与猪肌纤维类型发育相关的circKANSL1L及其应用的制作方法

与猪肌纤维类型发育相关的circkansl1l及其应用
技术领域
1.本发明涉及猪肌纤维类型发育技术领域，更具体地，涉及一种与猪肌纤维类型发育相关的环状rna及其在评估猪肉品质中的应用。


背景技术：

2.动物肌肉形成与品质性状改良是家畜育种工作中的最主要研究方向。近年来，随着消费者对肉品质要求的日益提高，亟需改善肉质，培育优质肉猪。肌纤维是肌肉的基本组成单位，近年来研究表明，肌纤维的组织学特性与肌肉品质特别是食用品质性状(嫩度、风味、多汁性)密切相关，肌纤维的特征在某种程度上决定了肌肉特性。一般而言，氧化型肌纤维直径小，脂质和肌红蛋白含量高，有助于增加肌肉的嫩度、多汁性和风味；当氧化型肌纤维减少，酵解型肌纤维比例高时，猪肉品质下降。动物骨骼肌的生长发育以及肌纤维类型的发生与转化是一个非常复杂的生物学过程，受到许多信号通路与因子的调控。
3.环状rna(circular rna，circrna)通常是由基因外显子构成，是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(a)尾巴并以共价键形成环形结构的内源性非编码rna分子，不易被rna外切酶rnase r降解，稳定性高，大量存在于真核细胞中，具有一定的时序、组织和疾病特异性。目前已发现猴、牛、绵羊和鸡等物种肌肉组织中存在大量circrna与肌肉发育过程密切相关；circrna发挥与肌纤维类型发育相关的生物学功能已被证实，本发明提出一种与猪肌纤维类型发育相关的环状rna及其鉴定方法，为培育优质肉猪提供新的思路。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种与猪肌纤维类型发育相关的circkansl1l。
5.本发明的另一目的在于提供上述circkansl1l的应用。
6.本发明选择了1日龄和90日龄蓝塘猪背最长肌组织为研究材料。对比1日龄和90日龄的蓝塘猪肌肉，我们发现肌纤维从氧化型优势转化为酵解型优势。因此，结合二代测序及生物信息学分析的方法，本发明寻找到部分调控猪肌纤维类型发育相关的circrna，为选育优质猪品种(系)提供理论基础。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.本发明首次发现环状转录本circkansl1l的存在，并发现其与猪肌纤维发育密切相关，因此本发明要求保护以下内容：
9.一种与猪肌纤维类型发育相关的环状rna，名称为circkansl1l，其核苷酸序列如seq id no：1所示。
10.进一步，所述环状rna的pcr检测引物，包括上游引物f1和下游引物r1，其核苷酸序列如seq id no：2～3所示。
11.所述环状rna的qpcr检测引物，包括circkansl1l-f和circkansl1l-r，其核苷酸序列如seq id no：4～5所示。
12.所述检测引物在检测所述环状rna中的应用。
13.进一步，本发明还提供一种上述环状rna或检测引物在检测或评估猪肌纤维发育方面的应用。
14.进一步，上述环状rna或检测引物在预测或辅助预测猪肉品质中的应用；
15.进一步，上述环状rna或检测引物在制备预测或辅助预测猪肉品质的试剂盒中的应用；
16.进一步，上述环状rna或检测引物在选育具有不同猪肉品质猪品种(系)中的应用。
17.一种检测上述环状rna的试剂盒，含有上述pcr检测引物或qpcr检测引物。
18.进一步，使用pcr法检测环状rna时，所用的引物包括上游引物f1和下游引物r1，其核苷酸序列如seq id no：2～3所示。
19.进一步，使用qpcr法检测环状rna时，所用的引物包括circkansl1l-f和circkansl1l-r，其核苷酸序列如seq id no：4～5所示。
20.上述试剂盒应用于猪肌肉组织中circkansl1l的定量检测。
21.上述试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
22.本发明还提供一种检测上述环状rna的方法，包括如下步骤：
23.(1)提取猪肌肉组织总rna，作为待测样品；
24.(2)将步骤(1)中的rna进行逆转录获得cdna；
25.(3)将步骤(2)获得的cdna进行扩增检测；
26.(4)通过溶解曲线分析，2-δδct
法进行相对定量。
27.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
28.本发明验证了circkansl1l的存在，并克隆获得了该环状rna的分子序列全长，确定了circkansl1l环结构，该分子对核酸外切酶rnase r存在抗性。该circkansl1l调控猪肌纤维发育影响猪肉品质，应用于猪肉品质改良方面的辅助遗传选育过程。本发明公开的circkansl1l可以作为与猪肉品质相关的分子标记，在遗传辅助育种中具有重要的实际应用价值。
附图说明
29.图1是circkansl1l接头序列中环化位点的测序峰图。
30.图2是rnase r处理后circkansl1l和线性kansl1l定量变化。
31.图3是双引物法验证circkansl1l环状结构的结果图；其中，a为circkansl1l位置引物示意图，表示divergent primers；表示convergent primers；b为双引物法验证circkansl1l环状结构的琼脂糖凝胶电泳图。
32.图4是荧光定量pcr检测猪背最长肌组织中circkansl1l的相对表达量。
具体实施方式
33.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
34.本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对
这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
35.实施例1circkansl1l的环状鉴定
36.本实施例提出一种与猪肌纤维发育相关的环状rna，其特征在于：包括与猪肌纤维发育相关的环状rnacirckansl1l，所述环状rnacirckansl1l的核苷酸序列如seq id no：1所示。
37.用于检测所述环状rna circkansl1l的引物包括上游引物f1和下游引物r1，所述上游引物f1的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述下游引物r1的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述环状rnacirckansl1l的接头序列的核苷酸序列如图1所示。
38.1、实验操作
39.一种猪肌纤维发育相关的环状rna的鉴定方法，包括以下步骤：
40.1.1、实验动物：
41.试验以1日龄和90日龄蓝塘猪背最长肌组织为实验材料。其中，蓝塘猪在文献“蓝塘猪与长白猪正反交f1代胴体性状和肉品质的比较.华南农业大学学报,2015,36(5):1-6”中公开。
42.1.2、样品采集及rna提取：
43.屠宰实验猪后，取约100mg背最长肌组织样品于装有1ml trizol的1.5ml匀浆管中，高速匀浆使细胞完全破裂，离心后转移至新1.5ml离心管，静置30分钟后，12000rpm、4℃离心5分钟，取上清，按1ml trizol加入0.2ml氯仿，震荡20秒种，室温放置5分钟，12000rpm离心20分钟(降速为0)。将离心后的上清转移到新的离心管中，按1ml trizol加入0.5ml异丙醇(预冷)，-20℃静置过夜，12000rpm、4℃离心10分钟。弃上清后加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀，4℃、7500rpm离心5分钟，弃上清，空干rna沉淀，约10分钟，加入适量depc处理水溶解rna。用核酸浓度测定仪测定总rna的浓度，记录rna的浓度。取0.5μl总rna进行琼脂糖凝胶电泳，检测rna的质量。提取后的rna放置于-80℃冰箱保存备用。
44.1.3、不同日龄蓝塘猪背最长肌circrna测序及生物信息学分析
45.对上述取得的1日龄和90日龄的蓝塘猪背最长肌rna进行circrna测序，运用fastqc(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布、质量值的位置分布、gc含量、pcr duplication含量等。
46.对circrna-seq测序数据进行circrna鉴定分析，采用国际公认算法circ explorer2(http://circexplorer2.readthedocs.io/en/latest/)、circrna_finder(https://omictools.com/circrnafinder-tool)、ciri(https://sourceforge.net/projects/ciri/)、find_circ(https://github.com/orzechoj/circrna_finder)和mapsplice(http://www.netlab.uky.edu/p/bioinfo/mapsplice2)进行。采用国际公认算法edge(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edger.html)进行差异筛选，通过分析最终挑选出差异表达极显著的circkansl1l，circkansl1l在90日龄蓝塘猪背最长肌组织中极显著高表达。circkansl1l由猪kansl1l基因的第2至3外显子环化而成，如图1所示，核苷酸序列如seq id no：1所示，circkansl1l的接头区域序列，核苷酸序列
如图1所示；
47.1.4、反转录
48.取1.2步骤中所得90日龄蓝塘猪背最长肌rna，采用反转录试剂盒获得cdna模板，反转录程序如表1、2：
49.表1去除基因组dna反应
50.试剂体积5
×
gdna eraserbuffer2μlgdna eraser1μltotal rna1μgrnase-free ddh2oup to 10μl
51.将溶液混匀后42℃2min。
52.表2 rna反转录反应
53.试剂体积将上述混合液10μlprimescript rt enzyme mix i1μlrnase-free ddh2o4μlrt primer mix1μl5
×
primescript buffer 2(for real time)4μltotal20μl
54.用移液枪混匀，进行第二步程序37℃，15min；85℃，5sec，4℃。反转录后的cdna放置于-80℃冰箱保存备用。
55.1.5、pcr验证circkansl1l的环状特征
56.以circkansl1l的全长序列为模板，利用primer 5软件设计能够进行rt-pcr鉴定环状rnacirckansl1l的引物序列，其序列如下：
57.上游引物f1：5
′‑
aatggaagtggcttgtagacagag-3
′
(seq id no：2)；
58.下游引物r1：5
′‑
aagcagataccctttgttgctg-3
′
(seq id no：3)；
59.利用设计的引物f1/r1，以上述cdna为模板，进行pcr反应，反应体系见表3。
60.表3 pcr反应体系：
61.试剂体积2
×
taq master mix10μl上游引物0.5μl下游引物0.5μlcdna模板2μlddh2o7μltotal20μl
62.pcr程序设置：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃45s，39个循环；72℃10min。将所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将目的条带进行切胶回收。
63.将回收后的dna送到生工生物公司测序，以鉴定环状rna circkansl1l的存在及反
向成环。
64.2、实验结果
65.序列比对发现circkansl1l的junction位置是存在的，junction位置由5'utr的5'端和外显子2的3'端连接形成，其位置峰图单一，没有出现杂峰(图1)。
66.实施例2circkansl1l分子rnase r耐受性分析
67.1、实验操作
68.按照1μg猪背最长肌rna(指1日龄和90日龄蓝塘猪背最长肌rna混合样品)添加2u/μg的rnase r酶，在37℃下孵育30分钟。作为对照，将另外1μg上述rna与无rnase的水在相同条件下孵育。用rnase r处理后，将所得的上述rna反应液进行反转录，我们使用定量实时pcr(qpcr)检测到circrna及其线性mrna的rna表达水平，使用gapdh(3-磷酸甘油醛脱氢酶)作为数据分析的内参，circrna使用引物circkansl1l-f(seq id no：4)和circkansl1l-r(seq id no：5)，线性mrna使用引物kansl1l-f(seq id no：6)和kansl1l-r(seq id no：7)，gapdh内参基因使用引物gapdh-f(seq id no：8)和gapdh-r(seq id no：9)进行qpcr定量检测。
69.2.1、引物设计：
70.circkansl1l扩增：
71.circkansl1l-f：5
′‑
agtactgaatggaagtggcttg-3
′
(seq id no：4)；
72.circkansl1l-r：5
′‑
ctggagataattactggaagccttag-3
′
(seq id no：5)；
73.线性mrnakansl1l扩增：
74.kansl1l-f：5
′‑
ctttgactgtggagaggga-3
′
(seq id no：6)；
75.kansl1l-r：5
′‑
gcagaaagcctgtggttag-3
′
(seq id no：7)；
76.gapdh内参基因扩增：
77.gapdh-f：5
′‑
ctgccgcctggagaaacct-3
′
(seq id no：8)；
78.gapdh-r：5
′‑
gctgtagccaaattcattgtcg-3
′
(seq id no：9)。
79.2.2、rnase r处理
80.表4 rnase r处理体系
81.试剂体积rna1μg10x reaction buffer2μlrnase r(20u/μl)2u/μg rnarnase-free waterup to 10μl
82.按照1μg rna添加2u/μg的rnase r酶，如表4，37℃反应30min；将所得的上述rna反应液按照表1和表2进行反转录。
83.2.3、qrcr反应
84.表5 qpcr反应体系
85.试剂体积2
×
sybp qpcr master mix5μl上游引物0.5μl下游引物0.5μl
cdna模板2μlddh2o2μltotal10μl
86.qpcr程序设置：预变性95℃2min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸40s，40个循环并在延伸结束收集荧光信号；最后95℃1min，60℃退火30s，绘制相应的熔解曲线。
87.3、实验结果
[0088]2‑△△
ct
法分析每组样本间基因的相对表达情况，用t-检验统计分析相对表达量，数据结果展示为平均数
±
标准差(mean
±
sd)，p《0.05为差异显著。
[0089]
由于circrna不存在游离的5'端和3'端，对核酸外切酶具有耐受性，将总rna用rnase r处理后，定量发现处理前后circkansl1l的量变化不显著，而线性对照组的变化达到极显著水平(图2)，成功验证circkansl1l的环状结构。
[0090]
实施例3双引物法验证circkansl1l成环
[0091]
1、实验操作
[0092]
用上海生物工程股份有限公司ezup柱式动物基因组dna抽提试剂盒提取猪背最长肌组织的基因组dna(gdna)，然后分别以cdna和gdna为模板，以发散引物上游引物f1(seq id no：2)和下游引物r1(seq id no：3)进行pcr扩增，作为对照，以收敛引物convergent-kansl1l-f(seq id no：10)和convergent-kansl1l-r(seq id no：11)再分别进行pcr扩增，观察琼脂糖凝胶电泳结果。
[0093]
2、引物设计
[0094]
收敛引物：
[0095]
convergent-kansl1l-f：5
′‑
tctcaccaaagacgctaatgta-3
′
(seq id no：10)；
[0096]
convergent-kansl1l-r：5
′‑
cgagcattcacttcctgctct-3
′
(seq id no：11)；
[0097]
3、实验结果
[0098]
使用circrna的收敛引物成功扩增出了以cdna和gdna为模板的对应条带，而使用circrna的发散引物只在cdna中成功扩增出对应条带(图3b)，验证了circkansl1l成环。
[0099]
实施例4荧光定量pcr检测1日龄和90日龄背最长肌组织中circkansl1l的表达
[0100]
1、实验操作
[0101]
将1.2步骤中所得的1日龄和90日龄背最长肌组织rna进行反转录后，使用qpcr检测蓝塘猪1日龄和90日龄背最长肌组织circkansl1l表达水平，使用gapdh(3-磷酸甘油醛脱氢酶)作为数据分析的内参，circkansl1l使用引物circkansl1l-f(seq id no：4)和circkansl1l-r(seq id no：5)检测，gapdh内参基因使用引物gapdh-f(seq id no：8)和gapdh-r(seq id no：9)检测，所使用的qpcr反应体系如表5所示，反应时每个样品设计三个重复。反应程序为：95℃30s，40个循环(95℃5s，退火55℃30s)于53℃30s收集荧光信号。采用2
‑△△
ct
法度量基因在各样品中的表达情况。
[0102]
2、实验结果
[0103]
qpcr定量结果如图4显示，90日龄蓝塘猪背最长肌circkansl1l的表达量显著高于1日龄。
[0104]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，
均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。