检测单元：包括生物标志物检测模块；
38.2)分析单元：将检测单元检测得到的生物标志物的表达水平作为输入变量，输入预测慢性粒细胞白血病患者是否对酪氨酸激酶抑制剂耐药的模型进行分析；
39.3)评估单元：输出样本对应的受试者对酪氨酸激酶抑制剂耐药的风险值；
40.所述的生物标志物包括s100a9、vegfc和/或osbpl2。
41.进一步，所述的预测慢性粒细胞白血病患者是否对酪氨酸激酶抑制剂耐药的模型使用选自以下一种或更多种算法来确定：xgboost、随机森林、glmnet、cforest、机器学习的分类与回归树、treebag、k-毗邻、神经网络、支持向量机径向、支持向量机线性、朴素贝叶斯或多层感知。
[0042]“模型”是任何数学方程式，算法，分析或程序化过程或统计技术，其采用一个或多个连续或分类输入并计算输出值，有时称为“索引”，“索引值”，“预测器”，“预测值”，“概率”或“概率得分”。“公式”的非限制性示例包括和、比率以及回归算子，例如系数或指数，生物标志物值转换和标准化，规则和指南，统计分类模型以及对历史群体进行训练的神经网络。在组(panel)和组合构造中，特别有趣的是结构和句法统计分类算法，以及利用模式识别特征的风险指数构建方法，包括已建立的技术，例如互相关，主成分分析(pca)，因子旋转，对数回归(logreg)，线性判别分析(lda)，特征基因线性判别分析(eigengene lineardiscriminant analysis,elda)，支持向量机(support vector machines，svm)，随机森林(random forest,rf)，递归分区树(rpart)、xgboost(xgb)以及其他相关的决策树分类技术，shrunkencentroids(sc)，stepaic，最近的kth邻居(kth-nearest neighbor)，boosting，决策树(decision trees)，神经网络，贝叶斯网络，支持向量机和隐马尔可夫模型(hidden markovmodels)等。还进一步实现了许多此类算法技术，以执行特征(基因座)选择和规则化(regularization)规则化，例如在岭回归(ridge regression)，lasso和elastic net等中。其他技术可用于生存和事件前时间危险分析(time to event hazard analysis)中，包括本领域技术人员众所周知的cox，weibull，kaplan-meier和greenwood模型。这些技术中的许多技术都可以与生物标志物选择技术结合使用，例如正向选择，后向选择或逐步选择，给定大小的所有潜在生物标志物集或组的完整枚举，遗传算法或它们本身可以包括生物标志物选择方法。这些可以与信息标准结合使用，例如akaike的信息标准(akaike'sinformation criterion，aic)或贝叶斯信息标准(bayes information criterion，bic)，以便量化其他生物标志物和模型改进之间的权衡，并有助于最小化过度
拟合。生成的预测模型可以在其他研究中进行验证，或在它们最初进行培训的研究中交叉验证，使用诸如bootstrap，leave-one-out(loo)和10倍交叉验证(10-fold cross-validation)(10倍cv)等技术进行。在各个步骤，可以根据本领域已知的技术通过值排列来估计错误发现率。
[0043]
本发明还提供了一种筛选能提高慢性粒细胞白血病患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感度的药物的方法，所述方法包括：
[0044]
1)在测试组中，向待测对象施用待测试药物，检测测试组中来源于所述对象的样品中生物标志物的表达水平v1；在对照组中，向待测对象施用空白对照，检测对照组中来源于所述对象的样品中生物标志物的表达水平v2；
[0045]
2)比较上一步骤检测得到的水平v1和水平v2，从而确定所述测试化合物是否是能提高慢性粒细胞白血病患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感度的候选药物；
[0046]
所述的生物标志物包括s100a9、vegfc和/或osbpl2。
[0047]
进一步，所述的酪氨酸激酶抑制剂包括bcr/abl酪氨酸激酶抑制剂、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂、血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，优选为bcr/abl酪氨酸激酶抑制剂。
[0048]
更为优选的，所述的bcr/abl酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、azd9291，优选为伊马替尼。
附图说明
[0049]
图1是s100a9差异表达的箱线图；
[0050]
图2是vegfc差异表达的箱线图；
[0051]
图3是osbpl2差异表达的箱线图；
[0052]
图4是s100a9和vegfc联合预测慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼敏感性的roc曲线图；
[0053]
图5是vegfc和osbpl2联合预测慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼敏感性的roc曲线图；
[0054]
图6是s100a9和osbpl2联合预测慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼敏感性的roc曲线图；
[0055]
图7是s100a9 vegfc osbpl2联合预测慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼敏感性的roc曲线图。
具体实施方式
[0056]
以下所举实例是为了对本发明的的某些优选实施方案和本发明的某些方面进行描述，并不应解释为限定本发明的范围。以下实例结合附表和附图对本发明所述实施方案做进一步的详细说明。
[0057]
实施例1差异表达基因
[0058]
从geo数据库下载gse14671，用r语言limma包对其进行差异分析，得到1126个差异表达基因，筛选标准为：pvalue《0.05。
[0059]
该数据集源自对伊马替尼治疗的cml患者的cd34 细胞的基因表达分析。该数据集
中，nr:r＝18:41，r表示应答组(即敏感组)，nr表示无应答组(即耐药组)。应答组定义为治疗后12个月内至少有部分细胞遗传学反应的患者，无应答组定义为其他患者。
[0060]
本发明所涉及的差异表达基因s100a9、vegfc、osbpl2的表达水平如表1和图1-3所示。
[0061]
表1差异表达基因
[0062]
基因tp.valueup/downs100a92.3710.021upvegfc-2.3770.021downosbpl22.0400.046up
[0063]
实施例2诊断效能
[0064]
使用r包“proc”(版本1.15.0)绘制受试者工作曲线(roc)，分析auc值、敏感性和特异性，结果见表2和图4-7。
[0065]
表2生物标志物/生物标志物组合诊断效能数据
[0066]
生物标志物/生物标志物组合auc值s100a90.676vegfc0.683osbpl20.663s100a9 vegfc0.833vegfc osbpl20.786s100a9 osbpl20.701s100a9 vegfc osbpl20.866
[0067]
以上结果证明，本发明所涉及的生物标志物在预测慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼敏感性中具有很好的诊断效能，且生物标志物组合的诊断效能优于单个生物标志物。
[0068]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。