用于鉴定亚洲型舞毒蛾特异性引物及检测方法与流程

1.本发明属于林业和植物检疫技术领域，具体地说，涉及一种用于鉴定亚洲型舞毒蛾特异性引物及检测方法。


背景技术：

2.舞毒蛾 lymantria dispar （linnaeus）是鳞翅目（lepidoptera）裳蛾科（erebidae），毒蛾属 (lymantria)的一中重要的检疫性害虫。根据其形态特征、雌虫的飞行能力和地理分布区域，最新的亚种分类研究将其分为3个典型亚种（pogue& schaefer, 2007）：欧洲亚种(lymantria dispar dispar)、亚洲亚种(lymantria dispar asiatica)、日本亚种(lymantria dispar japonica)，欧洲亚种又称为欧洲型舞毒蛾（european gypsy moth)，亚洲亚种和日本亚种被统称为亚洲型舞毒蛾（asian gypsy moth）。相对于欧洲型舞毒蛾来说，亚洲型舞毒蛾的雌成虫具备强的飞行能力，且其寄主范围广，有500多种林木均为其寄主，而欧洲型舞毒蛾的雌成虫没有飞行能力且幼虫寄主有250种左右。基于这样的的特性，由于亚洲型雌成虫的迁飞距离可达25英里，加上其寄主广泛性的特点，一旦被引入并定殖，其传播和蔓延的速度会比欧洲型舞毒蛾快得多，对北美的危害会比欧洲型舞毒蛾更加严重。为了防止亚洲型舞毒蛾的传入，美国先后对来自俄罗斯远东地区、日本等地的船舶实施特别检疫措施，2007年以来，也向中国提出了来自中国的船舶实施同类检疫措施。加拿大，墨西哥，智利，新西兰等国家也开始向中国颁发同样严格的检疫文件。中国作为亚洲型舞毒蛾的发源地，这些检疫措施的颁布给中国几乎全部的重要口岸的植物检疫和对外贸易发展带来重大影响。但是在中国境内还存在着几种毒蛾如木毒蛾，褐顶毒蛾，模毒蛾，栎毒蛾等无论是成虫还是幼虫甚至是卵的形态都和舞毒蛾非常相似，即使是专业的鉴定人员也有将其混淆的可能性。因为毒蛾属的昆虫主要是依靠鳞翅的形态来进行鉴别，而货物运输过程中发现的蛾类很难有完整的鳞翅花纹保留，因此传统的形态学方法难以满足口岸检疫及货物调运过程中对舞毒蛾和其近缘种的快速准确识别与鉴定的现实需求。因此，在进出境检疫的时候，很有可能会出现将毒蛾属其他非检疫性物种识别成舞毒蛾的情况，导致我国的重要港口的检疫形势严峻，进而造成严重经济损失。因此，对于不同毒蛾属的快速鉴定和准确识别对于防治政策的实施具有重要意义。
3.基于舞毒蛾两个亚种的检疫意义和不同毒蛾属昆虫的形态相似特点，近年来有很多的研究采用分子生物学手段来开发舞毒蛾两个亚种之间以及其近缘种在之间的快速检测引物。其中线粒体dna已经被证明是一种适合快速鉴定引物设计的良好目标。线粒体 dna 具有构造简单，突变速率快（一般是单拷贝核dna的5-10倍），基因保守性强，母系遗传等特点，被称为真核细胞的第二遗传信息系统，或核外表达系统。相对于核基因，mtdna 更能反映出较短时期内的进化事件，尤其是低阶阶元的进化现象，因而已被广泛的运用在生物种及种下关系的鉴别。同时，mtdna 在相同及不同物种之间，同一物种单个及多个种群之间广泛存在的多态性也使其成为物种鉴定的有效遗传标记。
4.目前有一些研究基于线粒体coi基因，16s基因进行了舞毒蛾的快速鉴定工作，但
一方面来说现有的技术大多数是对亚洲型舞毒蛾和欧洲型舞毒蛾的准确鉴定，鲜有对其近缘种进行引物设计，对于亚洲型舞毒蛾和近缘种的检测的相关研究中所采集的样本量不足以覆盖中国的不同地理种群。目前有研究表明在中国舞毒蛾的不同地理种群已经产生了分化，因此采样覆盖中国少部分地理种群的引物不具有代表性。经试验，有些引物甚至对会对毒蛾属其他昆虫产生阳性反应或者是对舞毒蛾不同地理种群产生阴性反应。另一方面来说，对于舞毒蛾常见的近缘种如枫毒蛾，烟毒蛾，栎毒蛾等，前人的研究虽已经做过相关快速鉴定，但是近两年在我国云南地区大发生的一种褐顶毒蛾，其外形和舞毒蛾非常相似，且在同一地区混合发生危害。由于是近几年才开始有大发生情况，而且有关外形鉴定记录很少，当地防治人员无法区分开来，因此出现了错误的识别和报导。除此之外，毒蛾属昆虫的卵和幼虫阶段形态比成虫阶段更加难以区分，在检测舞毒蛾不同虫态时，一些引物的灵敏度达不到要求，只能检测出成虫和末龄体型较大的幼虫。因此，目前在舞毒蛾和其近缘种的快速鉴定研究中还缺乏一种覆盖度广并且灵敏度足够高的技术。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一对用于鉴定亚洲型舞毒蛾特异性引物及检测方法。
6.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一对用于鉴定亚洲型舞毒蛾特异性引物，包括如seq id no:1所示的正向引物和如seq id no:2所示的反向引物。其扩增的靶区段位于舞毒蛾线粒体coi基因第297-647 bp。舞毒蛾线粒体coi基因在ncbi上的参考序列编号为ky923067。
7.第二方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。
8.第三方面，本发明提供亚洲型舞毒蛾检测方法，包括以下步骤：（1）提取待测昆虫的基因组dna；（2）以基因组dna为模板，利用seq id no:1-2所示引物进行pcr扩增；（3）分析扩增产物。
9.pcr反应体系为25ul，包括：12.5ul的2
×
taqpcr mix，10pmol/ul正向引物和反向引物各1-2ul，dna模板1-3ul，ddh2o补齐至25ul。
10.pcr反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，49℃~56℃（优选50℃）退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环；最后72℃延伸5分钟。
11.前述的方法，步骤（3）包括：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现一条350bp的特征条带，则判定待测昆虫为亚洲型舞毒蛾。
12.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：本发明基于ss-coi技术，针对亚洲型舞毒蛾线粒体coi基因的特异性区域设计了用于区别毒蛾属其他物种的引物，该对引物对于亚洲型舞毒蛾不同地理种群，不同虫态，不同龄期都有准确的鉴定效果，而且检测全过程只需要2-3个小时，检测灵敏度为舞毒蛾：近缘种=1：100（dna摩尔比），具有快速准确的优点。可用于海关植物检疫的快速检测与鉴定，为我国的对外贸易提供技术壁垒。
附图说明
13.图1为本发明较佳实例中利用通用引物（c1-j1709，c1-n2776）对毒蛾属4个物种的
coi基因进行扩增，其中，1-2为褐顶毒蛾；3-5为模毒蛾，6-8为木毒蛾；9-13为亚洲型舞毒蛾，m为dna marker。
14.图2为本发明较佳实施例中利用特异性引物agm(f)和agm(r)对亚洲型舞毒蛾和其近缘种木毒蛾，模毒蛾，褐顶毒蛾进行扩增的电泳图。其中，m：：dl2000 dna marker(从上至下分别为2000 ,1000 ,750 ,500 ,250 ,100bp)；泳道1-4为亚洲型舞毒蛾（其中1，2为亚洲型舞毒蛾亚洲亚种lymantria dispar asiatica；3，4为亚洲型舞毒蛾日本亚种lymantria dispar japonica）；5-8为木毒蛾（lymantria xylina）；9-12为模毒蛾（lymantria monacha）；13-16为褐顶毒蛾（lymantria apicebrunnea）；17为无菌去离子水。
15.图3a和图3b为本发明较佳实施例中设置从49℃~56℃的8个温度梯度来检测引物agm(f)和agm(r)的最适退火温度。其中，m：dl2000 dna marker。
16.图3a：1，2，3，4，5分别代表lymantria dispar asiatica，lymantria xylina，lymantria monacha，lymantria apicebrunnea，无菌去离子水。四组（1，2，3，4，5）分别表示不同的退火温度，依次为56℃，55℃，54℃，53℃。
17.图3b：1，2，3，4分别代表lymantria dispar asiatica， lymantria xylina，lymantria monacha，lymantria apicebrunnea，无菌去离子水。四组（1，2，3，4，5）分别表示不同的退火温度，依次为52℃，51℃，50℃，49℃。
18.图4为本发明较佳实施例中利用引物agm(f)和agm(r)对中国14个亚洲型舞毒蛾分布的地理种群进行了通用性检验。其中，m：dl2000 dna marker。泳道1-15分别表示在天津市，鹤岗，青岛，赤峰，承德市，张家口，查日苏，通辽，北京，大连，咸阳，朔州，运城，乌兰浩特采集的舞毒蛾。
19.图5为本发明较佳实施例中以单个亚洲型舞毒蛾的不同发育阶段的组织dna为模板，检测agm(f)，agm(r)的通用性。其中m：dl2000 dna marker。泳道1-10分别表示亚洲型舞毒蛾的卵，一龄，二龄，三龄，四龄，五龄，六龄，蛹，成虫，无菌水。
20.图6为本发明较佳实施例中选择舞毒蛾：木毒蛾模板不同比例不同比例进行agm(f)，agm(r)的灵敏度检验。其中，m：dl2000 dna marker。泳道1-6分别对应于舞毒蛾：木毒蛾dna模板分别为1：0、1：1、1：10、1：50、1：100、1：1000。
具体实施方式
21.本发明采用分子生物学手段建立亚洲型舞毒蛾和其近缘种的快速鉴定方法，不受到不同龄期和不同虫态，不同地理种群的限制，优化舞毒蛾和近缘种快速鉴定引物和扩增体系，为进出境检疫害虫识别和植物检疫工作提供有力工具。
22.本发明首先使用适合于鳞翅目的经过序列比对修正的通用引物对来扩增舞毒蛾及其近缘种的线粒体coi片段。上游引物为5
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aattggwggwttyggaaaytg-3’，下游引物为5
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ggtaatcagagtatcgwcgngg-3’。为了更好的扩增效果，该引物为简并引物，其中，w为a或t，y为c或t，n为a、t、g或c。
23.进一步地，将4个毒蛾属物种相同coi片段的测序结果进行序列比对，采用bioedit软件来完成。找到亚洲型舞毒蛾种内保守但是种间差异较大的片段进特异性引物的设计，种内保守用于保证所设计的引物可以识别亚洲型舞毒蛾的不同个体，种间差异为了保证引物有足够的特异性将亚洲型舞毒蛾检测出。本发明使用primer 5.0设计了亚洲型舞毒蛾的
一对特异性引物：agm(f)，agm(r)。引物序列如下（seq id no:1-2）：agm(f): 5
’‑
ccttctacttttatctttacctgtt-3’agm(r): 5
’‑
attgtagcagaggtaaag-3’本发明提供一种利用上述引物检测亚洲型舞毒蛾的方法，即提取待测样品dna模板，加入上述引物进行pcr扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果电泳产生的条带片段大小约为350bp，则该样品为亚洲型舞毒蛾。
24.本发明提供了一种用上述引物检测亚洲型舞毒蛾的pcr反应体系：包括12.5ul的2
×
taqpcr mix，10pmol/ul正向引物和反向引物各1ul，dna模板1ul，无菌蒸馏水9ul。pcr反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；最后72℃延伸5分钟，产物放于4℃冰箱保存。
25.本发明提供了一种用于检测亚洲型舞毒蛾的试剂盒，包括上述引物以及相应的dna提取试剂，taqpcr mix。
26.具体地，本发明用于检测亚洲型舞毒蛾的方法如下：1）提取待测昆虫的基因组dna。
27.2）利用ss-coi引物对目标片段进行扩增：采用上述的pcr反应体系和pcr反应程序，以待测昆虫的基因组dna为模板及进行扩增，将扩增产物放于4℃保存。
28.3）琼脂糖凝胶电泳：将扩增产生的原液吸取5ul在1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，条件为110v，25-30分钟。采用的核酸染料为无毒的gelred，电泳缓冲液为1
×
的tae缓冲液。电泳时加入dl2000 dna marker作为标记，电泳结束后，在omega lumg凝胶成像仪下观察是否有条带出现。如果条带片段大小为350bp左右，则待测样品为亚洲型舞毒蛾。
29.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册（sambrook j & russell dw, molecular cloning: a laboratory manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
30.实施例1 亚洲型舞毒蛾检测方法1、昆虫基因组dna的提取利用omega基因组dna小量试剂盒提取采自国内不同地理的舞毒蛾以及近缘种标本的基因组dna。
31.（1）用研钵和研杵在液氮中粉碎不超过50mg的虫体组织（前胸或者腿），并将粉末转移到干净的1.5ml微量离心管中。
32.（2）加入350μl buffer ctl和25μl proteinase k涡旋混匀，于60℃孵育30min直至样品完全溶解。
33.（3）加入350μl氯仿:异戊醇（24:1，v/v）混合物，涡旋混匀，室温下10,000g离心5min，小心转移上清液至新的1.5ml离心管中。
34.（4）加入等体积的buffer cbl，最大速度涡旋混匀15s，60℃孵育10min。
35.（5）加入等体积的无水乙醇，最大速度涡旋混匀15s。
36.（6）将hibind
®ꢀ
dna column套入到2ml收集管中，加入750μl步骤5中的混合液，室温下，10,000g离心1min，弃滤液。
37.（7）将hibind
®ꢀ
dna column套回到2ml收集管中，加入500μl buffer hb，10,000g离心1min，弃滤液。
38.（8）将hibind
®
dna column套入到新的2ml收集管中，加入700μl dna wash buffer，10,000g离心1min，弃滤液并重复一次该操作。
39.（9）将hibind
®ꢀ
dna column套回到2ml收集管中，室温下，10,000g空柱子离心2min干燥。
40.（10）将hibind
®ꢀ
dna column套入到新的1.5ml离心管中，加入50-100μl在60℃预热的elution buffer，室温静置2min，10,000g离心1min，洗脱dna。
41.（11）dna浓度检测。利用超微量分光光度计检测所提dna的浓度。检测前用先用去离子水对检测孔进行清洗，擦干后吸取1ul dna提取时所用的洗脱缓冲液elution buffer进行修正，修正完成后吸取1ul样品点入检测孔中，将所有dna分别测定其浓度。
42.在dna提取过程中，通过加入体积比为24:1的氯仿：异戊醇，能更有效地使蛋白质变性，减少杂质污染；同时也可以减少有裂解液产生的泡沫，减少dna的损失。
43.2、亚洲型舞毒蛾及及近缘种目标基因的扩增选取线粒体dna基因组中的coi基因用于特异性引物的设计，使用适合于鳞翅目家蚕的线粒体修正后的coi基因的一对通用引物，经序列比对，合成简并引物进行4个毒蛾属物种（舞毒蛾、木毒蛾、褐顶毒蛾和模毒蛾）线粒体coi基因的扩增，通用引物序列如下：c1-j1709：5
’‑
aattggwggwttyggaaaytg-3’c1-n2776：5
’‑
ggtaatcagagtatcgwcgngg-3’其中，w为a或t，y为c或t，n为a、t、g或c。
44.简并引物c1-j1709和c1-n2776扩增的靶区段位于舞毒蛾线粒体coi基因第248-1295bp。
45.pcr反应的总体系为25ul，包括12.5ul的2
×
taqpcr mix（北京中科裕博生物科技有限公司），10pmol/ul正向引物和反向引物各1ul，dna模板1ul，然后补充无菌蒸馏水至25ul。反应条件如下：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环；最后72℃延伸5分钟，产物放于4℃冰箱保存。随后将pcr产物（5ul）在1.5%的琼脂糖凝胶电泳中进行分析检测，其中制备琼脂糖凝胶时候加入无毒的gelred染料，并用dl2000 dna marker标记片段大小，将有条带的样品送至北京擎科公司进行双向测序。扩增结果见图1。
46.3、亚洲型舞毒蛾ss-coi引物设计先对亚洲型舞毒蛾不同地理种群个体的coi基因进行扩增后，首先对亚洲型舞毒蛾进行了种内序列比对，找到亚洲型舞毒蛾的种内保守片段，然后再将亚洲型舞毒蛾和其他近缘种的coi基因进行种间比对，找到亚洲型舞毒蛾相对于近缘种的突变率高的片段。最后结合种内保守的片段，即找到亚洲型舞毒蛾种内保守但是种间差异较大的片段进特异性引物的设计，其中序列比对采用bioedit软件来完成。本研究使用primer 5.0设计了亚洲型舞毒蛾的一对特异性引物：agm(f)，agm(r)。引物序列如下（seq id no:1-2）：agm(f): 5
’‑
ccttctacttttatctttacctgtt-3’agm(r): 5
’‑
attgtagcagaggtaaag-3’4、亚洲型舞毒蛾ss-coi引物的特异性检验（1）以舞毒蛾的近缘种木毒蛾，模毒蛾，褐顶毒蛾为阴性对照，水为空白对照进行引物的特异性检验，每个物种选择4个样本进行检测。pcr反应体系为25ul，包括12.5ul的2
×
taqpcr mix（北京中科裕博生物科技有限公司），10pmol/ul正向引物和反向引物各1ul，dna模板1ul，然后补充无菌蒸馏水至25ul。反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环；最后72℃延伸5分钟琼脂糖凝胶电泳后显示只有舞毒蛾能扩增出明亮的条带（图2），而阴性对照和空白对照均未条带出现。
47.（2）设置8个退火温度进行温度梯度pcr实验来探索最适退火温度，分别为49℃-56℃。根据电泳结果显示，本发明所设计的亚洲型舞毒蛾特异性引物对退火温度有较宽的幅度，从49℃到56℃均只有舞毒蛾有目标条带产生（图3a和图3b），说明该对引物的稳定性和特异性良好，对多个退火温度下的标本都具有扩增效果，可以排除不同pcr仪器温度差导致的结果不准确。
48.（3）利用agm(f)，agm(r)对舞毒蛾不同地理种群进行通用性检测，另外采集了中国14个地理种群（表1）进行验证，水为空白对照。电泳检测后发现舞毒蛾ss-coi特异性引物对中国14个地理种群具有扩增能力（图4）。
49.表1舞毒蛾及其近缘种采集地点（4）提取亚洲型舞毒蛾的单个卵，一龄，二龄，三龄，四龄，五龄，六龄，卵，成虫的基
因组dna，作为模板，利用特异性引物agm(f)和agm(r)进行pcr扩增检测，根据电泳结果，该对引物对舞毒蛾不同虫态，不同龄期都扩增出了目标条带（图5）。
50.（5）亚洲型舞毒蛾特异性引物的灵敏度检验选择舞毒蛾：木毒蛾dna模板分别为1：0、1：1、1：10、1：50、1：100、1：1000等不同比例进行特异性引物的灵敏度检验。其中舞毒蛾和木毒蛾标准液的浓度都为20ng/ul。电泳结果显示除了1：1000以外，其他的浓度梯度均有目标条带出现（图6）。
51.本发明至少具有以下优点：1、采样范围广，亚洲型舞毒蛾严格意义来讲是亚洲亚种（lymantria dispar asiatica）和日本亚种（lymantria dispar japonica）的合称，此前研究只覆盖了少量中国的地理种群，而本研究不仅采集了中国广泛分布的18个地理种群，而且采集了日本亚种，覆盖全面，使得结果更具有广泛实施的可能。
52.2、本发明采集了近两年中国个别地区爆发并有可能扩散的褐顶毒蛾，其并不是北美等国家所列出来检疫性蛾类，防止海关检疫错误识别成舞毒蛾的情况。本发明所设计的引物可准确区分出两个物种。
53.3、本发明引物设计可靠，采用的通用引物为经过修改的简并引物，可提高扩增成功率和扩增效果，为特异性引物的设计提供了更加可靠的序列信息。
54.4、本发明适用范围广，检测了亚洲型舞毒蛾从卵到成虫的每一个龄期和发育阶段，证明该引物有能力将亚洲型舞毒蛾的各个阶段检测出来。
55.5、本发明的pcr体系简单便捷，只需要加入引物和模板将可以进行扩增，极大的优化了扩增体系，节约时间，减少污染。
56.6、本发明提供的引物有广幅的退火温度范围，在49℃~56℃范围内都可以精确的检测出目标物种，不产生假阳性，解决了现有引物只有一个最适退火温度导致的假阳性高的问题。
57.7、本发明考虑到了检疫过程出现的多种蛾类组织混合无法辨认的情况，提出混合dna检测检疫性物种，经检测，本发明的引物有足够高的灵敏度（舞毒蛾dna：近缘种dna=1:100范围内）可以将亚洲型舞毒蛾低浓度模板检测出来。
58.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。